LES TECHNIQUES DE BASE DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

I. PURIFICATION DES ACIDES NUCLÉIQUES.

I.1. EXTRACTION A PARTIR DE MATÉRIELS BIOLOGIQUES.

L’ADN (ou l’ARN) doit impérativement être purifié à partir de matériels biologiques dans des conditions optimales de qualité et de quantité.

Dans la pratique, les acides nucléiques sont souvent extraits du sang total. Le procédé classique est l’extraction par le couple phénol-chloroforme. Le phénol est un excellent agent dénaturant des protéines et il permet de séparer efficacement les protéines et les acides nucléiques. Il est ensuite éliminé par l’extraction avec du chloroforme (non miscible avec l’eau). La séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucléiques. Des traitements par des agents clivant les protéines (protéolyse) peuvent être nécessaires. Les acides nucléiques peuvent être finalement récupérés sous forme solide à la suite de précipitation par l’alcool éthylique ou par l’alcool isopropylique. De nombreux réactifs sont disponibles, prêts à l’emploi, ce qui permet de simplifier les opérations de purification. Il est possible d’extraire les acides nucléiques à partir d’échantillons biologiques variés: cultures cellulaires, tissus divers etc... Les méthodes d’extraction doivent bien entendu être adaptées aux quantités disponibles de matériel biologique.

I.2. ESTIMATION DES QUANTITÉS D’ADN.

Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un matériel biologique. Elle s’effectue par spectrophotométrie dans l’ultra-violet à 260 nm. Il est indispensable de mesurer également l’absorption à 280 nm. Cette dernière longueur d’onde permet d’estimer la contamination éventuelle de l’extrait par des protéines. L’absorption se définit par l’unité de densité optique mesurée à 260 nm. Une unité de densité optique correspond à l’absorption d’une solution d’ADN double brin à la concentration de 50 µg/ml ou à l’absorption d’une solution d’ADN simple brin (ou d’ARN) à la concentration de 25 µg/ml.

II. MIGRATION ÉLECTROPHORÉTIQUE DES FRAGMENTS D’ADN.

Les fragments d’ADN après digestion par les enzymes de restriction peuvent être séparés par électrophorèse sur un gel d’agarose. Dans ce type de gel, les migrations des fragments d’ADN dépendent de la taille du fragment plus que de la charge de celui-ci. Plus le fragment a une taille élevée, moins la migration électrophorétique par rapport au puits d’inclusion sera importante. A l’opposé les fragments de petite taille auront une distance de migration la plus élevée. La détermination précise des tailles des fragments séparés par électrophorèse est effectuée en faisant migrer des marqueurs de poids moléculaire en parallèle avec les échantillons à analyser. La détection de l’ADN sur ce type de gel est réalisée par exposition aux rayons UV après réaction avec un réactif spécifique (bromure d’éthidium par exemple, agent s’intercalant entre les brins d’ADN).

L’électrophorèse des fragments d’ADN en gel d’agarose permet des séparations jusqu’à 20-25 kb (20000-25000 pb). Le tampon utilisé pour la migration électrophorétique a un pH basique (par exemple: 8,3 dans le cas du tampon appelé TBE = Tris-Borate-EDTA).

Des fragments d’ADN de taille restreinte (inférieure à 1000 paires de bases) peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

D’autres techniques électrophorétiques existent comme l’électrophorèse en champ pulsé qui permet de séparer des grands fragments d’ADN (taille supérieure à 50 kb). Le support d’électrophorèse est constitué par de l’agarose et on applique au gel un champ électrique de nature variable. Ainsi, le champ électrique peut être appliqué dans une direction donnée pendant 1 minute puis dans une

direction perpendiculaire au champ précédent pendant une minute et ainsi de suite. Le processus de réorientation des macromolécules dans le champ électrique dépend de leur taille.

ÉLECTROPHORÈSE EN GEL D’AGAROSE APRÈS MIGRATION ET COLORATION PAR LE BROMURE D’ETHIDIUM.

FIGURE DE GAUCHE:

- PISTE 1: Marqueurs de taille (en paires de bases).

- PISTE 2: Echantillon d’ADN dont la taille est à déterminer.

FIGURE DE DROITE:

- Courbe d’étalonnage en abscisses, les distances par rapport au puits d’inclusion:et en ordonnées les poids moléculaires (échelle logarithmique).

