Protocole de ire BIO6031-BIA3020 2010_2
52
PROTOCOLES DE LABORATOIRE D'ENSEIGNEMENT BIO 6031 MÉTHODOLOGIE BIOCHIMIQUE BIA 3020 DÉPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES SESSIONS HIVER ET ÉTÉ 2010 PROFESSEURS: NORMAND CHEVRIER FRANÇOIS DRAGON MARIO HOUDE
Transcript of Protocole de ire BIO6031-BIA3020 2010_2
PROTOCOLES DE LABORATOIRE D'ENSEIGNEMENT
BIO 6031
MÉTHODOLOGIE BIOCHIMIQUE
BIA 3020
DÉPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES
SESSIONS HIVER ET ÉTÉ 2010
PROFESSEURS:NORMAND CHEVRIER
FRANÇOIS DRAGONMARIO HOUDE
FRANÇOIS OUELLET
LA SANTÉ ET LA SÉCURITÉ AU LABORATOIRE
Rappel de règles générales
- Porter un sarrau et des souliers fermés en tout temps. Le sarrau doit toujours être propre et utilisé uniquement au laboratoire. Les cheveux longs doivent être attachés. S’abstenir de porter chapeau, casquette ou foulard au laboratoire.
- Porter des lunettes de sécurité lors de la manipulation de produits contrôlés (voir références). Concernant le port des lentilles cornéennes, voir l'encadré de la page 2.
- Utiliser tout équipement individuel ou collectif de protection recommandé, selon la nature du matériel manipulé et le type de manipulation effectué. A ce propos, s'abstenir de porter des gants protecteurs hors du laboratoire.
- Utiliser les instruments mis à votre disposition aux fins de pipetage. Ne jamais pipeter à la bouche.
- S'abstenir de manger, de boire, de fumer, de se bousculer ou d'utiliser une radio portative personnelle. De plus, laisser vos objets personnels, y compris nourriture et boisson, dans votre casier.
- Se laver les mains et nettoyer votre surface de travail avec les produits appropriés, avant et après chaque séance de laboratoire.
- Bien suivre les instructions décrites dans le protocole en ce qui concerne la nature et l'ordre des réactions et s'informer des dangers reliés aux manipulations à effectuer (lire les étiquettes et consulter le personnel technique ou les auxiliaires d'enseignement).
- Toujours identifier les contenants utilisés lors d'une expérience et les couvrir de façon appropriée. S'abstenir de sortir le matériel à l'extérieur du laboratoire.
- Toujours prévenir le personnel technique ou la démonstratrice, le démonstrateur lors d'un bris de matériel ou d'équipement ainsi que lors d'un déversement quelle que soit la nature du produit (microorganismes, solvants, acides, etc.).
- Utiliser les procédés recommandés pour l'élimination des différents types de déchets.
2
EN CAS D'ACCIDENT
- Prévenir le personnel technique ou la démonstratrice, le démonstrateur.
- Appeler le Service de la prévention et de la sécurité (Accès direct: téléphones rouges dans les corridors. Composer le 3131).
- Faire appel à une ou un secouriste.
EN CAS DE GROSSESSE
Les femmes enceintes doivent être particulièrement vigilantes relativement aux produits manipulés au laboratoire. Prévenir le personnel technique et consultez les fiches signalétiques pour bien connaître le niveau de risque encouru.
RÉFÉRENCES
- Introduction à la santé et la sécurité dans les laboratoires et lors de la manipulation des substances à risque. (Document disponible dans toutes les salles de laboratoire, dans les présentoirs SIMDUT).
- Répertoire des fiches signalétiques des produits utilisés dans les laboratoires.
- Liste des secouristes et des principaux numéros de téléphone à composer en cas d'urgence.
À propos des lentilles cornéennes
Il n'y a pas d'interdiction de port de lentilles cornéennes dans les laboratoires. L'interdiction qui est prononcée dans certains laboratoires n'est pas fondée scientifiquement. Toutefois, il faut rappeler que les lentilles cornéennes ne peuvent en aucun cas être considérées comme un équipement protecteur : partout où le port de lunettes de protection est exigé, cette obligation est aussi faite aux porteurs de lentilles.
Il y a des inconvénients au port de lentilles dont les usagers doivent eux-mêmes assumer les conséquences. D'une part, il y a des risques d'irritation oculaire dans les atmosphères très sèches ou poussiéreuses. D'autre part, en cas d'urgence, la projection d'agents agresseurs dans les yeux implique le recours immédiat à la douche oculaire : l'usager doit enlever rapidement ses lentilles (ce qui n'est pas toujours facile) ou risquer de les perdre sous la douche; s'il y a perte de conscience, ce seront d'autres personnes qui devront procéder, et il y a lieu d'informer votre entourage que vous portez des lentilles, afin qu'on puisse intervenir efficacement.
La décision de porter des lentilles (plutôt que des verres) revient donc à chaque étudiant, mais elle doit être prise en toute connaissance de cause.
3
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉALDÉPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES
BIO 6031/BIA3020 MÉTHODOLOGIE BIOCHIMIQUEProf: Chevrier, N.
Dragon, F.Houde, M.Ouellet, F.
OBJECTIF DU COURS
Le cours de Méthodologie biochimique consiste en une activité de synthèse axée sur l'intégration des connaissances biochimiques que vous avez acquises jusqu'à date à travers les diverses activités pédagogiques que vous avez suivies. En outre, cette activité de synthèse vise à développer plusieurs habiletés intellectuelles qui vous seront indispensables pour œuvrer dans votre spécialité, notamment l'esprit de synthèse, l'esprit critique, le sens de l'organisation, l'autonomie, le travail en équipe et la communication orale et écrite.
FORMULE PÉDAGOGIQUE
Chaque équipe de deux personnes doit établir son protocole expérimental en se référant au présent guide et aux divers articles qui sont cités à la fin du document. Ces articles constituent une bibliographie abrégée que l'étudiant doit compléter. Il est également fortement recommandé à l'étudiant(e) de réviser les notions de base de la chimie des protéines et de la catalyse enzymatique. Le protocole doit être remis 4 ou 5 semaines avant le début du travail expérimental. Le professeur corrigera les protocoles et remettra les commentaires selon l’échéancier remis sur la fiche de cheminement (1 à 2 semaines). Vous pourrez par la suite récupérer votre protocole et devrez faire les corrections et les ajustements demandés avant de commencer le laboratoire. Vous pourrez consulter le professeur sur rendez-vous si vous avez besoin de discuter de votre protocole. L'évaluation du protocole ne porte pas seulement sur le contenu mais aussi sur la compréhension des informations qu'on y retrouve. Aucun travail expérimental ne pourra débuter sans l'accord du professeur.
Le travail en laboratoire s'effectue par équipe de deux étudiant(e)s et s'échelonne sur une période de deux semaines (soit 11 jours incluant le samedi de la première semaine). L'équipe devra remettre un rapport rédigé sous la forme d'un article scientifique à la date fixée dans l'entente d'évaluation. Le protocole annoté par le professeur de même que le cahier de laboratoire doivent également être remis au professeur en même temps que le rapport final.
Le but du laboratoire consiste en l'extraction, la purification et la caractérisation d'une phosphatase acide d'origine végétale.
EXTRACTION
Pour extraire l'enzyme, vous devez broyer le matériel à l'aide d'un homogénéisateur (Waring blender) dans un solvant approprié (tampon d'extraction) selon un ratio poids/volume adéquat. La fraction soluble que vous recueillez après les étapes de filtration et centrifugation correspond à la fraction brute soluble F1.
PURIFICATION
La purification de l'enzyme nécessite la précipitation fractionnée des protéines avec du sulfate d'ammonium ((NH4)2SO4) ou un solvant organique (ex. acétone), des dialyses et des chromatographies. La fraction obtenue après la précipitation sera la F2, celle obtenue après la 1ère
chromatographie sera la F3, et celle obtenue après la 2e chromatographie sera la F4. Lors de la rencontre préparatoire au cours, chaque équipe se verra assigner le matériel végétal à utiliser, le type de précipitation fractionnée (sel ou solvant organique) à faire et un minimum de deux étapes chromatographiques à effectuer en série. À partir de ces données, chaque équipe doit rédiger de façon détaillée la procédure expérimentale qu'elle se propose de suivre.
