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Biologie Moleculaire-2013 2

Horaire Exercice 1 9 janv. Concentrations et Dilutions

Utilisation des micropipetteurs

Préparation d’un gel d’agarose

Électrophorèse sur gel d’agarose

Exercice 2 16 janv. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ; isolation d’ADN plasmidique

Enzymes de restrictions et l’électrophorèse sur gel d’agarose

Exercice 3 23 janv. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ; PCR

Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN

Exercice 4 30 janv. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ

Électrophorèse des amplicons de PCR

Purification des amplicons de PCR

Digestion des amplicons de PCR et du vecteur pUC19

Ligature des amplicons de LacZ


Exercice 5 6 févr. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ

Transformation des ligatures

Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN (Dernière chance)

Projet III: Empreintes génomiques

Isolation d’ADN génomique humain des cellules de joues


MI-SESSION Samedi 9 févr.

Exercice 6 13 févr. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ

Criblage par PCR des transformants

Analyse des produits du PCR de colonies

Repiquage sur X-Gal

Projet III: Empreintes génomiques

SEMAINE D’ÉTUDE 17-23 févr.

Exercice 7 27 fév. Projet IV : Contrôle transcriptionnel du gène Mel1

Isolation d’ARN de levures

Électrophorèse d’ARN

Transfert Northern

RT-PCR

Exercice 8 6 mars Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1

Hybridation Northern

Analyse des réactions de RT-PCR

Exercice 9 13 mars Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1

Immunodétection des membranes Northern

Projet V: Contrôle traductionnel de l'alpha galactosidase et de la bêta galactosidase

Essais des activités enzymatiques

EXAMEN FINAL PRATIQUE 20 mars

SEMAINE LIBRE 26 mars

EXAMEN FINAL THÉORIQUE 3 avr.


Exercice 1

Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !

Concentrations et Dilutions


Préparation d’un gel d’agarose

Électrophorèse sur gel d’agarose


Introduction aux concentrations Une propriété très importante au sujet des solutions qui doit être adressée c’est la concentration.

En général, la concentration indique la quantité d’un soluté dans une quantité donnée d’une

solution. Pour travailler avec des concentrations vous devez tenir à l’esprit les distinctions entre le

soluté, le solvant et la solution.

Puisque différentes quantités de solutés peuvent être dissoutes dans une solution, la concentration

est une propriété variable. Nous avons donc besoin d’une façon numérique pour indiquer comment

concentrée est une solution. Une variété de différentes façons ont été développées pour calculer et

exprimer les concentrations des solutions.

Ceci peut être fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les

deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres à la façon que les

composés chimiques réagissent entre eux (moles).

Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront présentés. Elles incluent le

pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la

molarité (l’utilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume.

Vous obtiendrez de l’expérience avec plusieurs des façons d’établir la concentration d’une solution.

Vous pouvez préparer une solution à partir des matières brutes et mesurer chacune des composantes

qui doivent être présentes dans la solution. Vous pouvez préparer une solution en diluant une

solution préexistante. Si une solution est colorée, vous pouvez déterminer sa concentration en

mesurant l’intensité de la couleur par colorimétrie.

POURCENTAGE

L’utilisation des pourcentages est une façon commune pour exprimer la concentration d’une

solution. C’est une approche simple qui indique la quantité d’un composé par 100. Les

pourcentages peuvent être calculés en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une

façon, que vous connaissez, sans doute, d’exprimer les concentrations est le pourcentage par

volume. Une autre façon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre façon est un hybride

appelé le pourcentage par poids/volume.

Le pourcentage par volume est habituellement utilisé quand la solution est préparée en

mélangeant deux liquides.

Par exemple, l’alcool à friction est habituellement

70% par volume d’alcool isopropyl. Ceci veut dire

que 100 mL de solution contient 70 mL d’alcool

isopropyl. Ceci veut aussi dire qu’un litre (ou 1000

mL) de cette solution contient 700 mL d’alcool

isopropyl et assez d’eau pour compléter le volume

à un total de 1 litre ou 1000 mL.

Pourcentage par volume = volume du soluté

volume de solution x 100


Le pourcentage par poids est une façon d’exprimer la concentration d’une solution comme le

poids du soluté/poids de la solution.

Pourcentage par poids = Poids du soluté

Poids de la solution x 100

À titre d’exemple, considérons une solution

de 12% NaCl par poids. Une telle solution

aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100

grammes de solution. Pour préparer une telle

solution, vous pourriez peser 12 grammes de

NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes d’eau,

afin que la masse totale de la solution soit de

100 grammes. Puisque les masses sont

conservées, les masses des composantes de

la solution s’additionneront à la masse totale

de la solution.

12 % NaCl solution = 12 g NaCl

100 g solution

12 g NaCl

(12 g NaCl + 88 g eau) = 12% NaCl solution

Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse d’une solution, vous devez

diviser la masse du soluté par la masse de la solution (la somme combinée de la masse du soluté et

du solvant) et ensuite multipliée par 100 pour la changer en pourcentage.

Pourcentage par poids/volume

Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le

pourcentage masse/volume. Cette variante mesure la quantité de soluté en grammes, mais mesure la

quantité de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle

contient 5 g de NaCl pour chaque 100 mL de solution.

Pourcentage par volume = Poids du soluté (en g)

Volume de solution (en mL) x 100

Cette façon est la manière la plus couramment utilisée dans ce cours pour exprimer les solutions en

pourcentages.


MOLARITÉ

Une autre façon d’exprimer une concentration

s’appelle la molarité. La molarité c’est le nombre

de moles de soluté dissout dans un litre de

solution. Les unités sont donc moles par litre,

plus précisément, c’est les moles de soluté par

litre de solution.

molarité = moles de soluté

litre de solution

Plutôt d’écrire moles par litre, l’abréviation “M” est utilisée pour ces unités. Alors, quand vous

voyez la lettre M cela signifie molarité et représente moles par litre (pas seulement moles). Vous

devez faire très attention de distinguer entre moles et molarité. "Moles" est une mesure de la

quantité que vous avez d’une composante; "molarité" mesure la concentration de la composante.

Alors quand un problème vous est donné, qui stipule que la concentration d’une solution est 0.1 M,

ceci veut dire qu’elle possède 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que c’est

0.1 mole.

POIDS/VOLUME

Cette façon d’exprimer une concentration est très semblable à celle des pourcentages et représente

une des façons les plus populaires utilisées par les biologistes moléculaires. Contrairement au

pourcentage, la concentration est exprimée par quelconque volume l’utilisateur désire utiliser. Plus

communément, ces concentrations sont exprimées par une unité de mesure. Par exemple, par 1 mL

ou 1 µL ou 1L, etc. Essentiellement, ces expressions représentent la masse d’un soluté dans une

quantité donnée de la solution. Par exemple, une solution qui est à une concentration de 1mg/mL

contient 1mg de soluté dans 1 mL de solution.