III. LE TRANSFERT SELON SOUTHERN.

III. 1. PRINCIPE.

Cette méthode a été initialement décrite par E.M. SOUTHERN en 1975. Elle consiste à détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope.

III. 2. RÉALISATION PRATIQUE.

Les étapes successives de cette technique sont les suivantes:

III. 2.1. Extraction de l’ADN génomique.

Cette extraction s’effectue à partir des leucocytes circulants par exemple obtenus à partir de sang total.

III. 2. 2. Digestion par des enzymes de restriction différentes du même ADN génomique.

L’ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes: dans le tube 1, on réalisera une digestion par l’enzyme 1; dans le tube 2, une digestion par l’enzyme 2; etc....). On peut bien entendu réaliser des digestions par deux enzymes dans un même tube. Dans ces conditions, on obtient un très grand nombre de fragments, mais seuls quelques fragments correspondent à une partie ou à la totalité du gène étudié.

III. 2. 3. Séparation électrophorétique des fragments d’ADN par électrophorèse dans un gel d’agarose.

Après séparation électrophorétique en gel d’agarose des fragments d’ADN bicaténaires obtenus par digestion enzymatique, on réalise une dénaturation des fragments par un traitement alcalin du gel d’électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments d’ADN double brin (ou bicaténaires) en fragments d’ADN monobrin (ou monocaténaires).

III. 2. 4. Transfert des fragments monocaténaires du gel d’agarose à un support souple (feuille de nylon par exemple).

Le transfert des fragments monocaténataires du gel d’agarose à un support type nylon s’effectue par simple capillarité.

III. 2. 5. Fixation des fragments monocaténaires d’ADN sur le support souple et hybridation dans des conditions optimales de stringence avec une sonde complémentaire marquée à un radioisotope.

Les fragments monocaténaires d’ADN transférés sur un support solide souple (nylon) sont mis en présence d’une sonde qui va s’hybrider dans des conditions physico-chimiques bien définies. on parle de conditions optimales de stringence. La sonde s’apparie avec les fragments d’ADN monocaténaire selon les règles de complémentarité. De plus, elle est marquée avec un radioisotope (soit à son extrémité 5’, soit à l’intérieur de la chaîne polynucléotidique). Nous verrons plus loin la préparation des sondes.

III. 2. 6. Lavages et révélation (dans ce cas par autoradiographie).

Après de nombreux lavages, le support solide est mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs jours. Le film est ensuite révélé. Les bandes d’ADN monocaténaires hybridées avec la sonde radioactive sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc. La position de ces bandes par rapport à des témoins de poids moléculaire permet de déterminer la taille de ces fragments.

III.3. UTILISATIONS DE LA TECHNIQUE DE SOUTHERN.

Nous citerons parmi les applications de la technique de SOUTHERN:

III.3.1. Carte de restriction de l’ADN.

Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de séquences parfaitement définies. Il est donc possible d’établir une véritable carte d’un gène donné par la technique de SOUTHERN. Cette carte porte le nom de carte de restriction.

En pratique, l’ADN à étudier est réparti en différentes fractions. Chaque fraction est traitée par une enzyme de restriction ou un couple d’enzymes de restriction. Ainsi dans l’exemple ci-dessous. Dans le puits 1, on dépose l’ADN digéré par Eco RI seule; dans le puits 2, on dépose l’ADN digéré par Hind III seule et dans le puits 3, l’ADN digéré par Eco RI et Hind III. La détection des différents fragments est réalisée à l’aide d’une sonde marquée du gène étudié (voir schémas).

Cartographie selon SOUTHERN et résultats:

Interprétation:

(1): Position des coupures par Eco RI.

(2): Position des coupures par Hind III.

(3): Position des coupures par Hind III + Eco RI.

III.3.2. Si on dispose de sondes spécifiques du gène à explorer.

Mise en évidence des délétions dans un gène ou une zone juxta-génique. L’étendue de la délétion peut être estimée par la détermination de la taille des fragments d’ADN.

III.3.3. Comparaison de l’ADN de différents individus avec mise en évidence des polymorphismes de restriction.

En présence de mutation(s) ponctuelle(s) dans des sites de restriction, des variations dans la taille de certains fragments seront observées et ceci par exemple à l’intérieur d’une même population. Ces petites différences entre des individus dans une même population sont appelées de polymorphisme de taille des fragments de restriction (ou RFLP pour « restriction fragment length polymorphism »).

