Biologie Moleculaire Microbienne

8/10/2019 Biologie Moleculaire Microbienne

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Filire SVI - S6

Module de Gntique et Biologie Molculaire M21

Elment 2: Biologie Molculaire Pr. Bouchra BELKADI

Partie 1:

Biologie Molculaire Microbienne

Facult des Sciences - Rabat

Anne universitaire 2009 - 2010

Pr. Bouchra BELKADI


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* les macromolcules* les complexes macromolculaires de lADN,

lARN et des protines

* la rplication, la transcription, la traduction

Biologie Molculaire?

Etude des gnes portant linformationgntique et leurs transformations


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Comment a-t-on pu procder ces tudes?Grce la technologie de lADN recombin ou gnie gntique, qui permet:

de prlever un fragment spcifique dADN de manipuler ce fragment dans un tube essai

de le remettre dans un organisme (le mme ou un autre)

Production de fragments dADN

Liaison de ces fragments un support molculaire(= vecteur)

Introduction du vecteur dans une cellule htepour en faire de multiples copies (= pourlamplifier)

Slection du fragment que lon veut tudier


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Ex. de dcouvertes ralises grce aux bactries:

- Recombinaison intragnique;

- Rplication de lADN;

- Code gntique;

- La rgulation (opron);

- Les enzymes de Biologie Molculaire: Enzymes

de restriction, Ligases, Polymrases (ADN et ARN),

Polymrases thermostables (PCR), etc..


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Quelles sont les consquences du

dveloppement de la biologie molculaire?

des connaissances dans le domaine fondamental

des applications pratiques:-production de protines dintrt mdical

-vaccins

-

diagnostic en mdecine

-

plantes et animaux transgniques


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Les 3 domaines du vivant

Archaea

Gram positif

Cyanobacteria

Proteobacteria

PlantesFungi

Animaux

Sulfolobus

Mthanognes

Halophiles

I- Introduction


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Les 3 domaines du vivant


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EUCARYOTE

PROCARYOTE


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Procaryotes ou Bactries

Deux grands groupes, les eubactries et les

archaebactries avec des fonctionnements diffrentsau niveau molculaire mais une organisation similaire

Structure:

!

Petite taille gnralement (avec des exceptions)!

Leur structure est trs simple, le plus souventsans cytosquelette ni rseau de membrane interne

!Prsence d'une paroicomplexe

!

Dans le cytoplasme, il y a prsence des ribosomes etd'une masse "plus claire", le nuclodequi contient l'ADNsous forme dun ou quelques chromosomes ( svt circulaire)


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"Par scissiparit(fission binaire): 1 cellule donne pardivision 2 cellules filles gntiquement identiques (notion

de clone)

"Pas d'individualisation de chromosomes visibles encytologie aucun moment de leur cycle de vie

Procaryotes ou Bactries

Division binaire:

"

Multiplication exponentielle:Xn = 2nX0

X0: nombre de cellules au dpartXn: nombre de cellules obtenues un temps donn

n: nombre de divisions ou de gnrations


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0 min

20-30 min

2 cellules fillesidentiques

cellule mre

109 bactries/ ml

18 heuresde croissance

" Temps de Gnration : 20 min (E.coli) dans des

conditions optimales quelques heures

"Taux de croissance : 2 divisions / h ou moins"

Echange gntique se fait par transferts horizontaux

(transformation, conjugaison, transduction)


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"

Trs diversifies et prsentes dans TOUSles milieux et Biotopes

"Adaptation rapide diverses conditions et

divers environnements

"Des plus dangereuses (pathognes) au plus

utiles et exploitables: Biotechnologies


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Deinococcus radiodurans


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2- Les lments gntiques non chromosomiques,principaux processus dvolution rapide des bactries

- Les plasmides- Les transposons

Les lments gntiques dans une cellule

Recombinaison gntique: change physique de gnes

entre les lments gntiques (chromosome, plasmide..)(Recombinaison homologue : change rciproque entreune paire de squence homologue dADN entre cellule

donneuse et receveuse)

1- Le chromosome porte les gnes essentiels lacroissance


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Trois principaux mcanismes dchange gntiquechez les bactries

1- TransformationBactrie + ADN libre

2- ConjugaisonBactrie + bactrie

3- TransductionBactrie + bactriophage

Bactrierceptrice


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Exemple de dcouvertes ralises grce aux

bactries:# Recombinaison intragnique;

#Rplication de lADN;

#mRNA;

#Code gntique;

#La rgulation (opron);

#

Les enzymes de Biologie Molculaire : Enzymes de

restriction, Ligases, Polymrases (ADN et ARN),

Polymrases thermostables (PCR), etc..


