Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

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Atelier Paludisme 2007 Outils mol Outils mol é é culaires disponibles culaires disponibles pour surveiller la r pour surveiller la r é é sistance aux sistance aux antipaludiques antipaludiques Claude GIRY Centre Hospitalier de Mayotte EVALUATION par les FACILITATEURS

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Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques - Présentation de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Claude GIRY - Biologiste - Centre Hospitalier - Mamoudzou, Mayotte - [email protected]

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  • Atelier Paludisme 2007

    Outils molOutils molculaires disponibles culaires disponibles pour surveiller la rpour surveiller la rsistance aux sistance aux antipaludiquesantipaludiques

    Claude GIRYCentre Hospitalier de Mayotte

    EVALUATION

    par les FACILITATEURS

  • Atelier Paludisme 2007

    Problmatique La rsistance aux antimalariques repose sur 3 mcanismes :

    Mutations ponctuelles Amplification gnique Activit transcriptionnelle

    A chaque mcanisme correspond un ou plusieurs gnes dont laltration est associe une rsistance mdicamenteuse

    Chaque mcanisme fait lobjet dtudes ralises au moyen doutils molculaires

    Applications Surveiller le dveloppement des souches rsistantes Discriminer un chec thrapeutique dune rinfection

  • Atelier Paludisme 2007

    Mutations ponctuelles

    Y268S/Ncyt bAtovaquone

    Codon sauvage N86 Nb copies gne mdr1 > 1

    mdr 1Mefloquine, Quinine, Halofanthrine, Lumefantrine

    N86Y, Y184F, S1034C, N1042D, D1246Ymdr 1

    C72S, M74I, N75D/E, K76T, A220S, Q271E

    crtChloroquine

    A16V, S108Tou N51I, C59R, S108N, I164L

    dhfrProguanil, Chlorproguanil

    N51I, C59R, S108N, I164L ou C50R, N51I, S108N, I164L

    dhfrPyrimthamine, Trimethoprim

    S436A/F, A437G, K540E, A581G,A613S/T

    dhpsSulfadoxine, Dapsone

    Remplacement acide aminRemplacement acide amin induit par induit par une mutation ponctuelleune mutation ponctuelle

    GGne ne ciblcibl

    AntipaludiqueAntipaludique

  • Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCR en temps finalPCR en temps final

    Principe dune raction de PCR

    AS PCR RFLP PCR

    SSOPDIG PCR ELISA

    Alifrangis et al. (2005). Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); pp. 155162

    NZILA-MOUNDA, A. et al.(Jan. 1998). AntimicrobialAgents and Chemotherapy. p. 164-169

    DURAISINGH, M.T. et al. (1998).Exp Parasitol. 89;1-8

  • Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCR en temps rPCR en temps relel

    Principe SYBR Green I

    Sondes dhydrolyse Taqman Sondes dhybridation

  • Mutations ponctuellesMutations ponctuellesSSquenquenageage

    Pyrosquenage Squenage direct

    Zhou et al. (2006). J Clin Microbiol. 44(11); p 39003910.

    Pyrosequencing, a High-Throughput Methodfor Detecting Single NucleotidePolymorphisms in the DihydrofolateReductase and Dihydropteroate SynthetaseGenes of Plasmodium falciparum

    2.28 USDPyrosquenage

    3.66 USDSquenage direct

    6.58 USDRFLP

    Cot/chantillon/SNP

  • Mutations ponctuellesMutations ponctuellesDNA ChipsDNA Chips

    BRYANT et al. (2004). Lancet Infect Dis 2004; 4: 100111

  • Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCRPCR--RFLP RFLP PfPf. DHPS K540E. DHPS K540E

    M

    ndd

    Daprs Mbugi et al. (2006). Malaria Journal, 5:94. p 1-11

  • Mutations ponctuellesMutations ponctuellesPCR temps rPCR temps rel el PfPf. DHFR S108N. DHFR S108N

    Thermocycleurtemps rel

    (TaqMan 48 Roche)

    Extracteur dacides nucliques (MagNA Pure

    Compact Roche)

    Laboratoire de biologie Centre Hospitalier de Mayotte Daprs une adaptation du protocole de Alker et al. (2004). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 29242929

  • Amplification gAmplification gniqueniquePCR temps rPCR temps rel el -- PfPfmdrmdr--11

    SYBR Green I / Taqman Gnes de rfrence prsents 1

    ou plusieurs copie(s) Souche Pf. tester vs. souche Pf.