III.3.4. Mise en évidence des recombinaisons entre des gènes.

IV. LA TECHNIQUE D’AMPLIFICATION GÉNIQUE OU TECHNIQUE PCR® (« POLYMERASE CHAIN REACTION »).

IV. 1. PRINCIPE.

Cette technique décrite en 1985 (K. MULLIS et collaborateurs) permet d’amplifier des séquences d’ADN de manière spécifique et d’augmenter de manière considérable la quantité d’ADN dont on dispose initialement. Elle nécessite de connaître la séquence des régions qui délimitent l’ADN à amplifier. Ces séquences serviront à synthétiser des amorces oligonucléotidiques complémentaires (de longueur de 20 à 30 nucléotides en général). Ces oligonucléotides serviront à délimiter la portion d’ADN à amplifier. L’ADN polymérase les utilisera comme amorces.

IV. 2. RÉALISATION PRATIQUE.

La technique comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession de trois phases:

- Une phase de dénaturation par la chaleur pour séparer les deux brins d’ADN (92-95°C)(30 secondes-1 minute).

- Une phase d’hybridation avec les deux amorces spécifiques entre 55-60°C. La première amorce se fixe sur un brin d’ADN, l’autre sur le brin complémentaire (30 secondes-1 minute).

- Une phase d’extension par l’ADN polymérase à partir des amorces à 70-72°C (1-2 minutes).

Cette technique a pris un essor considérable avec l’introduction d’une ADN polymérase résistante à la chaleur. Cette ADN polymérase ou Taq polymérase est extraite d’une bactérie thermophile (Thermus aquaticus). Elle permet une automatisation des différents cycles (dans des appareils appelés thermocycleurs). Le nombre de cycles est généralement compris entre 30 et 40. Cette méthode permet d’amplifier l’ADN compris entre les deux amorces d’un facteur de 105 à 106. Les résultats doivent être optimisés en fonction d’un certain nombre de paramètres: concentration en MgCl 2, concentration en amorces, spécificité des amorces etc... Le choix des amorces est particulièrement crucial pour obtenir des résultats satisfaisants (spécificité, taille, paramètres physico-chimiques.....). L’introduction de logiciels spécialisés et des bases de données nucléotidiques a permis de réaliser des choix plus rationnels.

La Taq polymérase extraite de Thermus aquaticus présente une activité exonucléasique 5’à3’, mais elle est dénuée d’activité exonucléasique 3’à5’, c’est-à-dire de la fonction d’édition. Elle peut insérer des bases qui ne suivent pas la règle classique d’appariement et ceci au hasard. On estime qu’elle réalise une mauvaise incorporation toutes les 104 à 105 bases.

Cette technique a évolué considérablement. De nouveaux types de PCR ont été introduits. Nous citerons brièvement:

- La PCR dite « Multiplex » pour amplifier des gènes avec de nombreux exons (le gène CFTR impliqué dans la mucoviscidose possède 27 exons), il est possible d’introduire dans le milieu d’amplification des couples d’amorces spécifiques différentes.

- La PCR dite « Nested PCR ». Elle correspond à une seconde PCR réalisée en utilisant des nouuvelles amorces situées à l’intérieur du domaine défini par les amorces de la première PCR.

- La PCR quantitative. Dans ce type de PCR, on cherche à estimer le nombre de copies présent dans la séquence cible d’ADN ou d’ARN. La proportionnalité entre le nombre d’amplifications et le nombre de copies n’est valable que pour un nombre de cycles PCR faible.

IV. 3. UTILISATIONS DES PRODUITS PCR.

Les utilisations des produits PCR sont très variées, nous citerons quelques exemples (cette liste n’est pas exhaustive):

IV.3.1. Mise en évidence de mutations ponctuelles par hybridation des produits PCR avec des sondes oligo-nucléotidiques (technique dite du « dot-blot »).

Les produits PCR peuvent après transformation en monobrins être hybridés avec des sondes oligonucléotidiques fixées sur un support solide. Ces sondes correspondent à des séquences normales et pathologiques (présence de mutations ponctuelles par exemple) pour un gène donné.

IV.3.2. Analyse de restriction.

Le produit PCR est soumis à une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une mutation ponctuelle modifie le site de restriction intialement présent, la taille des fragments d’ADN obtenus après digestion sera modifiée et décelable après électrophorèse des fragments d’ADN (sur gel d’agarose ou gel de polyacrylamide).