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Objectifs :

- Dfinir un plasmide ?

- Prciser les proprits biologiques codes par les

plasmides ?- Les consquences mdicales de ce type de

transfert ?

- dfinir la transposition et le transposon ?


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I- IntroductionDfinitionCaractristiques gnralesStructure et organisation

II- Mthodes dtude: extraction, purification et curagedes plasmides (TD)

III- Proprits des plasmides

IV- Diffrents types de plasmides et rles biologiques

A- Les Plasmides

B- Les transposons


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PlasmidesMilliers pb

I- Introduction

Chromosomebactrien circulaire

4millions pb

Bactrie

En gnral circulaire,le nombre de copies par cellulepeut varier de 1 quelques centaines.

A- Les Plasmides


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1- Dfinition:

"

Molcules dADN double brin libres le plus

souvent circulaire, localisation extra-

chromosomique, capacit de rplication

autonome et procure un avantage slectif.


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" Ils possdent plusieurs proprits confrant aux

bactries une meilleure adaptation lenvironnement.

"

Ils sont porteurs de gnes non essentiels mais

utiles et donc non indispensables au mtabolismenormal de la cellule hte.

" Leur transmission naturelle au cours des divisions

cellulaires est stable et se fait habituellement par

conjugaison.

2- Caractristiques gnrales:


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Prsents chez la plupart des espces bactriennes:

"

Tailles trs variables entre 1Kb 1 mgabase(gnralement infrieures 5% de celle du chromosome)

"

ADN double brin Superhlicale avec 3 formes:

3- Structure et organisation:


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Forme I: CCC: Circular

Covalently Closed(circulaire, covalemment

ferm)

Forme II: OC: OpenCircular ( circulaire relch,

un des 2 brins coup)

Forme III: Linaire

(2 brins coups)

Diffrentes formes des plasmides


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II- Mthodes d'tudes des

plasmides : TD


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III- Proprits des plasmides:

Les plasmides sont des associations modulaires de gnesregroups en units fonctionnelles.

Ils comportent une zone obligatoire de rplication:

Rplicon.

Rplication du plasmide indpendante de celle duchromosome

Petit nombre de copies/cellule (1 3) = PlasmideStringent / Rplicationstringente.

Grand nombre de copies/cellule (20 2000) =Plasmide relch /Rplication relche


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Ils peuvent comporter aussi:

$Une rgion de transfert (opron tra) chez les plasmides

conjugatifs codant pour: pili et protines de conjugaison

$

Des lments gntiques mobiles ou non (IS, Tn, Int)

$

Gnes divers (rsistance aux antibiotiques, etc)

1: Gne codant la rsistance un antibiotique

2: Gnes de transfert (Tra)3: Origine de rplication

Schma d'un plasmide

III- Proprits des plasmides:


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"

Les plasmides peuvent coder pour diverses fonctionsQuelques plasmides clbres:

%Facteur R: Plasmides de rsistance aux

antibiotiques et aux mtaux lourds (conjugatifs le plussouvent)

%

Facteur F: (fertilit) Prototype du gros plasmideconjugatif petit nombre de copies, capacit de

synthse de Pili sexuels chez la bactrie dite F+

ou Hfrpar rapport F- (absent de la cellule)

%pBR322: Vecteur de clonage trs utilis auxpremier temps du clonage et du gnie gntique

"Plasmides cryptiques: aucun rle connu

IV- Type de plasmides et rles biologiques


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1- Les gnes impliqus dans la rplication

2- Les gnes de transfert: Plasmides conjugatifs

3- Les gnes confrant des propritssupplmentaires la cellule hte

V- Gnes codant diffrentes fonctions


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"

Des plasmides incompatiblesne peuvent coexister dans lamme cellule, car leur rplication est soumise au mmesystme de rgulation donc

>>> ils sont fortement apparents structuralement doprsence de fortes homologies ADN/ADN

"

Ces plasmides sont ainsi classs en groupedincompatibilit ou groupe Inc.