Les dilutions et l’utilisation des micropipetteurs

Les dilutions : Savoir préparer des dilutions est essentiel pour la préparation de plusieurs réactifs, mélanges

réactionnels, et solutions utilisées dans les laboratoires de biologie moléculaire. Essentiellement, les

dilutions servent à réduire la concentration initiale du composé afin d’atteindre une nouvelle

concentration voulue. Les solutions préparées par l’entremise de dilutions peuvent être composées

d’un ou de plusieurs composés. Le nombre d’ingrédients dans la solution à être préparée

n’influence aucunement la formulation des dilutions. Un bref survol de la préparation des dilutions

est présenté ci-dessous. Assurez-vous de bien comprendre leurs préparations, car vous serez appelé

à les préparer tout au cours de la session ainsi que pour l’examen final.

La compréhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La concentration, le

facteur de dilution, et la dilution.

La concentration se définit comme la quantité d'un composé pour un volume total de solution.

Puisqu'une quantité peut être exprimée de plusieurs façons, les concentrations sont exprimées

comme l'unité de mesure de la quantité du composé/volume total et final.

E.x. Gram/Litre

Molécules/Litre

Moles/Litre

Etc.

Le facteur de dilution représente la multiple arithmétique par laquelle une concentration initiale

doit être divisée afin d'obtenir la concentration finale désirée. Par exemple, si une solution contient

30 grammes de caféine par 1L de solution et que vous désirez réduire la concentration de caféine à

0.3 Grammes/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100, ce qui représente le facteur

de dilution. Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de déterminer un facteur de dilution.

Le facteur de dilution = Concentration initiale ou Ce que j’ai

Concentration finale Ce que je désire

La dilution représente la fraction du composé étant examiné. Par exemple, dans le problème

précédent, une dilution de 1/100 a été effectuée. La dilution est exprimée comme une fraction de 1

sur le facteur de dilution. C.a.d. que la solution initiale est représentée comme une fraction de

l’original sur le total. Par exemple si vous avez déterminé qu’une dilution de 1/100 doit être

préparée, cela veut dire qu’un centième de la nouvelle solution doit être représenté par la solution

originale. Donc pour un volume total de disons 2mL, 0.02 mL doit être représenté par la solution

originale.


Préparer une solution qui requière la dilution de plus d’un ingrédient : Le principe pour la formulation d’une solution qui nécessite la dilution de plus d’un composé est la

même que pour une solution avec seulement qu’une composante. La seule différence est le volume

de solvant qui doit être ajouté.

Disons par exemple que l’on désire préparer 10mL d’une solution de 0.1M à partir d’une solution

mère de 2M.

Pour calculer le facteur de dilution : Ce que j’ai = 2M = 20

Ce que je désire 0.1M

Donc la dilution requise est de 1/20 ce qui veut dire qu’un vingtième du total doit être représenté

par la solution originale.

Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la solution mère et compléter avec 9.5mL de

solvant.

Si la solution à préparer inclut une deuxième composante; disons que celle-ci doit être à une

concentration finale de 0.5 M et que la solution mère est de 3M.

Encore une fois pour calculer le facteur de dilution : Ce que j’ai = 3M = 6

Ce que je désire 0.5M

Donc la dilution requise est de 1/6. Ce qui veut dire qu’un sixième du total doit être représenté par

la solution originale.

Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la première solution, 1.7mL de la deuxième

solution et puis complété avec 7.8mL de solvant.

Si les explications ci-haut ne sont pas suffisantes, vous pouvez consulter le site web suivant :

http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/HtmL/dilutions.html

http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/HtmL/dilutions.html



Les micropipettes sont des outils indispensables dans les laboratoires de biologie moléculaire

modernes. Quelle est l’exactitude des vôtres? Quelles sont leurs précisions? Quelle est la

différence entre l’exactitude et la précision?

Dans le cas de l’exactitude, il s’agit de la performance comparativement à une valeur de référence.

Tandis que la précision est une indication, de la fiabilité ou la répétitivité est ne dépend pas

nécessairement d’une référence. Ces deux attributs sont indépendants l’un de l’autre. Il est possible

d’avoir un instrument qui est précisément inexact (ou exactement imprécis)!

Analogie d’une cible pour illustrer l’exactitude et la précision

Dans cet exemple, le centre de la cible représente la référence à laquelle l’exactitude est évaluée.

Afin d’évaluer de façon simultanée l’exactitude et la précision de vos pipettes vous devez faire des

mesures multiples afin de calculer le % d’erreur de la moyenne et l’écart type des mesures pour

chacune de pipettes.

Directives pour l’utilisation des micropipetteurs Gilson

Vous avez des micropipettes de trios grandeurs. La P-1000, la P-200 et la P-20. Le numéro du

modèle indique le volume maximal en microlitres. Initialement, vous devrez déterminer quelle

pipette utiliser sous des circonstances données. Par exemple, si vous devez transférer 0.18 mL vous

aurez probablement besoin de la P-200 puisque 0.18 mL = 180 µL car la P-200 fera la mesure de ce

volume avec une exactitude et une précision plus grande que ne le ferait la P-1000.

Règles:

Toujours utiliser un embout jetable. La P-20 et la P-200 utilisent les plus petits embouts et

la P-1000 utilise les plus gros.

Ne jamais aspirer du liquide dans le baril blanc de la pipette.

Ne jamais déposer la pipette quand il y a du fluide dans l’embout. Le fluide pourrait

accidentellement se retrouver dans le baril.

Ne jamais tourner le réglage de volume au dessus ou en dessous de l’étendue prévue.

Afin de maximiser la précision, toujours utiliser la pipette de plus petit volume qui

correspond au volume total donné.

1. Régler le volume désiré:

Ajustez le volume à un réglage légèrement plus élevé que celui désiré, et ensuite

retournez-le à celui désiré.

2. Placer un embout:

Pousser l’embout fermement avec une motion de torsion. L’embout doit créer un

joint étanche avec le baril de la pipette.

Exact et précis Précis & inexact Imprécis & inexact


3. Peser le piston jusqu’au premier arrêt.

4. Introduire l’embout dans le liquide que vous désirez transférer. Pas trop loin, juste un peu

sous la surface.

5. Lentement, relâchez le piston.

6. Tout en retirant l’embout, toucher le côté de la paroi du tube afin de retirer l’excédant de

fluide de l’extérieur.

7. Afin de livrer, peser sur le piston jusqu’au premier arrêt, puis jusqu’au fond.

Ne jamais livrer de très petits volumes dans le vide. Toujours livrer dans un liquide

ou sur la paroi du tube, de telle façon à ce que la force d’adhésion va retirer le

liquide livré de l’embout.

8. Avec le piston, toujours complètement au fond, retirer l’embout du liquide.

RAPPELEZ-VOUS QUE VOS MICROPIPETTEURS SONT DES INSTRUMENTS

DISPENDIEUX!

EXERCICE DE DILUTIONS AVEC LES MICROPIPETTEURS (CET EXERCICE DOIT ÊTRE FAIT PAR CHAQUE PERSONNE)

Nous avons inclus cet exercice afin que chacun se familiarise avec la préparation des dilutions,

l’utilisation du micropipetteur et des embouts. (TOUJOURS ÉTIQUETER VOS TUBES!!)

