Atelier Paludisme 2007

Outils molOutils molculaires disponibles culaires disponibles pour surveiller la rpour surveiller la rsistance aux sistance aux antipaludiquesantipaludiques

Claude GIRYCentre Hospitalier de Mayotte

EVALUATION

par les FACILITATEURS

Atelier Paludisme 2007

Problmatique La rsistance aux antimalariques repose sur 3 mcanismes :

Mutations ponctuelles Amplification gnique Activit transcriptionnelle

A chaque mcanisme correspond un ou plusieurs gnes dont laltration est associe une rsistance mdicamenteuse

Chaque mcanisme fait lobjet dtudes ralises au moyen doutils molculaires

Applications Surveiller le dveloppement des souches rsistantes Discriminer un chec thrapeutique dune rinfection

Atelier Paludisme 2007

Mutations ponctuelles

Y268S/Ncyt bAtovaquone

Codon sauvage N86 Nb copies gne mdr1 > 1

mdr 1Mefloquine, Quinine, Halofanthrine, Lumefantrine

N86Y, Y184F, S1034C, N1042D, D1246Ymdr 1

C72S, M74I, N75D/E, K76T, A220S, Q271E

crtChloroquine

A16V, S108Tou N51I, C59R, S108N, I164L

dhfrProguanil, Chlorproguanil

N51I, C59R, S108N, I164L ou C50R, N51I, S108N, I164L

dhfrPyrimthamine, Trimethoprim

S436A/F, A437G, K540E, A581G,A613S/T

dhpsSulfadoxine, Dapsone

Remplacement acide aminRemplacement acide amin induit par induit par une mutation ponctuelleune mutation ponctuelle

GGne ne ciblcibl

AntipaludiqueAntipaludique

Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCR en temps finalPCR en temps final

Principe dune raction de PCR

AS PCR RFLP PCR

SSOPDIG PCR ELISA

Alifrangis et al. (2005). Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); pp. 155162

NZILA-MOUNDA, A. et al.(Jan. 1998). AntimicrobialAgents and Chemotherapy. p. 164-169

DURAISINGH, M.T. et al. (1998).Exp Parasitol. 89;1-8

Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCR en temps rPCR en temps relel

Principe SYBR Green I

Sondes dhydrolyse Taqman Sondes dhybridation

Mutations ponctuellesMutations ponctuellesSSquenquenageage

Pyrosquenage Squenage direct

Zhou et al. (2006). J Clin Microbiol. 44(11); p 39003910.

Pyrosequencing, a High-Throughput Methodfor Detecting Single NucleotidePolymorphisms in the DihydrofolateReductase and Dihydropteroate SynthetaseGenes of Plasmodium falciparum

2.28 USDPyrosquenage

3.66 USDSquenage direct

6.58 USDRFLP

Cot/chantillon/SNP

Mutations ponctuellesMutations ponctuellesDNA ChipsDNA Chips

BRYANT et al. (2004). Lancet Infect Dis 2004; 4: 100111

Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCRPCR--RFLP RFLP PfPf. DHPS K540E. DHPS K540E

M

ndd

Daprs Mbugi et al. (2006). Malaria Journal, 5:94. p 1-11

Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCR temps rPCR temps rel el PfPf. DHFR S108N. DHFR S108N

Thermocycleurtemps rel

(TaqMan 48 Roche)

Extracteur dacides nucliques (MagNA Pure

Compact Roche)

Laboratoire de biologie Centre Hospitalier de Mayotte Daprs une adaptation du protocole de Alker et al. (2004). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 29242929

Amplification gAmplification gniqueniquePCR temps rPCR temps rel el -- PfPfmdrmdr--11

SYBR Green I / Taqman Gnes de rfrence prsents 1

ou plusieurs copie(s) Souche Pf. tester vs. souche Pf.

contrle Mthode du CT

Nb de copies relatif= 2CT=2 ( (CTER-CTEC)-(CTBR-CTBC) )

R: gne de rfrence C: gne cible E: souche tester B: souche de rfrence

Exemple: Price et al. (2004). Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum andincreased pfmdr1 gene copy number . Lancet. 364; p 438-47

Illustration: C. GIRY Centre Hospitalier de Mayotte

Atelier Paludisme 2007

ActivitActivit transcriptionnelletranscriptionnellePCR temps rPCR temps rel el -- PfPfmdrmdr--11

Quantification relative SYBR Green I Gnes de rfrence

(housekeeping genes) dont lexpression nest pas affecte par lantipaludique.

Mthode du CT

Echantillon

Extraction dARN

DNase I

Purification ARNm

cDNA synthesis

Random priming

OligodT priming

Sp. primer priming

Real time PCR

Real time PCR

1-step qRT-PCR

2-step qRT-PCR

Stratgie

Optimisation Volume dchantillon dNTPs, Mg2+ / Mn2+ Concentration en primers tet temps dannealing/extension Efficacit de lamplification

Atelier Paludisme 2007

Applications (I)Applications (I)Surveillance de la propagation des rSurveillance de la propagation des rsistancessistances

Chloroquine Pyrimthamine Sulfadoxine

Daprs Jelinek et al.(2002). Malaria Journal. I:II; p 1-7

Atelier Paludisme 2007

Applications (II)Applications (II)Discriminer rDiscriminer rinfection infection vs.vs. recrudescencerecrudescence

Recrudescence tmoigne dun chec thrapeutique prcoce ou tardif

Utilisation de marqueurs polymorphiquesMsp1, Msp2, GlurpMicrosatellites

Atelier Paludisme 2007

ConclusionsPerspectives

QuantificationdARNm

PCRTEMPSREEL

Amplificationgnique

GnotypageRFLP Squenage

DltionVariants dpissage

Dtection / Quantification absolue de pathognes

TranslocationRarrangement

Rfrences ALIFRANGIS, M. et al. (2005). A Simple, High-Throughput Method to Detect Plasmodium

falciparum Single Nnucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase, DihydropteroateSynthase, and P. Falciparum Chloroquine Resistance Transporter Genes Using Polymerase Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Technology . Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); p. 155162

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