Biologie Moleculaire-2017 1 http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/moleculaire/accueil.htm

Biologie Moleculaire-2017 2

DIRECTIVES GÉNÉRALES

1. La présence dans le laboratoire est obligatoire. S'il vous plaît, être à l'heure.

2. Des chaussures et vêtements appropriés doivent être portés en tout temps.

3. Laisser vos vêtements d'extérieur, sacs à dos, et toutes autres matières étrangères dans les

casiers à l'extérieur du laboratoire. Il est fortement recommandé que vous ayez un cadenas.

Nous ne sommes pas responsables pour les objets perdus ou volés.

4. Porter une blouse de laboratoire et des gants en tout temps quand vous travaillez dans le labo.

5. Enlever vos gants chaque fois que vous sortez du labo.

6. Enlever vos gants quand vous utilisez notre ou votre ordinateur.

7. Toujours placer les pipettes utilisées, les embouts, tubes de microcentrifuge et autres matériaux

dans les sacs biohazard fournis afin qu'ils puissent être éliminés de façon appropriée. Ne pas

jeter de déchets dans les sacs d'autoclaves.

8. Ne jamais se lécher les doigts, ou mettre vos doigts dans votre bouche.

9. Ne pas manger ou boire dans le laboratoire.

10. Pas de radios, lecteurs MP3, de lecteurs de CD dans le laboratoire.

11. Aucune utilisation des téléphones cellulaires ou des textos en laboratoire.

12. Aviser l'A.E. ou un instructeur de tout accident, même mineur.

13. Aviser l'A.E. ou un instructeur de tout bris ou malfonctionnement de l’équipement fourni.

Matériel que vous DEVEZ avoir pour travailler dans le laboratoire de microbiologie :

Une blouse de laboratoire

Un crayon-feutre à pointe fine permanent, de préférence noir, pour l'étiquetage.

Un cahier de notes pour enregistrer vos résultats. N'importe quel type est acceptable. Ne gaspillez

pas votre argent

Une clef A USB pour sauvegarder vos images

Une calculatrice. L’utilisation des calculatrices sur les cellulaires n’est pas permise.

Facultatif, mais fortement recommandé :

Aviser l'instructeur de tout problème médical de sorte que des accommodations appropriées

peuvent être prises. Par exemple, les allergies, le diabète, l'hypoglycémie, l'épilepsie, les blessures

apparentes, daltonisme, etc.

Aviser l'instructeur de tout besoin particulier dont vous pourriez avoir besoin de sorte que les

accommodations appropriées peuvent être prises. Par exemple, si vous écrivez vos examens avec

SASS.

Biologie Moleculaire-2017 3

Horaire

Introduction au labo de biologie moléculaire 11 janv.

Exercice 1 18 janv. Concentrations et dilutions

Isolation d’ADN plasmidique par lyse alcaline

Digestions par enzymes de restriction et électrophorèse sur gel d’agarose

Exercice 2 25 janv. Cartographie de restriction d’un plasmide recombinant

Isolation d’ADN plasmidique avec Qiagen

Digestions par enzymes de restriction

Électrophorèse sur gel d’agarose

Cartographie de restriction d’un gène de la levure – Analyse Southern

Isolation d’ADN génomique

Digestions par enzymes de restriction d’ADN génomique

Électrophorèse sur gel d’agarose

Exercice 3 1 févr. Mutagenèse dirigée et clonage de GFP

Amplification et mutagenèse de GFP par PCR

Purification des réactions de PCR avec Qiaquick

Digestion des amplicons de PCR de GFP et du vecteur pUC19

Ligature des amplicons de GFP

Exercice 4 8 févr. Mutagenèse et clonage de GFP - Analyse des transformations

Compte de colonies

PCR de colonies

Digestion par enzyme de restriction des produits de la PCR de colonies

EXAMEN DE MI-SESSION (Exercices 1-4) 15 févr.

SEMAINE D’ÉTUDE 19-25 févr.

Biologie Moleculaire-2017 4

Exercice 5 1 mars Expression génique - Transcription

Isolation d’ARN de levure

Électrophorèse d’ARN

Principes de la RT-PCR

Exercice 6 8 mars Contrôle transcriptionnel du gène CTT1 de la levure

RT-PCR

Analyse northern

Exercice 7 15 mars Empreintes génétiques

Isolation d’ADN génomique des cellules de joues

Amplification par PCR du VNTR ApoC2

Amplification par PCR du RFLP ApoB

Stringence – Profils de dénaturation d’ADN

Exercice 8 22 mars Expression protéique

Préparation d’extrait de protéines

Quantification des protéines - Essai Bradford

Électrophorèse sur gel des protéines

EXAMEN FINAL THÉORIQUE PÉRIODE D’EXAMENS FINAUX

Biologie Moleculaire-2017 5

Barème

Option I Option II

Quiz 5% + *Bonus 2% 5% + *Bonus 2%

Devoirs (X5) 15% 15%

Performance en labo 10% 10%

Mi-session 25% 15%

Final 45% 55%

Total 102% 102%

*Vous devez obtenir 100% sur au moins 4 des 8 quiz afin d’obtenir le boni

QUIZ

Chaque semaine, à partir de la semaine 2, il y aura un quiz disponible sur Blackboard le samedi

précédent la prochaine semaine de labo disponible de 9h-21h. Vous aurez 30 minutes pour

compléter le quiz. Ces quiz contribueront à 5% de votre note finale. De plus un bonus de 2% sera

ajouté sur la note finale de tout étudiant qui aura obtenu 100% sur au moins 4 des 8 quiz.

DEVOIRS

Devoirs recouvrant les procédures et les données générées ainsi que des exercices de

bioinformatiques associés. Les devoirs doivent être dactylographiés et peuvent être soumis

individuellement ou en groupe de deux (vous et votre coéquipier). Une pénalité de 10%/jour sera

imposée sur les devoirs en retard. (Les week-ends sont considérés comme un seul jour). Certaines

parties des devoirs doivent être soumises sur Blackboard, tandis que d’autres doivent être soumises

en tant que copies imprimées durant votre session de labo. Dans les deux cas, les soumissions

doivent être faites avant 17h la journée de votre labo.

DATES DE REMISES DES DEVOIRS

DEVOIR 1: LE 25 JANVIER

DEVOIR 2: LE 1 FÉVRIER

DEVOIR 3: LE 15 FÉVRIER

DEVOIR 4: LE 15 MARS

DEVOIR 5: LE 29 MARS

Biologie Moleculaire-2017 6

EXAMENS ÉCRITS

Tous les examens sont à livre ouvert. L'accès à l'internet sera permis pour les examens de mi-

session et final. Les ordinateurs portables NE SONT PAS permis. Vous devez utiliser les

ordinateurs du laboratoire.

Le format de l'examen de mi-session (2 heures) sera le suivant:

8 problèmes de calculs (12 points)

4 exercices de bioinfo (4 points)

4 questions théoriques sur la bioinfo et les procédures moléculaires (4 points)

2 sur 3 problèmes avec une emphase sur l'analyse de données et la conception expérimentale

(10 points)

Le format de l'examen final (3 heures) qui sera récapitulatif sera le suivant:

5 problèmes de calculs (10 points)

10 exercices de bioinfo (10 points)

5 questions théoriques sur la bioinfo et les procédures moléculaires (5 points)

3 sur 4 problèmes sur l'analyse de données et la conception expérimentale (15 points)

Biologie Moleculaire-2017 7

Exercice 1

Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !

Concentrations et dilutions

Isolation d’ADN plasmidique par lyse alcaline

Digestions de restriction et électrophorèse sur gel d’agarose

Biologie Moleculaire-2017 8

Introduction aux concentrations Une propriété très importante au sujet des solutions qui doit être adressée c’est la concentration.

En général, la concentration indique la quantité d’un soluté dans une quantité donnée d’une

solution. Pour travailler avec des concentrations vous devez tenir à l’esprit les distinctions entre le

soluté, le solvant et la solution.

Puisque différentes quantités de solutés peuvent être dissoutes dans une solution, la concentration

est une propriété variable. Nous avons donc besoin d’une façon numérique pour indiquer comment

concentrée est une solution. Une variété de différentes façons ont été développées pour calculer et

exprimer les concentrations des solutions.

Ceci peut être fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les

deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres à la façon que les

composés chimiques réagissent entre eux (moles).

Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront présentés. Elles incluent le

pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la

molarité (l’utilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume.

Vous obtiendrez de l’expérience avec plusieurs des façons d’établir la concentration d’une solution.

Vous pouvez préparer une solution à partir des matières brutes et mesurer chacune des composantes

qui doivent être présentes dans la solution. Vous pouvez préparer une solution en diluant une

solution préexistante. Si une solution est colorée, vous pouvez déterminer sa concentration en

mesurant l’intensité de la couleur par colorimétrie.

POURCENTAGE

L’utilisation des pourcentages est une façon commune pour exprimer la concentration d’une

solution. C’est une approche simple qui indique la quantité d’un composé par 100. Les

pourcentages peuvent être calculés en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une

façon, que vous connaissez, sans doute, d’exprimer les concentrations est le pourcentage par

volume. Une autre façon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre façon est un hybride

appelé le pourcentage par poids/volume.

Le pourcentage par volume est habituellement utilisé quand la solution est préparée en

mélangeant deux liquides.

Par exemple, l’alcool à friction est habituellement

70% par volume d’alcool isopropyl. Ceci veut dire

que 100mL de solution contient 70mL d’alcool

isopropyl. Ceci veut aussi dire qu’un litre (ou

1000mL) de cette solution contient 700mL

d’alcool isopropyl et assez d’eau pour compléter le

volume à un total de 1 litre ou 1000mL.

Pourcentage par volume = volume du soluté

volume de solution x 100

Biologie Moleculaire-2017 9

Le pourcentage par poids est une façon d’exprimer la concentration d’une solution comme le

poids du soluté/poids de la solution.

Pourcentage par poids = Poids du soluté

Poids de la solution x 100

À titre d’exemple, considérons une solution

de 12% NaCl par poids. Une telle solution

aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100

grammes de solution. Pour préparer une telle

solution, vous pourriez peser 12 grammes de

NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes d’eau,

afin que la masse totale de la solution soit de

100 grammes. Puisque les masses sont

conservées, les masses des composantes de

la solution s’additionneront à la masse totale

de la solution.

12 % NaCl solution = 12 g NaCl

100 g solution

12 g NaCl

(12 g NaCl + 88 g eau) = 12% NaCl solution

Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse d’une solution, vous devez

diviser la masse du soluté par la masse de la solution (la somme combinée de la masse du soluté et

du solvant) et ensuite multipliée par 100 pour la changer en pourcentage.

Pourcentage par poids/volume

Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le

pourcentage masse/volume. Cette variante mesure la quantité de soluté en grammes, mais mesure la

quantité de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle

contient 5g de NaCl pour chaque 100mL de solution.

Pourcentage par volume = Poids du soluté (en g)

Volume de solution (en mL) x 100

Cette façon est la manière la plus couramment utilisée dans ce cours pour exprimer les solutions en

pourcentages.

Biologie Moleculaire-2017 10

MOLARITÉ

Une autre façon d’exprimer une concentration

s’appelle la molarité. La molarité c’est le nombre

de moles de soluté dissout dans un litre de

solution. Les unités sont donc moles par litre,

plus précisément, c’est les moles de soluté par

litre de solution.

Molarité = moles de soluté

litre de solution

Plutôt d’écrire moles par litre, l’abréviation “M” est utilisée pour ces unités. Alors, quand vous

voyez la lettre M cela signifie molarité et représente moles par litre (pas seulement moles). Vous

devez faire très attention de distinguer entre moles et molarité. "Moles" est une mesure de la

quantité que vous avez d’une composante; "molarité" mesure la concentration de la composante.

Alors quand un problème vous est donné, qui stipule que la concentration d’une solution est 0.1M,

ceci veut dire qu’elle possède 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que c’est

0.1 mole.

POIDS/VOLUME

Cette façon d’exprimer une concentration est très semblable à celle des pourcentages et représente

une des façons les plus populaires utilisées par les biologistes moléculaires. Contrairement au

pourcentage, la concentration est exprimée par quelconque volume l’utilisateur désire utiliser. Plus

communément, ces concentrations sont exprimées par une unité de mesure. Par exemple, par 1mL

ou 1µL ou 1L, etc. Essentiellement, ces expressions représentent la masse d’un soluté dans une

quantité donnée de la solution. Par exemple, une solution qui est à une concentration de 1mg/mL

contient 1mg de soluté dans 1 mL de solution.

LES RAPPORTS

Toutes les façons décrites ci-dessus pour exprimer les concentrations se font en fonction du volume

de la solution qui est la somme du volume du soluté et du solvant. Une manière courante que

plusieurs biologistes et chimistes utilisent pour d’exprimer les concentrations est les rapports. Dans

ce cas-ci, la relation entre le soluté et le solvant est exprimée indépendamment de la solution. Par

exemple, nous pourrions dire que le rapport entre un soluté est un solvant est de 2 pour 1 avec la

notation 2 : 1. Ceci indique que pour deux parties du soluté il y a une partie du solvant. Donc, trois

parties total de solution!