    contrle Mthode du CT

    Nb de copies relatif= 2CT=2 ( (CTER-CTEC)-(CTBR-CTBC) )

    R: gne de rfrence C: gne cible E: souche tester B: souche de rfrence

    Exemple: Price et al. (2004). Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum andincreased pfmdr1 gene copy number . Lancet. 364; p 438-47

    Illustration: C. GIRY Centre Hospitalier de Mayotte

  • Atelier Paludisme 2007

    ActivitActivit transcriptionnelletranscriptionnellePCR temps rPCR temps rel el -- PfPfmdrmdr--11

    Quantification relative SYBR Green I Gnes de rfrence

    (housekeeping genes) dont lexpression nest pas affecte par lantipaludique.

    Mthode du CT

    Echantillon

    Extraction dARN

    DNase I

    Purification ARNm

    cDNA synthesis

    Random priming

    OligodT priming

    Sp. primer priming

    Real time PCR

    Real time PCR

    1-step qRT-PCR

    2-step qRT-PCR

    Stratgie

    Optimisation Volume dchantillon dNTPs, Mg2+ / Mn2+ Concentration en primers tet temps dannealing/extension Efficacit de lamplification

  • Atelier Paludisme 2007

    Applications (I)Applications (I)Surveillance de la propagation des rSurveillance de la propagation des rsistancessistances

    Chloroquine Pyrimthamine Sulfadoxine

    Daprs Jelinek et al.(2002). Malaria Journal. I:II; p 1-7

  • Atelier Paludisme 2007

    Applications (II)Applications (II)Discriminer rDiscriminer rinfection infection vs.vs. recrudescencerecrudescence

    Recrudescence tmoigne dun chec thrapeutique prcoce ou tardif

    Utilisation de marqueurs polymorphiquesMsp1, Msp2, GlurpMicrosatellites

  • Atelier Paludisme 2007

    ConclusionsPerspectives

    QuantificationdARNm

    PCRTEMPSREEL

    Amplificationgnique

    GnotypageRFLP Squenage

    DltionVariants dpissage

    Dtection / Quantification absolue de pathognes

    TranslocationRarrangement

  • Rfrences ALIFRANGIS, M. et al. (2005). A Simple, High-Throughput Method to Detect Plasmodium

    falciparum Single Nnucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase, DihydropteroateSynthase, and P. Falciparum Chloroquine Resistance Transporter Genes Using Polymerase Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Technology . Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); p. 155162

    BERRY, A. et al. (2006). Prevalence of Plasmodium falciparum cytochromeb gene mutations in isolates imported from Africa, and implications for atovaquone resistance . Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 986-988

    DURAISINGH, M.T. et al. (2005). Contribution of the pfmdr1 gene to antimalarial drug-resistance . Acta Tropica. 94; p 181190

    HYDE, J.E. (2002). Mechanisms of resistance of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs . Microbes and Infection. 4; p165-174

    HYDE, J.E. (2005). Drug-resistant malaria . TRENDS in Parasitology. 21(11); p 494-498 JONES, P.M. et al. (2005). Multidrug resistance in parasites: ABC transporters, P-glycoproteins

    and molecular modelling . International Journal for Parasitology. 35 ; p 555566 LE BRAS, J. et al. (2006). Les rsistances aux mdicaments antipaludiques . Mdecine et

    maladies infectieuses. 36 ; 401405 MBUGI, E.V. et al. (2006). Drug resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in Plasmodium

    falciparum malaria in Mlimba, Tanzania. Malaria Journal. 5(94) ; p 1-11 PLOWE, C.V. (2003). Monitoring antimalarial drug resistance: making the most of the tools at

    hand . The Journal of Experimental Biology. 206; p 3745-3752 PRICE, R.N. et al. (2004). Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased

    pfmdr1 gene copy number .Lancet. 364; p 43847 RANDRIANARIVELOJOSIA M. et al. (2006). First evidence of pfcrt mutant Plasmodium

    falciparum in Madagascar . Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 826-830

    WILSON, P.E. et al. (2005). Real-time PCR methods for monitoring antimalarial drug resistance . TRENDS in Parasitology. 21(6); p 278-283

    WOODROW, C.J. et al.(2006). Antimalarial drugs: recent advances in molecular determinants of resistance and their clinical significance . Cell. Mol. Life Sci. 63 ; p 15861596

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