Pour les chromatographies, vous devez indiquer le tampon et la quantité de résine chromatographique à utiliser, la quantité d'échantillon que vous appliquerez, la vitesse d'écoulement et le volume des fractions que vous récolterez.
Exemples de types de chromatographie
1. Chromatographie de filtration sur tamis moléculaireMatrice: Bio-gel a – 0.5 m (Bio Rad)
2. Chromatographie par échange ioniqueMatrice: CM Bio-gel (échangeur cationique)
DEAE Bio-gel (échangeur anionique)Phosphocellulose (échangeur cationique)
3. Chromatographie d'hydrophobicitéMatrice: Phényl-sépharose
Ter-butyl-sépharose
4. Chromatographie d'affinitéMatrice: Concanavaline A-sépharose
Après l’obtention de chacune des fractions (F1 à F4), il faut déterminer les paramètres appropriés pour compléter le tableau de purification (voir ci-après) avant de procéder à l'étape suivante. Il faut donc minimalement déterminer le volume des fractions et effectuer un dosage des protéines et de l'activité enzymatique. De plus, pour chacune des fractions, il faut précipiter une quantité suffisante de protéines avec de l'acétone en prévision de l'électrophorèse (200 µg pour F1 et F2 et 50 µg pour F3 et F4). S'il y a trop peu de protéines en F4, cette quantité pourra être diminuée. Les protéines précipitées à l'acétone devront être séchées et resuspendues à une concentration de 2 µg/µL dans le tampon d'échantillon pour l'électrophorèse.
TABLEAU DE PURIFICATION
2
Les paramètres ci-dessous doivent être déterminés sur toutes les fractions de F1 à F4
Fraction Volumeml
Protéines U Enz ActivitéSpécifiqueU/mg prot.
Facteur depurification
Rendement %mg/ml mg
totalU/ml U
totaleF1 (brute)*F2 (…..)F3 (…..)F4 (…..)*
* Il faut aliquoter environ 5% de la F1 en plusieurs tubes tandis que la fraction F4 sera entièrement aliquotée. Ces tubes sont congelés à -20ºC pour la caractérisation. Un nouveau tube sera dégelé à chaque jour de caractérisation. Il est important de tester votre activité à chaque fois que vous décongelez un nouveau tube pour vérifier si vous avez perdu de l’activité et, le cas échéant, ajuster les dilutions. Pour la fraction F4, il faut évaluer si la concentration de protéines est faible et discuter avec le professeur de la possibilité de stabiliser cette fraction en ajoutant du BSA.
CARACTÉRISATION
La caractérisation d'une enzyme s'effectue sur la fraction brute F1 et la fraction la plus purifiée F4. Un minimum de paramètres doivent être déterminés:
température optimale pH optimal coefficient de dénaturation thermique Km et Vmax énergie d'activation effets d’activateurs et d'inhibiteurs (incluant un inhibiteur organique phosphorylé)
- déterminer I50 pour deux inhibiteurs de types différents- utiliser cette I50 pour déterminer la Ki pour chacun de ces deux inhibiteurs
poids moléculaire (SDS-PAGE et gradient de glycérol)
N.B. Les valeurs de Vmax doivent être exprimées en µmol de produit formé/min/mg de protéine.
3
PLAN DE RÉDACTION DU PROTOCOLE
1. Table des matières
2. Introduction (max. 2 pages): Propriétés des phosphatases et objectifs de l'expérience
3. Échéancier (calendrier de travail)(1)
4. Liste des principaux tampons(2)
5. Dosage des protéines et courbe standard(3)
5.1 Méthode de dosage5.2 Courbe standard
6. Dosage de l'activité enzymatique et courbe standard(4)
6.1 Méthode de dosage 6.2 Courbe standard
7. Extraction et purification de la phosphatase acide de…7.1 Extraction…7.2 Précipitation fractionnée(5)…
- Principe (max. ½ p.)- Procédure
7.3 Dialyse (si nécessaire)- Principe (max. ½ p)- Procédure
7.4 Purification7.4.1 1ère étape chromatographique (nommez-la)
- Principe (max ½ p.)- Procédure
7.4.2 2e étape chromatographique (nommez-la)- Principe (max ½ p.)- Procédure
8. Caractérisation de la phosphatase acide de … (F1 et FX)(6)
8.1 Détermination de la température optimale8.2 Détermination du pH optimal8.3 Linéarité de la réaction dans le temps en conditions optimales(7)
8.4 Détermination du coefficient de dénaturation thermique8.5 Détermination du Km et de Vmax8.6 Détermination de l'énergie d'activation(8)
8.7 Identification et justification des choix de substances affectant l’activité de la phosphatase acide(9)
8.8 Détermination de I50 de 2 inhibiteurs de types différents (dont un est organique phosphorylé)(9)
8.9 Détermination du Ki pour les deux inhibiteurs sélectionnés 8.10 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)(10)
4
8.11 Gradient de glycérol sur la F2 et la F4
9. Liste des références(11)
10. Réponse aux questions
NOTES:
1 Définissez les étapes quotidiennes à franchir pour les 11 jours de travail expérimental.
2 Énumérez les principaux tampons que vous prévoyez utiliser :ex: tampon A: Tampon de réaction enzymatique : acétate de sodium 100 mM, pH 5,2
tampon B : Tampon d’extraction : acétate de sodium 100 mM pH 5,5, 1 mM PMSF, 0,1 mM DTT, 100 mM NaCl, 1% PVPtampon C: Tampon de chargement et de lavage pour chromatographie DEAE : Tris-HCl 10 mM pH 7,4
Vous devez préparer la majorité des solutions que vous allez utiliser. Par contre, les solutions suivantes sont habituellement préparées par les techniciens:
- BSA (albumine de sérum bovin) 2% (dissous dans H2O)- PMSF 100 mM (dissous dans de l’éthanol)- DTT 100 mM (dissous dans H2O)- para-nitrophénol (pNP) 10 mM (dissous dans H2O)- para-nitrophényl phosphate (pNPP) 50 mM (dissous dans H2O)- acide acétique 6 M, HCl 6 M et NaOH 2 M- solution de Na2CO3 0,2 M (solution basique d'arrêt de la réaction enzymatique)- les solutions pour le dosage des protéines (Lowry) (Annexe 1)- les solutions et les tampons pour l'électrophorèse.
3 Référez-vous à l'annexe 1.
Dans le cas de la courbe standard, préparez un tableau précisant les détails de la procédure:
# éprouvette
BSA 100 µg/ml(µL)
H2O(µL)
QuantitéBSA(µg)
Sol. A(mL)
Sol. B(mL)
A750 nm
1,23,4
''
0100
''
1000900
''
010''
55''
10min
0,50,5
''
30min
Note: À l'annexe 2 on décrit une procédure d'estimation de la concentration en protéines par mesure d'absorbance en U.V.
4 Lire attentivement l'annexe 3 et répondre aux questions posées en annexe 7 pour bien comprendre les conditions à respecter pour préparer un milieu de dosage adéquat.
5
5 Si vous devez faire une précipitation fractionnée avec du sulfate d'ammonium, consultez l'annexe 4.
6 Décrire en détail (en incluant un tableau des pipetages requis, ordre d’addition des réactifs, composition des blancs, temps de réaction, etc.) la procédure pour chacun des tests de caractérisation. Donnez tous les détails des calculs relatifs aux traitements des données (formules à utiliser) et présentez un exemple de graphique nécessaire pour la représentation (et parfois pour le calcul) de vos données. Expliquez comment calculer (quelles formules et à partir de quelles données expérimentales et graphiques) les Ki pour les 3 types d'inhibition réversible.
7 Lorsque vos conditions optimales sont établies, vous devez déterminer un temps de réaction et une dilution enzymatique appropriée pour les différentes expériences.