Matériaux: Solution I (1% Composé “A” (m/v); P.M. 800g/mole)

Solution II (1.2M Composé “B” P.M. 60g/mole; Densité: 1.6g/mL)

Méthode:

1. Préparer 1mL de chacune des solutions suivantes des solutions mères ci-dessus.

a. Une solution de 1.5mM du composé “A”.

b. Une solution de 0.36% (m/v) du composé “B”.

c. Une solution de 6% (v/v) de la solution I.

d. Une solution qui contient 0.5mg du composé “A” et 0.1% (v/v) du composé “B”.

2. Transférer 100µL de chacune des solutions aux puits appropriés d’une plaque de 96 puits tel

qu’indiqué ci-dessous:

Plan de la plaque à 96 puits (une plaque/Table)

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Personne 1 Groupe 1

Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Personne 2








Essai de protéines de Bio-Rad

Cette méthode qui est fondée sur la méthode de Bradford, est une procédure simple et précise pour

la détermination de la concentration de protéines solubilisées. Elle implique l’ajout d’un colorant

acide à la solution de protéine, après quoi des mesures au spectrophotomètre ou à l’aide d’un

lecteur de plaque à une longueur d’onde de 595 nm sont faites. Une comparaison à une courbe

étalon permet ensuite d’obtenir une mesure relative de la concentration de protéine.

Matériaux

Colorant

ASB 5mg/mL

ASB de concentration inconnue

Méthode : (Groupe de 2)

1. Préparer 200µL de chacune des solutions de référence protéiques de 0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 et

1.0mg/mL.

2. Préparer des échantillons de 1mL de la solution de protéine de concentration inconnue

(dilutions de 1/4 et 1/10).

3. Pipeter 10μL de chacune des solutions de référence et de l’échantillon inconnu dans des puits

indépendants de la plaque.

4. Ajouter 200μL du colorant dilué à chaque puits. Bien mélanger les échantillons et le colorant.

5. Incuber à la température de la pièce pour au moins 15 minutes.

6. Obtenir les lectures d’absorbances à 595 nm.

Plan de la plaque pour l’essai de Bradford

ND: échantillon non dilué

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB

Standard Personne 1

Personne 2 Groupe 1

0 ND 1/4 1/10 Inc.

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB

Standard Personne 1

Personne 2 Groupe 2

0 ND 1/4 1/10 Inc.

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB

Standard Personne 1

Personne 2 Groupe 3

0 ND 1/4 1/10 Inc.

0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB

Standard Personne 1

Personne 2 Groupe 4

0 ND 1/4 1/10 Inc.


Digestions par enzymes de restrictions Au milieu des années 1970, le domaine de la biologie moléculaire a connu une croissance

importante grâce à l’utilisation des endonucléases de restriction pour le clivage d’ADN à des sites

spécifiques. Il existe maintenant plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes disponibles

commercialement. Vous pouvez trouver de l’information détaillée sur plusieurs d’entre elles

(incluant celles que vous utiliserez dans ce cours) dans des catalogues de produits commerciaux.

Leurs spécificités les rendent particulièrement utile pour plusieurs tâches incluant entre autres la

cartographie de l’ADN, le clonage et le sous clonage de l’ADN, etc. Le but de ce premier

exercice est de faire des digestions simples de votre ADN afin de répondre aux questions

suivantes :

Quelles enzymes coupent dans l’insertion?

Quelles enzymes ne coupent pas dans l’insertion?

Quelle est la taille de l’insertion?

Quelles sont les positions possibles des différents sites de restrictions?

Le fragment d’ADN a été inséré dans quel site de restriction du SCM?

Pour de plus amples informations au sujet des enzymes de restrictions consultez le site Web

suivant : NOTEZ : VOUS ÊTES RESPONSABLE POUR CETTE INFORMATION!!

http://askabiologist.asu.edu/expstuff/mamajis/restriction/restriction.html

Électrophorèse sur gel d’agarose L’électrophorèse sur gel d’agarose implique la séparation de molécules d’ADN d’après leurs tailles

et leurs conformations. La migration électrophorétique d’un fragment d’ADN dans l’agarose est

inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire (ceci est vrai seulement pour

certaines gammes de taille sous des conditions définies). [Conseil! Quand vous estimez la taille de

fragments de restrictions, gardez à l’esprit la précision requise, spécifiquement le nombre de

chiffres significatifs! La concentration de l’agarose utilisée dépend de l’éventail des tailles étant

étudiées; pour la séparation d’ADN linéaires entre 0.5 kb et 10 kb, un gel d’agarose de 1% est

habituellement utilisé. Suite à l’électrophorèse, les gels sont visualisés sous des ultras violets et

photographiés avec une caméra numérique. L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la

quantité (et la longueur) de l’ADN linéaire. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir une

estimation de la quantité d’ADN dans les échantillons.

L’électrophorèse sur gel d’agarose utilise un courant à haute tension ce qui peut présenter un

danger. Le boîtier qui contient le gel est muni d’un mécanisme de connexion spécial pour des

raisons de sécurité. Les connexions doivent donc être retirées avant de pouvoir ouvrir le couvercle.

COUPEZ TOUJOURS L’ALIMENTATION AVANT DE DÉBRANCHER L’APPAREIL.

Le bromure d’éthidium, qui est utilisé comme colorant des gels d’agarose afin de pouvoir observer

l’ADN sous lumière UV, est un agent cancérigène potentiel. Toujours porter des gants pour

manipuler tout ce qui en contient. La source de lumière UV est aussi très dangereuse pour la peau et

surtout pour vos yeux, assurez-vous donc de bien vous protéger (gants, sarrau, masques) lorsque

vous observez vos gels d’agarose.

http://askabiologist.asu.edu/expstuff/mamajis/restriction/restriction.html


Chaque appareil a deux supports de gels et deux peignes (8-puits et 14-puits contenants environ

14μL et 6μL respectivement), donc lorsque vous faites migrer deux (ou plus) gels durant un après-

midi, les gels peuvent être coulés en séquence (en entreposant le premier, couvert d’une pellicule de

plastique, jusqu’à l’utilisation). Une autre méthode plus rapide (mais un peu plus risqué) est de

couler les deux gels en même temps. Un gel est coulé dans le boîtier et l’autre sur le comptoir avec

les bouts du support de gel collés avec un ruban. Le peigne doit être aligné perpendiculairement à la

direction de migration (en utilisant les barres rouges). Placez les gels hors de portée pour ne pas les

déranger lors de leur solidification.

Rappelez-vous que les gels à 8 puits contiennent à peu près deux fois plus d’ADN que les gels à 14

puits à cause de la taille de leurs puits. De plus, si vous utilisez des enzymes de restriction avec des

sites de reconnaissances de 4 pb plutôt que 6 pb, ou une combinaison d’enzymes de restrictions, on

s’attend à avoir plus de fragments (dont la coloration sera moins intense). Vous devriez alors

utiliser plus d’ADN (et peut-être une plus forte concentration d’agarose- ex. 1.5%, au lieu du 1%

standard) afin d’obtenir une meilleure résolution pour les fragments de faible masse moléculaire.

MÉTHODE: (Groupes de 2)

A. PRÉPARATION DU GEL D’AGAROSE (peigne à 8 puits)

Matériaux :

Agarose

10X TBE

1. Préparer dans votre cylindre gradué 200mL de tampon TBE à une concentration finale de 1X.

Assurez-vous de bien mélanger.