Biologie Moleculaire-2017 11

Les dilutions et l’utilisation des micropipetteurs

Les dilutions : Savoir préparer des dilutions est essentiel pour la préparation de plusieurs réactifs, mélanges

réactionnels, et solutions utilisées dans les laboratoires de biologie moléculaire. Essentiellement, les

dilutions servent à réduire la concentration initiale du composé afin d’atteindre une nouvelle

concentration voulue. Les solutions préparées par l’entremise de dilutions peuvent être composées

d’un ou de plusieurs composés. Le nombre d’ingrédients dans la solution à être préparée

n’influence aucunement la formulation des dilutions. Un bref survol de la préparation des dilutions

est présenté ci-dessous. Assurez-vous de bien comprendre leurs préparations, car vous serez appelé

à les préparer tout au cours de la session ainsi que pour les examens.

La compréhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La concentration, le

facteur de dilution, et la dilution.

Une concentration se définit comme la quantité d'un composé pour un volume total de solution.

Puisqu'une quantité peut être exprimée de plusieurs façons, les concentrations sont exprimées

comme l'unité de mesure de la quantité du composé/volume total et final.

E.x. Gram/Litre

Molécules/Litre

Moles/Litre

Etc.

Le facteur de dilution représente la multiple arithmétique par laquelle une concentration initiale

doit être divisée afin d'obtenir la concentration finale désirée. Par exemple, si une solution contient

30 grammes de caféine par 1L de solution et que vous désirez réduire la concentration de caféine à

0.3 Grammes/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100, ce qui représente le facteur

de dilution. Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de déterminer un facteur de dilution.

Concentration finale Ce que je désire

La dilution représente la fraction du composé étant examiné. Par exemple, dans le problème

précédent, une dilution de 1/100 a été effectuée. La dilution est exprimée comme une fraction de 1

sur le facteur de dilution. C.à.d. que la solution initiale est représentée comme une fraction de

l’original sur le total. Par exemple si vous avez déterminé qu’une dilution de 1/100 doit être

préparée, cela veut dire qu’un centième de la nouvelle solution doit être représenté par la solution

originale. Donc pour un volume total de disons 2mL, 0.02mL doit être représenté par la solution

originale.

Facteur de dilution = Concentration initiale

Concentration finale OU

Ce que j’ai

Ce que je veux

Biologie Moleculaire-2017 12

Préparer une solution qui requière la dilution de plus d’un ingrédient :

Le principe pour la formulation d’une solution qui nécessite la dilution de plus d’un composé est la

même que pour une solution avec seulement qu’une composante. La seule différence est le volume

de solvant qui doit être ajouté.

Disons par exemple que l’on désire préparer 10mL d’une solution de 0.1M à partir d’une solution

mère de 2M.

Pour calculer le facteur de dilution :

Donc la dilution requise est de 1/20; ce qui veut dire qu’un vingtième du total doit être représenté

par la solution originale.

Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la solution mère et compléter avec 9.5mL de

solvant.

Si la solution à préparer inclut une deuxième composante; disons que celle-ci doit être à une

concentration finale de 0.5 M et que la solution mère est de 3M.

Encore une fois pour calculer le facteur de dilution :

Donc la dilution requise est de 1/6. Ce qui veut dire qu’un sixième du total doit être représenté par

la solution originale.

Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la première solution, 1.7mL de la deuxième

solution et puis complété avec 7.8mL de solvant.

Si les explications ci-haut ne sont pas suffisantes, vous pouvez consulter le site web suivant :

http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/HtmL/dilutions.htmL

Ce que j’ai

Ce que je veux =

2M

0.1M = 20

Ce que j’ai

Ce que je veux =

3M

0.5M = 6

Biologie Moleculaire-2017

13

Utilisation des micropipetteurs

Les micropipettes sont des outils indispensables dans les laboratoires de biologie moléculaire

modernes. Quelle est l’exactitude des vôtres? Quelles sont leurs précisions? Quelle est la différence

entre l’exactitude et la précision?

Dans le cas de l’exactitude, il s’agit de la performance comparativement à une valeur de référence.

Tandis que la précision est une indication, de la fiabilité ou la répétitivité est ne dépend pas

nécessairement d’une référence. Ces deux attributs sont indépendants l’un de l’autre. Il est possible

d’avoir un instrument qui est précisément inexact (ou exactement imprécis)!

Analogie d’une cible pour illustrer l’exactitude et la précision

Dans cet exemple, le centre de la cible représente la référence à laquelle l’exactitude est évaluée.

Afin d’évaluer de façon simultanée l’exactitude et la précision de vos pipettes vous devez faire des

mesures multiples afin de calculer le % d’erreur de la moyenne et l’écart type des mesures pour

chacune de pipettes.

Directives pour l’utilisation des micropipetteurs Gilson

Vous avez 4 micropipettes qui possèdent différentes capacités. La P-1000, la P-200, la P-20 et la P2.

Le numéro indique le volume maximal en microlitres qui peut être mesuré de façon exacte et précise.

Initialement, vous devrez déterminer quelle micropipette utiliser sous des circonstances données. Par

exemple, si vous devez transférer 0.18mL vous aurez probablement besoin de la P-200 puisque

0.18mL = 180µL, car la P-200 fera la mesure de ce volume avec une exactitude et une précision plus

grande que ne le ferait la P-1000.

Règles:

Toujours utiliser un embout jetable. La P-20 et la P-200 utilisent les plus petits embouts et la

P-1000 utilise les plus gros.

Ne jamais aspirer du liquide dans le baril blanc de la pipette.

Ne jamais déposer la pipette quand il y a du fluide dans l’embout. Le fluide pourrait

accidentellement se retrouver dans le baril.

Ne jamais tourner le réglage de volume au-dessus ou en dessous de l’étendue prévue.

Afin de maximiser la précision, toujours utilisez la pipette de plus petit volume qui

correspond au volume total donné.

1. Régler le volume désiré:

Ajustez le volume à un réglage légèrement plus élevé que celui désiré, et ensuite

retournez-le à celui désiré.

2. Placer un embout:

Pousser l’embout fermement avec une motion de torsion. L’embout doit créer un joint

étanche avec le baril de la pipette.

Exact & précis Précis & inexact Imprécis & inexact

Biologie Moleculaire-2017

14

3. Peser le piston jusqu’au premier arrêt.

4. Introduire l’embout dans le liquide que vous désirez transférer. Pas trop loin, juste un peu

sous la surface.

5. Lentement, relâchez le piston.

6. Tout en retirant l’embout, toucher le côté de la paroi du tube afin de retirer l’excédent de

fluide de l’extérieur.

7. Afin de livrer, peser sur le piston jusqu’au premier arrêt, puis jusqu’au fond.

Ne jamais livrer de très petits volumes dans le vide. Toujours livrer dans un liquide ou

sur la paroi du tube, de telle façon à ce que la force d’adhésion retire le liquide livré

de l’embout.

8. Avec le piston, toujours complètement au fond, retirer l’embout du liquide.

RAPPELEZ-VOUS QUE VOS MICROPIPETTEURS SONT DES INSTRUMENTS

DISPENDIEUX!

Exercice de dilutions avec les micropipetteurs (Groupes de 2)

Nous avons inclus cet exercice afin que chacun se familiarise avec la préparation des dilutions,

l’utilisation du micropipetteur et des embouts. (TOUJOURS ÉTIQUETER VOS TUBES!!)

Matériaux: Solution I (1% Composé “A” (m/v); P.M. 250g/mole)

Solution II (1.5M Composé “B” P.M. 480g/mole; Densité: 1.6g/mL)

Méthode:

1. Préparer 1mL de chacune des solutions suivantes des solutions mères ci-dessus.

a. Une solution de 0.2mM du composé “A”.

b. Une solution de 0.72% (m/v) du composé “B”.

c. Une solution de 5% (v/v) de la solution I.

d. Une solution qui contient 0.1mg du composé “A” et 0.1% (v/v) du composé “B”.

e. Une solution avec le rapport suivant : solution I : solution II : eau : 2 : 1 : 247

2. Transférer 150 µL de chacune des solutions aux puits appropriés d’une plaque de 96 puits tel

qu’indiqué ci-dessous:

Plan de la plaque à 96 puits (une plaque/table)

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 1

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 2

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 3

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 4

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2

Biologie Moleculaire-2017

15

Encore des dilutions: déterminer la concentration d'ADN (Groupes de 2) Comme avec la plupart des composés, la concentration d'acides nucléiques peut être déterminée par

spectrophotométrie. Pour ce faire, l'absorbance du composé est déterminée à la longueur d'onde

d'absorption maximale. Dans le cas des acides nucléiques, c'est dans la gamme des UV à une

longueur d'onde de 260 nm. Dans l'exercice suivant, vous allez préparer des échantillons à différentes

concentrations connues d'ADN et ensuite utiliser les valeurs d'absorbance obtenues pour générer une

courbe étalon représentant l'absorbance Vs concentration d'ADN (PAS QUANTITÉ). La courbe

étalon vous permettra alors de déterminer la concentration d'un échantillon d'ADN inconnu ainsi que

la détermination de la relation entre la concentration de l'ADN et l'absorbance à une longueur d'onde

de 260 nm. Plus précisément, vous souhaitez déterminer quelle concentration de l'ADN (en µg/mL

ou ng/µl) est égale à une absorbance de 1.0.

Matériaux

ADN de sperme de saumon (200µL à 0.5mg/mL)

ADN de sperme de saumon (200µL de concentration inconnue)

Méthode:

1. Préparer 500µL dans de l'eau de chacune des solutions standards d'ADN suivantes à partir de

l'échantillon d'ADN de concentration connue: 0.0, 0.05, 0.025, 0.01, 0.005 et 0.0025mg/mL.

2. Préparer des échantillons de 500µL dans l'eau représentant des dilutions de 1/4 et 1/10 de

l'échantillon d'ADN inconnu.

3. Transférer 200µL de chacune des solutions d'ADN standards dans la plaque tel qu'indiqué dans le

plan ci-dessous.

4. Transférer 200µL de chacune des solutions d'ADN inconnues dans la plaque tel qu'indiqué dans

le plan ci-dessous.

5. Mesurer l'absorbance à 260nm.

Plan de la plaque d'essai d'ADN

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 1

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 2

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 3

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 4

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 5

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 6

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 7

0.0 0.05 0.025 0.01 0.005 0.0025 Vide INC

1/4

INC

1/10 Groupe 8

Biologie Moleculaire-2017

16

Isolation d’ADN plasmidique (Groupes de 2) La plupart des méthodes utilisées pour la purification de plasmide se basent sur la disruption des

cellules en présence de dénaturants puissants. La disruption peut se faire par des cycles de gel et de

dégel, le broyage ou par une lyse chimique en utilisant des solutions fortement alcalines. Les

dénaturants sont essentiels afin d’inactiver les nucléases endogènes et exogènes qui dégraderaient

l’ADN. Examinez les différentes composantes du tampon d’extraction et déterminez la fonction de

chaque composé chimique.

Les plasmides sont des réplicons bactériens extrachromosomiques circulaires non obligatoires.

L’isolation d’ADN plasmidique nécessite la séparation de cet ADN de l’ADN chromosomique, ainsi

que des polysaccharides, les lipides et les protéines de la cellule. Les manipulations subséquentes,

tout particulièrement les modifications enzymatiques, nécessitent que l’ADN soit dépourvu de ces

impuretés.

Purification d’ADN plasmidique par lyse alcaline

Dans cette procédure, la lyse des cellules est accomplie avec une solution fortement alcaline (NaOH)

et les protéines sont dénaturées à l’aide d’une solution fortement alcaline et d’un détergent (SDS).

Les complexes de détergent sont ensuite précipités avec un sel neutralisant (KOAC). Le plasmide est

séparé de l’ADN bactérien en vertu de sa stabilité relative dans des conditions alcalines. De laisser le

plasmide dans la solution alcaline trop longtemps détruira le plasmide aussi. De plus, le chromosome

est lié aux membranes et sera précipité par le sel et le détergent. Il est donc important de ne pas

mélanger la solution de façon trop vigoureuse, car ceci aurait pour effet de relâcher le chromosome

qui est piégé. Le plasmide est plus petit et demeure donc libre en solution. La solution de plasmide

est séparée des débris cellulaires par une centrifugation, puis concentrée par une précipitation à

l’alcool.

Biologie Moleculaire-2017

17

A. Préparation de vos solutions:

Préparer 1mL des solutions I & II ainsi que le TE à partir des solutions mères suivantes :

10M NaOH

10% (m/v) SDS

0.5M glucose

1M Tris-Cl (pH 8.0)

0.5M EDTA

3 M KOAc pH 5

Isopropanol

ARNase 10mg/mL

Solution I: 50mM Glucose (tampon)

25mM Tris-Cl (pH 8.0) (tampon)

10mM EDTA (pH 8.0) (Chélateur)

Solution II: 0.2M NaOH (Alcalin)

1% SDS (Détergent)

T.E.: 10mM Tris-Cl pH 8.0

1mM EDTA pH 8.0

B. Protocole pour l’isolation d’un plasmide recombinant de pUC9: 1. Centrifuger à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse pour une durée de 1 minute 1.5mL de

la suspension d’E.coli/plasmide qui vous a été fournie.

2. Déversez-le surnageant sans déranger le culot. Utiliser une micropipette pour enlever le

surnageant résiduel.

3. Ajouter 200μL de la Solution I au culot et le suspendre sur le vortex.

4. Ajouter 400μL de la solution II. Fermer le tube et mélanger par inversion.

5. Ajouter 300μL d’une solution glacée de KOAc. Bien mélangé et gardé sur glace pour 5 minutes.

6. Centrifuger dans la microcentrifuge à vitesse maximale pour 5-10 minutes. Ceci précipite les

protéines et l’ADN chromosomique le long de la paroi du tube.