8 Pour la détermination de l'énergie d'activation, il est utile de consulter la référence suivante: Segel, 1976. Décrivez également les deux méthodes (graphique d’Arrhenius et formule dérivée) pour calculer l'énergie d'activation ainsi que les expériences requises dans les deux cas.
9 Afin d’identifier des substances qui modulent l’activité de votre phosphatase, vous devez en tester plusieurs à une concentration reconnue pour agir (activateurs tels des ions divalents, ou des inhibiteurs) sur des phosphatases avec références à l’appui. Vous devrez présenter les résultats des effets observés pour les différentes substances sous forme de tableau exprimant le pourcentage d’activité par rapport au témoin. Si vous effectuez plusieurs concentrations d’une même substance, un graphique pourrait être plus approprié. Parmi les substances ayant un effet inhibiteur, vous en choisirez deux (dont un est organique phosphorylé) pour déterminer les I50 et Ki. Référez-vous à la liste de l'annexe 5. Certains produits tels les ions ne sont pas listés mais peuvent être disponibles sur demande. Attention: certaines substances peuvent affecter le pH.
10 Référez-vous à l'annexe 6. Faire un tableau résumé des solutions à utiliser (concentrations initiale et finale, volumes) pour préparer des gels de séparation de 12% polyacrylamide, surmontés de gels d’empilement de 5%. Ne pas répéter tous les détails qui se trouvent dans l’annexe sur la préparation des gels!
11 Indiquez ici toutes les références qui ont été citées dans le texte pour documenter chacune des étapes de votre protocole.
Il est à noter que dans le texte, on cite les références de la façon suivante: Un auteur : Biswas (1996); deux auteurs : Biswas et Muller (1996); trois auteurs et plus : Biswas et al. (1996). Dans la liste des références (bibliographie) apparaissent les noms de tous les auteurs, l’année, le titre, la revue, le volume et les pages (voir la bibliographie du présent document à titre d'exemple). Pour les livres et chapitres de livres, il faut ajouter la maison d'édition, les éditeurs (s'il y a lieu), la ville et le nombre de pages (ou les pages consultées).
6
ANNEXE 1
DOSAGE DES PROTÉINES
Réf. Lowry O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.
Dosage utile entre 20 et 100 µg de protéines par échantillon. Le standard utilisé le plus communément est l’albumine de sérum bovin (BSA).
Réactifs: Tartrate double Na et K à 2% dans de l'eau distilléeCuSO4 à 1% dans de l'eau distilléeNa2CO3 à 2% dans 0,1 N NaOH
Solution A : Juste avant le dosage, mélangez ces 3 réactifs dans les proportions suivantes:
Tartrate: 1 mlCuSO4: 1 mlNa2CO3: 100 ml
Solution B: réactif de Folin-Ciocalteu dilué selon les recommandations du fabricant avec de l'eau distillée.
Dosage :+ 5 ml + 0,5 ml
Échantillon ou standarddans 1 ml H2O
Solution AAttente de
10 min.
Solution BAttente de
30 min.
Lecture de A750nm
Après avoir ajouté la solution A, mélangez immédiatement par inversion et attendez exactement 10 min. Après 10 min, ajoutez la solution B, mélangez à nouveau et attendez 30 min avant de mesurer l'absorbance à 750 nm. Il est important de mélanger chaque tube dès qu’une solution est ajoutée.
*Veuillez noter que l’échantillon standard est préparé dans l’eau alors que vos échantillons de phosphatases sont dans différents tampons selon les étapes de purification. Il faut alors préparer un blanc approprié pour le dosage des protéines. Dans certains cas, il est préférable de faire une microdialyse ou de précipiter au TCA une partie de votre fraction avant d’effectuer le dosage (exemple : forte concentration en sel).
7
ANNEXE 2
ESTIMATION DES PROTÉINES PAR ABSORBANCE EN UV
RapportA280/A260
Facteur pourcellule de 1 cm
1,751,601,501,401,301,251,201,151,101,051,000,960,920,880,860,840,820,800,780,760,740,720,700,680,660,650,640,620,60
1,111,081,051,02
1,0051,0000,9500,9010,8700,8370,8040,7730,7570,7170,7050,6900,6700,6490,6190,5970,5670,5440,5100,4810,4490,4290,4170,3820,361
Pour cette méthode, des lectures d’absorbance sont faites à 280 et 260 nm. Le ratio A280/A260 doit être calculé et utilisé pour déterminer le facteur de correction dans le tableau ci-haut. On peut estimer la concentration en protéines (en mg/mL) en multipliant le facteur de la cellule par A280.
8
ANNEXE 3
ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
Si vous désirez déterminer l'activité enzymatique à un temps fixe, vous devez vous assurer que la quantité de produit formé est directement proportionnelle au temps, c'est-à-dire que:
P/t = constante, sur la période de temps choisie.
Notez que la concentration enzymatique (dilution 1/2, 1/5, 1/10 …) est l'un des facteurs qui gouverne cette relation entre la quantité de produit formé et le temps de réaction. Il est donc nécessaire, pour chaque fraction F1 à F4, de faire une cinétique de l'activité enzymatique dans le temps (ex: de 0 à 30 min) et ce à différentes concentrations d'enzyme (ex: dilution 1/2, 1/5, 1/10, etc.). Ceci vous permettra de visualiser graphiquement l'activité de votre enzyme en fonction de sa concentration et du temps de réaction.
De plus, le pouvoir tampon ainsi que le volume du mélange réactionnel, servant à déterminer l'activité enzymatique, doivent être constants d'une expérience à l'autre. Par exemple, vous pourriez avoir un mélange réactionnel standard composé comme suit:
Tampon X 100 mM pH 5,0Substrat (pNPP) 50 mMPréparation enzymatique (dil 1/5)H2O (ou sel ou autre substance à tester, dissout dans H2O)
500 µL100 µL50 µL
350 µLVolume final = 1 mL
Note: Lorsque vous décrivez la procédure de dosage de l'activité enzymatique, il est bien important de donner tous les détails pertinents tels que la composition du milieu de dosage (volume, concentration initiale, concentration finale, quantité de chaque substance), l'ordre d'addition des substances, le temps de pré-incubation, la température du milieu, comment on démarre la réaction, le temps de réaction, comment on arrête la réaction, comment on prépare le(s) blanc(s) de réaction, etc…
Il faut décrire un (ou plusieurs) blanc(s) pour chaque expérience prévue pour la caractérisation.
9
ANNEXE 3 (suite)
COURBE STANDARD
Vous devez également quantifier le produit formé par la réaction. Vous devez donc établir une courbe standard de l'absorbance du produit (pNP) à son lamdaMAX en fonction de sa concentration. Cette courbe doit être établie dans les mêmes conditions que celles utilisées pour déterminer l'activité enzymatique sauf que l'enzyme et le substrat sont remplacés par le produit (vous trouverez le lamdaMAX
dans la littérature).
Faire un tableau détaillant la composition des milieux servant à établir la courbe standard en complétant les données manquantes. Évitez les petits volumes pour réduire l’imprécision des pipetages. Faites plutôt des dilutions en séries et pipetez des volumes de plus de 20 µL lorsque cela est possible.
ex:
# tube pNP x mM(µL)
Tp acétate100 mM pH 5,0(µL)
H2O(µL)
Na2CO3
0,2M(mL)
Volumefinal(mL)
Quantité de pNP(µmol)
pNP(µM)
-Na2CO3 + Na2CO3
Absorbance(max)
1, 23, 45, 6etc…
020
??
??
22
33
??
??
??
