LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES AUX

HEPATITES VIRALES

bDNA

Plusieurs sondes de détection par cible

Ajouter sondes et ADN branché

TMA

Copies(ARN)

Ajouter primers et enzymes

1 sonde de détection par copie

Ajouter primers et enzymes

PCR

Copies (ADN)

1 sonde de détection par copie amplifiée

Cible ARN ou ADN Virus

1° - Les techniques de quantification virale

Détection en point final Détection en temps réel

TMA:

Avantages et inconvénientsAvantages:

Amplification d’ADN ou d’ARN

Permet l’amplification simultanée de plusieurs cibles

Production d’amplicons ARN

Réalisée dans un tube unique

Jusqu’à 100 résultats obtenus en 4 heures

Inconvénients:

Technique en grande partie manuelle

sensibilité / contaminations

bDNA

Pré-amplificateur*

Microplaque

ARN cible

Label Extender*(LE)

CaptureExtender(CE) Sonde de Capture

Sondes* marquées hybridées à l’Amplificateur*

Versant HCV-RNA (bDNA3.0)

3’UT3’UT5’UT5’UT C E1 E2/NS NS2 NS3 NS4 NS5StructuralStructural Non-StructuralNon-Structural

HCV RNAHCV RNA

1 18 129 214 297 392 487 578 658 7531 18 129 214 297 392 487 578 658 753

Spacer (SP)Spacer (SP)

Capture Extender (CE)Capture Extender (CE)

Label Extender (LE)Label Extender (LE)17 sondes de capture permettant une quantification Équivalente de tous les génotypes

Versant HCV-RNA (bDNA3.0)

bDNA

Caractéristiques Versant HCV RNA

bDNA

5 Standards

Gamme d’étalonnage externe

Phage recombinant

Contrôles

1 Positif Fort

1 Positif faible

1 Négatif (simple)

Linéarité3.200 – 40.106 copies/ml

615 – 7,7.106 UI/ml

Type ÉchantillonPlasma ou sérum

Volume échantillon50 µl

InstrumentationSystème 340 ou 440

bDNA

Technique automatisée

Excellente reproductibilité

Permet la quantification de l’ARN VHC avec une bonne linéarité

prise d’essai faible : 50 μl

Inconvénients

bDNAAvantages

84 résultats peuvent être rendus après 2 demi-journées sur 2 jours de manipulation

séries minimum de 24 échantillons

Sensibilité relativement faible : seuil de détection à 615 UI/l

PCR en point final

Amplicor Roche ou LCx Abbott Détection colorimétrique ou fluorimétrique en point final

PCR en point final

• Amplicor HCV 2.0 Roche– Linéarité :600 à 500000 UI/ml– Sensibilité 50 UI/ml en

qualitatif, 600 en Monitor

• Abbott LCx– Linéarité jusqu’à 23

millions IU/ml– Sensibilité 23 UI/ml

Hépatite C

PCR en temps réel

Gamme de linéarité

PCR en temps réel

Ct

Log C0

Droite standard

108 copies

10 copies

PCR en temps réel

SYBR® Green TaqMan ®

Sondes d’hybridation

MGB TaqMan ®

Molecular beacon, Scorpions...

PCR en temps réel

Principaux types de fluorophores

PCR en temps réel

Principe du FRET : Fluorescence resonance Energy Transfert

Transfert d’énergie sans transfert de photons (non radiatif)

λ d’excitation

quencherreporter

PCR en temps réel

Technologie TaqMan®

PCR en temps réel

Technologie FRET par sondes spécifiques

Cobas TaqMan 48

CTM 48 et AL 3.1 station

de pilotage

Extraction automatisée

cobas AmpliPrep

AbbottReal Time

Extraction

Chargement des tubes primaires

Préparation de la réaction de

PCR

Amplification et Détection

3h

15mn

1h30

Acides nucléiques totaux ARN et ADN Technologie de capture sur billes de silice

Lyse, stabilisation et déprotéinisation Capture

Casse des Virus et des cellulesLibération des acides nucléiques

Virus ou Cellule

Cible ADN

ou

Cible ARN (Virus)