7. Transférer 700µL du surnageant à un nouveau tube de microcentrifuge. Ajouter un volume égal

d’isopropanol. Fermer le tube et mélanger par des inversions rapides des tubes.

8. Centrifuger les tubes à vitesse maximale pour 5 minutes. Déversez-le surnageant.

9. Le culot blanc au fond du tube contient l’ADN plasmidique et de l’ARN.

10. Suspendre le culot dans 50μL de TE pH8.0.

11. Ajouter 1μL d’une solution de 10mg/mL d’ARNase et incuber à 37oC 5-10 min.

Biologie Moleculaire-2017

18

Digestions par enzymes de restrictions & électrophorèse sur gel d’agarose (Groupes de 2) Au milieu des années 1970, le domaine de la biologie moléculaire a connu une croissance importante

grâce à l’utilisation des endonucléases de restriction pour le clivage d’ADN à des sites spécifiques. Il

existe maintenant plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes disponibles

commercialement. Vous pouvez trouver de l’information détaillée sur plusieurs d’entre elles

(incluant celles que vous utiliserez dans ce cours) dans des catalogues de produits commerciaux.

Leurs spécificités les rendent particulièrement utile pour plusieurs tâches incluant entre autres la

cartographie de l’ADN, le clonage et le sous-clonage de l’ADN, etc. Le but de ce premier exercice

est de faire des digestions simples de votre ADN afin de répondre aux questions suivantes :

Quelles enzymes coupent dans l’insertion?

Quelles enzymes ne coupent pas dans l’insertion?

Quelle est la taille de l’insertion?

Quelles sont les positions possibles des différents sites de restrictions?

Le fragment d’ADN a été inséré dans quel site de restriction du SCM?

Pour de plus amples informations au sujet des enzymes de restrictions, consultez le site Web suivant :

http://askabiologist.asu.edu/expstuff/mamajis/restriction/restriction.htmL

Électrophorèse sur gel d’agarose L’électrophorèse sur gel d’agarose implique la séparation de molécules d’ADN d’après leurs tailles et

leurs conformations. La migration électrophorétique d’un fragment d’ADN dans l’agarose est

inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire (ceci est vrai seulement pour

certaines gammes de taille sous des conditions définies). [Conseil! Quand vous estimez la taille de

fragments de restrictions, gardez à l’esprit la précision requise, spécifiquement le nombre de chiffres

significatifs! La concentration de l’agarose utilisée dépend de l’éventail des tailles étant étudiées;

pour la séparation d’ADN linéaires entre 0.5 kb et 10 kb, un gel d’agarose de 1% est habituellement

utilisé. Suite à l’électrophorèse, les gels sont visualisés sous des ultras violets et photographiés avec

une caméra numérique. L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité (et la

longueur) de l’ADN linéaire. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir une estimation de la

quantité d’ADN dans les échantillons.

L’électrophorèse sur gel d’agarose utilise un courant à haute tension ce qui peut présenter un danger.

Le boîtier qui contient le gel est muni d’un mécanisme de connexion spécial pour des raisons de

sécurité. Les connexions doivent donc être retirées avant de pouvoir ouvrir le couvercle. TOUJOURS

COUPEZ L’ALIMENTATION AVANT DE DÉBRANCHER L’APPAREIL.

Le bromure d’éthidium, qui est utilisé comme colorant des gels d’agarose afin de pouvoir observer

l’ADN sous lumière UV, est un agent cancérigène potentiel. Toujours porter des gants pour

manipuler tout ce qui en contient. La source de lumière UV est aussi très dangereuse pour la peau et

surtout pour vos yeux, assurez-vous donc de bien vous protéger (gants, sarrau, masques) lorsque

vous observez vos gels d’agarose.

Biologie Moleculaire-2017

19

Chaque appareil a deux supports de gels et trois peignes (8-puits, 10 puits et 14-puits contenants

environ 14μL, 12μL et 6μL respectivement). Rappelez-vous que les gels à 8 et 10 puits contiennent à

peu près deux fois plus d’ADN que les gels à 14 puits à cause de la taille de leurs puits. De plus, si

vous désirez visualiser des petits fragments (<500bp), qui sont moins intenses, vous devriez

considérer utiliser plus d'ADN et peut-être une plus forte concentration d’agarose (ex. 1.5% au lieu

du 1% standard) afin d’obtenir une meilleure résolution.

Méthode:

A. Préparation du gel d’agarose (peigne de 8 puits)

Matériaux :

Agarose

10X TBE

1. Préparer dans votre cylindre gradué 200mL de tampon TBE à une concentration finale de 1X.

Assurez-vous de bien mélanger.

2. Mélanger la quantité appropriée d’agarose pour obtenir une concentration finale de 1.0% m/v

dans 25mL de tampon TBE de 1X.

3. Pour dissoudre l’agarose, chauffé aux micro-ondes (25-45 secs.). Recouvrir le flacon d’une

pellicule de plastique afin de minimiser l’évaporation). Lorsque l’agarose sera complètement

dissout, laissez refroidir jusqu’à 50-60oC (à peu près 5 minutes).

4. Ajoutez 50 L d’une solution mère de bromure d’éthidium à 1mg/mL (ATTENTION!

CANCÉRIGÈNE!) et bien mélanger.

5. Versez l’agarose dans le support à gel. Après avoir versé le gel, placer le peigne de 8 puits

(Capacité du puits est approx. 14µL) et enlever toutes les bulles d’airs (avec un embout jaune de

micropipetteur). Refermez le couvercle de l’appareil et laissez solidifier le gel pour au moins 15-

20 minutes.

6. Une fois le gel solidifié, retirez les joints noirs puis versez une quantité suffisante du tampon TBE

1X dans l’appareil pour recouvrir le gel d’environ 0.5cm.

7. Soigneusement enlever le peigne.

Biologie Moleculaire-2017

20

B. Conseils pour vérifier l’opération adéquate de votre gel

8. Branchez les électrodes de façon à ce que la cathode (électrode négative) soit à l’extrémité qui

représente l’origine du gel. Les échantillons vont migrer au travers du gel vers l’anode (électrode

positive). (ATTENTION! HAUTE TENSION!).

9. Régler l’appareil pour ~ 100V. Allumez l’appareil. Vérifier que l’ampérage est dans les environs

de 40-55 mA. Si cela n’est pas le cas, il y a un problème.

Problèmes possibles :

Le tampon de migration est à la mauvaise concentration

Le tampon dans le gel est à la mauvaise concentration

Vous avez oublié de mettre le tampon dans le gel

C. Analyse des digestions par enzymes de restrictions

10. Charger les échantillons d’ADN suivants. L’inconnu est un recombinant du vecteur pUC9:

a. Échelle de poids moléculaire de 1Kpb (5µL)

b. Recombinant de pUC9 que vous avez purifié précédemment, 5µL

c. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec BamHI, 5µL

d. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI, 5µL

e. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec HindIII, 5µL

f. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI + HindIII, 5µL

g. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec PstI, 5µL

h. Vecteur pUC9 digéré avec BamHI, 5µL

11. Faire l’électrophorèse à 100V pour approx. 45 minutes, puis demander à un aide enseignant de

faire la prise d’une photo.

Biologie Moleculaire-2017

21

Échelle de Tailles d’ADN

Masse d'ADN Paires de base

(ng/5µL)

Gel de 1% d'agarose TAE

Biologie Moleculaire-2017

22

Biologie Moleculaire-2017

23

Exercice 2

Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !

Cartographie de restriction d’un plasmide recombinant

Isolation d’ADN plasmidique avec Qiagen

Digestions par enzymes de restriction

Électrophorèse sur gel d’agarose

Cartographie de restriction d’un gène de la levure – Analyse Southern

Isolation d’ADN génomique

Digestions par enzymes de restriction d’ADN génomique

Électrophorèse sur gel

Biologie Moleculaire-2017

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Les enzymes de restriction et l’électrophorèse sur gel d'agarose Suite à la plupart des digestions, il est nécessaire de répondre aux questions suivantes :

L’ADN a-t-il été digéré?

Combien de fois est-ce que l’enzyme a coupé?

Quelles sont les tailles des fragments générés?

Est-ce que la digestion est complète ou partielle?

Les échantillons d’ADN sont-ils complètement digérés? S’il y a seulement eu clivage partiel de

l’ADN (exemple de cause possible : réduction de l’activité enzymatique à cause de conditions de

réactions non appropriées; impuretés dans l’ADN qui aurait inhibé l’enzyme), les fragments à

migration plus lente (qui représentent les fragments non clivés contenant un site pour l’enzyme

utilisée) sont habituellement présents à des proportions inférieures aux prédictions stœchiométriques.

Autrement dit, puisque l’intensité de la fluorescence UV est proportionnelle à la quantité de bromure

d’éthidium liée (et donc la quantité/longueur de l’ADN), ces fragments sont moins intenses qu’ils le

seraient s’ils étaient présents en quantité équimolaire aux fragments complètement digérés.

Est-ce que les tailles calculées des fragments de restriction sont conformes? Si vous effectuez la

migration de différentes digestions d’ADN cloné, il est important de vérifier que la somme des tailles

des fragments calculées est à peu près égale pour chacune des voies de migration (c. a. d. la taille de

la molécule d’ADN intacte). Puisque l’estimation de la taille à l’aide des marqueurs de taille n’est pas

exacte (et que l’erreur associée aux fragments se trouvant dans la partie non linéaire de la courbe

étalon est plus grande), il n’y a habituellement qu’un accord approximatif (une différence d’environ

200-300 pb pour un plasmide recombinant de 5 Kpb). Si vous obtenez de plus grandes différences,

considérez les points suivants: Y aurait-il co-migration de plusieurs fragments? (Observez l’intensité

relative de la fluorescence.) Y aurait-il des produits de digestion partielle inclus dans vos calculs? Y

aurait-il plusieurs fragments de faible masse moléculaire (donc de faible intensité que vous avez de la

difficulté à voir)? Les marqueurs utilisés pour évaluer la taille de molécules d’ADN linéaire sont-ils

aussi linéaires? Rappelez-vous que les molécules d’ADN linéaires, circulaires déroulées et

bicaténaires superenroulées ont toutes des propriétés de migrations différentes sous nos conditions

d’électrophorèse sur gel d’agarose. Puisque les marqueurs de tailles que nous allons utiliser sont

linéaires, peuvent-ils être utilisés pour estimer la taille de l’ADN d’un plasmide recombinant non

coupée?

Biologie Moleculaire-2017

25

Cartographie de restriction d’un plasmide recombinant (Groupes de 2) Le but de ce projet est d’obtenir une compréhension de la technique de cartographie par des enzymes

de restrictions. Chaque groupe de deux aura à travailler avec un plasmide qui contient une insertion

qui représente un des gènes listé sous la rubrique « séquences » > « gène inconnu » sur la page web

de ce cours. Parmi un groupe de 4 (par bout de table) les deux groupes de deux possèderont le même

inconnu, mais dans des orientations opposées. Ces insertions furent toutes obtenues d’une librairie

génomique créée dans le vecteur de clonage pUC19. En bref, l’ADN génomique d’un organisme a

été isolé, digéré, après quoi une ligature des fragments générés a été faite dans le vecteur pUC19

linéarisé avec une enzyme appropriée dont le site de restriction se retrouve dans le site de clonage

multiple. (Voir la figure sur la page suivante).

Les buts de ce projet sont :

Utiliser une approche expérimentale pour: o Déterminer le site d’insertion

o Vérifier la taille de l’insertion

o Vérifier l’orientation de l’insertion

o Déterminer la carte de restriction

Conseils pour l'utilisation des enzymes de restrictions Gardez toujours les solutions mères d’enzymes sur glace lorsqu’elles ne sont pas au congélateur à

-20oC (ce qui devrait être le temps le plus court possible).

L’enzyme est toujours la dernière composante ajoutée au mélange réactionnel et elle est ajoutée

directement à la solution dans le fond du tube plutôt que par goutte sur le bord du tube.

Assurez-vous que la solution est bien mélangée (ex. en donnant des petits coups sur le tube avec

votre doigt). S’il reste des gouttes sur le bord du tube, centrifugez brièvement les tubes. Vous

pouvez aussi les mélanger en utilisant le vortex (à moins que vous utilisiez de l’ADN génomique de

taille moléculaire élevée qui risque de se fragmenter).

Ne touchez jamais la pointe des embouts de pipette avec vos doigts ou avec autre chose que la

solution que vous voulez transférer.

Toujours utiliser un nouvel embout pour chaque opération et jeter les embouts utilisés aussitôt.

En accord avec les LIGNES DIRECTRICES SUR LE MATÉRIEL BIOLOGIQUE

DANGEREUX, tout le matériel jetable (embouts de micropipette, tubes de microcentrifugeuse, etc.)

utilisé lors de travaux avec de l’ADN recombinant et des cellules hôtes bactériennes doit être placé

dans des récipients à déchets spéciaux (c’est-à-dire, les boites de déchets à vos postes de travail).

Vous allez transférer ces déchets dans des sacs orangés qui seront autoclavés avant d’être jetés.