10
ANNEXE 4
TABLE DE SATURATION EN SULFATE D'AMMONIUM À 0°C
Quantité de sulfate d'ammonium en grammes à ajouter à 100 mL de solution
% SATURATION FINALE EN SEL
% 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
%
SATURATION
INITIALE
EN
SEL
0
5
10.7
8.0
13.6
10.9
16.6
13.9
19.7
16.8
22.9
20.0
26.2
23.2
29.5
26.6
33.1
30.0
36.6
33.6
40.4
37.3
44.2
41.1
48.3
45.0
52.3
49.1
56.7
53.3
61.1
57.8
65.9
62.4
70.7
67.1
10
15
5.4
2.6
8.2
5.5
11.1
8.3
14.1
11.1
17.1
14.3
20.3
17.4
23.6
20.7
27.0
24.0
30.5
27.5
34.2
31.0
37.9
34.8
41.8
38.6
45.8
42.6
50.0
46.6
54.4
51.0
58.9
55.5
63.6
60.0
20
25
2.7 5.6
2.7
8.4
5.7
11.5
8.5
14.5
11.7
17.7
14.8
21.0
18.2
24.4
21.4
28.0
24.8
31.6
28.4
35.4
32.1
39.2
36.0
43.3
40.1
47.6
44.2
51.9
48.5
56.5
52.9
30
35
2.8 5.7
2.8
8.7
5.8
11.9
8.8
15.0
12.0
18.4
15.3
21.7
18.7
25.3
22.1
28.9
25.8
32.8
29.5
36.7
33.4
40.8
37.4
45.1
41.6
49.5
45.9
40
45
2.9 5.9
2.9
9.0
6.0
12.2
9.1
15.5
12.5
19.0
15.8
22.5
19.3
26.2
22.9
30.0
26.7
34.0
30.6
38.1
34.7
42.4
38.8
50
55
3.0 6.1
3.0
9.3
6.2
12.7
9.4
16.1
12.9
19.7
16.3
23.3
20.0
27.2
23.8
31.2
27.7
35.3
31.7
60
65
3.1 6.3
3.1
9.6
6.4
13.1
9.8
16.6
13.4
20.4
17.0
24.2
20.8
28.3
24.7
70
75
3.2 6.6
3.2
10.0
6.7
13.6
10.2
17.3
13.9
21.2
17.6
80
85
3.3 6.8
3.4
10.4
6.9
14.1
10.6
90
95
3.4 7.1
3.5
11
ANNEXE 5Inhibiteurs compétitifs : Organiques : 100 mM ADPAMP ATP 2-carboxyphenyl phosphatefructose 6-phosphate
fructose 1,6-diphosphateglucose 1-phosphate glucose 6-phosphate -glycérophosphateDL--glycérolphosphate -naphthylphosphate phénylphosphate
3-phosphoglyceric acid (acide 3-phosphoglycérique)phosphoénol pyruvatephosphosérinephosphothréonine phosphotyrosine phytic acid (acide phytique) ribose 5-phosphate
Inorganiques : concentration à déterminer potassium phosphate dibasique PM 174,18
monobasique PM 136,09sodium phosphate dibasique PM 141,96
monobasique PM 119,96sodium pyrophosphate PM 446,06tripolyphosphate PM 367,9
Métaux lourds: Solutions déjà préparées N.B. toujours porter des gants quand on manipule ces produits
Métal Concentration Toxicité
Nitrate de cadmium (cadmium nitrate) 1 M toxique: effets cumulatifs
oxidant fort
Acide p-(hydroxymercury)benzoique.Na
(p-(hydroxymercury)benzoic acid Na salt)
0,05 M très très toxique
Iodoacétamide 500 mM toxique
Acétate de plomb (lead acetate) 0,05 M toxique: effets cumulatifs
Chlorure de plomb (lead chloride) 1 mM toxique: effets cumulatifs
Nitrate de plomb (lead nitrate) 0,1 mM toxique: effets cumulatifs
Chlorure de mercure (mercury chloride) 0,1 mM toxique: effets cumulatifs
Nitrate de mercure (mercury nitrate) 10 mM toxique: effets cumulatifs
Sulfate de mercure (mercury sulfate) 10 mM toxique: effets cumulatifs
Acide oxalique (oxalic acid) 100 mM toxique, oxidant fort
Nitrate d’argent (silver nitrate) 100 mM toxique
Arséniate de sodium (sodium arsenate) 100 mM toxique
Fluorure de sodium (sodium fluoride) 100 mM toxique
12
ANNEXE 6ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE EN PRÉSENCE DE SDS
Les gels de polyacrylamide sont préparés selon la technique de Laemmli (1970), légèrement modifiée.
Les gels de polyacrylamide de 5%, et de 12% doivent être préparés dans des tubes en plastique jetables à partir d'une solution stock composée de 29,2% (p/v) acrylamide et 0,8% (p/v) N;N, bismethylène-acrylamide dissous dans de l'eau distillée. (Voir le tableau à la page suivante).
Pour cette expérience un minigel sera utilisé. Vous devez préparer :- 10 ml de gel de séparation 12% dans le tampon Tris-HCl, pH 8,8 contenant du SDS- 4 ml de gel 5% dans le tampon Tris-HCl, pH 6.8 contenant du SDS
Les gels sont polymérisés par l'addition de TEMED (tétramethyl ethylène diamine) (concentration finale de 0,05%), et de persulfate d'ammonium 10% (concentration finale 0,1%). L'addition du TEMED et du persulfate d'ammonium dans la solution d'acrylamide (5% ou 12%) se fait au dernier moment. Les solutions sont mélangées doucement pour éviter la formation de bulles d'air, ce qui ralentirait la polymérisation des gels.
A l'aide d'une pipette P1000, on introduit la solution de gel 12% entre les plaques de verre de façon à ce que le gel occupe 6 cm de hauteur. On laisse ensuite les gels polymériser à la température de la pièce (environ 45 minutes). Lorsque les gels sont polymérisés, on insère le peigne puis on ajoute le gel de 5% de façon à ce qu'il occupe le reste du volume disponible entre les deux plaques (environ 1 cm de hauteur) et on laisse polymériser (au moins 45 minutes).
Les protéines (50 à 200 µg) des fractions F1, F2, F3, F4 ... peuvent être dyalisées et concentrées par lyophilisation. Elles peuvent aussi être précipitées avec 5 volumes d'acétone très froid (-20°C) pendant au moins une heure, et chacun des précipités est solubilisé à une concentration de 2 µg/µL dans le tampon d'échantillon pour électrophorèse (0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycérol, 5% β-mercaptoéthanol et 0,002% de bleu de bromophénol (ce dernier est un colorant servant de marqueur pour le front de migration dans chacun des puits).
Les échantillons sont ensuite incubés à 100°C pendant 2 min. puis déposés dans les puits. Dans un des puits, déposez les standards de protéines de masses moléculaires connues (5-10 µL).
L'appareil à électrophorèse est alors rempli avec le tampon d'électrophorèse 0,025 M Tris, 0,192 M glycine et 0,1% SDS, pH 8,3. L'électrophorèse est effectuée à la température de la pièce à 150 V jusqu'à ce que le bleu de bromophénol ait atteint le bas du gel (environ 75 min.).
13
ANNEXE 6 (suite)ÉLECTROPHORÈSE : SOLUTIONS POUR LES GELS TRIS-GLYCINE SDS-PAGE 6% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 mlH2O 2.65 5.3 7.95 10.6 13.25 15.9 21.2 26.530 % mélange Acrylamide-bisa 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.01,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.510% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.510% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.058% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 mlH2O 2.3 4.6 6.95 9.25 11.6 13.9 18.5 23.130 % mélange Acrylamide-bisa 1.33 2.66 4 5.33 6.66 8 10.66 13.331,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.510% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.510% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.0510% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 mlH2O 2.00 4.00 5.95 8 9.9 11.9 15.9 19.830 % mélange Acrylamide-bisa 1.66 3.33 5 6.66 8.33 10 13.33 16.661,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.510% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.510% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.0512% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 mlH2O 1.65 3.3 4.95 6.6 8.25 9.9 13.15 16.4530 % mélange Acrylamide-bisa 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.01,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.510% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.510% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.0515% 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 mlH2O 1.15 2.3 3.45 4.6 5.75 6.9 9.15 11.4530 % mélange Acrylamide-bisa 2.5 5.0 7.5 10 12.5 15 20 251,5 M Tris (pH 8,8) 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 10 12.510% Sodium dodecyl sulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.510% Ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0,4 0.5TEMEDb 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0,04 0.05
EMPILEMENT (5%) 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 10 mlH2O 0.68 1.38 2.06 2.75 3.44 4.12 5.5 6.8830 % mélange Acrylamide-bisa 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.33 1.661,0 M Tris (pH 6,8) 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1 1.2510% Sodium dodecyl sulfate 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.110% Ammonium persulfate 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1TEMEDb 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01a Mélange de 29.2% Acrylamide et de 0.8% de N,N’-methylene-bis-acrylamide
14
b N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
15
ANNEXE 6 (suite)
COLORATION AU BLEU DE COOMASSIE
Les gels sont retirés des plaques et colorés dans du méthanol-acide acétique-H2O (40:10:50) contenant 0,1% de bleu de Coomassie R-250 durant 2 h. Ensuite, les gels sont décolorés par plusieurs lavages successifs dans de l’eau distillée en chauffant au micro-ondes.