Fixation des Acides nucléiques sur la silice à la surface des Magnetic Particle (Billes)

ParticleMagnetic(Billes) coatées à la silice

37°C

Libération des acides Nucléiques à partir des billes

Elution

80°C

Lavage

TA

• Une grande sensibilité

• Une gamme très étendue de linéarité

• Détection simultanée de plusieurs cibles (standard interne de quantification)

• Possibilité de Multiplex

PCR en temps réel

Les avantages

Inconvénients

• Prise d’essai importante d’environ 1ml

• Appareillage spécifique

Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV

CAP/CTM TaqMan HCV :

Linéarité : 43 UI/ml à 69 millions UI/ml

Sensibilité : 15 UI/ml

Spécificité : 99,99%

Génotype : 1 à 6 ? : sous-estimation des génotypes 4

Abbott Real Time HCV

ART HCV :

Linéarité : 12 UI/ml à 50 millions UI/ml

Sensibilité : 12 UI/ml

Spécificité : >99%

Génotype : 1 à 6 : pas de dépendance au génotype

PCR en temps réel

L’hépatite C

CAP/CTM TaqMan HBV:

•Linéarité : 54 - 110 millions UI/ml

•Sensibilité : 12 UI/ml

•Spécificité : 99,50%

•Génotype : A à G,

mutants pré-core

Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV

ART HBV :Linéarité : 1.16 log c/ml à 9.16 log c/ml

Sensibilité : 10 UI/ml

Spécificité : 100%

Génotype : A, B, C, D, E, F, G et H détectés

Abbott Real Time HCV

PCR en temps réel

L’hépatite B

2° - Les techniques de détection des génotypes et des mutants

ChromogèneChromogène(NBT/BCIP)

Précipité VioletPrécipité Violet

Cible ARN ou ADN Virus

LIPA SEQUENCAGE

ChromogèneChromogène(NBT/BCIP) Précipité VioletPrécipité Violet

VERSANT HCV LiPA 2.0

VERSANT HCV LiPA 2.0

3

1817

15

19

20

21

23. AC

Marker

CC

AC

4

8

7

5

6

9

10

11

12

13

14

25. 1 a

26. 1 b

24. 6 c-l

16

2b 3a 4b 6a1b 7-91aBand

positions

HCV RNA regions

5’ UT

Core

E 1

E 2

NS2

NS3

NS4

NS5A

NS5B

3’ UT

Core Region23 Amp Control24 6 c-l25 1a26 1b

5’ UT RegionSame band configuration as current LiPA

VERSANT HCV LiPA 2.0

• Extension du menu de génotypage– GT 1à 6 c-l

• 5’NCR GT 1-6• Core GT 1a/1b et GT 6 c-l

• Amélioration du soustypage – Meilleure Spécificité entre 1a et 1b

• Nouveau design des bandelettes• Toujours 1 bandelette /1 résultat• Marqué CE• Une boite d’amplification comprenant tous les réactifs

nécessaires• Plusieurs méthodes d’extraction testées et validées

TRUGENE HCV 5’NC

Autres protocolesAmplicor HCV Monitor

- Purification

CLIP™ Sequencing / TRUGENETM HCV 5 ’NC

Long-Read Tower™ GeneObjects™

Gene Objects™ / GeneLibrarian™

Rapport de génotypage

TRUGENETM HCV 5 ’NC (Type/Soustype/Isolat/accession number)

