Download - Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Transcript
Page 1: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Atelier Paludisme 2007

Outils molOutils molééculaires disponibles culaires disponibles

pour surveiller la rpour surveiller la réésistance aux sistance aux

antipaludiquesantipaludiques

Claude GIRY

Centre Hospitalier de Mayotte

EVALUATION

par les FACILITATEURS

Page 2: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Atelier Paludisme 2007

Problématique

� La résistance aux antimalariques repose sur 3 mécanismes :

� Mutations ponctuelles

� Amplification génique

� Activité transcriptionnelle

� A chaque mécanisme correspond un ou plusieurs gènes dont l’altération est associée à une résistance médicamenteuse

� Chaque mécanisme fait l’objet d’études réalisées au moyen d’outils moléculaires

� Applications

� Surveiller le développement des souches résistantes

� Discriminer un échec thérapeutique d’une réinfection

Page 3: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Atelier Paludisme 2007

Mutations ponctuelles

Y268S/Ncyt bAtovaquone

Codon sauvage N86

� Nb copies gène mdr1 > 1

mdr 1Mefloquine, Quinine,

Halofanthrine, Lumefantrine

N86Y, Y184F, S1034C, N1042D, D1246Ymdr 1

C72S, M74I, N75D/E, K76T, A220S,

Q271E

crtChloroquine

A16V, S108T

ou N51I, C59R, S108N, I164L

dhfrProguanil, Chlorproguanil

N51I, C59R, S108N, I164L

ou C50R, N51I, S108N, I164L

dhfrPyriméthamine, Trimethoprim

S436A/F, A437G, K540E, A581G,

A613S/T

dhpsSulfadoxine, Dapsone

Remplacement acide aminRemplacement acide aminéé induit par induit par

une mutation ponctuelleune mutation ponctuelleGGèène ne

ciblciblééAntipaludiqueAntipaludique

Page 4: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Mutations ponctuellesMutations ponctuelles

PCR en temps finalPCR en temps final

� Principe d’une réaction de PCR

� AS PCR � RFLP PCR

� SSOPDIG PCR ELISA

Alifrangis et al. (2005). Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); pp. 155–162

NZILA-MOUNDA, A. et al.

(Jan. 1998). Antimicrobial

Agents and Chemotherapy.

p. 164-169

DURAISINGH, M.T. et al.

(1998).

Exp Parasitol. 89;1-8

Page 5: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Mutations ponctuellesMutations ponctuelles

PCR en temps rPCR en temps rééelel

� Principe � SYBR Green I

� Sondes d’hydrolyse Taqman � Sondes d’hybridation

Page 6: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Mutations ponctuellesMutations ponctuelles

SSééquenquenççageage

� Pyroséquençage� Séquençage direct

Zhou et al. (2006). J Clin Microbiol. 44(11); p 3900–3910.

Pyrosequencing, a High-Throughput Methodfor Detecting Single NucleotidePolymorphisms in the DihydrofolateReductase and Dihydropteroate SynthetaseGenes of Plasmodium falciparum

2.28 USDPyroséquençage

3.66 USDSéquençage

direct

6.58 USDRFLP

Coût

/échantillon/SNP

Page 7: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Mutations ponctuellesMutations ponctuelles

DNA ChipsDNA Chips

BRYANT et al. (2004). Lancet Infect Dis 2004; 4: 100–111

Page 8: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Mutations ponctuellesMutations ponctuelles

PCRPCR--RFLP RFLP PfPf. DHPS K540E. DHPS K540E

M

ndd

D’après Mbugi et al. (2006).

Malaria Journal, 5:94. p 1-11

Page 9: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Mutations ponctuellesMutations ponctuelles

PCR temps rPCR temps rééel el PfPf. DHFR S108N. DHFR S108N

Thermocycleur

temps réel

(TaqMan 48

Roche)

Extracteur d’acides

nucléiques (MagNA Pure

Compact Roche)

Laboratoire de biologie – Centre Hospitalier de Mayotte D’après une adaptation du protocole de Alker et al. (2004). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 2924–2929

Page 10: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Amplification gAmplification gééniquenique

PCR temps rPCR temps rééel el -- PfPfmdrmdr--11

� SYBR Green I / Taqman

� Gènes de référence présents à 1 ou plusieurs copie(s)

� Souche Pf. à tester vs. souche Pf. contrôle

� Méthode du ∆∆CT

� Nb de copies relatif

= 2−∆∆CT=2 −( (CTER-CTEC)-(CTBR-CTBC) )

� R: gène de référence

� C: gène cible

� E: souche à tester

� B: souche de référence

Exemple: Price et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and

increased pfmdr1 gene copy number ». Lancet. 364; p 438-47

Illustration: C. GIRY – Centre Hospitalier de Mayotte

Page 11: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Atelier Paludisme 2007

ActivitActivitéé transcriptionnelletranscriptionnelle

PCR temps rPCR temps rééel el -- PfPfmdrmdr--11

Quantification relative

� SYBR Green I

� Gènes de référence

(housekeeping genes) dont

l’expression n’est pas affectée par

l’antipaludique.