Gradient linéaire de glycérol.
Le poids moléculaire natif de l'enzyme sera déterminé par ultracentrifugation sur un gradient linéaire de glycérol 10-30% dans un tampon 0,1 M Na-acétate pH 5,0. Des tubes serviront à faire sédimenter des protéines de poids moléculaires connus et à générer une courbe étalon. Les différentes protéines et leurs poids moléculaires vous seront communiqués au laboratoire. Deux autres tubes serviront pour vos échantillons F2 et F3 ou F4 selon la quantité d'enzyme disponible. Des gradients de 11 ml seront générés à l'aide d'un formateur de gradient et vous déposerez délicatement une unité enzymatique (volume à calculer) de vos échantillons à la surface du gradient. Les tubes seront centrifugés à 40,000 RPM dans un rotor SW41 (Beckman) pendant 30-36 heures. Des fractions de 0,5 ml (10 gouttes) seront récupérées dans des microtubes de 1,5 ml (environ 20 tubes) à l'aide d'un fractionateur de gradient (Fraction Recovery System, Beckman) et la DO280 ainsi que l'activité enzymatique seront déterminées. Le tube contenant le maximum d'activité sera analysé par électrophorèse avec vos différents échantillons (F1 à F4).
16
ANNEXE 7
Répondre aux questions suivantes:
1. Lorsque l'on veut extraire la phosphatase acide à partir d'un matériel végétal, il est important que le solvant utilisé permette une extraction efficace de l'enzyme tout en préservant son intégrité fonctionnelle. Dans quelle mesure le milieu d'extraction que vous vous proposez d'utiliser permettra d'atteindre cet objectif? Définir le rôle de chacune des composantes de votre milieu d'extraction.
2. Quand peut-on utiliser la méthode de dosage des protéines par absorbance en U.V. plutôt que la méthode de Lowry? Expliquez.
3. Pourquoi est-il nécessaire de mesurer la vitesse de réaction enzymatique de la phosphatase acide en début de réaction (vitesse initiale) plutôt qu'en fin de réaction?
4. Pourquoi la réaction enzymatique (phosphatase acide) est-elle arrêtée en ajustant le pH à 10,5-11,0 avec une base (Na2CO3 ou NaOH)? Est-ce simplement pour inactiver l'enzyme à un pH extrême? Si oui, pourrait-on utiliser un acide tel que le HCl?
5. Dans quelle mesure les valeurs de Km et Vmax relevées dans la littérature peuvent être utiles pour la préparation de votre milieu de dosage de l'activité phosphatase acide?
6. Pourquoi est-il nécessaire d'exprimer les valeurs de Vmax par mg de protéines?
7. En supposant que vous ayez un milieu réactionnel pour le dosage de l'activité enzymatique qui soit le suivant:
Tampon X 100 mM pH 5,0Substrat (pNPP) 50 mMPréparation enzymatique (dil 1/5)H2O (ou sel ou substance autre à tester et dissoute dans H2O)
500 µL100 µL50 µL
350 µL1 mL
a) Dans cet exemple, quelles sont les concentrations finales de tampon et de substrat?
b) Comment pourrait-on avoir les mêmes concentrations finales de tampon ou de substrat à partir de solutions initiales de concentrations différentes et ce sans modifier le volume final (STANDARD) de 1 ml? Donnez un exemple.
8. Pour mesurer l'activité phosphatase acide, il faut préparer, en plus du milieu de dosage, un milieu approprié qui sert de blanc de réaction. Indiquez les volumes respectifs de même que la concentration initiale et la concentration finale de chacune des composantes de ce milieu. Expliquez le rôle du blanc de réaction.
9. Pour mesurer la quantité de produit formé (pNP) par la réaction enzymatique, vous devez vous référer à la courbe standard que vous aurez établie. De quelle façon les valeurs de coefficient
17
d'extinction molaire retrouvées dans la littérature vous sont utiles pour préparer votre courbe standard de pNP?
10. Pour déterminer l'effet du pH sur l'activité de la phosphatase acide, il est nécessaire d'utiliser différents tampons pour être capable de couvrir une gamme assez large de pH (ex: pH 3,5 à 8,5). La valeur de pKa de chaque tampon est une des caractéristiques qui guide votre choix. Expliquer.
S'il faut plusieurs tampons pour couvrir la gamme de pH, il faut des points de pH commun entre chaque changement de tampon. Pourquoi?
D'autre part, certains tampons, tel le tampon phosphate, peuvent ne pas convenir pour d'autres raisons. Expliquez.
11. Vous disposez d'un pH mètre et des produits et solutions suivants :
- Acétate de sodium, poudre (CH3COONa.3H2O) : FW 136,08- Acide acétique, liquide (CH3COOH) : 6 M- Acide chlorhydrique, liquide (HCl) : 12 M- Acide éthylènediaminetétraacétique disodique, poudre (EDTA.2Na) : FW 372,24- Dithiothreitol (DTT): 1 M- Glycérol: liquide 100% (v/v)- Sodium dodecyl sulfate (SDS): poudre- Tris base, poudre (tris(hydroxymethyl)aminomethane) : MW 121,14
Décrire précisément la procédure à suivre pour la préparation des solutions suivantes:
a) Préparez une solution de tampon acétate de sodium 0,2 M pH 5,2. b) Préparez exactement 150 ml du tampon acétate de sodium 50 mM, pH 5,2, EDTA 5 mM,
DTT 1 mM.c) Préparez exactement 50 ml du tampon Tris-HCl 25 mM pH 6,8, SDS 2% (p/v), glycérol
10% (v/v), DTT 100 mM.
18
RÉFÉRENCES
MONOGRAPHIES UTILES (LIVRES)
1. Voet D. et Voet J.G. 1998. Biochimie (2e édition). DeBoeck. Paris. 1361pp.
2. Voet D. et Voet J.G. 2005. Biochimie (3e édition). DeBoeck. Bruxelles. 1583 pp.
3. Pelmont J. 1995. Enzymes – Catalyseurs du monde vivant (2e édition). Presses Universitaires Grenoble. Grenoble. 1040pp.
4. Methods in enzymology. 1990. Guide to protein purification. Ed. Deutscher M.P. Academic Press Inc. San Diego. Vol. 182 : 1-495.
5. Dey P.M. and Harborne J.B. 1997. Plant biochemistry. Academic Press. San Diego. p24-30.
6. Lehninger A.L. (1975) Biochemistry. Worth Publishers Inc. New York. 1104pp.
7. Segel, I.H. 1976. Biochemical calculations: how to solve mathematical problems in general biochemistry (2nd edition). John Wiley and Sons. New York. 441 p.
8. Bilodeau C. Houde M. et Chevrier N. Recueil d’exercice de biochimie. 1999. UQAM. Montréal. 103 pp.
ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE
1. Chrambach, A. and Rodbard D. 1971. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science 172: 440-451.
2. Garfin, D.E. 1990. One dimensional Gel Electrophoresis. Methods in Enzymology 182: 425-441.
3. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature 227: 680-685.
4. Rosenberg, I.M. 1996. Protein analysis and purification. Benchtop Techniques. Birkhaüser. Boston. 433 pp.
5. Weber, K and Osborn M. 1969. The reliability of MW determinations by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 244: 4406-4412.