Détection du séquençage

Analyse de séquence

Preparation échantillons

Réaction de séquençage

3h

0h

5 ’NC Amplicon

TRUGENE HCV 5’NC

Génotypage HCV

• LIPA– Possibilité de grandes

séries avec détection automatisable

– Détection des doubles populations

– Lipa 1 sur amplicons Roche

mais– Lipa 1 : mauvaise

discrimination des sous-types 1, pas de 6

– Lipa 2 : mise en œuvre nécessitant une amplification spécifique

• TRUGENE– ++ pour épidémiologie

(comparaison de souches)– Meilleure discrimination des

sous-types

mais– Petites séries uniquement– Difficulté de mee de doubles

populations

Avantages et inconvénients des deux techniques

Mutants HBV : rappels

• Génome du virus B

Mutants précore :•Sur le gène précore mutation stop entraînant l’arrêt de la synthèse de l’Ag Hbe

•Sur le BCP (binding core promoter) qui agit sur la régulation du gène core

Mutants YMDD :•Sur le gène de la polymérase, site d’action des analogues nucléosidiques (lamivudine)

• Mutants précore :– Lien avec l’évolution de la maladie ?

– Lien avec la réponse au traitement ?

• Mutants de la polymérase :– Adaptation du ou des traitements :

• Apparition quasi systématique en cas de tt prolongé à la lamivudine seule

• Certaines mutations pourraient compromettre les traitements ultérieurs par d’autres molécules

• Arrêt du tt (sans risque) ou changement de molécule

Mutants HBV : rappelsInterêt de leur détection

• Même technologie que pour l’HCV

• Intérêt clinique : différences de pronostic d’évolution spontanée et sous traitement des génotypes :– Occident : A > D (plus sensible à l’interféron)

(Erhardt et al, Gut,2005, 54 : 1009-1013)

– Asie : B >C (moins d’activité inflammatoire et d’évolution vers la cirrhose; meilleure réponse au tt)

TRUGENE HBV GENOTYPING

TRUGENETM HBV assay

preS1 preS2

RNase HTP

HBsAg

SPACER RT

F A B C D E

110 279

101 237

~500pb

SA Mutations*145R

RT Mutations**173L180M/V204I/V (YMDD)207I

236T***

I169T, M250V****T184S/A and S202G****

* Carman et al. 1990 The Lancet, 336, 325-329** Pillay et al. 1998 International Antiviral News, 6:9*** Angus et al. 2003 Gastroenterology, 125, 292-297**** Colonno et al, 2005 EASL, Abstract 478

Lamivudine

Adefovir

Entecavir

TRUGENE HBV

Analyse des séquences

GeneObjects ™ / GeneLibrarian ™

TRUGENE™ HBV Report

Préparation de l’échantillon Extraction de l’ADN génomique Qiagen Blood DNA

Extraction Kit

PCR Réaction PCR 1.2 kb fragment

MutationsGenotype (A to G)

Réaction de séquençage

Sequencing Reaction CLIP sequencing (520 pb)

Détection desséquences

Long-Read Tower ™GeneObjects ™

GO 3.2

GeneLibrarian™ HBV Module:

Genotyping report (1): Genotype

séquence consensus la plus proche

HBV genotype

List of Mutations in SA and Pol (RT)

- Published substitutions

- Silent mutations (all positions)

- Substitution not at published sites

- Unpublished coding changes

GeneLibrarian™ HBV Module:

Genotyping report (2) : Mutation Profile

DETECTION DES MUTANTS HBV

technique LIPA par Innogenetics

Mutants précore Mutants YMDD

LIPA

Manuel, facile à mettre en oeuvre, pas d’appareillage

Non

OUI 

OUI

Non

TRUGENE HBV

automatisé, facile à interpréter, standardisé

 OUI

 OUI

OUI

OUI

Format

Genotype viral (A-G)  Mutations RT Mutations Ag HBs Nouvelles Mutations sur RT & SA

Mutants et génotypes HBV

Comparaison des deux techniques

Remerciements à

Catherine Lemagne, société Bayer

Nicolas Gautier, société Roche

Christine Murigneux, société Abbott

pour l’aide apportée dans l’iconographie