� Méthode du ∆∆CT

Echantillon

Extraction d’ARN

DNase I

Purification ARNm

cDNA synthesis

Random priming

OligodT priming

Sp. primer priming

Real time PCR

Real time PCR

1-step qRT-PCR

2-step qRT-PCR

Stratégie

Optimisation

� Volume d’échantillon

� dNTPs, Mg2+ / Mn2+

� Concentration en primers

� t°et temps d’annealing/extension

� Efficacité de l’amplification

Page 12: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Atelier Paludisme 2007

Applications (I)Applications (I)

Surveillance de la propagation des rSurveillance de la propagation des réésistancessistances

Chloroquine Pyriméthamine Sulfadoxine

D’après Jelinek et al.(2002). Malaria Journal. I:II; p 1-7

Page 13: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Atelier Paludisme 2007

Applications (II)Applications (II)

Discriminer rDiscriminer rééinfection infection vs.vs. recrudescencerecrudescence

� Recrudescence témoigne d’un échec thérapeutique précoce ou tardif

� Utilisation de marqueurs polymorphiques

�Msp1, Msp2, Glurp

�Microsatellites

Page 14: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Atelier Paludisme 2007

ConclusionsPerspectives

Quantification

d’ARNm

PCRTEMPSREEL

Amplification

génique

Génotypage

RFLP Séquençage

DélétionVariants d’épissage

Détection / Quantification absolue de pathogènes

Translocation

Réarrangement

Page 15: Outils moléculaires disponibles pour surveiller la résistance aux antipaludiques

Références� ALIFRANGIS, M. et al. (2005). « A Simple, High-Throughput Method to Detect Plasmodium

falciparum Single Nnucleotide Polymorphisms in the Dihydrofolate Reductase, DihydropteroateSynthase, and P. Falciparum Chloroquine Resistance Transporter Genes Using Polymerase Chain Reaction and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Technology ». Am. J. Trop. Med. Hyg. 72(2); p. 155–162

� BERRY, A. et al. (2006). « Prevalence of Plasmodium falciparum cytochromeb gene mutations in isolates imported from Africa, and implications for atovaquone resistance ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 986-988

� DURAISINGH, M.T. et al. (2005). « Contribution of the pfmdr1 gene to antimalarial drug-resistance ». Acta Tropica. 94; p 181–190

� HYDE, J.E. (2002). « Mechanisms of resistance of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs ». Microbes and Infection. 4; p165-174

� HYDE, J.E. (2005). « Drug-resistant malaria ». TRENDS in Parasitology. 21(11); p 494-498� JONES, P.M. et al. (2005). « Multidrug resistance in parasites: ABC transporters, P-glycoproteins

and molecular modelling ». International Journal for Parasitology. 35 ; p 555–566� LE BRAS, J. et al. (2006). « Les résistances aux médicaments antipaludiques ». Médecine et

maladies infectieuses. 36 ; 401–405� MBUGI, E.V. et al. (2006). « Drug resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in Plasmodium

falciparum malaria in Mlimba, Tanzania”. Malaria Journal. 5(94) ; p 1-11� PLOWE, C.V. (2003). « Monitoring antimalarial drug resistance: making the most of the tools at

hand ». The Journal of Experimental Biology. 206; p 3745-3752� PRICE, R.N. et al. (2004). « Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased

pfmdr1 gene copy number ».Lancet. 364; p 438–47� RANDRIANARIVELOJOSIA M. et al. (2006). « First evidence of pfcrt mutant Plasmodium

falciparum in Madagascar ». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 100; p 826-830

� WILSON, P.E. et al. (2005). « Real-time PCR methods for monitoring antimalarial drug resistance ». TRENDS in Parasitology. 21(6); p 278-283

� WOODROW, C.J. et al.(2006). « Antimalarial drugs: recent advances in molecular determinants of resistance and their clinical significance ». Cell. Mol. Life Sci. 63 ; p 1586–1596

Merci de votre attentionMerci de votre attention