2. Mélanger la quantité appropriée d’agarose pour obtenir une concentration finale de 1.0% m/v

dans 25mL de tampon TBE de 1X.

3. Pour dissoudre l’agarose, chauffé au micro-ondes (25-45 secs.). Recouvrir le flacon d’une

pellicule de plastique afin de minimiser l’évaporation). Lorsque l’agarose sera complètement

dissout, laissez refroidir jusqu’à 50-60oC (à peu près 5 minutes).

4. Ajoutez 2 gouttes (avec le compte goutte) d’une solution mère de bromure d’éthidium à

1mg/mL (ATTENTION! CANCÉRIGÈNE!) et bien mélanger.

5. Versez l’agarose dans le support à gel. Après avoir versé le gel, placer le peigne de 8 puits

(volume qui peut être accommodé est approx. 14µL) et enlever toutes les bulles d’airs (avec un

embout jaune de micropipetteur). Refermez le couvercle de l’appareil et laissez solidifier le gel

pour au moins 15-20 minutes.

6. Une fois le gel solidifié, retirez les joints noirs puis versez une quantité suffisante du tampon

TBE 1X dans l’appareil pour recouvrir le gel d’environ 0.5cm.

7. Enlevez lentement le peigne.


B. CONSEILS POUR VÉRIFIER L’OPÉRATION ADÉQUATE DE VOTRE GEL

8. Branchez les électrodes de façon à ce que la cathode (électrode négative) soit à l’extrémité qui

représente l’origine du gel. Les échantillons vont migrer au travers du gel vers l’anode

(électrode positive). (ATTENTION! HAUTE TENSION!).

9. Régler l’appareil pour ~ 100V. Allumez l’appareil. Vérifier que votre intensité est dans les

environs de 40-55 mA. Si cela n’est pas le cas, il y a un problème.

Problèmes possibles :

Le tampon de migration est à la mauvaise concentration

Le tampon dans le gel est à la mauvaise concentration

Vous avez oublié de mettre le tampon dans le gel

C. ANALYSE DES DIGESTIONS PAR ENZYMES DE RESTRICTIONS

10. Charger les échantillons d’ADN suivants. L’inconnu est un recombinant avec le vecteur pUC9:

a. Échelle de poids moléculaire de 1Kpb (2.5µL)

b. Plasmide recombinant pUC9 non digéré 5µL

c. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec BamHI, 5µL

d. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI, 5µL

e. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec HindIII, 5µL

f. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI + HindIII, 5µL

g. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec PstI, 5µL

h. pUC9 digéré avec BamHI, 5µL

11. Faire la migration à 100V pour approx. 1-1.5 heures, puis demander à un aide enseignant de

faire la prise d’une photo.


Échelle de Poids Moléculaire d’ADN

Masse d'ADN Paires de bases

(ng/5µL)

Gel d'agarose de 1% TAE


Exercice 2


Isolation d’ADN plasmidique

Enzymes de restrictions et électrophorèse sur gel d’agarose (Partie II)


Isolation d’ADN plasmidique La plupart des méthodes utilisées pour la purification de plasmide se basent sur la disruption des

cellules en présence de dénaturants puissants. La disruption peut se faire par des cycles de gel et de

dégel, le broyage ou par une lyse chimique en utilisant des solutions fortement alcalines. Les

dénaturants sont essentiels afin d’inactiver les nucléases endogènes et exogènes qui dégraderaient

l’ADN. Examinez les différentes composantes du tampon d’extraction et déterminez la fonction de

chaque composé chimique.

Les plasmides sont des réplicons bactériens extrachromosomiques circulaires non obligatoires

L’isolation d’ADN plasmidique nécessite la séparation de cet ADN de l’ADN chromosomique,

ainsi que des polysaccharides, les lipides et les protéines de la cellule. Les manipulations

subséquentes, tout particulièrement les modifications enzymatiques, nécessitent que l’ADN soit

dépourvu de ces impuretés.

Dans la procédure suivante, la lyse des cellules est accomplie avec une solution fortement alcaline

(NaOH) et les protéines sont dénaturées à l’aide d’une solution fortement alcaline et d’un détergent

(SDS). Les complexes de détergent sont ensuite précipités avec un sel neutralisant (KOAC). Le

plasmide est séparé de l’ADN bactérien en vertu de sa stabilité relative dans des conditions

alcalines. De laisser le plasmide dans la solution alcaline trop longtemps détruira le plasmide aussi.

De plus, le chromosome est lié aux membranes et sera précipité par le sel et le détergent. Il est donc

important de ne pas mélanger la solution de façon trop vigoureuse, car ceci aurait pour effet de

relâcher le chromosome qui est piégé. Le plasmide est plus petit et demeure donc libre en solution.

La solution de plasmide est séparée des débris cellulaires par une centrifugation, puis concentrée

par une précipitation à l’alcool.

Pour de plus amples informations au sujet de la purification de plasmides, vous pouvez consulter le

site Web suivant : http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/index.htmL

http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/index.html


Purification d’ADN plasmidique par lyse alcaline

(Groupes de 2)

A. La préparation de vos solutions:

Préparer 1 mL de chacune des solutions I & II ainsi que le T.E. à partir des solutions mères

suivantes :

10N NaOH

10%SDS

0.5M glucose

1M Tris-Cl (pH 8.0)

0.5M EDTA

3 M KOAc pH 5

Isopropanol

ARNase 10mg/mL

Solution I: 50mM Glucose (tampon)

25mM Tris-Cl (pH 8.0) (tampon)

10mM EDTA (pH 8.0) (Chélateur)

Solution II: 0.2N NaOH (Alcalin)

1% SDS (Détergent)

T.E.: 10mM Tris-Cl pH 8.0

1mM EDTA pH 8.0

B. Protocole pour l’isolation du vecteur pUC19: 1. Centrifuger à vitesse maximale 1.5mL de la suspension d’E.coli/plasmide qui vous a été donnée

dans la microcentrifugeuse pour une durée de 1 minute.

2. Déverser le surnageant sans déranger le culot. Utiliser une micropipette pour enlever le

surnageant résiduel.

3. Ajouter 200μL de la Solution I au culot et le suspendre sur le vortex.

4. Ajouter 400μL de la solution II. Fermer le tube et mélanger par inversion.

5. Ajouter 300μL d’une solution glacée de KOAc. Bien mélangé et gardé sur glace pour 5 minutes.

6. Centrifuger dans la microcentrifuge à vitesse maximale pour 5-10 minutes. Ceci précipite les

protéines et l’ADN chromosomique le long de la paroi du tube.

7. Transférer 700µL du surnageant à un nouveau tube de microcentrifuge. Ajouter un volume égal

d’isopropanol. Fermer le tube et mélanger par des inversions rapides des tubes.