A titre d’exemple, la mutation ponctuelle (GAGàGTG) sur le sixième codon du premier exon du gène b de la globine humaine entraîne l’apparition d’une hémoglobine anormale appelée hémoglobine S (mutation ponctuelle d’un acide aminé: GluàVal). Cette anomalie est répandue dans le monde entier. Elle est responsable à l’état homozygote d’une pathologie grave: la drépanocytose homozygote. Cette mutation entraîne une modification du site de restriction de l’enzyme Dde I: C / TNAG (N = A, T, C ou G).

La séquence suivante représente les 9 premiers codons normaux du premier exon du gène b de la globine humaine:

La mutation Hb S conduit à une mutation ponctuelle au niveau du codon 6 avec disparition du site de restriction pour l’enzyme Dde I:

 

 

L’électrophorèse des produits PCR après digestion par l’enzyme Dde I permet d’affirmer ou d’infirmer la présence d’une mutation GAGàGTG sur le codon 6 par la comparaison des tailles des fragments. On peut donc confirmer l’état hétérozygote ou l’état homozygote pour cette mutation.

IV.3.3. Introduction du produit PCR dans un vecteur: clonage du produit PCR (voir cours sur les vecteurs).

IV.3.4. Séquençage direct du produit PCR (voir cours sur le séquençage).

IV.3.5. Analyse électrophorétique des produits PCR: technique DGGE et technique SSCP).

Ces techniques d’analyse électrophorétiques des produits PCR sont particulièrement utiles pour mettre en évidence des mutations ponctuelles au niveau d’un gène. Des produits PCR (ou amplimères) particuliers sont formés si des mutations sont présentes sur l’ADN initial. Les produits PCR seront différents en fonction de la présence d’une séquence normale, d’une séquence mutée (homozygote, hétérozygote ou composite)(voir schémas).

IV. 3.5.1. Technique DGGE (pour « denaturating gel gradient electrophoresis »).

La température de fusion d’un produit PCR (ADN double brin), c’est-à-dire la température moyenne de séparation des deux brins est fonction de sa séquence. Une mutation ponctuelle qui change donc la séquence entraîne une modification de la température de fusion. Cette modification est mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence d’un gradient d’agent dénaturant.

IV. 3.5.2. Technique SSCP (pour « single strand chain polymorphism ».

La technique SSCP est basée sur l’analyse électrophorétique des produits PCR sous forme de fragments simple brin. On amplifie par PCR une région que l’on désire étudier et on compare la mobilité de l’ADN dénaturé portant une mutation par rapport à celle d’un fragment de référence comportant une séquence normale. Une mutation ponctuelle au sein d’une séquence modifie suffisamment la structure secondaire de l’ADN monobrin pour qu’il en résulte des changements de migration électrophorétique sur gel de polyacrylamide.

Les techniques DGGE et SSCP sont concurrencées par des techniques de chromatographie liquide à haute performance avec des températures d’élution variables (DHPLC: « denaturing high pressure liquid chromatography »).

V. LA RT-PCR.

La RT-PCR se déroule en deux phases. Une première phase correspond à la copie d’ARN messager en ADN complémentaire (cADN) et une seconde phase correspond à une réaction PCR classique sur le cADN synthétisé.

Dans la première phase, l’ARN messager à étudier est répéré en utilisant une sonde oligonucléotidique spécifique (amorce 1 qui s’hybride à l’extrémité 3’ du seul mARN auquel on s’intéresse), puis la transcriptase inverse (ou rétrotranscriptase) permet la synthèse du brin complémentaire (sous une forme de cADN simple brin), une seconde amorce oligonucléotidique spécifique (amorce 2) permettra la synthèse du second brin par extension.

L’ADN complémentaire synthétisé servira ensuite de matrice pour une réaction PCR classique.

La technique RT-PCR a permis de montrer que la transcription de tous les gènes s’effectuait dans tous les tissus et ceci même pour les gènes qui présentent une très grande spécificité tissulaire. On parle dans ces conditions de transcription illégitime. Il est évident qu’avant les techniques d’amplification génique, la sensibilité des méthodes classiques n’avait pas permis de mettre en évidence un tel phénomène.

VI. LE SÉQUENÇAGE DE L’ADN.

VI.1. TECHNIQUE DE SANGER.

VI.1.1. PRINCIPE.