19
GRADIENT DE GLYCÉROL
1. Tso, M.Y.W. 1974. Some properties of the nitrogenase proteins from Clostridium pasteurianum. Molecular weight, subunit structure, isolectric point and EPR spectra. Arch. Microbiol. 99: 71-80.
2. Van Humbeeck C., Waelkens, E., Corti O., Brice A, and Vandenberghe W. 2008. Parkin occurs in a stable, non-covalent, _110-kDa complex in brain. Eur. J. Neurosci. 27: 284–293.
3. Park K.S., Kim J.A. and Chai K.J. (2000) Molecular assembly of mitogen-activated protein kinase module in ras-transformed NIH3T3 cell line. Exp. Mol. Med. 32: 120-126.
4. Yu G., Chen F., Levesque G., Nishimura M., Zhang D.M., Levesque L., Rogaeva E., Xu D., Liang Y., Duthie M., St George -Hyslop P.H. and Fraser P.E. 1998. The presenilin 1 protein is a component of a high molecular weight intracellular complex that contains b-catenin. J. Biol. Chem. 273: 16470–16475.
PHOSPHATASE ACIDE
1. Biswas T.K., Promo M. and Biswas B. 1996. Purification of acid phosphatase I from germinating seeds of Vigna sinensis. Phytochemistry 41: 1457-1458.
2. Del Pozo J.C., Allona I., Rubio V., Leyva A., De la Pena A., Aragoncillo C. and Paz-Ares J. 1999. A type 5 acid phosphatase gene grom Arabidopsis thaliana is induced by phosphate starvation and by some other types of phosphate mobilising/oxidative stress conditions. Plant J. 19: 579-589.
3. Duff M.G., Sarath G. and Plaxton W.C. 1994. The role of acid phosphatases in plant phosphorus metabolism. Physiol. Plant. 90: 791-800.
4. Ferreira C.V., Granjeiro J.M., Taga E.M. and Aoyama H. 1998. Soybean seed acid phosphatases: unusual optimum temperature and thermal stability studies. Biochem. Biophys. Res. Com. 242: 282-286.
5. Ferreira C.V., Taga E.M. and Aoyama H. 1999. Glycolytic intermediates as substrates of soybean acid phosphatase isoforms. Plant Sci. 147: 49-54.
6. Gellatly K.S., Moorhead G.B.G., Duff S.M.G., Lefebre D.D. and Plaxton W.C. 1994. Purification and characterization of a potato tuber acid phosphatase having significant phosphotyrosine phosphatase activity. Plant Physiol. 106: 223-232.
7. Gonnety J.T., Niamké S., Meuwiah Faulet B., Kouadio N.E.J.P., and Kouamé L.P. 2006. Purification and characterization of three low molecular-weight acid phosphatases from peanut (Arachis hypogaea) seedlings Afr. J. Biotechnol. 5: 35-44.
8. Greiner R., and Jany K.D. 2003. Purification and characterization of homogeneous acid phosphatase from nongerminated buckwheat (Fagopyrum esculentum) seeds J. Food Biochem. 27: 197-220.
20
9.. Granjeiro P.A., Ferreira C.V., Granjeiro J.M., Taga E.M. and Aoyama H. 1999. Purification and kinetic properties of a castor bean seed acid phosphatase containing sulfhydryl groups. Physiol. Plant. 107: 151-158.
10. Kouadio N.E.J.P., Niamké S., Kouamé L.P., Dabonné S., and Kamenan A. 2006. Purification et caractérisation de deux phosphatases acides du tubercule de taro (Xanthosoma sp.) et leur rôle dans la conservation post-récolte Biotechnol. Agron. Soc. Environ.10: 83-91.
11. Luan S. 2003. Protein phosphatases in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 54: 63-92.
12. Olczak M., Watorek W., and Morawecka B. 1997. Purification and characterization of acid phosphatase from yellow lupin (Lupinus luteus) seeds. Biochem. Biophys. Acta 1341: 14-25.
13. Roknabadi S.M., Bose S.K. and Tanya V. 1999. A histidine thiol 100 kDa, tetrameric acid phosphatase from lentil, Lens esculenta, seeds with the characteristics of protein tyrosine phosphatase. Biochem. Biophys. Acta 1433: 272-280.
14. Smith R.D. and Walker J.C. 1996. Plant protein phosphatases. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 101-125.
15. Tso S.C. and Chen Y.R. 1997. Isolation and characterization of a group III isozyme of acid phosphatase from rice plants. Bot. Bull. Acad. Sin. 38: 245-250.
21
PLAN DE RÉDACTION DU RAPPORT DE LABORATOIRE
Le rapport vaut 50% de la note finale. La pondération suivante est calculée sur 100: Résumé 5%; Introduction 10%; Résultats 10%; Discussion 25%, Matériel et Méthodes 10%; Références 5%; Légende, figures et tableaux 20%; Exemples de calculs 5%; Forme (présentation, syntaxe, ortographe, langage scientifique) incluant le cahier de laboratoire 10%. Le modèle de rédaction doit suivre celui qui est requis pour la soumission de manuscrits à la revue Plant Physiology (voir p. 24-27).
1. Page 1: Titre abrégé (maximum 60 caractères et espaces), nom et adresse professionnelle des auteurs ainsi que les coordonnées pour être rejoint (téléphone, fax, courriel). À l'exception de la page titre, numérotez toutes les pages (comptez la page titre).
2. Page 2: Titre complet, nom des auteurs et adresse de l'institution.
3. Page 3: Résumé Maximum 200 mots. Les objectifs principaux, les méthodes et résultats principaux obtenus (purification et caractérisation) doivent être présentés pour F1 et Fx. Porter une attention aux unités utilisées. Les points nouveaux par rapport à la littérature sont intéressants à souligner.
4. Page 4 et suivantes.
- Introduction. Maximum 5 pages à double interligne. Une revue de littérature sur le rôle et les propriétés des phosphatases soulignant leur diversité, ressemblances, etc. Une recherche de la littérature récente est importante (ne pas se limiter aux références fournies avec le protocole).
- Résultats. Pas de limite de pages. Des titres et sous-titres sont utiles dans cette section ex: purification de la…, détermination du pH optimal, etc.). Uniquement le texte est présenté dans cette section. Il faut citer tous les tableaux et toutes les figures dans le corps du texte de la section résultats. Les étapes chromatographiques sont à expliquer et à présenter en figures principales (pas en annexe). Tous les éléments importants doivent être inclus dans les figures (Ex: D.O. lors du chargement, des lavages, moment où l'échantillon est ajouté, début et fin des gradients, valeur d'activité enzymatique et unités utilisées, etc.).
- Discussion. Maximum 10 pages.
- Matériel et méthodes. Voir exemples de présentation dans les divers articles fournis. Il ne s'agit pas ici de répéter le format utilisé pour élaborer votre protocole de laboratoire mais de fournir les informations essentielles pour permettre à d'autres personnes expérimentées de pouvoir répéter vos expériences. Utilisez des titres pour chaque méthode. Pour des méthodes très connues (ex. Lowry), vous pouvez référer aux articles publiés. Maximum 5 pages.
- Littérature citée. En ordre alphabétique. Faites attention de respecter le format demandé par la revue Plant Physiology (ponctuation, type de caractères, abréviation du journal, etc.).
22
- Tableaux. Pour chaque tableau, il faut indiquer le titre et la légende sur la même page.
- Légendes des figures. Cette section comprend seulement le texte des titres et légendes des figures.
- Figures (chaque figure sur une page séparée sauf pour les figures composées (A, B, etc.) qui rapportent des données pouvant être présentées ensemble). Il faut indiquer seulement « Figure 1 », « Figure 2 », etc. sous chacune des figures.
- Annexes.
- Les courbes standards sont présentées ici sous forme de figures avec des légendes sur des pages séparées (même style que pour les résultats). Certains résultats non présentés dans la section résultats, mais qui peuvent servir aux exemples de calculs, peuvent être ajoutés ici.