8. Centrifuger les tubes à vitesse maximale pour 5 minutes. Déverser le surnageant.

9. Le culot blanc au fond du tube contient l’ADN plasmidique et de l’ARN.

10. Suspendre le culot dans 50μL de TE pH8.0.

11. Ajouter 1μL d’une solution de 10mg/mL d’ARNase et incuber à 37oC 5-10 min.

Biologie Moléculaire-2013

21

Purification d'ADN plasmidique avec le kit de QIAGEN Une autre façon de purifier les plasmides consiste à utiliser des kits commerciaux tels que celui

offert par Qiagen. À la base, cette technique de purification est fondée sur la méthode de lyse

alcaline que vous avez exécutée précédemment. Afin de pouvoir comparer les deux méthodes, vous

allez répéter la purification à partir de la même culture bactérienne avec le kit de Qiagen. À la fin de

la procédure, vous devriez être capable de comparer les deux méthodes en ce qui a trait aux

similarités et les différences.

Étape 1

Étapes 2-5

Étapes 6-7

Étapes 8-9

Étape 10

Culot bactérien

Suspension

Lyse

Neutralisation

Liaison

Lavage

Élution

ADN plasmidique pure


22

Projet I

Mutagenèse dirigée de LacZ; isolation d’ADN plasmidique

Protocole pour l’isolation du vecteur pUC19: 1. Obtenir la culture de 1.5mL qui a été préparé pour vous et récolter les cellules par une

centrifugation à vitesse maximale pour 1 minute. Déversez-le surnageant.

2. Suspendre au vortex le culot de cellules dans 250µL de tampon P1 (+ ARNase) et transférer

dans un tube de microcentrifugeuse. Vous ne devriez pas avoir d’agrégats de cellules après

cette étape.

3. Ajoutez 250µL de Tampon P2 (qui contient du NaOH/SDS) et inversez doucement le tube 4-6

fois afin de mélanger. Ne passez pas le mélange au vortex puisque ceci causerait un

déchirement de l’ADN génomique. Si nécessaire, continuez à inverser le tube jusqu’à ce que la

solution devienne visqueuse et un peu claire. Ne pas dépasser 5 min, car l’ADN plasmidique

risquerait de se dénaturer irréversiblement.

4. Ajoutez 350µL du tampon N3 (neutralisation, tampon à forte concentration de sel) et inversez

immédiatement le tube doucement 4-6 fois. La solution devrait devenir trouble.

5. Centrifugez à vitesse maximale 10 min. Un culot compact blanc va se former au fond du tube

avec le “lysat éclairci” au-dessus.

6. Utilisez une pipette pour transférer le surnageant de l’étape 5 à une colonne QIAprep placée

dans un tube de récupération de 2mL.

7. Centrifugez 60 sec. à vitesse maximale. Jetez le volume écoulé dans les déchets organiques.

8. Lavez la colonne QIAprep en ajoutant 0.375mL de tampon PE (qui contient de l’éthanol) et

centrifugez 60 secs. Jetez l’écoulement (déchets organiques). Répétez une deuxième fois.

9. Jetez l’écoulement (déchets organiques), transférez dans un tube à centrifugeuse avec le

capuchon coupé et centrifugez pour 1 min additionnelle afin d’éliminer le tampon de lavage

résiduel.

IMPORTANT: L’éthanol résiduel du tampon PE peut inhiber des réactions enzymatiques

subséquentes. Les étapes 8 et 9 sont donc très importantes.

10. Placez la colonne QIAprep dans un tube à microcentrifugeuse (1.5mL) propre avec capuchon

coupé. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 50 µL de tampon EB (tampon d’élution = 10 mM Tris-HCl,

pH 8.5) et centrifugez 1 min.

11. Transférez dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté. Entreposez dans votre boîte à -20oC


23

Électrophorèse sur gel d'agarose d'ADN digéré Suite à la plupart des digestions, il est nécessaire de répondre aux questions suivantes :

L’ADN a-t-il été digéré?

Combien de fois est-ce que l’enzyme a coupé?

Quelles sont les tailles des fragments générés?

Est-ce que la digestion est complète ou partielle?

Les échantillons d’ADN sont-ils complètement digérés? S’il y a seulement eu clivage partiel de

l’ADN (exemple de cause possible : réduction de l’activité enzymatique à cause de conditions de

réactions non appropriées; impuretés dans l’ADN qui aurait inhibé l’enzyme), les fragments à

migration plus lente (qui représentent les fragments non clivés contenant un site pour l’enzyme

utilisée) sont habituellement présents à des proportions inférieures aux prédictions

stœchiométriques. Autrement dit, puisque l’intensité de la fluorescence UV est proportionnelle à la

quantité de bromure d’éthidium liée (et donc la quantité/longueur de l’ADN), ces fragments sont

moins intenses qu’ils le seraient s’ils étaient présents en quantité équimolaire aux fragments

complètement digérés.

Est-ce que les tailles calculées des fragments de restriction sont conformes? Si vous effectuez la

migration de différentes digestions d’ADN cloné, il est important de vérifier que la somme des

tailles des fragments calculées est à peu près égale pour chacune des voies de migration (c. a. d. la

taille de la molécule d’ADN intacte). Puisque l’estimation de la taille à l’aide des marqueurs de

taille n’est pas exacte (et que l’erreur associée aux fragments se trouvant dans la partie non linéaire

de la courbe étalon est plus grande), il n’y a habituellement qu’un accord approximatif (une

différence d’environ 200-300 pb pour un plasmide recombinant de 5 Kpb). Si vous obtenez de plus

grandes différences, considérez les points suivants: Y aurait-il co-migration de plusieurs fragments?

(Observez l’intensité relative de la fluorescence.) Y aurait-il des produits de digestion partielle

inclus dans vos calculs? Y aurait-il plusieurs fragments de faible masse moléculaire (donc de faible

intensité que vous avez de la difficulté à voir)? Les marqueurs utilisés pour évaluer la taille de

molécules d’ADN linéaire sont-ils aussi linéaires? Rappelez-vous que les molécules d’ADN

linéaires, circulaires déroulées et bicaténaires superenroulées ont toutes des propriétés de migrations

différentes sous nos conditions d’électrophorèse sur gel d’agarose. Puisque les marqueurs de tailles

que nous allons utiliser sont linéaires, peuvent-ils être utilisés pour estimer la taille de l’ADN d’un

plasmide recombinant non coupée?

Dans l’expérience suivante, vous allez comparer et faire l'analyse de digestions d'ADN circulaire et

linéaire.


24

Méthode (Groupes de 2)

1. Préparez les digestions par enzymes de restrictions du plasmide pBR322 qui se retrouve dans

votre boîte au congélateur. Toutes les réactions doivent être préparées SUR GLACE en

ajoutant les ingrédients suivants dans un tube de microcentrifuge dans l’ordre indiqué: assurez-

vous de bien mélanger!

Digestions:

HincII

PvuII

PvuII + HincII

Mélanges réactionnels

Hinc II Pvu II Hinc II + Pvu II

Eau : Compléter à un volume final de 20µL 12µL 12µL 11µL

Tampon de restriction 10X 2µL

Tango

2µL

G

2µL

G

Plasmide pBR322 5µL 5µL 5µL

Hinc II 10 unités/µL 1µL ------- 1µL

Pvu II 10 unités/µL ------- 1µL 1µL

2. Incuber les 3 réactions à 37oC pour 1 heure.

3. Après la période d’incubation, entreposer vos échantillons SUR GLACE.

4. Ajouter du tampon de chargement d'ADN 5X à chacun des tubes afin d’obtenir une

concentration finale d'au moins 1X.