Biologie Moleculaire-2017

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Les enzymes suivantes ne coupent pas pUC19 : AdeI, AloI, ApaI, AscI, BaeI, BbvCI, BclI, BcuI, BglII, BoxI, BpiI, BplI, Bpu10I,

Bpu1102I, BsaAI, BsaBI, BseRI, BsgI, BshTI, BsmFI, Bsp68I, Bsp119I, Bsp120I,

Bsp1407I, BspTI, Bst1107I, BstXI, Bsu15I, BtrI, Cfr42I, CpoI, DsaI, Eco32I,

Eco47III, Eco52I, Eco72I, Eco81I, Eco91I, Eco105I, Eco130I, Eco147I, FseI, Kpn2I,

KspAI, MlsI, MluI, Mph1103I, MssI, MunI, Mva1269I, NcoI, NheI, NotI, PacI, PauI,

PdiI, Pfl23II, PsiI, Psp5II, PsyI, SacII, SanDI, SexAI, SfiI, SgfI, SgrAI, SmiI,

SrfI, SstII, Van91I, XagI, XcmI, XhoI, XmaJI.

Les vecteurs pUC sont de petits plasmides, dont le nombre de copies maintenues est élevé qui

possèdent un site de clonage multiple (SCM), l’origine de réplication pMB1 nécessaire à la

réplication du plasmide (source – plasmide pBR322), et le gène bla, qui code pour la bêta-lactamase,

qui confère une résistance à l’ampicilline (source – plasmide pBR322). Noter que tous les sites de

restriction dans le site de clonage multiple surviennent seulement qu’une fois.

pUC19

SCM de pUC19

Biologie Moleculaire-2017

27

Conseils pour le clivage par enzymes de restriction des plasmides

Quantité d’ADN à utiliser:

La facilité que vous aurez à détecter vos fragments de restrictions (par fluorescence UV après une

coloration au bromure d’éthidium où l’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la masse de

l’ADN dans un fragment) dépend du montant d’ADN utilisé (et des paramètres tels que l’épaisseur

du gel, la précision des bandes, etc.). On utilise habituellement entre 200-600ng d’ADN

plasmidique/puits pour une digestion avec une seule enzyme. Pour des digestions qui génèreront

plusieurs fragments, vous pourriez avoir besoin de faire la restriction de 400-1000ng afin de pouvoir

déceler les plus petits fragments (POURQUOI??)

Après avoir sorti les échantillons d’ADN du congélateur, assurez-vous de les dégeler complètement

avant de les prélever avec une pipette (pour obtenir la quantité adéquate d’ADN dans un volume

donné).

Vos digestions seront faites en présence d’un tampon commercial fourni par la compagnie

Fermentas. La concentration de sel idéale varie d’une enzyme de restriction à l’autre et vous pouvez

l’obtenir en utilisant différentes formulations du tampon.

Certaines enzymes requièrent des températures d’incubation autre que 37oC. Notez également que

les enzymes de restrictions qui reconnaissent les mêmes séquences s’appellent des isoschizomères

(ex. SacI et SstII). Il y a aussi des enzymes qui portent des noms très semblables (EcoRI, EcoRV)

mais qui reconnaissent des séquences distinctes (donc, soyez certain de bien lire les étiquettes sur les

tubes d’enzymes).

En principe, 1 UNITÉ D’ENZYME DE RESTRICTION DIGÈRE COMPLÈTEMENT 1g

D’ADN PURIFIÉ EN 1 HEURE. Par contre, puisque nous utilisons souvent des préparations

d’ADN brutes, nous augmentons souvent la quantité d’enzyme utilisé et dans le cas d’ADN

génomique complexe, les temps d’incubation sont habituellement prolongés aussi. Typiquement, les

enzymes de restrictions sont fournies à des concentrations de 5-10 unités/l.

Le volume final d’enzyme ne devrait pas excéder 1/10 du volume réactionnel total, puisque le

glycérol dans la solution stock d’enzyme, que l’on ajoute pour empêcher la formation de cristaux lors

de la congélation, peut inhiber la réaction. Notez aussi que les solutions qui contiennent du glycérol

sont plus difficiles à manipuler avec des pipettes que des solutions aqueuses, soyez attentifs aux

volumes dans vos embouts de pipette.

Pour un survol de la cartographie par d’enzymes de restriction, consultez les sites Web

suivants:

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/RestMap/RestMapTutorial.htmL

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/maps.htmL

http://wps.prenhall.com/esm_klug_essentials_5/17/4576/1171606.cw/content/index.htmL

Biologie Moleculaire-2017

28

Liste d’enzymes de restriction disponibles

ENZYME SITE

BamHI G▼GATCC

HindIII A▼AGCTT

PstI CTGCA▼G

XbaI T▼CTAGA

▼- indique le lien phosphodiester clivé

Biologie Moleculaire-2017

29

Matériaux et Méthodes :

Certaines des enzymes de restrictions que vous utiliserez se retrouvent dans votre boîte au

congélateur. Si elles ne sont pas dans votre boîte, elles sont dans la boîte au congélateur du

groupe en face de vous sur le même bout de banc que vous.

Votre plasmide recombinant inconnu, à une concentration de 100g/mL, est dans votre boîte

au congélateur.

Les tampons 10X d’enzymes de restrictions sont dans votre boîte au congélateur.

Préparation de vos digestions : Puisque les différentes enzymes requièrent différents tampons, vous aurez à être flexible lorsque vous

ferez une digestion de restriction. Préparez un tableau en indiquant toutes les composantes que vous

avez l’intention d’ajouter et leurs volumes avant de débuter. Lorsque vous ajouterez une des

composantes à votre tube étiqueté, rayez-la de votre tableau. Choisir le tampon qui permet d’avoir

100% d’activité avec l’enzyme appropriée. (Consulter le tableau sur la page suivante)

Mélange réactionnel d’une digestion simple typique de 30µL:

Ingrédients Concentration finale

ADN (100ng/µL) 8.3ng/ µL

Tampon de restriction 10X 1X

Enzyme (10 unités/µL) 0.3 unités/ µL

Eau Compléter à 30µL

Pour les digestions simples, utiliser le tampon de restriction recommandé pour une activité de

100%.

Pour les digestions doubles, les réactions doivent contenir chacune des deux enzymes à une

concentration finale de 0.3 unités/ µL. Utiliser le tampon de restriction qui possède la meilleur

compatibilité pour les deux enzymes.

Biologie Moleculaire-2017

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Enzyme Tampon recommandé

pour 100% d'activité

% d'activité dans les tampons Fermentas

B G O R Tango

(bleu) (vert) (orange) (rouge) (jaune)

1X 1X 1X 1X 1X

ApaI B 100 20-50 0-20 0-20 20-50

BamHI BamHI 20-50 100 20-50 50-100 100

BclI G 20-50 100 20-50 20-50 100

BglI O 0-20 50-100 100 100 0-20

BglII O 0-20 20-50 100 50-100 0-20

BstXI O 20-50 100 100 50-100 50-100

ClaI Tango 20-50 20-50 20-50 20-50 100

EcoRV R 0-20 50-100 50-100 100 20-50

EcoRI EcoRI 0-20 NR 100 100 NR

HincII Tango 50-100 50-100 20-50 50-100 100

HindIII R 0-20 20-50 0-20 100 50-100

HinfI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100

HpaII Tango 50-100 50-100 0-20 20-50 100

HphI B 100 0-20 0-20 0-20 20-50

KpnI KpnI 20-50 0-20 0-20 0-20 20-50

MluI R 0-20 20-50 50-100 100 20-50

NcoI Tango 20-50 20-50 20-50 50-100 100

NdeI O 0-20 0-20 100 50-100 0-20

NheI Tango 100 20-50 0-20 0-20 100

PstI O 50-100 50-100 100 100 50-100

PvuI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100

PvuII G 50-100 100 20-50 50-100 20-50

RsaI Tango 50-100 20-50 0-20 0-20 100

SacI SacI 50-100 20-50 0-20 0-20 50-100

SacII B 100 50-100 0-20 0-20 50-100

SalI O 0-20 0-20 100 20-50 0-20

ScaI ScaI 0-20 0-20 0-20 0-20 0-20

SmaI Tango 50-100 0-20 0-20 0-20 100

SspI G 20-50 100 0-20 50-100 100

TaqI TaqI 0-20 20-50 20-50 20-50 20-50

XbaI Tango 50-100 50-100 20-50 0-20 100

XhoI R 0-20 50-100 50-100 100 20-50

NR - Non recommandé

Biologie Moleculaire-2017

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Vos Digestions :

1. Préparer les digestions de 0.25g d’ADN par les enzymes de restrictions suivantes.

BamHI HindIII + PstI PstI + XbaI

HindIII HindIII + XbaI

PstI

XbaI

2. Préparer un témoin de digestion, qui contient toutes les composantes, sauf pour l’enzyme. (Vous

pouvez utiliser n’importe lequel des tampons de restriction pour cette réaction)

3. Incuber à 37oC pour 60 minutes.

4. Durant l’incubation des digestions, faire un gel d’agarose de 1.0% avec du bromure d’éthidium.

5. Après la période d’incubation, transférer 5L de vos digestions a des nouveaux tubes étiquetés de

façon appropriée et ensuite ajouter du tampon de chargement 5X à chacune d’entre elles afin

d’obtenir une concentration de 1X ou plus.

6. Charger les échantillons qui contiennent le tampon de chargement dans le gel.

7. Charger 5μL du vecteur pUC9 linéarisé qui a été préparée pour vous.

8. Charger 5μL de l’échelle de poids moléculaire.

9. Faire l’électrophorèse à 100V.

10. Après l’électrophorèse, examiner votre gel aux ultras violets et prendre une photo pour votre

analyse.

Biologie Moleculaire-2017

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Purification d'ADN plasmidique avec le kit QIAGEN Une autre façon de purifier les plasmides consiste à utiliser des kits commerciaux tels que celui offert

par Qiagen. À la base, cette technique de purification est fondée sur la méthode de lyse alcaline que

vous avez exécutée précédemment. Afin de comparer les deux méthodes, vous utiliserez le kit de

Qiagen pour la purification du vecteur pUC19. À la fin de la procédure, vous devriez être capable de

comparer les deux méthodes en ce qui a trait aux similarités et les différences.

Étape 1

Étapes 2-5

Étapes 6-7

Étapes 8-9

Étape 10

Culot bactérien

Suspension

Lyse

Neutralisation

Liaison

Lavage

Élution

ADN plasmidique pure

Biologie Moleculaire-2017

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Protocole pour la purification du vecteur pUC19 : 1. Obtenir la culture de 1.5mL d'E.coli avec un plasmide qui a été préparé pour vous et récolter les

cellules par une centrifugation à vitesse maximale pour 1 minute. Déversez-le surnageant.

2. Suspendre au vortex le culot de cellules dans 250µL de tampon P1 (+ ARNase) et transférer dans

un tube de microcentrifugeuse. Aucun agrégat de cellules ne devrait être visible.

3. Ajoutez 250µL de Tampon P2 (qui contient du NaOH/SDS) et inversez doucement le tube 4-6

fois afin de mélanger. Ne passez pas le mélange au vortex puisque ceci causerait un déchirement

de l’ADN génomique. Si nécessaire, continuez à inverser le tube jusqu’à ce que la solution

devienne visqueuse et un peu claire. Ne pas dépasser 5 min, car l’ADN plasmidique risquerait

de se dénaturer irréversiblement.

4. Ajoutez 350µL du tampon N3 (neutralisation, tampon à forte concentration de sel) et inversez

immédiatement le tube doucement 4-6 fois. La solution devrait devenir trouble.

5. Centrifugez à vitesse maximale 10 min. Un culot compact blanc va se former au fond du tube

avec le “lysat clarifié” au-dessus.

6. Utilisez une pipette pour transférer le surnageant de l’étape 5 à une colonne QIAprep placée dans

un tube de récupération de 2mL.

7. Centrifugez 60 secs. à vitesse maximale. Jetez le volume écoulé dans les déchets organiques.

8. Lavez la colonne QIAprep en ajoutant 0.375mL de tampon PE (qui contient de l’éthanol) et

centrifugez 60 secs. Jetez l’écoulement (déchets organiques). Répétez une deuxième fois.

9. Jetez l’écoulement (déchets organiques), transférez dans un tube à centrifugeuse avec le

capuchon coupé et centrifugez pour 1 minute additionnelle afin d’éliminer le tampon de lavage

résiduel.

IMPORTANT: L’éthanol résiduel du tampon PE peut inhiber des réactions enzymatiques

subséquentes. Les étapes 8 et 9 sont donc très importantes.

10. Placez la colonne QIAprep dans un tube à microcentrifugeuse (1.5mL) propre avec capuchon

coupé. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 50 µL de tampon EB (tampon d’élution = 10 mM Tris-HCl,

pH 8.5) et centrifugez pour 1 minute.

11. Transférez dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté. ASSUREZ-VOUS DE BIEN

ÉTIQUETER CETTE PRÉPARATION ET D’ENTREPOSER le RESTANT DANS

VOTRE BOÎTE À -20OC PUISQUE VOUS EN AUREZ BESOIN POUR L’EXERCICE 3

ET POUR L’EXAMEN PRATIQUE!

12. Transférer 5L de votre préparation à un nouveau tube et ajouter une quantité suffisante de

tampon de chargement pour obtenir une concentration finale de 1X ou plus.

13. Charger votre échantillon sur le gel précoulé qui a été préparé pour vous.

Biologie Moleculaire-2017

34

Cartographie d’un gène de la levure – Analyse Southern (Groupes de 2)

La cartographie de restriction des plasmides est une tâche relativement simple étant donné la faible

complexité des plasmides. On ne peut pas dire la même chose de l'ADN génomique. Une technique

qui a été développée pour effectuer une analyse de restriction d’ADN complexe comme les génomes

est le Southern. Le principe de cette technique repose sur la digestion de l'ADN d'intérêt, suivie d'une

électrophorèse, la dénaturation, le transfert sur un support solide et, enfin, une hybridation à une

sonde complémentaire dirigée contre la région d'intérêt. Compte tenu de l'avènement de la PCR et du

séquençage, l'analyse Southern n’est plus très utilisée de nos jours. Cependant, ce type d'analyse

demeure utile pour ...