- Exemples de calculs. Inclure des titres. Chacune des données utilisées doit provenir de résultats réels auxquels vous devez vous référer précisément, soit à votre cahier de laboratoire (no. de page) ou à une des figures ou tableaux présentés dans le rapport (ex: ordonnée à l'origine pour le calcul du Km apparent lors du calcul des Ki; la valeur doit être indiquée sur le graphique).
Des exemples de calculs doivent être fournis pour:- dosage des protéines- dosage de l'activité enzymatique- calcul de l'activité spécifique- calcul du facteur de purification- calcul du rendement- calcul du coefficient de dénaturation thermique- calcul de l'énergie d'activation par la méthode d'Arrhenius et/ou par la méthode
non graphique (Vmax à 2 températures, Segel 1976) selon les résultats obtenus- calcul du Km- calcul de I50
- calcul du Vmax (en U/mg de protéines) Un tableau doit montrer les données brutes (DO d'activité) et les facteurs utilisés (expliqué un à un) pour obtenir les valeurs finales en U/mg de protéine.
- calcul du Ki pour un inhibiteur compétitif- calcul du Ki pour un 2e inhibiteur de type différent.
23
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Plant Physiology 2009
ORGANIZATION
Submit manuscript with elements arranged in the following order, numbering all pages consecutively. All material should be 1.5-spaced. Font: Times New Roman, Courier New, Arial. (Other fonts may cause conversion problems).
1. Page 1: Running head not to exceed 60 characters and spaces; name, address, telephone number, and e-mail address of author to whom all correspondence should be sent (please note that the Journal will cite only one corresponding author per article); and journal research area most appropriate for the paper (categories are listed above).
2. Page 2: Title of article; all authors' full names (necessary for accurate indexing and abstracting); institution address(es).
3. Page 3: Footnotes in the following order: financial source (if any) and the experiment station or institution paper number; present address(es) of authors if different from heading; corresponding author with e-mail address.
4. Page 4: Abstract (include genus and species). Abstracts cannot exceed 250 words or the processing of the paper will be delayed.
5. Page 5 and subsequent pages: Text (the "introduction" should not exceed 10,000 characters), Results, Discussion, Conclusion, and Materials and Methods; Acknowledgments (do not use the space to supply financial source).
6. Literature Cited. (Authors are responsible for accuracy in citations. Citations will be copyedited for format only.)
7. Figure legends.
8. Tables with brief and concise titles and legends (one table per page).
9. Original figures (one figure per page). See FIGURE PREPARATION.
TEXT REQUIREMENTS
Style and format. Manuscripts should be written in simple declarative sentences and must conform to accepted standards of English style and usage. Consult recent issues for style and placement of main headings, subheadings, and paragraph headings and for other details of format.
Nomenclature. In the abstract, at first mention in the text, and in "Materials and Methods," include complete botanical names (genus, species, and, when appropriate, cultivar) for all experimental plants. Do NOT use the genus name alone, unless that is the accepted common name. Identify algae and microorganisms by a collection number or that of a comparable listing. Following first mentions, generic names should be abbreviated to the initial, except when confusion could arise by reference to genera with the same initial. Common names can be used after first mention. When the genus name is the accepted common name, the name should be in lowercase, roman type. Arabidopsis (no italics) is an accepted common name for A. thaliana.
Abbreviations. Do not abbreviate words or measures in the title other than those standard for international usage. Chemical symbols can be used in the title, but spell out chemical elements. Units of measure can be abbreviated in the abstract. Please click on the following link for a list of abbreviations that can be used in the remainder of the text and the running head: List of Abbreviations. Introduce all other abbreviations parenthetically following the term both in the abstract (if used three times) and at first use of the term in the text.
24
Abbreviations must be used three times in the text (this includes table and figure legends) or the term must be spelled out.
Units of measure. The metric system is standard, and SI units must be used as much as possible. Use negative exponents to indicate units in the denominator when three or more units are used (e.g., µmol m-2 s-1
rather than µmol/m2/s).
Numbers and fractions. Write out numerals one through nine, except when used with units of measure. Write out all numbers or fractions that begin a sentence, or rephrase the sentence to avoid beginning with a numeral. Use the preposition "to" between numerals (do not use a dash): e.g., "13 to 22 min" and "3°C to 10°C." Exceptions: in tables, figures, graphs, legends, and within parentheses in the text, dashes are used. Decimals are preferred over fractions; however, when simple fractions are used, write them out as a hyphenated unit: "two-thirds."
Statistical treatment. When appropriate, include statistical analysis. Define all statistical measures and models clearly. Identify the number of independent replications of experimental treatments and the number of times individual experiments were duplicated.
Solutions. Describe solutions of common acids and bases in terms of normality (N), e.g., 1 N NaOH, and those of salts in terms of molarity (M). Express fractional concentrations by decimals: 0.1 N acetic acid (not N/10 acetic acid). Define % as (w/w), (w/v), or (v/v); 10% (w/v) signifies 10 g/100 mL. Express concentrations as micrograms per gram (µg g-1) or micrograms per milliliter (µg mL-1) rather than as parts per million (ppm).
Ions. Represent ions as follows: Na+, Mn3+, Br-, PO43-.
Molecular weight and mass. Two equivalent expressions should be distinguished: "molecular weight" (Mr) is the ratio of the mass of a molecule to 1/12 of the mass of carbon 12 and is, therefore, dimensionless. "Molecular mass" (the mass of one molecule of a substance) is not a ratio and can be expressed in daltons (D). Say "the molecular mass of X is 20,000 daltons" (20 kD) or "the molecular weight (Mr) is 20,000," but do not express Mr in daltons. Expressions such as "the 20-kD peptide" and "the mass of a band on a gel is 240 kD" are acceptable for an entity that is not a definable molecule.
Trade names and suppliers. Whenever possible, use the generic name of equipment, chemicals, or other things used in research, followed by the trade name (capitalized) in parentheses with the name and location of the manufacturer. Avoid the use of trade names and code numbers of experimental chemical compounds used in research; rather, identify such compounds by common name (American Standards Association) if such a name exists, or by chemical name and structural formula.
Materials and methods. This section should reference all standard procedures but must be complete enough so that results can be verified by other laboratories.
For reports of experiments in which growth rooms were used to simulate the natural environment, growth room conditions must be described according to the guidelines in Scientific Style and Format, Council of Biology Editors, 1994, 6th Ed., pp.434–436. The following information must be provided:
For plants grown under controlled or semi-controlled growth chamber conditions, the primary parameters needed are the timing and levels of illumination (e.g., 16/8 hr photoperiod at 200 µmol m-2 s-
1) and the temperature(s) at which the plants were grown.
For plants grown in greenhouses, the major items needed are (1) the time of year that the plants were grown, (2) whether any supplemental lighting was provided and, if so, its nature, and (3) details of any temperature control.
For both chamber and greenhouse conditions, the application of any fertilization regime, if present, should also be given.
Literature cited. Cite all references in text by last names and year of publication. Grouped text citations should be arranged from the earliest to most recent year, alphabetized by name within the same year. For entries in
25
"Literature Cited," alphabetize by first author's last name and follow the styles below exactly for capitalization, punctuation, and order of elements. The accuracy in the "Literature Cited" section is the responsibility of the authors. The Journal will only proofread references for format. Any mistakes in reference formats may affect the conversion of html references.
Journal articles: Author AB, Author BB (1977) Title of article. Plant Physiol 59: 45–59
Book articles: Author AB, Author BB, Author CC (1974) Title of article. In A Smith, B Jones, eds, Title of Book, Ed 2 Vol 3. Publisher, City, pp 14–19
Theses: Author BC (1974) Title of thesis. PhD thesis. University, City
Online: Author A (year of publication) Title. Source Title, http://www.utopia.com/talent/lpb/muddex/essay
Patent: Author B, Author BC, inventors. January 1, 1997. Endogenous nonstarch polysaccharide hydrolyzing enzymes. European Patent Application No. XXX
No Authors or Editors: Title of Booklet, Pamphlet, etc. (1975) Publisher (or Company), City
If you are citing an article that only exists as an early online version, including the PubMed ID (PMID) number will allow reviewers to link directly to the article. At the bottom of the PubMed record for the article, you will find the PMID number which you should include in the reference as follows:
Author AB, Author BB (2006) Title of article. PMID: 16723506
Write out in full all one-word journal titles. Use the BIOSIS List of Serials for abbreviations of multiple-word journal titles; write out in full the names of journals not listed there. Unpublished data (submitted articles and articles in preparation) and personal communications are not acceptable as literature citations, so they must be referred to parenthetically in the text. Please include initials and last names of all authors. Articles that are "in press" may be so designated in "Literature Cited." Note: An article may be referred to as "in press" only if it has been accepted for publication; cite the journal in which the article will appear. For personal communications, it is the corresponding author's responsibility to ensure that those cited are aware of the citation and have approved the content of the personal communication.