25

DETERMINER LE RENDEMENT ET LA QUALITÉ DE L’ADN PAR SPECTROSCOPIE

ET DENSITOMÈTRE

Il existe différentes façons d'obtenir une estimation de la concentration d'ADN. Une des façons et

de déterminer l’absorbance à 260nm. Par la suite, vous pouvez estimer la concentration de l’ADN

double brin en utilisant le rapport suivant : Une absorbance de 1.0 à 260nm équivaut une

concentration d’ADN de 50 g/mL.

Une autre façon est d'utiliser un colorant tel que le bromure d'éthidium. La liaison du bromure est

une fonction de la quantité d'ADN; donc l'intensité de l'ADN coloré peut être utilisée pour estimer

la quantité d'ADN.


1. Préparer 5 dilutions en série de 1/2 dans de l'eau de l'ADN de sperme de saumon (100ng/ml)

dans un volume final de 500µL.

2. Transférer 100µL de chacune des dilutions à des puits d'une plaque de 96 puits tel qu'illustré ci-

dessous.

3. Une fois que les plaques seront toutes chargées, leurs lectures à une longueur d'onde de 260nm

seront faites.

4. Déterminer les concentrations respectives d'après les lectures obtenues.

Plan

5. Transférer 10µL de chacune de vos dilutions d'ADN de sperme de saumon à des tubes de

microcentrifugeuse étiquetés de façon appropriés.

6. Ajouter du tampon de chargement d'ADN 5X à chacun des tubes afin d’obtenir une

concentration finale d'au moins 1X.

ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 1 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 2 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 3 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 4 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 5 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 6 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 7 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 8


26

Électrophorèse sur gel d'agarose


1. Préparer un gel d'agarose de 1%.

2. Charger le gel avec vos digestions préparées plus tôt ainsi que vos dilutions d'ADN de sperme

de saumon tel qu'indiqué ci-dessous:

Puits Échantillon

1 2.5µL Échelle de poids moléculaire de 1Kpb

2 5µL du plasmide pUC19 isolé par lyse alcaline + tampon de chargement

3 5µL du plasmide pUC19 isolé par le kit Qiagen + tampon de chargement

4 5µL du plasmide pBR322 digéré avec PvuII

5 5µL du plasmide pBR322 digéré avec HincII

6 5µL du plasmide pBR322 avec PvuII + HincII

7 Vide

8 Vide

9 5µL de l'ADN de sperme de saumon non dilué

10 5µL de la dilution 1/2 de l'ADN de sperme de saumon





3. Faire la migration à 100V jusqu'a ce que le colorant ait migré à peu près 2/3 de la distance

(approx. 1-1.5 heures), puis demandez à un aide enseignant de faire la prise d’une photo.


27

Exercice 3


Projet I: Mutagénèse dirigée de LacZ; PCR



28

Projet II

Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN

Le but de ce projet est d’obtenir une compréhension de la technique de cartographie par des

enzymes de restrictions. Dans les semaines à venir, vous aurez à utiliser des approches

expérimentales et de bio-informatiques pour caractériser un fragment d’ADN cloné. Chaque groupe

de deux aura à travailler avec un plasmide qui contient une insertion qui représente un des gènes

listé sous la rubrique "séquences" > gène inconnu" sur la page web de ce cours. Parmi un groupe de

4 (par bout de table) les deux groupes de deux possèderont le même inconnu, mais dans des

orientations opposées. Ces insertions furent toutes obtenues d’une librairie génomique créée dans le

vecteur de clonage pUC19. Essentiellement l’ADN génomique d’un organisme a été isolé, digéré,

après quoi une ligature des fragments générés a été faite dans le vecteur pUC19 linéarisé avec une

enzyme appropriée dont le site de restriction se retrouve dans le site de clonage multiple. (Voir la

figure sur la page suivante).

LES BUTS DE CE PROJET SONT :

Utiliser une approche expérimentale pour: o Déterminer le site d’insertion

o Vérifier la taille de l’insertion

o Vérifier l’orientation de l’insertion

o Vérifier la carte

o Prouver que le plasmide obtenu est bel et bien celui assigné

o Soumettre une carte révisée

Déterminer par bioinformatique la carte de restriction d’une insertion d’ADN


29

Les enzymes suivantes ne coupent pas pUC19 : AdeI, AloI, ApaI, AscI, BaeI, BbvCI, BclI, BcuI, BglII, BoxI, BpiI, BplI,

Bpu10I, Bpu1102I, BsaAI, BsaBI, BseRI, BsgI, BshTI, BsmFI, Bsp68I, Bsp119I,

Bsp120I, Bsp1407I, BspTI, Bst1107I, BstXI, Bsu15I, BtrI, Cfr42I, CpoI, DsaI,

Eco32I, Eco47III, Eco52I, Eco72I, Eco81I, Eco91I, Eco105I, Eco130I, Eco147I,

FseI, Kpn2I, KspAI, MlsI, MluI, Mph1103I, MssI, MunI, Mva1269I, NcoI, NheI,

NotI, PacI, PauI, PdiI, Pfl23II, PsiI, Psp5II, PsyI, SacII, SanDI, SexAI, SfiI,

SgfI, SgrAI, SmiI, SrfI, SstII, Van91I, XagI, XcmI, XhoI, XmaJI.

Les vecteurs pUC sont de petits plasmides, dont le nombre de copies maintenues est élevé qui

possèdent un site de clonage multiple (SCM), l’origine de réplication pMB1 nécessaire à la

réplication du plasmide (source – plasmide pBR322), et le gène bla, qui code pour la bêta-

lactamase, qui confère une résistance à l’ampicilline (source – plasmide pBR322). Noter que tous

les sites de restriction dans le site de clonage multiple se retrouvent seulement qu’une fois dans le

plasmide.

Amorce univ. reverse

Amorce univ. forward

PvuII

PvuII


30

CONSEILS POUR L'UTILISATION DES ENZYMES DE RESTRICTIONS Gardez toujours les solutions mères d’enzymes sur glace lorsqu’elles ne sont pas au congélateur à

-20oC (ce qui devrait être le temps le plus court possible).

L’enzyme est toujours la dernière composante ajoutée au mélange réactionnel et elle est ajoutée

directement à la solution dans le fond du tube plutôt que par goutte sur le bord du tube.

Assurez-vous que la solution est bien mélangée (ex. en donnant des petits coups sur le tube avec

votre doigt). S’il reste des gouttes sur le bord du tube, centrifugez brièvement les tubes. Vous

pouvez aussi les mélanger en utilisant le vortex (à moins que vous utilisiez de l’ADN génomique de

taille moléculaire élevée qui risque de se fragmenter).

Ne touchez jamais la pointe des embouts de pipette avec vos doigts ou avec autre chose que la

solution que vous voulez transférer.

Toujours utiliser un nouvel embout pour chaque opération et jeter les embouts utilisés aussitôt.