Cette technique enzymatique est basée sur la copie d'un fragment d'ADN monocaténaire que l'on désire séquencer par une ADN polymérase. On utilise des didésoxynucléosides triphosphates. Ces dérivés ne possèdent pas d'OH en position 3' du désoxyribose. L'incorporation de ce didésoxyribonucléotide par l'ADN polymérase bloque l'allongement de la molécule d'ADN en cours de copie. En effet, l'allongement d'une chaîne polynucléotidique par une ADN polymérase nécessite un groupement OH en 3' disponible. Soit l'ADN bicaténaire suivant dont la séquence doit être déterminée :

5'   3'

 

G C T C A T C C A T G G A T T C G AC C A G T A G G T A C C T A A G C T

 

3'   5'     

Les deux brins d'ADN sont préalablement séparés par fusion. Considérons le brin orienté 3'-->5' :

C C A G T A G G T A C C T A A G C T

On réalise une hybridation avec une amorce de séquençage1 : GGTCATCC, orientée 5'-->3' :

5'   3'

 G C T C A T C C C C A G T A G G T A C C T A A G C T

 

3'   5'     

 

1 L'amorce de séquençage pour simplifier l'exposé a été volontairement réduite en nombre de nucléotides, ceci n'est pas le cas en pratique. L'exemple présenté ci-dessus est bien entendu essentiellement à but didactique.

Puis, on réalise une réaction de séquençage avec des dNTPs (dATP, dTTP, dCTP et dGTP) et de la Taq polymérase. On prépare quatre tubes identifiés : A, T, C et G.

Tube A T C GTaq polymérase + + + +

dNTPs + + + +ddNTP ddATP ddTTP ddCTP ddGTP

 

Dans le tube A : on introduit du ddATP.La synthèse d'ADN s'arrêtera au niveau de chaque A avec les fragments suivants:5'-GGTCATCCA-3' (8 nucléotides)5'-GCTCATCCATGGA-3' (13 nucléotides)5'-GCTCATCCATGGATTCGA-3' (18 nucléotides)

Dans le tube T : on introduit du ddTTP.La synthèse s'arrêtera au niveau de chaque T avec les fragments suivants:5'-GGTCATCCAT-3' (10 nucléotides)5'-GGTCATCCATGGAT -3' (14 nucléotides)5'-GGTCATCCATGGATT -3' (15 nucléotides)

Dans le tube C : on introduit du ddCTP.La copie d'ADN s'arrêtera au niveau de chaque C avec le fragment unique suivant :5'-GGTCATCCATGGATTC -3' (16 nucléotides)

Dans le tube G: on introduit du ddGTP.La synthèse s'arrêtera au niveau de chaque G avec les fragments suivants:5'-GGTCATCCATG-3' (11 nucléotides)5'-GGTCATCCATGG-3' (12 nucléotides)5'-GGTCATCCATGGATTC-3' (17 nucléotides)

On voit facilement qu'avec cette technique, si l'amorce ajoutée est marquée en 5' par un phosphate radioactif (32P), dans chaque tube, on aura différentes espèces qui présenteront toutes un marquage en 5' au phosphate radioactif.

nt = nucléotide (nombre de nucléotides)La lecture de ce gel se fait de bas en haut (des fragments de petite taille aux fragments de grande taille). On aura donc le résultat de séquençage suivant:

VI.1.2. Les appareils de séquençage automatique.La technique de Sanger s'est considérablement automatisée avec l'apparition des appareils de séquençage automatique. On utilise des amorces ou des didésoxynucléosides triphosphates marqués à des fluorochromes. La réaction de séquençage s'effectue comme décrite précédemment dans la technique manuelle de Sanger. La lecture du gel se fait par un balayage automatique qui permet de discriminer grâce à des fluorochromes différents les quatres bases A , T, C ou G. L'utilisation de

logiciels informatiques permet de fournir un tracé électrophorétique avec des couleurs différentes pour chaque base élémentaire.

 

VI.2. TECHNIQUE CHIMIQUE DE MAXAM ET DE GILBERT.

La méthode chimique de MAXAM et de GILBERT est moins utilisée actuellement que la méthode enzymatique de SANGER. L’ADN à séquencer est tout d’abord marqué en 5’ avec phosphore 32 (dATP), puis clivé après A, G, C ou T par divers réactifs chimiques. Après clivage par ces réactifs, les fragments produits sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide. L’examen de l’autoradiographie correspondante permet de connaître la séquence du brin analysé.