― trouver la position d’une séquence dans un gros fragment d’ADN

― déceler les réarrangements chromosomiques

― déterminer le nombre de copies d’un gène

― trouver des séquences avec une faible homologie

― analyser de l’ADN de séquence inconnu d’organismes inconnus

Isolation d’ADN génomique de levure

Matériaux:

Culot d’une culture de levure de 2mL

Tampon de lyse

Tube avec capuchon à vis contenant des billes de verres et 200μL phénol:chloroform:isoamyl alcool

(25:24:1)

99% ETOH

ARNase (dans le bac à glace à l‘avant)

4M acétate d’ammonium

Méthode:

1. Suspendre le culot de levure dans 200μL de tampon de lyse.

2. Transférer la suspension au tube à vis qui contient les billes de verres et 200μL

phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1).

3. Mélanger au Vortex pour 1 minute, puis placer sur glace pour 1 minute.

4. Répéter l’étape 3 deux fois de plus.

5. Centrifuger à vitesse maximale pour 5 minutes. Transférer la phase aqueuse supérieure à un

nouveau tube de microcentrifuge. EVITER DE RÉCOLTER L’INTERPHASE!

6. Ajouter 1mL de 99% ETOH à la phase aqueuse, bien mélanger par inversion puis centrifuge à

vitesse maximale pour 2 minutes.

7. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 400μL d’eau.

8. Ajouter 2μL ARNase et incuber à 37oC 15 minutes.

9. Ajouter 10μL 4M acétate d’ammonium, 1mL 99% ETOH, et bien mélanger.

10. Centrifuger à vitesse maximale pour 2 minutes.

11. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 100μL d’eau.

12. Préparer une dilution de 1/10 dans de l’eau dans un volume final de 250μL de votre préparation

d’ADN génomique.

13. Étiqueter votre échantillon dilué et le remettre à l’aide enseignant pour qu’il fasse la lecture à

260nm.

14. Déterminer la concentration de votre préparation.

Biologie Moleculaire-2017

35

Digestion et électrophorèse d’ADN génomique de levure

Méthode:

15. Une fois que vous aurez déterminé la concentration de votre ADN génomique, préparer une

digestion de 5μg d’ADN avec 20 unités de l’enzyme BamHI dans un volume réactionnel de

50μL.

16. Faire la digestion à 37oC pour 1 heure.

17. Après la période d’incubation, transférer 15μL à un nouveau tube puis ajouter du tampon de

chargement d’ADN de %X pour obtenir une concentration finale de 1X ou plus.

18. Une photo sera prise des gels à a fin de leurs migrations. Ceux-ci seront transférés à une

membrane puis hybridés avec une sonde contre un gène de la levure.

19. Les résultats des hybridations seront disponibles sur le T:\.

Biologie Moleculaire-2017

36

Exercice 3

Qu’est qu’on fait aujourd’hui !

Mutagenèse dirigée et clonage de GFP

Amplification et mutagenèse de GFP par PCR

Purification des réactions de PCR avec Qiaquick

Digestion des produits de PCR de GFP et du vecteur pUC19

Ligature des amplicons de GFP

Biologie Moleculaire-2017

37

Mutagenèse dirigée et clonage de GFP (Groupes de 2) Le but ultime de ce projet est d’utiliser la PCR pour faire la mutagenèse de la protéine GFP. La

stratégie qui sera utilisée pour atteindre ce but sera d’utiliser la réaction de la polymérase en chaîne

afin de faire la mutagenèse dirigée du gène tout en l’amplifiant. Ce projet comprend plusieurs parties

indépendantes qui seront exécutées pendant les deux prochaines semaines. Consulter les pages web

suivantes pour rafraîchir vos connaissances sur la PCR:

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm

http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.htmL

Survol des étapes qui seront faites sont présentées dans l’organigramme ci-dessous.

Amplification et mutagenèse par PCR de GFP (Étape I)

Nettoyage des produits de PCR de GFP (Étape II)

Digestion des produits de PCR de GFP par HindIII et EcoRI (Étape III)

Digestion de pUC19 purifié par Qiagen avec HindIII et EcoRI (Étape III)

Nettoyage des produits de PCR de GFP digéré ou du vecteur pUC19 digéré (Étape IV)

Ligature des produits de PCR de GFP dans le vecteur pUC19 digéré (Étape V)

Transformation des ligatures dans E.coli Xl-1 (Étape VI; ceci sera faite pour vous)

Criblage des transformants (Étape VII; sera fait la semaine prochaine)

Biologie Moleculaire-2017

38

Étape I : Amplification et mutagenèse de GFP par PCR Des amorces ont été conçues afin de faire la mutagenèse et amplifier la séquence codante du gène

GFP qui se retrouve dans le plasmide pGFPuv. Les amorces qui seront utilisées sont indiquées ci-

dessous.

Amorce “Forward”:

GFPfor-1: CGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG

GFPfor-2: CGCCAAGCTTGcCATGCCTGCAGGTCG

GFPfor-3: CGCCAAGCTTGaCATGCCTGCAGGTCG

Caractéristiques:

Un site HindIII (AAGCTT) indiqué en italique et souligné sera utilisé pour le clonage.

Amorces “Reverse”:

GFPrev: CCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAG Méthode:

Préparez vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50µL. Dans des tubes de PCR

étiquetés (utilisez des tubes de PCR à paroi mince de 200 µL), ajoutez les ingrédients dans l’ordre

indiqué dans le tableau ci-dessous. Pour chaque composante, utilisez un nouvel embout autoclavé.

Notez : la polymérase Taq sera ajoutée par l’aide enseignant.

Ingrédients Conc. mère Conc. finale Volume

Eau Compléter à 50µL

Tampon PCR Taq 10X 1X

Amorce GFPfor 2µM 0.2µM

*Amorce GFPrev assignée 2µM 0.2µM

MgCl2 50mM 1.5mM

dNTP 2mM 200µM

pGFPuv - 5µL

Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL

*Assurez-vous de noter quelle amorce GFP reverse vous a été assignée!

Une fois que votre mélange réactionnel est complété, remettez-le à l’aide enseignant.

Conditions d’amplifications par PCR:

1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer.

2. 30 cycles de 30sec, 94oC dénaturation; 1 minute à 68oC appariement et extension.

3. 1 cycle de 5min, 72oC.

4. Refroidir à 4oC, indéfinie.

Biologie Moleculaire-2017

39

Électrophorèse des amplicons de PCR de GFP Une fois vos réactions de PCR terminées vous utiliserez l’électrophorèse sur gel d’agarose afin de

vérifier la réussite de l’amplification avant d’initier le clonage.

Méthode:

1. Récupérez vos réactions de PCR

2. Transférez 8µL de votre produit de PCR et placez-le dans un nouveau tube, puis ajoutez 2.5µL

de tampon de chargement 5X. Entreposer le restant sur glace pour des expériences subséquentes.

3. Charger vos échantillons sur un gel d’agarose de 1% précoulé qui contient du bromure

d’éthidium et une échelle de poids moléculaire appropriée.

4. Observer sous les UV. Prendre une photo pour l’analyse.

Étape II : Purification des réactions de PCR avec le kit de purification

QIAQUICK (Groupes de 2 assignés)

Méthode:

1. Ajoutez 5 volumes de tampon PB à 1 volume de la réaction de PCR et mélangez par inversion.

2. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.

3. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.

4. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK

dans le même tube.

5. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.

6. Jeter l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES.

7. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.

8. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le

même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon

PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.

9. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.

10. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la

colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.

11. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne

QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.

12. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez

jusqu’au besoin. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30.0µL, ajoutez assez du tampon

d’élution afin de compléter le volume à 30µL).

Biologie Moleculaire-2017

40

Étape III : Digestion du produit de PCR de GFP et du vecteur pUC19 (Groupes de 2 assignés)

Méthode:

Un des groupes de deux fera la digestion de l’amplicon de GFP tandis que l’autre groupe de

deux fera la digestion du vecteur pUC19.

1. Préparer un mélange réactionnel de 50uL pour faire une digestion double HindIII-EcoRI du

produit de PCR de GFP ainsi que du plasmide pUC19 purifié la semaine passée par la méthode de

Qiagen.

Volume PCR Volume Vecteur

Produit de PCR de GFP 10uL ---------

OU plasmide pGFPuv --------- 5uL

Tampon de restriction rouge 10X 1X 1X

HindIII 1uL 1uL

EcoRI 1uL 1uL

Eau Compléter à 50uL Compléter à 50uL

2. Faire la digestion à 37oC pour 1 heure.

Étape IV : Purification avec le kit de purification QIAQUICK des digestions des

produits de PCR ou de pUC19 (Groupes de 2 assignés)

Méthode:

1. Ajoutez 5 volumes de tampon PB à 1 volume de la réaction de restriction et mélangez par

inversion.

2. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.

3. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.

4. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK

dans le même tube.

5. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.

6. Jeter l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES.

7. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.

8. Jetez l’éluât dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le

même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon

PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.

9. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.

10. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la

colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.

11. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne

QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.

12. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez

dans votre boite au congélateur. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30µL, ajoutez assez du

tampon d’élution afin de compléter le volume à 30µL).

Biologie Moleculaire-2017

41

Purification par QIAquick

Produit de PCR

ou

Morceau de gel solubilisé

ou

Réaction enzymatique

Liaison

Lavage

Élution

Biologie Moleculaire-2017

42

Étape V : Ligature des amplicons de GFP Ayant digéré l’amplicon de PCR de GFP et le vecteur pUC19 vous procéderez maintenant avec la

ligature. Votre but ultime est de cloner la séquence GFP amplifiée dans le vecteur pUC19.

Ingrédient Tube 1 Tube 2

pUC19 digéré 5.0L 5.0L

Tampon de ligature 10 X 2.0L 2.0L

Amplicon GFP digéré 5.0L 0.0L

Eau ajouter de l’eau pour compléter le volume à 19.0L

Ligase 1.0L 1.0L

DONNER VOS ÉCHANTILLONS ÉTIQUETÉS À VOTRE AIDE ENSEIGNANT

Les ligatures seront incubées à la température de la pièce jusqu'à demain, puis transformées dans

E.coli Xl-1.

Biologie Moleculaire-2017

43

Exercice 4

Qu'est-ce qu’on fait aujourd'hui!

Mutagenèse et clonage de GFP - Analyse des transformations

Compte de colonies

PCR de colonie

Digestion des produits du PCR de colonie

Biologie Moleculaire-2017

44

Mutagenèse et clonage de GFP (Groupes de 4)

Analyse des résultats des transformations Les ligatures que vous avez faites la semaine passée ont été utilisées pour transformer la souche

d’E.coli Xl-1 blue. On vous a fourni avec les plaques des transformations pour poursuivre avec

l’analyse de l’expérience de clonage. Obtenir les données suivantes pour chacune des plaques.

Amorce reverse utilisée pour l’amplification et la mutagenèse

Nombre total de colonies observé

Nombre de colonies blanches

Nombre de colonies bleues

Nombre de colonies vertes fluorescentes

Assurez-vous d’obtenir ces données pour chacune des mutagenèses qui ont été faites. (c.à.d. chacune

des trois différentes amorces « forward »)

Criblage par PCR des transformants

Une fois les comptes enregistrés vous utiliserez la PCR et une digestion pour cribler les

recombinants pour des insertions (et visualiser les produits de PCR après une électrophorèse).

Méthode:

1. Étiqueter 7 tubes de microcentifuge de 1-7.

2. Ajouter 50L d’eau a chacun des tubes.

3. En utilisant un embout de pipette stérile, ramasser une des colonies bleues à partir de la gélose

qui représente la transformation du plasmide + insertion, puis placer l’embout dans le tube

correspondant étiqueté 1.

4. Répéter la procédure ci-dessus avec 6 colonies blanches. Si vous avez des colonies blanches

fluorescentes et non fluorescentes, ramasser trois de chaque. Si toutes les colonies blanches

étaient fluorescentes, alors ramasser 6 de celles-ci.

5. Mélanger brièvement au vortex chacun des 7 tubes contenants les embouts pour suspendre la

colonie (Tenir l’embout pendant que vous mélangez).

6. Retirer les embouts de chaque tube, et bouillir pour 5 minutes. Placez sur glace pour 1 minute.

7. Centrifugé à vitesse maximale pour 5 minutes. Vous utiliserez le surnageant pour votre analyse

par PCR.

8. Préparer un cocktail pour 8 réactions de PCR de 20L. GARDER SUR GLACE. Ci-dessous est

la recette pour une réaction de 20L.

Réaction de PCR

Solution Conc. mère Conc. finale

Eau L pour un volume final de 20 L

Tampon Taq 10X 1 X

Amorce MutScreenFor 2 M 0.2 M

Amorce MutScreenRev 2 M 0.2 M

MgC12 50 mM 2.5 mM

dNTPs 2mM 200 M

ADN Pol. Taq 5U/µL 0.25U/L

Biologie Moleculaire-2017

45

9. Distribuer 19L du cocktail à chacun des 7 tubes de PCR étiquetés (SUR GLACE)

10. Ajouter 1L de chacun des surnageant des colonies obtenus à l’étape 7 aux tubes de PCR

appropriés.