V 1- Les gnes impliqus dans la rplication :

La fonction ori: cest lorigine de la rplication (initiation), elleest responsable du contrledu nombre de copies d'un mmeplasmide prsent dans une bactrie.

Ce systme de rgulation est loriginedu phnomne dincompatibilit


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V 2- Les gnes de transfert, Plasmidesconjugatifs:

"

Un plasmide conjugatif est autotransfrabledune bactrie mle une autre femelle parconjugaison.

"

Sa taille est suprieure 30 kb, chezEscherichia coli 90 kb , dont 30 50 kb pour lesgnes ncessaires au transfert conjugatif.

"Ces plasmides sont en faible nombre de copiesde 1 3 par cellule.


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Principaux lments desplasmides conjugatifs

Lopron tra code pourles pili sexuels et pourles protines

ncessaires laconjugaison.

Rle trs important dans la dissmination delinformation gntique et particulirementdes gnes de rsistance aux antibiotiques.


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1- Reconnaissance entre donneur (F+)

et accepteur (F-) grce la synthse du

pili (tube creux)2- Transfert d'un des deux brins du

plasmide

3- Synthsedu brin complmentaire

chez l'accepteur

4- Re circulisation du plasmide chez

l'accepteur

Le transfert entre les organismes donneur et accepteur de plasmide

se fait en 4 grandes tapes: ConjugaisonF+X F-&2 F+

Transferts d'ADN par conjugaison


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Grace la prsence des squences IS (Insertion

squences), le facteur F peut sintgrer dans le chromosome

dune bactrie F+, appels pisomes, donc leur rplication

est sous le contrle du chromosome.

Bactrie Hfr

Bactrie Hfr (Haute frquence de recombinaison)

En effet, les squences IS du plasmide F ont des

squences homologues sur le chromosome. Linsertion se

fait par recombinaison site spcifique.

IS

Bactrie F+


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Dans ce cas le plasmide peut mobiliser le transfert de lADNchromosomique dune cellule vers une autre et tre incorpor dans lechromosome par recombinaison entre les rgions homologues.

Conjugaison entre bactrieHfr et bactrie F-


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Plasmides conjugatifs: Diffusion plasmidique au sein

de la mme espce ou entre divers groupes

Escherichia Salmonella Proteus Enterobacter

Serratia Klesbsiella Pseudomonas Acinetobacter

Transfrables dans une large gamme dhtes

- intra spcifique- intra gnrique- inter gnrique (phylogntiquement diffrentes)


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Notions importantes retenir surle transfert conjugatif du plasmide

"

Contact direct entre les cellules est indispensable

"Transfert est orient

- Commence toujours en un point fixe (OriT)- Unidirectionnel: du donneur vers le receveur

"

Transfert accompagn par la rplication de lADNtransfr

"Suite au transfert- Le donneur garde sa copie du F

- Le receveur est transform en mle car ilporte une nouvelle copie du F

"Aucun transfert des gnes chromosomiques par le biaisdu plasmide F libre


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Plasmides non conjugatifs

"Ne sont pas autotransfrables.

"Taille plus petite de 1 70 kb, souvent cryptiques, et en grand nombre

de copies ( > 10), du fait d'un contrle relch de leur rplication.

"Transfrs une autre bactrie par deux autres mcanismes de

transfert : la transduction et mobilisation grce la prsence d'un

plasmide "mobilisateur".

Plasmide conjugatif Plasmide non conjugatif

Transfert Pas de transfert


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V 3- Gnes confrant des propritssupplmentaires la cellule hte

3a- Les gnes mtaboliques spciales

"

Gnes non indispensables la vie de la bactrie quipeuvent tre une cause derreur pour lidentification des

souches.

"Grand intrt sur le plan biotechnologique:

dgradation des produits chimiques (polluants toxiques).


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"

Les gnes mtaboliques codent pour la synthse de

protines permettant lutilisation de nutriments

- chez E. coli, gnes dutilisation du citratecomme

source de carbone, production de soufre, hydrolyse de lure

- chez les Salmonelles, gnes de dgradation du lactose


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#

Ce sont des plasmides de grande taille (> 200 kb).

3b- Les gnes de rsistance

#Les gnes de rsistance peuvent tre ports par des

plasmides (svt conjugatif), des transposons ou des phages

#

Ils confrent une rsistance aux antibiotiques et

dautres inhibiteurs de croissance


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Les plasmides R:

Rle de protection de la cellule

La modification des proprits denveloppe de la cellule et

la rendre impermable la substance toxique (mtauxlourds).