En accord avec les LIGNES DIRECTRICES SUR LE MATÉRIEL BIOLOGIQUE

DANGEREUX, tout le matériel jetable (embouts de micropipette, tubes de microcentrifugeuse,

etc.) utilisé lors de travaux avec de l’ADN recombinant et des cellules hôtes bactériennes doit être

placé dans des récipients à déchets spéciaux (c’est-à-dire, les boites de déchets à vos postes de

travail). Vous allez transférer ces déchets dans des sacs orangés qui seront autoclavés avant d’être

jetés.


31

CONSEILS POUR LE CLIVAGE D’ADN PLASMIDIQUES

Quantité d’ADN à utiliser:

La facilité que vous aurez à détecter vos fragments de restrictions (par fluorescence UV après une

coloration au bromure d’éthidium où l’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la masse de

l’ADN dans un fragment) dépend du montant d’ADN utilisé (et des paramètres tels que l’épaisseur

du gel, la précision des bandes, etc.). On utilise habituellement entre 200-600 ng d’ADN

plasmidique/puits pour une digestion avec une seule enzyme. Pour des digestions qui génèreront

plusieurs fragments, vous pourriez avoir besoin de faire la restriction de 400-1000 ng afin de

pouvoir déceler les plus petits fragments (POURQUOI??)

Après avoir sorti les échantillons d’ADN du congélateur, assurez-vous de les dégeler complètement

avant de les prélever avec une pipette (pour obtenir la quantité adéquate d’ADN dans un volume

donné).

Vos digestions seront faites en présence d’un tampon commercial fourni par la compagnie

Fermentas. La concentration de sel idéale varie d’une enzyme de restriction à l’autre et vous

pouvez l’obtenir en utilisant différentes formulations du tampon.

Certaines enzymes requièrent des températures d’incubation autre que 37oC. Notez également que

les enzymes de restrictions qui reconnaissent les mêmes séquences s’appellent des isoschizomères

(ex. SacI et SstII). Il y a aussi des enzymes qui portent des noms très semblables (EcoRI, EcoRV)

mais qui reconnaissent des séquences distinctes (donc, soyez certain de bien lire les étiquettes sur

les tubes d’enzymes).

En principe, 1 unité d’enzyme de restriction digère complètement 1 g d’ADN purifié en 1

heure. Par contre, puisque nous utilisons souvent des préparations d’ADN brutes, nous

augmentons souvent la quantité d’enzyme utilisé et dans le cas d’ADN génomique complexe, les

temps d’incubation sont habituellement prolongés aussi. Typiquement, les enzymes de restrictions

sont fournies à des concentrations de 5-10 unités/ l. (Si la même enzyme est utilisée pour plusieurs

échantillons d’ADN différents, nous préparons souvent un mélange, ou cocktail,

eau/tampon/enzyme afin de sauver du temps et de l’argent. Une de vos premières expériences

consistera à utiliser un tel cocktail.)

Le volume final d’enzyme ne devrait pas excéder 1/10 du volume réactionnel total, puisque le

glycérol dans la solution stock d’enzyme, que l’on ajoute pour empêcher la formation de cristaux

lors de la congélation, peut inhiber la réaction. Notez aussi que les solutions qui contiennent du

glycérol sont plus difficiles à manipuler avec des pipettes que des solutions aqueuses, soyez

attentifs aux volumes dans vos embouts de pipette.

LES MÉLANGES RÉACTIONNELS DES ENZYMES DOIVENT TOUJOURS

ÊTRES PRÉPARÉS ET GARDÉS SUR GLACE!!


32

GÉNÉRER UNE CARTE DE RESTRICTION D’UN PLASMIDE

Une des techniques de base dans le clonage c’est l’analyse par enzyme de restriction (AER) de

votre ADN cloné. L’AER et les cartes de restriction sont utilisées pour plusieurs différentes raisons

telles que pour faire la confirmation d’une procédure de clonage. On les utilise aussi comme

première étape dans le sous-clonage de grands fragments afin d’obtenir des fragments de plus

petites tailles pour faciliter le séquençage. Vous allez choisir un des échantillons inconnus pour

l’AER et la construction d’une carte de restriction. Ils ont chacun un vecteur pUC (voir carte) et

une insertion qui varie de taille et d’enzyme de restriction utilisé pour son clonage.

Il y a plusieurs stratégies pour l’AER. Les stratégies utilisées le plus couramment pour établir une

carte de restriction sont (1) des digestions doubles ou triples avec différentes combinaisons

d’enzymes de restriction (2) la digestion en série d’un fragment d’ADN isolé avec d’autres enzymes

(3) la digestion partielle, soit de l’ADN non marqué, ou de l’ADN qui a été marqué de façon

spécifique à une extrémité (Smith & Birnstiel, 1976, Nucl.Acids Res. 3: 2387).

La stratégie que nous allons utiliser est directe et facile à comprendre. Premièrement, vous ferez la

restriction de l’ADN avec une série d’enzymes (voir la liste des enzymes pour le site de restriction

et la concentration de tampon à utiliser). Après l’électrophorèse sur gel, vous serez capable de

déterminer quelles enzymes coupent à l’intérieur de l’insertion. Ensuite, en vous basant sur les

résultats que vous aurez obtenus, vous allez établir une stratégie pour déterminer l’emplacement de

ces sites sur une carte de restriction en utilisant des digestions doubles.

Pour un survol de la cartographie par d’enzymes de restriction, consultez les sites Web

suivants:

http://homepages.strath.ac.uk/~dfs99109/BB211/ResMap.html

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/RestMap/RestMapTutorial.htmL

http://homepages.strath.ac.uk/~dfs99109/BB211/ResMap.html

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/RestMap/RestMapTutorial.html


33

Matériaux et Méthodes :

La moitié des enzymes de restrictions que vous utiliserez se retrouve dans votre boîte au

congélateur. L’autre moitié se retrouve dans la boîte de l’autre groupe en face de vous.

Votre plasmide recombinant inconnu, à une concentration de 100 g/mL est dans votre boîte

au congélateur. Assurez-vous de noter quel inconnu vous possédez!!

Les tampons 10X d’enzymes de restrictions sont dans votre boîte au congélateur.

Préparation de vos digestions : Puisque les différentes enzymes requièrent différents tampons, vous aurez à être flexible lorsque

vous ferez une digestion de restriction. Préparez un tableau en indiquant toutes les composantes que

vous avez l’intention d’ajouter et leurs volumes avant de débuter. Lorsque vous ajouterez une des

composantes à votre tube étiqueté, rayez-la de votre tableau. Choisir le tampon qui permet d’avoir

100% d’activité avec l’enzyme appropriée. (Consulter le tableau sur la page suivante)

Mélange réactionnel d’une digestion simple typique de 20µL:

Ingrédients Concentration finale/µL

ADN (100ng/µL) 12.5ng/µL ou 250ng total

Tampon de restriction 10X 1X

Enzyme (10 unités/µL) 0.5 unités/µL

Eau Compléter à 20µL

Puisque vous allez digérer le même ADN avec plusieurs enzymes, vous devriez considérer préparer

un cocktail qui contient toutes les composantes à l’exception de l’enzyme.