11. Préparer un gel d’agarose de 1.25% contenant du bromure d’éthidium.

Conditions de PCR:

i. 1 cycle de 5 min, 94oC pour dénaturer;

ii. 30 cycles de 30s, 94oC pour dénaturer; 1 min. à 68oC pour l’appariement et l’extension.

iii. 1 cycle de 5 min, 72oC

iv. Refroidir à 4oC.

Amorces :

Forward : AGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC

Reverse: ATCGGTGCGGGCCTCTTCGC

Digestion par enzyme de restriction des produits de PCR :

1. Obtenir vos réactions de PCR.

2. Préparer 7 digestions par l’enzyme BamHI, une pour chacune de vos réactions de PCR, dans un

volume final de 20 µL qui inclut 5 µL de chacune de vos réactions de PCR.

3. Préparer un témoin non-digéré en utilisant n’importe lesquelles de vos 7 réactions de PCR.

4. Digérer pour une heure.

5. Après la digestion, ajouter 5 µL de tampon de chargement à chaque échantillon.

6. Charger 10 µL de chaque mélange, ainsi que l’échelle de poids moléculaire, sur votre gel

d’agarose de 1.25%. Migrer pour 1.5 heure à 100 V.

7. Prendre une photo de votre gel.

Biologie Moleculaire-2017

46

Exercice 5

Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !

Expression génique - Transcription

Isolation d’ARN de levure

Électrophorèse d’ARN

Principes de la RT-PCR

Biologie Moleculaire-2017

47

Expression génique - Transcription Les informations contenues dans nos génomes sont de peu d'utilité, à moins que la cellule puisse la

décoder pour produire des produits utiles qui peuvent effectuer des travaux. Cette information est

contenue dans des unités appelées gènes (ou ADN codant). Le produit exprimé à partir d'un gène

peut être soit de l'ARN ou une protéine. Cependant, tous les produits des gènes ne sont pas

nécessaires en tout temps ou dans les mêmes quantités. Il serait très énergiquement exigeant et

coûteux pour une cellule d’exprimer chaque gène en tout temps. En outre, un rapport inapproprié

entre les différents produits des gènes pourrait entraver leur fonction et être nuisible à la cellule ou à

l'organisme. Par conséquent, la cellule contrôle l'expression des gènes en réponse à différents signaux

intracellulaires et extracellulaires. La première étape pour l'expression génique est la transcription,

un processus par lequel la polymérase ARN fait la lecture de la séquence d'ADN d'un gène pour

produire soit un transcrit codant (ARNm) ou un transcrit non codant telle que l'ARN ribosomal ou

ARNt. Donc la première étape dans l’étude de l’expression d’un gène est de déterminer sont

abondance sous différentes conditions parmi la population d’ARN total exprimé à un temps donné.

Isolation d’ARN de levure (Groupes de 2)

Chaque groupe de deux sera fourni avec une culture de levure qui a été assujettie à une des

conditions environnementales suivantes :

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.

Assurez-vous d’enregistrer quelle condition environnementale vous a été assignée. Vous aurez

besoin de cette préparation d’ARN pour des expériences qui seront faites la semaine prochaine.

Méthode : (Les étapes 1-3 ont été faites pour vous)

1. Obtenir 10mL de la culture de levure assignée.

2. Centrifuger pour 10 minutes à 7 000 rpm.

3. Jeter le surnageant.

4. Suspendre le culot dans 200μL de tampon de lyse.

5. Transférer à un nouveau tube avec un bouchon à vis qui contient des billes de verres et 200μL de

phénol : chloroforme : isoamyl alcool (25:24:1).

6. Mélanger au vortex pendant 2 minutes et ensuite placer sur glace pour 2 minutes.

7. Répéter l’étape 6 deux fois de plus.

8. Centrifuger à vitesse maximale pour 5 minutes. Transférer la phase aqueuse supérieure à un

nouveau tube.

9. Ajouter 0.1 volume de 3M NaOAc et 1mL d’ETOH à 99%, bien mélangé par inversion et

centrifuger à vitesse maximale pour 2 minutes.

10. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 100μL d’eau traitée au DEPC.

11. Déterminer le rendement et la pureté.

Biologie Moleculaire-2017

48

Électrophorèse d’ARN (Groupes de 4) Ayant isolé l'ARN total à partir d'une condition donnée, celui-ci peut être migré sur un gel d'agarose

pour évaluer sa qualité et pour vérifier la correspondance avec le rendement prédit d’après

l'absorbance à 260 nm. Typiquement, les ARN sont séparés en fonction de leur taille sur des gels

dénaturants d'agarose de formaldéhyde. Ce type de gel fournit des conditions dénaturantes qui

empêchent l'appariement de base et de réduire ainsi la structure secondaire de l'ARN. Ceci est

important, car contrairement à des fragments d'ADN double brin, qui ont la même conformation

indépendamment de la longueur, des ARN simple brin peuvent adopter des conformations différentes

en raison de l'appariement de base intra brin. Cela affecterait la migration électrophorétique.

Méthodes :

A. Préparation d’un gel d’agarose au formaldéhyde (Un gel par groupes de 4)

1. Combinez les composantes suivantes pour la préparation d’un gel d’agarose-formaldéhyde de

1.5% (25mL) (en utilisant le peigne à 8 puits):

Tampon MOPS 5X 5mL

H20 15.5mL

Agarose 0.375g

2. Dissoudre l’agarose dans le four à micro-ondes. Laissez refroidir un peu. Ensuite, sous la hotte,

ajoutez 4.5mL de formaldéhyde (solution 37%) (TRAVAILLER DANS LA HOTTE

CHIMIQUE. ATTENTION! VAPEURS VOLATILES). Mélangez en remuant et coulez le

gel immédiatement.

3. Fermer le couvercle et laisser le gel solidifier au moins 30 minutes.

B. Préparation des échantillons d’ARN (Chaque groupe de 2)

1. Afin de préparer les échantillons d’ARN pour la migration sur le gel, chaque groupe de deux

mélangera les composantes suivantes en utilisant des tubes étiquetés SUR GLACE:

Volume final = 30µL

Échantillon d’ARN: µL (Ce volume devrait contenir 5g dans un volume maximum de

9L)

Tampon de chargement: 21µL (Tampon de chargement pour l’ARN et non pas pour l’ADN)

Eau (jusqu’à 30 µl): µL

2. Incubez vos échantillons 10 minutes à 70ºC et ensuite, placez rapidement les échantillons sur

glace. S’il y a du liquide sur le bord du tube, centrifugez quelques secondes.

3. Charger 14µL des échantillons d’ARN sur votre gel.

C. Électrophorèse sur gel 1. Le tampon de migration sera du MOPS 1X. Faire migrer le gel à 80 V (courant de ~ 80 mA)

jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol dépasse la moitié du gel.

2. Enlevez le gel du boîtier d’électrophorèse, examinez sous les UV et prenez une photo.

Notez : Les gels de formaldéhydes sont plus FRAGILES que les gels non dénaturants, faites

très attention!

Biologie Moleculaire-2017

49

PRINCIPES DU RT-PCR (Groupes de 2) Une méthode qui est couramment utilisée pour étudier le transcrit dérivé d’un gène est le RT-PCR,

ou une technique dérivé de celle-ci le Q-PCR (PCR en temps réel).

Contrairement aux réactions de PCR traditionnelles, tel que celle que vous avez faite avec

précédemment, le RT-PCR utilise l'ARN plutôt que l'ADN comme matrice. Par contre, puisque

l’ADN polymérase thermostable utilisée dans la réaction de PCR fonctionne seulement avec une

matrice d'ADN, l'ARN doit préalablement être transcrit en ADN. Ceci est accompli par un ADN

polymérase ARN-dépendante, la transcriptase inverse (RT). La transcriptase inverse est utilisée pour

synthétiser un ADN complémentaire (ADNc) simple-brin à partir de l'ARN d'intérêt. Une amorce

oligo dT sera utilisée pour cette réaction. Une fois que l'ADNc a été généré, une réaction de PCR

standard peut être utilisée pour amplifier la séquence d’ADN complémentaire à l’ARNm.

Pour un survol sur la technique de RT-PCR consultez le site web suivant :

http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Flash/RT_PCR.htmL

L'expérience suivante a été conçue pour vous démontrer les principes de la RT-PCR. Nous

examinerons l'expression du gène YRA1 de la levure. Essentiellement, l'ARN total sera isolé des

cellules de levure. Ensuite, tous les ARNm qui sont typiquement polyadénylés seront convertis en

ADNc en utilisant une amorce oligo dT et la transcriptase inverse. Des amorces spécifiques au gène

YRA1 seront ensuite utilisées sur la matrice d'ADNc pour effectuer la PCR à point final. Suite à

l'analyse des résultats obtenus, vous devriez être en mesure de répondre aux questions suivantes:

Les produits d'amplification observés sont-ils dérivés à partir d'ADNc ou d'ADN génomique

contaminant? En d'autres mots est-ce que les produits sont dépendants ou indépendants de la RT?

Est-ce que le gène est exprimé sous les conditions examinées?

Est-ce que le transcrit est modifié?

Isolation d’ARN total (R)

↓

Traitement de l’ARN avec l’ADNase (RD)

↓

Réaction de transcriptase inverse sur l’ARN non-traité (R) et traité à l’ADNase (RD)

↓

PCR de point final

Biologie Moleculaire-2017

50

Méthode :

Étape I : Préparation de l’échantillon d’ARN pour les réactions de RT :

1. Préparer le mélange suivant avec votre préparation d’ARN. Cette dilution sera ensuite utilisée en

tant que source d’ARN pour les réactions qui suivent. Entreposer le restant de votre ARN non

dilué dans votre boite au congélateur jusqu’à la semaine prochaine.

4.0g de votre échantillon d’ARN

5.0L de tampon ADNase 10X

Compléter avec de l’eau pour un volume final de 48L

ÉTIQUETER CET ÉCHANTILLON « R » ; ARN NON TRAITÉ À L’ADNASE

ENTREPOSER LE RESTANT DE VOTRE PRÉPARATION D’ARN NON-DILUÉ DANS

VOTRE BOITE AU CONGÉLATEUR. VOUS EN AUREZ BESOIN POUR DES

EXPÉRIENCES LA SEMAINE PROCHAINE

Étape II : Traitement de l’ARN total avec l’ADNase :

2. Afin de traiter votre ARN avec l’ADNase, préparer le mélange réactionnel suivant :

24L de l’échantillon d’ARN préparé dans l’étape précédente (R)

1L de l’ADNase I

3. Incubez 15 minutes à la température de la pièce. Après le traitement à l'ADNase, inactivez

l'enzyme en ajoutant 2.5µL d’EDTA 25mM et en incubant 5 minutes à 65ºC. Refroidir sur glace.

ÉTIQUETEZ CET ÉCHANTILLON « RD »; ARN TRAITÉ À L’ADNASE

Biologie Moleculaire-2017

51

Étape III : Réactions de transcriptase inverse :

4. Préparer les réactions de RT suivantes dans 2 tubes de PCR étiquetés RT-R et RT-RD.

Utiliser un nouvel embout autoclavé pour chacune des composantes ajoutées.

5. Ajouter 19.0L d’eau DEPC dans chaque tube.

6. Ajouter 4.0L d’amorce oligo-dT à chaque tube.

7. Ajouter 4.0L d’un mélange de dNTP à 2mM à chaque tube.

8. Ajouter 2L de votre ARN non-traité à l’ADNase (R) au tube étiqueté RT-R.

9. Ajouter 2L de votre ARN traité à l’ADNase (RD) au tube étiqueté - RT-RD.

10. Permettre l’appariement de l’amorce oligo-dT en incubant vos mélanges pré-réactionnels de

RT à 70oC pour 5 minutes.

11. Laisser vos tubes refroidir sur votre table de travail pour 5 minutes.

12. Ajouter 8.0L du tampon RT 5X à chacun des tubes.

13. Ajouter 2.0L de DTT à 100mM pour obtenir une concentration finale de 5mM à chacun des

tubes.

14. Ajouter 1.0 L de la transcriptase inverse de MMLV à 200U/L pour obtenir une

concentration finale de 5U/L à chacun des tubes.

15. Incuber à 42oC pour 60 minutes.

16. Inactiver la transcriptase inverse en incubant le mélange réactionnel à 70oC pour 15 minutes.

Étape IV : Réactions de PCR :

1. Après les réactions de transcriptase inverse, préparer 5 réactions de PCR avec les matrices

suivantes :

Réaction Matrice Volume à utiliser dans la

réaction de PCR

PCR-1 R (étape I) 1L d’une dilution de 1/20

PCR-2 RD (étape 2) 1L d’une dilution de 1/20

PCR-3 RT-R (étape III) 1L

PCR-4 RT-RD (étape III) 1L

PCR-5 ADN génomique de levure (Fourni) 1L

Ingrédient Conc. mère Conc. finale Vol. pour réaction de 50L

Eau - - L to a final volume of 49L

Tampon Taq 10 X 1X

Matrice (voir ci-dessus) - - 1L

Amorce YRA (For) 2M 0.2M

Amorce YRA (Rev) 2M 0.2M

MgCl2 50 mM 2.0mM

dNTP 2mM 200M

Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unité/µL

Amorces :

YRA (FOR) CCCGTGTCGGTGGTACTCGTG

YRA (REV) GTCCGCCATTTCCTTGTCCAGAT

Biologie Moleculaire-2017

52

2. Une fois vos mélanges réactionnels complétés, entreposés les dans le bac à glace à l’avant pour

faire la PCR.