VII L'HYBRIDATION MOLECULAIRE.

Nous avons déjà défini la température de fusion d'un ADN bicaténaire ainsi que les facteurs qui influencent celle-ci comme la composition en bases ou la nature du milieu dans lequel l'ADN est en solution. D'autres facteurs importants interviennent comme la longueur des fragments d'ADN ou la présence éventuelle dans l'ADN bicaténaire initiale de mésappariements.

A l'inverse après séparation de brins par fusion, si la solution d'ADN est refroidie lentement dans des conditions de milieus favorables, une réassociation des brins est progressivement observée. Ce phénomène est appelé hybridation moléculaire. Cette réassociation peut concerner deux séquences d'ADN ou une séquence d'ARN complémentaire. Elle est donc d'une spécificité très grande.

VII.1 LES FACTEURS AFFECTANT L'HYBRIDATION MOLECULAIRE.

L'hybridation moléculaire dépend d'un grand nombre de facteurs.

- Tout d'abord le temps. Plus le temps de réaction est long, plus la probabilité d'appariements pour des séquences complémentaires augmente.

- La concentration en acides nucléiques. Plus la concentration en acides nucléiques est élevée, plus la probabilité de rencontres entre des séquences complémentaires est élevée. En pratique on introduit le produit temps x concentration en acides nucléiques, Ce paramètre est appelé Cot pour les hybridations entre fragments d'ADN et Rot pour les hybridations d'ARN et d'ADN. On utilise souvent les valeurs de Cot 1/2 et de Rot 1/2 qui correspondent respectivement à 50% d'hybridation dans le cas d'hybridation moléculaire d'ADN ou d'ADN-ARN.

- D'autres facteurs interviennent : la nature du milieu, la longueur des fragments, la présence d'agents chimiques supplémentaires (phénol...) etc...

 

QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES ET LES RÉPONSES

Outils enzymatiques et techniques de base de la biologie moléculaire

1. Amplification PCR et longs fragments initiaux.L'amplification PCR génère des amplimères dont la taille est supérieure à la taille escomptée, ceci particulièrement dans les premiers cycles de la PCR. L'amplification de ces fragments n'est cependant pas exponentielle.

2. Les dot-blots: homozygotie et hétérozygotie pour une mutation ponctuelle, marquage des amorces pour la PCR.

Les amorces nécessaires pour réaliser l'amplification PCR sont marquées. Il peut s'agir d'un marquage chaud par un radio-isotope (32P) ou d'un marquage froid (biotine). L'hybridation se fait dans les conditions optimales de stringence1 entre les produits PCR dénaturés et les sondes oligonucléotidiques fixées sur le support solide (sondes normales et sondes portant une mutation ponctuelle). Après hybridation, lavages, on peut déceler la présence d'une mutation donnée à l'état hétérozygote ou à l'état homozygote.1 Les conditions de stringence d'une hybridation moléculaire correspondent aux conditions optimales physico-chimiques d'hybridation (température, temps, tampon, pH, additif éventuel...).

3. Technique du Southern-Blot.

3.1. Liens entre le Southern-Blot et sites de restriction. Notion de carte de restriction, polymorphisme de restriction.La révélation dans le cas du Southern-blot est étroitement dépendante du couple enzyme de restriction-sonde. Il est impératif de choisir avec soin la sonde pour déceler les fragments de restriction situés dans le domaine reconnu par la sonde.

3.2. Transformation des fragments d'ADN bicaténaires en fragments d'ADN monocaténaires dans le gel d'électrophorèse.Après migration électrophorétique des fragments d'ADN bicaténaires sur un gel d'agarose, il y a une dépurination par un traitement du gel avec de l'acide chlorhydrique dilué. Puis, le gel est plongé dans une solution de soude diluée ce qui permet la transformation des fragments d'ADN bicaténaires en fragments d'ADN monocaténaires.

3.3. Pré-hybridation dans le Southern-Blot.La pré-hybridation dans le Southern-Blot est une nécessité, car elle permet de diminuer le bruit de fond lié à la fixation non spécifique de la sonde radioactive sur le support de transfert (nylon par exemple). Cette pré-hybridation est souvent réalisée avec une solution d'ADN d'origine animale (par exemple de l'ADN de sperme de saumon).

3.4. Nécessité de reconnaissance par la sonde (exemple double digestion Hind III et Eco RI).Dans l'exemple présenté de double digestion par Hind III et Eco RI, le fragment de 4,5 kb n'est pas reconnu par la sonde utilisée.