TABLES
1. Number tables consecutively with Roman numerals.
2. First mention of tables in the text must be in sequential order.
3. Provide each table with a short, concise title followed by a legend that will make the general meaning of the table comprehensible without reference to the text.
4. Provide a descriptive heading for each column.
5. Do not separate data within the body of the table with new column headings or data. Do not arrange tables in sections labeled as, e.g., A or B. Instead, create another table to express data unconnected to or separate from that already presented. Authors will be contacted and asked to supply a new table if submitted in this form.
6. Use superscript lowercase letters to indicate footnotes. Asterisks or other symbols should not be used in place of the letters and will be changed accordingly.
7. For all submitted tables, please use Word's "create table" feature, with no tabbed text or tables created with spaces and drawn lines.
8. Do not use color, shading, or graphics in tables.
Numerals. Check both tabular data and numerical values reported in the text for the proper number of significant figures. For decimals smaller than one, insert a zero before the decimal point: 0.349.
26
Powers. To avoid numbers with many digits, express such numbers as powers of 10. The unit may be changed by the use of prefixes such as "m" or "µ." For example: enter "5" to express a g value of 0.005 under the heading g × 10-3 or a g value of 5,000 under the heading g × 103; conversely, express a concentration of 0.0015 M as 1.5 under the heading "concn (mM)."
FIGURE PREPARATION
Figure preparation. Number figures consecutively according to the order in which they are called out in the text. Manuscripts submitted with substandard figures will be delayed. To assist the editors and reviewers, please also include the figure number in the figure image itself. Figures should be unambiguous and as conceptual as possible and provide enough information so that the reader can understand them without significant input from the text. For those figures that contain more than one panel, designate the panels with capital letters (no parentheses and no periods following letters) in the upper left-hand corner. Whenever possible, position panels vertically for one-column reproduction in the journal. For the best possible reproduction of gel blots, submit combination figures in which the labels and photographs or autoradiographs are composite images. Format the width of sequence data in the paper to one column.
27
RESPECT DE L'INTÉGRITÉ ACADÉMIQUE
Face à l’importance et à l’ampleur du phénomène de la tricherie et du plagiat dans les universités, ici et à l’étranger, l’UQAM a amorcé, en janvier 2007, une démarche visant à promouvoir le respect de l’intégrité académique. Dans ce contexte et inspirée d’une philosophie de « tolérance zéro », la Commission des études de l’UQAM a modifié son Règlement sur les infractions de nature académique (R. 18) à sa réunion du 2 décembre 2008. Endossant cette philosophie de « tolérance zéro » relativement aux actes de plagiat, de fraude et de tricherie, la Faculté des sciences de l’UQAM souhaite sensibiliser ses étudiants à l’importance du respect de l’intégrité académique. Puisqu’en sollicitant son admission à l’UQAM, toute candidate, tout candidat s’engage à suivre les politiques et règlements de l’Université, la Faculté souhaite informer ses étudiants des différents articles de ce règlement, des actes répréhensibles et des sanctions applicables. Un extrait de ces articles se trouve ci-dessous. Le Règlement complet et son application à la Faculté des sciences sont disponibles à l’adresse Web suivante : http://www.sciences.uqam.ca/decanat/reglements.phpTous ces efforts visent à assurer la validité de la formation dispensée par la Faculté, ainsi qu’un traitement équitable de tous afin de maintenir la qualité de ses diplômes.
Article 2 - Infractions de nature académique Article 3 - Sanctions2.1 InfractionTout acte de plagiat, fraude, copiage, tricherie, falsification de document ou création d’un faux document commis par une candidate, un candidat, une étudiante, un étudiant de même que toute participation à ces actes ou tentative de les commettre, à l'occasion d'un examen, d'un travail ou d’un stage faisant l'objet d'une évaluation ou dans toute autre circonstance, constitue une infraction au sens de ce règlement.2.2 Liste non limitative des infractionsSans limiter la généralité de ce qui précède, constitue notamment une infraction le fait de poser ou tenter de poser l'un des actes suivants ou le fait d'y participer :a) la substitution de personnes ou l’usurpation d’identité;b) le plagiat : l'utilisation totale ou partielle du texte ou de la production
d'autrui en le faisant passer pour sien ou sans indication de référence;
c) l'autoplagiat : le dépôt d'un travail pour fins d'évaluation alors que ce travail constitue essentiellement un travail qui a déjà été soumis pour fins d'évaluation académique à l'Université ou dans une autre institution d'enseignement, sauf avec l'accord préalable de l'enseignante, l'enseignant;
d) la possession ou l'obtention par vol, manœuvre ou corruption de questions ou de réponses d'examen;
e) la possession ou l'utilisation de tout document ou matériel non autorisé préalablement, pendant un examen ou lors de la réalisation de travaux, incluant le recours aux outils informatiques ou moyens technologiques;
f) l'utilisation pendant un examen de la copie d'examen ou de tout autre matériel provenant d'une autre personne;
g) l'obtention de toute aide non autorisée, qu'elle soit collective ou individuelle;
h) l'obtention d'une évaluation non méritée notamment par corruption, chantage, intimidation ou toute forme de harcèlement ou la tentative d'obtenir une telle évaluation;
i) la falsification d'un document ou la création d’un faux document, notamment d'un document transmis à l'Université ou d'un document de l'Université transmis ou non à une tierce personne, quelles que soient les circonstances;
j) la falsification de données de recherche dans un travail, notamment une thèse, un mémoire, un mémoire-création, un rapport de stage ou un rapport de recherche.
3.1 L’attribution de la mention «P»L'étudiante, l'étudiant qui commet une infraction est mis en probation et peut se voir imposer une ou plusieurs sanctions. La mise en probation génère l’attribution de la mention «P» au dossier informatisé de l’étudiant, de l’étudiante. La mention «P» n'apparaît pas au relevé de notes de l'étudiante, l'étudiant mais figure en tout temps à son dossier.Lorsque la sanction est la suspension, une mention à cet effet apparaîtra au relevé de notes pour la durée de la suspension. Dans le cas d’une expulsion définitive de l’Université, une mention à cet effet apparaîtra de manière permanente au relevé de notes.
3.2 La mise en probation et autres sanctionsa) la mise en probation;
La mise en probation constitue la reconnaissance que l'étudiante, l'étudiant a commis une infraction au présent règlement.La mise en probation peut être imposée sans autre sanction, auquel cas, l'enseignant, l'enseignante se voit inviter à attribuer une notation à l'étudiante, l'étudiant pour le cours conformément au résultat obtenu pour les prestations complétées. La mise en probation sans autre sanction signifie que la mention «P» est inscrite au dossier de l'étudiante, l'étudiant et que celle, celui qui en est l'objet ne doit commettre aucune autre infraction au présent règlement, à défaut de quoi, l'une ou l'autre des sanctions suivantes lui sera imposée. Outre la mise en probation, l’étudiante, l'étudiant peut se voir imposer une ou plusieurs des sanctions suivantes :
b) l'échec au cours ou à l'activité créditée;c) l'obligation de réussir de trois à six crédits additionnels,
hors programme, afin d'obtenir son grade, diplôme, certificat ou attestation; les cours doivent être identifiés;
d) la suspension de toute activité à l'Université, pour une période maximale de neuf trimestres consécutifs;
e) son expulsion définitive de l'Université.
28