La synthse d'une protine de rsistance la substance

toxique: elle va neutraliser l'activit toxique de la

substance (en la dnaturant, hydrolysant, etc.)


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Plasmide R100de 94,3Kpb

Rsistance :- Sulfamides,-Streptomycine,-Spectinomycine,-Acide fusidique,-Chloramphnicol,

-

Ttracycline-Mercure

Ori T

Ori Vinc

mer

sulstr

cat

tet

Fonction de

rplication

tra

- Prsence de gnes Inc:Exclusionde

tout autre facteur R du mme type.

- Prsence dun facteur R empche le

maintien dun autre plasmide apparent.


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-Autres facteurs R, portant des gnes de rsistance :

Kanamycine,

Pnicilline,

Ttracycline,Nomycine

Rem: Lmergence de bactries rsistantes plusieurs antibiotiques a une

importance mdicale >>>>> cest corrle avec laugmentation de lutilisation

des antibiotiques pour le traitements des maladies infectieuses.

- Plusieurs gnes de rsistance ports par les facteurs Rsont des lments transposables, appels aussi

TRANSPOSONS TnMarqueurs de slection

Mutagnse dirige


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Les mcanismes de rsistanceaux antibiotiques

1- Rsistance chromosomique:

- Observe chez des mutants (spontans ou artificiels)

-Elle est due :- aux changements de la permabilit de labactrie lantibiotique

- la modification de la cible ou du sitedaction de lantibiotique.


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Exemple de mode daction: Streptomycine

Mode daction: Inhibition de la traduction par fixation

sur la petite sous unit du ribosome

RIBOSOME INACTIFRIBOSOME ACTIF

PROTEINEStrepto

Site defixation

Mode de rsistance: Modification du site de fixation delantibiotique

RIBOSOME ACTIFRIBOSOME ACTIF

PROTEINEStrepto

Site de fixationmodifi


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Gnes codant la synthse de nouvelles enzymes quisoit:

Inactivent lantibiotique

Empchent sa pntration dans la cellule

Ou le rejettent activement en dehors de labactrie

2- Rsistance plasmidique:

Selon divers mcanismes en fonction de la souche etle type de plasmide


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Les antibiotiques possdant les aminoglycosides:- Streptomycine,-Nomycine,

-

Kanamycine-Spectinomycine

AdnylationPhosphorylation

Actylation

Production denzymes modifiant

chimiquement ces antibiotiques

Perte dactivit antibiotique

Adnylation

PhosphorylationActylation


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Phospho-transfrases(APH):

aminoside-OH+ATP ---> aminoside-O-H2PO3+ADP

Adnosyl-transfrases(AAC): aminoside-OH + ATP ---> aminoside-O-adnosine + Ppi

Actyl-transfrases(AAC):

aminoside-NH2+ actyl-CoA ---> aminoside-NH-CO-CH3 + CoA-SH

Diffrents types d enzymesModifiant les aminosides


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Mode de rsistance plasmidique: Phosphorylation ouAdnylylation de lantibiotique et pour certains casActylation

RIBOSOME ACTIFRIBOSOME ACTIF

PROTEINEStreptomodifie

Site de fixation

Exemple: Streptomycine


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Les antibiotiques "-lactamines :Cas de la pnicilline

"-lactamase(Pnicillinase)

Les plasmides R code une enzyme la"-lactamase(Pnicillinase) qui coupe le cycle"-lactameinactivant ainsi lantibiotique


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ChloramphnicolLa rsistance est due uneenzyme Chloramphnicol-

actyltransfrase (CAT)code par le gne plasmidique cat

Actylation

en 2 tapes


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Plusieurs plasmides confrent des

rsistances multiples aux antibiotiques

Un simple plasmide R peut contenirplusieurs gnes diffrents codant chacun

une enzyme dinactivation dantibiotiquediffrente.


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-

La pathognicit des micro-organismes est lie desmcanismes physiologiqueset gntiques leur permettantde coloniserles htes et de provoquer linfection.