3.5. Il est toujours possible de réaliser une déshybridation d'une sonde.

4. ADN polymérase I et le fragment de Klenow.L'ADN polymérase I comme le fragment de Klenow présentent une activité exonucléasique 3'à5' qui est à la base de la fonction d'édition (ou " proofreading ") de l'enzyme.

5. La séquenase.La séquenase est une ADN polymérase dérivée d'une ADN polymérase d'E. coli infecté par le bactériophage T4. Cette ADN polymérase est dépourvue de l'activité 3'-->5' exonucléasique donc de la fonction d'édition. Elle n'a pas d'activité 5'-->3' exonucléasique.

6. La nucléase S1.La nucléase S1 coupe les acides nucléiques qui sont sous forme de monobrins. Elle ne coupe pas les ADN double brin (ou bicaténaires) et les hybrides ADN-ARN.

7. Les rétrotranscriptases.Deux formes commerciales de rétrotranscriptases sont principalement utilisées. Elles proviennent de rétro-virus: AMV (avian myeloblastosis virus) et Mo-MLV (Moloney murine leukemia virus). Ces rétrotranscriptases présentent une activité RNase.

8. La réaction typique des ADN polymérases.Dans la réaction suivante typique de l'action des ADN polymérases:

(dNMP)n + dNTP à (dNMP)n+1 + PPi

avec:dNTP = désoxynucléosides triphosphates avec N = A, T, C ou G.PPi = pyrophosphate. MP =monophosphate.(dNMP)n+1 = chaîne d'ADN en cours d'élongation.

9. Coloration des gels d'agarose par le B.E.T (bromure d'éthidium).Le B.E.T. est un agent intercalant, mais il peut révéler des mARN ou des cADN monocaténaires. En principe, on fait migrer des cADN bicaténaires (voir le Northern Blot).

10. Activité exonucléasique des ADN polymérases: L'activité 3'-->5' exonucléasique de l'ADN polymérase I (Kornberg) libère des nucléosides 3'-monophosphates.etL'activité 5'-->3' exonucléasique de l'ADN polymérase I (Kornberg) libère des dinucléotides (avec un 5' phosphate) et peut-être des nucléosides 5'-phosphates.

11. L'électrophorèse en champ pulsé est essentiellement utilisée pour des fragments d'ADN très volumineux (en principe supérieurs à 50 kb).

12. Extraction de l'ADN.L'enzyme protéolytique utilisée est la protéinase K, puis on traite par le mélange phénol/chloroforme. Le phénol est un agent efficace de dénaturation des protéines. Les procédés d'extraction de l'ADN actuels disponibles sur le marché peuvent être libres de phénol. On utilise cependant un traitement préalable par la protéinase K.

13. Température de fusion (Tm) et température optimale d'hybridation (Ta optimale).La température de fusion d'un fragment d'ADN peut être déterminée avec précision en suivant l'absorbance à 260 nm d'une solution de ce fragment en fonction de la température. Le passage de la forme double-brin à la forme simple-brin se traduit par une augmentation rapide de l'absorbance (ou densité optique), la courbe est de type sigmoïde. Le point d'inflexion de cette courbe correspond à la température de fusion ou Tm. Cette température de fusion dépend étroitement de la composition du fragments en bases G, C, A et T. Il existe des formules pour calculer directement la valeur du Tm en fonction de la composition en bases.

La température d'hybridation (ou température optimale d'hybridation) est une notion de la PCR. Elle correspond à la température à laquelle l'hybridation des amorces se fait pendant la PCR. Il est donc évident qu'il faut connaître la valeur des températures de fusion des amorces pour déterminer la température optimale d'hybridation. En général, les amorces sont utilisées

à une température d'hybridation (Ta) inférieure de 5°C à leur Tm ou à la Tm la plus faible des deux amorces.

14. Choix des amorces pour la PCR.Le choix des amorces doit se faire de manière rationnelle. Il est indispensable de choisir des amorces de taille suffisante (20-30 nucléotides). Les amorces peuvent être choisies par l'utilisation de banques de données informatiques sur de nombreux gènes disponibles par Internet. Après sélection des amorces, il faut vérifier par des logiciels spécialisés les propriétés physico-chimiques des amorces retenues. L'appariement des amorces (formation de dimères d'amorces) de même que des différences importantes entre les températures d'hybridation des amorces peuvent être des problèmes délicats à résoudre.