3. Vos réactions de PCR vous seront retournées une fois complétées.

Vos PCR seront effectuées sous les conditions suivantes:

i. 1 cycle: 5 min, 94oC pour dénaturer;

ii. 30 cycles: 30 sec, 94oC pour dénaturer; 30 sec, 70oC appariement et extension.

iii. 1 cycle: 5 min, 72oC.

iv. Refroidir à 4oC.

Étape V : Analyse des réactions de RT-PCR

1. Couler un gel d’agarose de 1.5%.

2. Obtenir vos réactions de RT-PCR.

3. Ajouter la quantité appropriée du tampon de chargement d’ADN à 10µL d’échantillon de

chacune de vos réactions.

4. Charger et migrer à 100V.

5. Après la migration, visualiser sous les UV et prendre une photo.

Biologie Moleculaire-2017

53

Exercice 6

Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !

Contrôle transcriptionnel du gène CTT1 de la levure

RT-PCR

Analyse northern

Biologie Moleculaire-2017

54

Contrôle transcriptionnel du gène CTT1 de la levure (Groupes de 2) Plusieurs conditions influencent l'expression de réseaux de réponses globales qui comprennent

plusieurs gènes régulés de manière coordonnée pour faire face à divers facteurs de stress. L'un de ces

gènes est le gène CTT1 de la levure Saccharomyces cerevisiae, qui fait partie d'un réseau de gènes

protecteur de stress. Le gène CTT1 code pour l'enzyme catalase. La catalase est une enzyme présente

dans les cellules de la plupart des organismes aérobies qui décompose les radicaux libres issus du

métabolisme oxydatif. Plus précisément, la catalase effectue la réaction suivante:

Cette semaine, nous examinerons l'expression de CTT1 au niveau transcriptionnel après un choc

osmotique des cellules de levure. La RT-PCR sera utilisée pour examiner l'expression du gène CTT1

dans des cellules de levures exposées à un choc osmotique pour différentes durées. Afin de comparer

l'abondance relative, et donc l'expression du gène CTT1, une normalisation sera effectuée à un

second gène, un gène domestique, le gène de l’actine. Le gène de l'actine ne fait pas partie du réseau

de gènes de stress global. Donc, son expression devrait demeurer constante. Cette approche

expérimentale sera comparée à une autre méthode, l’analyse northern. Dans ce cas, l'ARN est séparé

sur un gel dénaturant, comme vous l’avez fait la semaine dernière, transférée à un support solide et

ensuite sondée avec des séquences ciblant les transcrits d'intérêt.

Méthode:

1. La semaine passée, chaque groupe de deux a isolé l’ARN total de cultures de levures qui

représentaient une des conditions suivantes:

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.

Cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.

Obtenez vos préparations d’ARN de votre boite au congélateur et préparez le mélange suivant. Cette

dilution sera utilisée comme votre source d’ARN pour toutes les réactions subséquentes.

4.0g de votre échantillon d’ARN

5.0L de tampon ADNase 10X

Eau pour un volume final de 48L

2. Préparer le mélange réactionnel suivant afin de traiter votre ARN avec l’ADNase:

24L de la dilution d’ARN préparé dans l’étape 1

1L d’ADNase

3. Incubez 15 minutes à la température de la pièce. Après le traitement à l'ADNase, inactivez

l'enzyme en ajoutant 2.5µL d’EDTA 25mM et en incubant 5 minutes à 65ºC. Refroidir sur glace.

2H2O2 2H2O + O2

Biologie Moleculaire-2017

55

4. Préparer la réaction de transcriptase inverse suivante:

Ingrédient Volumes

Eau traitée au DEPC 19L

Oligo dT 4L

2mM dNTP 4L

ARN traité à l’ADNase 2L

Permettre l’appariement de l’amorce oligo-dT par une incubation de votre

pré-réaction de RT à 70oC pour 5 minutes.

Ensuite, laisser vos tubes refroidir lentement sur votre table pour 5 minutes.

Après l’étape d’appariement, ajouter les ingrédients suivants Tampon RT 5X RT 8L

100mM DTT 2L

MMLV 1L

Incubé à 42oC pour 60 minutes. Ensuite, inactiver l’enzyme RT en incubant le

mélange réactionnel à 70oC pour 15 minutes.

5. Après la réaction de transcriptase inverse, préparer deux réactions de PCR : une pour

l’amplification de l’actine et une pour l’amplification de CTT1 :

Ingrédient Conc. mère Conc. finale Volumes

Eau - - L à un volume final de 50L

Tampon Taq 10X 1X

Matrice - - 1L d’ADNc de l’étape 4

Amorce d’actine (For)

ou

Amorce CTT1 (For) 2M 0.2M

Amorce actine (Rev)

ou

Amorce CTT1 (Rev) 2M 0.2M

MgCl2 50mM 2.0mM

dNTP 2mM 200M

Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unité/µL

6. Une fois vos mélanges réactionnels complétés, entreposés les dans le bac à glace à l’avant pour

faire la PCR.

7. Vos réactions de PCR vous seront retournées une fois complétées.

Biologie Moleculaire-2017

56

Analyse des réactions de RT-PCR (Groupes de 4)

1. Couler un gel d’agarose de 1.5% avec le peigne de 10 puits.

2. Obtenir vos réactions de RT-PCR.

3. Ajouter 15µL du tampon de chargement d’ADN 5X à la totalité de chacune de vos deux

réactions de PCR.

4. Chaque groupe de 4 chargera un gel comme suit. Notez, les 4 groupes d’une table donnée

devront partager leurs échantillons entre eux.

Voie Échelle de poids moléculaire

1 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.

2 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.

3 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.

4 RT-PCR actine de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.

5 Vide

6 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 0 minute.

7 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 30 minutes.

8 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 60 minutes.

9 RT-PCR CTT1 de cultures exposées à 0.85M NaCl pour 120 minutes.

10 Vide

5. Faire la migration à 100V pour approx. 45 minutes.

6. Après la migration, visualiser sous les UV et prendre une photo.

Biologie Moleculaire-2017

57

Analyse northern Depuis l'avènement de la RT-PCR et de la Q-PCR, l'utilisation d'une analyse de Northern pour

étudier l'expression des gènes a été presque éliminée. Cependant, certaines informations peuvent être

obtenues d'une hybridation northern qui ne peuvent pas être facilement obtenues par des techniques

fondées sur la PCR. Celles-ci incluent l'analyse de la taille et les modifications post

transcriptionnelles. Comme avec l'analyse Southern, l'ARN à analyser est tout d'abord séparé en

fonction de la taille sur un gel d'agarose dénaturant, après quoi il est transféré et sondé. Dans

l'exercice suivant, vous effectuerez une analyse d'un northern qui a été effectuée sur l'ARN isolé de la

levure sous les mêmes conditions de croissance que vous avez utilisée pour la RT-PCR. Vous

pourrez alors comparer les résultats de cette analyse à ceux que vous avez obtenus par RT-PCR.

Méthode : (Notez, ceci doit être compléter durant la période de labo)

1. À votre disposition, sont deux hybridations northern de gels d'ARN duplicata provenant de

cultures de levure soumise à un choc osmotique pour différentes durées. Un des gels a été sondé

avec le gène CTT1 tandis que l'autre a été sondé avec le gène domestique; l’actine. Ces

hybridations sont disponibles sur la page web de ce cours.

2. Utilisez le logiciel ImageJ pour faire l’analyse de chacune de ces hybridations. Suivez le tutoriel

pour l'utilisation d’ImageJ disponible sur la page Web de ce cours. Le programme est disponible

sur le disque dur de votre ordinateur dans le dossier de la semaine 5.

3. Remplir le tableau suivant, puis demander à un de vos aides-enseignants de vérifier que vous

avez accompli la tâche.

Source

d’ARN

Valeurs brutes d’Image J Valeurs de CTT1

normalisées

Expression

relative* CTT1 Actine

0.85M NaCl

0 minute

1

0.85M NaCl

30 minutes

0.85M NaCl

60 minutes

0.85M NaCl

120 minutes

* Indiquer l’expression relative de CTT1 comparativement à l’exposition de zéro minute.

Biologie Moleculaire-2017

58

Exercice 7

Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !

Empreintes génétiques

Isolation d’ADN génomique des cellules de joues

Amplification par PCR du VNTR ApoC2

Amplification par PCR du RFLP ApoB

Stringence – Profils de dénaturation d’ADN

Biologie Moleculaire-2017

59

Empreintes génomiques (Groupes de 2) L’analyse de polymorphismes génomiques est devenue chose courante pour identifier des génotypes

de maladies et autres.

VNTR

Le principe de la variation évolutionnaire parmi une population est une des fondations de la biologie.

Ces variations sont le résultat de différences subtiles dans la séquence d'ADN des individus d'une

espèce donnée. Les variations surviennent souvent à cause d'erreurs de duplication de courtes

séquences de nucléotides où seulement qu'une copie était présente avant la réplication. Ceci résulte

en une répétition en tandem de la séquence originale. Si cette erreur survient encore une fois dans

une autre ronde de réplication, alors trois copies de la séquence seront en tandem (figure). Ces

répétitions en tandem font partie de nos chromosomes et sont donc héritées d'après le principe de la

génétique de Mendel. Au cours des siècles, le nombre de répétitions en tandem a augmenté ce qui

fait que chacun d'entre nous a hérité un nombre variable de répétitions en tandem (VNTRs) à

plusieurs loci dans nos génomes. On peut penser à un VNTR comme un loci avec chaque nombre de

répétitions d'une unité particulière étant analogue à différents allèles. Donc, chaque être humain (sauf

pour les vrais jumeaux) possède une combinaison unique de VNTRs et ces allèles peuvent être

utilisés dans les études de populations ou pour identifier un individu particulier.

Figure. Illustration du nombre de répétitions en tandem variable (VNTRs). Un simple brin d'ADN

du même locus de trois différents individus est montré. Dans cette région, le trinucléotide répété

CAT est présent une, deux ou trois fois ce qui donne des allèles de trois différentes longueurs.

RFLP

Un autre type de polymorphisme qui survient est appelé un polymorphisme de restriction de longueur

(RFLP). Ces polymorphismes surviennent quand un nucléotide unique est changé dans un site de

restriction, ce qui l'abolit ou le change. En conséquence, une région donnée du génome peut avoir un

site de restriction qui est absent dans la même région d'une autre copie du génome ou dans le génome

d'un autre individu.

Biologie Moleculaire-2017

60

Isolation d’ADN génomique des cellules de joues:

1. Une personne de chaque groupe de deux devrait utiliser un écouvillon stérile afin de se frotter

l’intérieur d’une des joues six fois. Sans tourner l’écouvillon, le déplacer de l’autre côté et frotter

l’intérieur de l’autre joue six fois.

2. Placer la portion de coton de l’écouvillon dans un tube de microcentrifuge de 1.5mL. Ensuite,

briser la tige juste au-dessus du coton pour qu’il tombe dans le tube.

3. Ajouter 400µL de PBS 1X pH 7.4 dans le tube.

4. Ajouter 20µL de protéinase K puis 400µL du tampon AL. Mélangé immédiatement au vortex

pour 15 secondes. Ne pas ajouter la protéinase K directement au tampon AL.

5. Incuber à 56oC pour 10 minutes. Centrifuger brièvement pour récolter le liquide sur les parois.

6. Ajouter 400µL d’éthanol à 99%. Mélanger sur le vortex pour 8 à 10 secondes. Centrifuger

brièvement pour récolter le liquide sur les parois.

7. Appliquer 600µL de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols et

centrifuger à 8k rpm pour 1 minute. Changer le tube de collecte.

8. Appliquer le restant de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols

et centrifuger à 8k rpm pour 1 minute. Changer le tube de collecte.

9. Ajouter 500µL du tampon AW1. Fermer et centrifuger à 8k rpm pour 1 minute. Changer le tube

de collecte.

10. Ajouter 500µL du tampon AW2. Fermer et centrifuger à vitesse maximale pour 3 minutes.

Changer le tube de collecte.

11. Centrifuger à vitesse maximale pour 1 minute afin de retirer le tampon résiduel et prévenir le

transfère.

12. Placer une colonne QIAprep dans un nouveau tube de 1.5mL de microcentrifuge duquel vous

avez coupé le capuchon. Ajouter 150µL du tampon AE à la colonne. Attendre 1 minute puis

centrifuger à 8k rpm pour 1 minute afin d’éluer.

13. Transférer l'ADN élué à un nouveau tube de microcentrifuge étiqueté et entreposé pour une

utilisation ultérieure.

Biologie Moleculaire-2017

61

Amplification par PCR du VNTR d’ApoC2 et du RFLP d’ApoB Les groupes pairs amplifieront le RFLP d’ApoB

Les groupes impairs amplifieront le VNTR d’ApoC2

Méthode:

Préparer vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50L. Dans des tubes de PCR

étiquetés (utiliser des tubes de PCR de 200L à paroi mince) ajouter les ingrédients suivants dans

l'ordre indiqué dans le tableau ci-dessous. Utiliser un nouvel embout autoclavé pour chaque

composante. Notez: la polymérase Taq sera ajoutée par les A.E.

Ingrédients Conc. mère Conc. Finale Volume

Eau Compléter à 50µL

Tampon de PCR Taq 10X 1X

Amorce ApoB For ou D1S80 For 2µM 0.2µM

Amorce ApoB Rev ou D1S80 Rev 2µM 0.2µM

MgCl2 50mM 2.0mM

dNTP 2mM 200µM

ADN Génomique de joue 5µL 5µL

Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL

Une fois que vous aurez complété l'assemblage de votre réaction, donnez là à votre aide enseignant.