3c- Les gnes codant des toxines etdautres facteurs de virulence

-

2 processus majeures impliqus dans la virulence despathognes:

lattachement et colonisation de tissus spcifiques

production de substances (toxines, enzymes et

autres)

E l


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2- les souches Staphylococcus aurus

- Coagulases- hmolysines- fibrinolysines- entrotoxines

1- les souches entropathognes de E. coli (intestin grle):

-

Facteur de colonisation : protine code/plasmide =Antigne K, capacit dattachement aux cellules pithliales

- leffet pathogne : production dau moins 2 toxines:

- lhmolysine (lyse les globules rouges)

- lentrotoxine (diarrhes= excrtion deau +sels)

Exemples:


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Ces plasmides codent

-

la synthse d'une premire protine extracellulaire dontla biosynthse est ltale pour la bactrie productrice

ainsi que pour les autres bactries non-productrices

environnantes.

Les bactriocines, protines agissant sur des fonctionsvitales de la bactrie en les inhibant ou en les tuant.

3d- Les plasmides de bactriocines

- une deuxime protine intracellulaire de rsistance

la premire toxine.


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Diffrentes catgories de bactriocines : colicinescodes

par les plasmides col:

- formation de pores dans la membrane cellulaire

causant des fuites des ions potassium et de

protons >>> perte de la capacit produire de lnrgie

- le gne colE2 code une endonuclase

- le gne colE3, une ribonuclase qui inactive les

ribosomes.

E. coli


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bactries lactiques

Bactriocine Nisin Ainhibant la croissancedautres bactries

Applications en agro-alimentaire:

-

Eliminer les bactries pathognes telles

que listeria monocythogenes-

Utilise comme conservateur

VI U ili i d l id


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VI 1- Les plasmides sont utiliss comme vecteur de clonage

VI- Utilisation des plasmides

"Intgration dun fragment dADN dans un plasmide

par recombinaison in vitro:P. recombin ouP. chimre.

"

L'ensemble des descendants d'une telle cellule

constitue un clone: Clonage dun fragment d'ADN

#Intgration de gnes dorigines trs varies qui

permet le transfert de matriel gntique en

franchissant les barrires despces


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LADN clon dans un plasmide peut exprimer les gnesqu'il porte dans les cellules d'Escherichia coli

Transcription ettraduction du messager

Faire fabriquer E. colides protines trangres( l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine)

VI 2- Les plasmides sont utiliss comme vecteurd'expression

VI 3- Les plasmides sont utiliss comme vecteur


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Introduire et faire exprimer de l'ADN dans des celluleseucaryotes

- levure, cellules de Mammifres en culture,- cellules rsultant des premires divisions del'uf d'un mammifre par exemple

VI 3- Les plasmides sont utiliss comme vecteurpour la transformation de cellules eucaryotes

Expression

Rintroduire le gne clon dans des cellules eucaryotes

aprs un clonage dans Escherichia coli


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B L l t ti bil


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B- Les lments gntiques mobiles:les transposons (Tn)

Dfinition:

!Squences d'ADN capables de changer de localisation

dans le gnome sans jamais apparatre l'tat libre.

!

Ils ne peuvent se rpliquer mais codent pour les

dterminants de la transposition et ceux d'autres fonctions

telle la rsistance aux antibiotiques et aux mtaux lourds .

bta-lactamines,aminosides, phnicols,cyclines, rythromycine,sulfamides ettrimthoprime


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Transposition :

Mcanisme d'volution rapide, cest l'addition

dune squence de gnes(ADN) de taille dfinie

au sein d'un gnome (chromosome bactrien ouplasmide) et en l'absence d'homologie de

squence nuclotidique par recombinaison

illgitime.appels transposons(Tn)


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#Le transposon est constitu d'un fragment d'ADN limit

de part et d'autre par des squences rptitives inverses

(IR) appartenant des squences d'insertion (IS).

Structuredestransposons

#Les squences d'insertion portent les gnes ncessaires

la transposition,transposase(lments rgulateurs de latransposition) et les marqueurs spcifiques ( ex:

rsistance aux antibiotiques).

IRL IRR

IS1

768 pb


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"Les transposons constituent un gnome collectifou un

patrimoine gntique commun, dans lequel puisent les

bactries en fonction de leur ncessit d'adaptation ou de la

pression de slection.

"Ces lments sont la preuve du "gnie gntique in vivo".

"

Il sont trs utilissen mutagnse in vitro, ou encore parles bactries elles-mmes pour moduler l'expression d'un

gne

RLE INTRT

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