15. Séparation des acides nucléiques en gradient continu de chlorure de césium.Les acides nucléiques (ADN monobrin, ADN double brin et ARN) peuvent être séparés par ultracentrifugation en solution concentrée de chlorure de césium (8 M). L'ultracentrifugation aboutit à la constitution de zones de densité où vont se stabiliser les différents constituants. Dans le sens croissant de densité (du sommet au fond du tube), on peut séparer : l'ADN bicaténaire, l'ADN monocaténaire et enfin l'ARN.

16. Coupure par les nucléases.Soit le polynucléotide suivant :

5'-----pApCp-----3'

p = phosphate.

Des nucléases peuvent couper :

5'-----pAêpCp-----3'

Cette attaque conduit aux produits suivants :

5'-----pA-OH-3'

et5'-pCp-OH-3'

Par contre l'attaque suivante :

5'-----pApêCp-----3'

conduit à :

5'----pAp-3'

et

5'OH-Cp-3'

17. Note complémentaire sur les topoisomérases.Parmi les topoisomérases :

1. Certaines peuvent relâcher les super-tours négatifs.

2. D'autres peuvent relâcher les super-tours négatifs et positifs.

3. Enfin, certaines peuvent introduire des super-tours négatifs.

Deux classes de topoisomérases existent :

- Les topoisomérases de type I. Leur action sur les super-tours est possible parce qu'elles réalisent une coupure transitoire d'un seul brin d'ADN.

- Les topoisomérases de type II. Leur action sur les super-tours est possible parce qu'elles réalisent une coupure transitoire des deux brins d'ADN. En général, elles agissent sur les super-tours positifs et les super-tours négatifs.

Les topoisomérases existent aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Chez les procaryotes, une topoisomérase de type I bien caractérisée est codée par le gène topA chez E. coli. Cette topoisomérase relâche l'ADN avec super-tours négatifs. Elle n'agit pas sur les super-tours positifs.L'ADN gyrase bactérienne est une topoisomérase de type II qui peut introduire des super-tours négatifs dans un ADN circulaire bactérien à l'état relâché.

L'amplification PCR d'une grande partie du gène b de la globine est réalisée en utilisant au cours d'une même PCR, deux couples d'amorces A1 et A2, B1 et B2. Les tailles des produits PCR sont contrôlées par électrophorèse en gel d'agarose. Dans un même tube PCR, il est possible d'introduire N couples d'amorces, bien entendu l'obtention des produits PCR correspondants nécessite des conditions de déroulement de la PCR très voisines des PCR réalisées avec un seul couple d'amorces.

L'HYBRIDATION SPECIFIQUE AVEC DES SONDES OLIGONUCLEOTIDIQUES

Les produits PCR (PCR classique ou multiplex) sont dénaturés en ADN monobrin et peuvent être hybridés avec des oligo-nucléotides normaux ou pathologiques fixés de manière covalente à un support solide. La présence du produit d'hybridation après lavages est décelée par réaction enzymatique grâce à la biotine fixée sur les amorces PCR. Les amorces PCR sont en effet marquées en 5' par de la biotine. La biotine réagit avec la streptavidine-peroxydase (ou phosphatase alcaline) pour la révélation enzymatique.SEQUENÇAGE AUTOMATIQUE DOUBLE BRIN SUR SEQUENCEUR LI-COR 4200

Cette technique de séquençage fait appel à un marquage des amorces (" Dye Primer "). Il est possible d'utiliser un marquage des di-désoxynucléotides (ddNTPs) avec les marquages 700 et 800 nm (" Dye Terminator "). On veut déterminer la séquence de l'ADN double brin suivant :

Les réactions de séquençage sont préparées dans quatre tubes : A, T, C et G. La synthèse d'ADN est réalisée en présence d'une Taq polymérase, de dNTPs et des ddNTPs spécifiques. L'appareil peut effectuer après migration électrophorétique une double détection aux deux longueurs d'onde par balayage du gel. Le tube de séquençage indiqué ddA contiendra différentes espèces dont l'extrémité 3' est terminée par ddA et l'extrémité 5' comporte un marquage soit à 700 nm, soit à 800 nm. Ces espèces sont séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide par une migration verticale.

APPAREIL DE SEQUENÇAGE AUTOMATIQUE LI-COR 4200