Conditions d'amplification par PCR:

1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer;

2. 35 cycles de 30sec, 94oC dénaturer; 30sec, 55oC (ApoB) ou 65oC (ApoC2) appariement;

1min, 72oC extension.

3. 1 cycle de 5min, 72oC.

4. Refroidir indéfiniment à 4oC.

Analyse des empreintes génomiques

Gène ApoB:

1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoB.

2. Dans le cas du gène ApoB, utiliser 10µl de la réaction de PCR pour préparer une digestion par

enzyme de restriction avec l'enzyme EcoRI dans un volume final de 20µl.

3. Un groupe de la classe préparera aussi un témoin non digéré.

4. Après avoir fait la digestion pour une heure, ajoutée du tampon de chargement et chargée sur le

gel précoulé.

5. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise.

Gène ApoC2 1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoC2.

2. Ajouter du tampon de chargement à un échantillon de 10µl de votre réaction de PCR.

3. Charger sur le gel précoulé.

4. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise pour

votre analyse.

Biologie Moleculaire-2017

62

Stringence Ce paramètre décrit la mesure dans laquelle un appariement peut se produire entre des brins d'acides

nucléiques dans des conditions ambiantes données. Des conditions de haute stringence exigent un

degré élevé de complémentarité entre les molécules, alors que des conditions de faible stringence

permettent un appariement, même s'il y a des bases mésappariées. En règle générale, les conditions

de haute stringence sont obtenues soit en réduisant la concentration de NaCl ou en augmentant la

température. Une faible stringence est obtenue en augmentant la concentration de NaCl ou en

diminuant la température. Le niveau de stringence peut être modifié en ajustant la température, la

concentration du sel ou d'autres produits chimiques qui influencent la température de fusion des

hybrides d'acide nucléique.

Ce concept peut être illustré par la formule suivante: Notez que le pourcentage de paires de bases G:

C a un impact direct sur le point de fusion (Tm) des hybrides d'acide nucléique. En dessous du Tm,

des hybrides d'acide nucléique à deux brins seront favorisés. Par contre, au-dessus du Tm, l'état

simple brin sera favorisé. Par conséquent, toute condition environnementale (ou chimique) qui réduit

le Tm augmentera la stringence.

Tm = 81.5 + 16.6 (log M [Na+]) + 0.41 (%G+C/100) – 0.72 (% formamide) – 500/n – (% mésappariement)

M : molarité d’ions monovalents positifs

n : Longueur en base de l’acide nucléique

Par exemple, déterminons le Tm d'une molécule d'acide nucléique de 1 kb qui est 50% G : C en

présence de 0.1 ou 0.2M de NaCl.

Tm (0.1M NaCl) = 81.5 + 16.6 (log 0.1) + 0.41 (0.5) – 0.72(0) – 0.5 = 84.9oC

Tm (0.2M NaCl) = 81.5 + 16.6 (log 0.2) + 0.41 (0.5) – 0.72(0) – 0.5 = 89.9 oC

Par conséquent, à 68oC un état double brin serait favorisé à 0.2M NaCl, mais l'état simple brin serait

favorisé à 0.1M NaCl. Ainsi le NaCl a réduit la stringence en augmentant la valeur du Tm et donc la

température maximale à laquelle l’état double brin peut être maintenu.

Stringence - Profils de dénaturation de l’ADN (Groupes de 2) L'hyperchromicité ou effet hyperchrome est la propriété des polymères biologiques, et en particulier

l'ADN et l'ARN, de voir leur absorption dans l'UV augmenter lorsqu'ils subissent une dénaturation.

Cette propriété est couramment utilisée en biologie pour analyser par spectrophotométrie la

structuration des acides nucléiques en fonction de paramètres physico-chimiques (température, pH,

ions...). L’hyperchromicité peut être utilisée pour suivre l'état de l'ADN en fonction des changements

de température.

Biologie Moleculaire-2017

63

Dans cet exercice, nous examinerons l’effet de différentes conditions environnementales sur le profil

de dénaturation d’ADN génomique. Spécifiquement, vous déterminerez le Tm en fonction de

différents paramètres physico-chimiques : la température, concentration de formamide,

concentration d’urée et la concentration d’ions positifs.

Matériaux :

Blocs chauffants réglés à 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 et 95oC

ADN génomique de sperme de saumon (50µg/mL)

1M NaCl

1M MgCl2

100% Formamide

50% Urée

Méthode :

1. Chaque groupe sera assigné un des composés chimiques ci-dessus. Préparer 9 solutions de

500µL à une concentration finale d’ADN de 5µg/mL et une concentration finale du composé

chimique assigné indiquée ci-dessous :

0.25M NaCl

0.25M MgCl2

25% Formamide

25% Urée

2. Incuber pour 5 minutes chacun des huit mélanges aux températures indiquées ci-dessus dans les

blocs chauffant préréglés.

3. Garder le neuvième mélange à la température de la pièce.

4. Après l’incubation, rapidement refroidir sur glace chacun des huit mélanges.

5. Distribuer 200µL de chacun des mélanges dans une plaque de 96 puits tel qu’indiqué ci-dessous.

6. Une fois que la plaque aura été chargée, l’absorbance à 260nm sera déterminée.

Plan de la plaque d'essai d'ADN

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 1

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 2

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 3

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 4

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 5

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 6

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 7

220C 550C 600C 650C 700C 750C 800C 850C 900C Groupe 8

Biologie Moleculaire-2017

64

EXERCICE 8

Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !

Expression protéique

Préparation d’extrait de protéines

Quantification des protéines - Essai Bradford

Électrophorèse sur gel de protéines

Biologie Moleculaire-2017

65

Expression protéique (Groupes de 2) Tout au long du semestre, nous avons examiné différentes techniques utilisées en biologie

moléculaire pour analyser l'ADN et l'ARN. Cette semaine, nous allons voir l'une des techniques les

plus couramment utilisées pour étudier les protéines exprimées dans un organisme. Plus précisément,

nous allons comparer le profil protéique dans les tissus musculaires de différents organismes. Chaque

groupe sera assigné des échantillons de tissus musculaires provenant de différents organismes.

Préparation d’extraits de protéines

1. Suspendre l’échantillon de tissu dans 500µL de tampon de lyse (62.5 mM, pH 6.8, 2% SDS).

2. Transférer la suspension à un tube avec un capuchon à vis qui contient des billes de verres.

3. Mélanger au vortex pour 1 minute puis refroidir sur glace pour 1 minute.

4. Répéter l’étape précédente 3 fois.

5. Centrifuger 10 minutes à vitesse maximale dans la microcentrifugeuse.

6. Transférer le surnageant à un nouveau tube et garder sur glace pour une utilisation ultérieure.

Essai de protéines de Bio-Rad Cette méthode fondée sur celle de Bradford, est utilisée pour la détermination de la concentration de

protéines solubilisées. Elle implique l’ajout d’un colorant acide à la solution de protéine, après quoi

des mesures au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 595nm sont faites. Une comparaison à

une courbe étalon permet ensuite d’obtenir une mesure relative de la concentration de protéines.

Matériaux

Colorant

ASB 5mg/mL

Méthode :

1. Préparer 200µL de chacune des solutions de référence protéiques d’ASB à des concentrations de

0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 et 1.0mg/mL.

2. Préparer des échantillons de 200µL des extraits protéiques représentant des dilutions de 1/4 et

1/10.

3. Pipetter 20μL de chacune des solutions de référence et de chacune des dilutions des extraits de

protéines dans des tubes de microcentrifuge étiquetés de façon appropriés.

4. Ajouter 400μL du colorant dilué à chaque tube. Mélanger au vortex pour 2-3 secondes.

5. Incuber à la température de la pièce pour au moins 15 minutes.

6. Charger 200μL de chacun des mélanges réactionnels dans une plaque de 96 puits tel qu’illustré

ci-dessous.

7. Obtenir les lectures d’absorbances à 595nm.

Plan de la plaque pour l’essai de Bradford

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 1

0 1/4 1/10 Protéine

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 2

0 1/4 1/10 Protéine

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 3

0 1/4 1/10 Protéine

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB Groupe 4

0 1/4 1/10 Protéine

Biologie Moleculaire-2017

66

ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL DE SDS POLYACRYLAMIDE Une méthode courante pour la séparation des protéines par électrophorèse utilise un gel de

polyacrylamide discontinu, en tant que milieu de support et du sulfate de sodium dodécyle (SDS)

pour dénaturer les protéines. Le SDS est un détergent anionique, ce qui signifie que lorsqu'il est

dissous ses molécules ont une charge négative. Une chaîne polypeptidique se lie à des quantités de

SDS en proportion à sa masse moléculaire relative. Les charges négatives du SDS détruisent la

majeure partie des structures complexe des protéines, et sont fortement attirées vers l'électrode

positive dans un champ électrique. Les gels de polyacrylamide préviennent les plus grosses

molécules de migrer aussi vite que des molécules plus petites. Parce que le rapport charge-masse est

presque le même chez les polypeptides SDS-dénaturées, la séparation finale des protéines dépend

presque entièrement sur les différences de masse moléculaire relative de polypeptides. Dans un gel

de densité uniforme, la distance de migration relative d'une protéine négative est proportionnelle au

logarithme de la masse. La séparation des protéines par SDS-PAGE peut être utilisée pour estimer la

masse moléculaire relative, l'abondance relative des principales protéines dans un échantillon, et de

déterminer la répartition des protéines entre les fractions.

Matériaux

Tampon de Laemmli 2X (4% SDS, 20% glycérol, 125mM Tris pH 6.8, 0.004% bromophénol bleu)

Extrait de protéines préparées précédemment

Standards de poids moléculaire protéiques

Méthode :

1. Préparer votre échantillon de protéine pour le chargement sur le gel de SDS PAGE comme suit :

Volume final = 10µL

Échantillon de protéine: µL (Ce volume devrait contenir 20g dans un volume maximum de

5L)

Tampon de chargement: 5µL Tampon de chargement Laemmli 2X

Eau (jusqu’à 5µl): µL

2. Chauffer pour 10 minutes à 70oC, puis refroidir sur glace. Centrifuger pour 1-2 secondes.

3. Charger la totalité de l’échantillon sur le gel de SDS PAGE de 10% précoulé.

4. Faire la migration à 200V pour approximativement 30-40 minutes.

5. Une fois la migration terminée, désassembler et placer le gel de résolution dans la solution de

coloration de coomasie.

6. Chauffer au microonde pour 1 minute, puis agiter sur la berceuse pour 10-20 minutes.

7. Remplacer la solution de coloration par la solution de décoloration.

8. Chauffer au microonde pour 1 minute, puis agiter sur la berceuse jusqu’à ce que les bandes soient

clairement visibles.

9. Déverser la solution de décoloration et la remplacer avec de l’eau distillée.

10. Prendre une photo.

Biologie Moleculaire-2017

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Solution de coloration

0.5g Coomassie Brilliant blue R 250

800mL méthanol

Mélanger jusqu’à dissolution, puis ajouter 140 mL d’acide acétique

Compléter à 1L avec de l’eau

Solution de décoloration

40% méthanol

7% acide acétique

Ce qui suit est une liste des protéines commune à tous les tissus musculaires animaux, adapté d’Alberts

et al. 1994.

Protéine MW (en kD) Fonction

Titine 3000 Centre la myosine dans le sarcomère

Dystrophine 400 Ancrage à la membrane

Filamine 270 Crés liens croisés des filaments d’actine en gel

Chaine lourde de myosine 210 Glissement des filaments d’actine

Spectrine 265 Attache les filaments d’actine à la membrane

M1/M2 190 Produit de dégradation de la myosine

M3 150 Produit de dégradation de la myosine

Protéine C 140 Produit de dégradation de la myosine

Nébuline 107 Contrôle l’assemblage de l’actine

A-actinine 100 Crés faisceaux de filaments d'actine

Gélsoline 90 Fragmente les filaments d’actine

Fimbrine 68 Crée faisceaux de filaments d'actine

Actine 42 Forme les filaments

Tropomyosine 35 Renforce les filaments d’actine

Troponine (T) 30 Contrôle la contraction

Chaine légère de myosine 24, 17, 15 Glissement des filaments d’actine

Troponine (I) 19 Contrôle la contraction

Troponine (C) 17 Contrôle la contraction

Biologie Moleculaire-2017

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Annexes

Biologie Moleculaire-2017

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Acide aminé Code de 3 lettres Code d'une lettre

alanine ala A

arginine arg R

asparagine asn N

acide aspartique asp D

asparagine or acide aspartique asx B

cystéine cys C

acide glutamique glu E

glutamine gln Q

glutamine or acide glutamique glx Z

glycine gly G

histidine his H

isoleucine ile I

leucine leu L

lysine lys K

méthionine met M

phénylalanine phe F

proline pro P

serine ser S

thréonine thr T

tryptophane try W

tyrosine tyr Y

valine val V

Biologie Moleculaire-2017

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Conversions Spectrophotométrique

1 unité A 260 d'ADN double brin = 50 µg/mL

1 unité A 260 d'ADN simple brin = 33 µg/mL

1 unité A 260 d'ARN simple brin= 40 µg/mL

Conversion Protéine/ADN

ADN de 1 kb → 333 acides aminés

→ Protéine de 37 kDa

Poids moléculaire moyen d’un acide aminé ≈ 110 daltons

Dalton (Da) est un nom alterne pour l’unité de masse atomique, et kilodalton (kDa) est

1,000 daltons. Donc une protéine avec une masse de 64 kDa à un poids moléculaire de

64 000 grammes par mole