34

Enzyme Tampon recommandé

pour 100% d'activité

% d'activité dans les tampons Fermentas

B G O R Tango

(bleu) (vert) (orange) (rouge) (jaune)

1X 1X 1X 1X 1X

ApaI B 100 20-50 0-20 0-20 20-50

BamHI BamHI 20-50 100 20-50 50-100 100

BclI G 20-50 100 20-50 20-50 100

BglI O 0-20 50-100 100 100 0-20

BglII O 0-20 20-50 100 50-100 0-20

BstXI O 20-50 100 100 50-100 50-100

ClaI Tango 20-50 20-50 20-50 20-50 100

EcoRV R 0-20 50-100 50-100 100 20-50

EcoRI EcoRI 0-20 NR 100 100 NR

HincII Tango 50-100 50-100 20-50 50-100 100

HindIII R 0-20 20-50 0-20 100 50-100

HinfI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100

HpaII Tango 50-100 50-100 0-20 20-50 100

HphI B 100 0-20 0-20 0-20 20-50

KpnI KpnI 20-50 0-20 0-20 0-20 20-50

MluI R 0-20 20-50 50-100 100 20-50

NcoI Tango 20-50 20-50 20-50 50-100 100

NdeI O 0-20 0-20 100 50-100 0-20

NheI Tango 100 20-50 0-20 0-20 100

PstI O 50-100 50-100 100 100 50-100

PvuI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100

PvuII G 50-100 100 20-50 50-100 20-50

RsaI Tango 50-100 20-50 0-20 0-20 100

SacI SacI 50-100 20-50 0-20 0-20 50-100

SacII B 100 50-100 0-20 0-20 50-100

SalI O 0-20 0-20 100 20-50 0-20

ScaI ScaI 0-20 0-20 0-20 0-20 0-20

SmaI Tango 50-100 0-20 0-20 0-20 100

SspI G 20-50 100 0-20 50-100 100

TaqI TaqI 0-20 20-50 20-50 20-50 20-50

XbaI Tango 50-100 50-100 20-50 0-20 100

XhoI R 0-20 50-100 50-100 100 20-50

NR - Non recommandé

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er141-apai

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er005-bamhi

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er072-bcli

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er007-bgli

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er008-bglii

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er102-bstxi

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er014-bsu15i

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er030-eco32i

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er027-ecori

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er049-hincii

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er050-hindiii

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er080-hinfi

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er051-hpaii

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er110-hphi

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er052-kpni

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er056-mlui

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er057-ncoi

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er058-ndei

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er097-nhei

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er061-psti

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er062-pvui

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er063-pvuii

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er112-rsai

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er113-saci

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er064-sali

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er043-scai

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er066-smai

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er077-sspi

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er067-taqi

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er068-xbai

http://www.fermentas.com/en/products/all/conventional-restriction-enzymes/er069-xhoi


35

Préparer un cocktail: Le but du cocktail et de minimiser les manipulations, c.à.d. le nombre de fois que vous devrez

pipeter, afin de minimiser les erreurs. Avant de préparer votre cocktail, déterminer les ingrédients et

leurs volumes pour une réaction. Ensuite, déterminer quels ingrédients ou ingrédients varient entre

les différentes réactions (par exemple le tampon). Une fois que vous avez cette information, vous

êtes prêts pour la préparation de votre cocktail comme dans l’exemple suivant :

Mélange réactionnel:

Ingrédient Volume pour 1 réaction Volume pour 10 réactions

A 1µL 10µL

B 2µL 20µL

C 3µL (Paramètre qui change) 30µL (pas ajouté)

D 5µL 50µL

H2O 9µL 90µL

Volume total 20µL 170µL

Une fois votre cocktail préparé, qui contient tous les ingrédients sauf pour celui qui est variable,

distribuez un volume égal à chacun de vos tubes réactionnels. Dans l’exemple ci-dessus, ceci serait

170/10= 17µL. Ensuite, ajouter la composante variable (3µL) à chaque tube.

Vos Digestions :

1. Préparer 10 digestions de 0.25 g d’ADN, une pour chacune des enzymes listées dans le tableau

sur la page suivante.

2. Préparer un témoin de digestion, qui contient toutes les composantes, sauf pour l’enzyme.

3. Incuber à 37oC pour 60 minutes.

4. Durant l’incubation de vos digestions, préparer un gel d’agarose de 1.0% avec du bromure

d’éthidium.

5. Suite à la période d’incubation, ajoutée du tampon de chargement de 5X à chacune des

digestions pour obtenir une concentration finale de 1X ou plus.

6. Charger 5 L de chaque échantillon sur le gel.

7. Charger 5μL du vecteur pUC9 linéarisé qui a été préparé pour vous.

8. Charger l’échelle de poids moléculaire.

9. Faire l’électrophorèse à 100V.

10. Entreposer le restant de vos digestions (étiquetés de façon appropriée) à –20oC.

11. Suite à l’électrophorèse, examiner votre gel aux ultras violets et prendre une photo pour votre

analyse.


36

LISTE D’ENZYMES DE RESTRICTION UTILISÉES DANS CE COURS

ENZYME SITE

BamHI G▼

GATCC

BglII A▼

GATCT

EcoRI G▼

AATTC

HindIII A▼

AGCTT

PstI CTGCA▼

G

PvuII CAG▼

CTG

SacII (SstII) CCGC▼

GG

ScaI AGT▼

ACT

XbaI T▼

CTAGA

XhoI C▼

TCGAG

▼

- indique le lien phosphodiester clivé


37

Projet I

Mutagénèse dirigée de LacZ

Le but ultime de ce projet est d’utiliser la PCR pour changer certains des acides aminés dans

l’enzyme bêta galactosidase codée par le gène LacZ d’E.coli. La stratégie qui sera utilisée pour

atteindre ce but sera d’utiliser la réaction de la polymérase en chaîne afin de faire la mutagenèse

dirigée du gène tout en l’amplifiant. Ce projet comprend plusieurs parties indépendantes qui seront

exécutées pour plusieurs semaines à venir.

PARTIE I:

Des amorces ont été conçues afin de faire la mutagenèse et amplifier une partie de la séquence

codante du gène LacZ qui se retrouve dans le plasmide pUC19. Chaque groupe de 4 utilisera une

différente paire d’amorces afin de faire différents changements à la séquence. Les amorces qui seront

utilisées sont indiquées ci-dessous. Notez que plusieurs caractéristiques qui ne sont pas normalement

présentes sur la séquence de LacZ ont été ajoutées aux amorces afin de faciliter le clonage et le

criblage subséquent. Consulter les pages web suivantes pour rafraîchir vos connaissances sur la

PCR:

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm

http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

Amorces “Forward” de PCR:

GCCTGCAGGTCGACTCTCGAG GAT CC (PCRmutagenGAT)

Caractéristiques :

CTGCAG : Site PstI du site de clonage multiple de pUC19

La séquence originale du site de clonage multiple de pUC19 TCTAGA qui représente le site

XbaI a été modifiée à TCTCGA afin d’abolir le site XbaI et de créer un nouveau site de

restriction; XhoI.

Une des bases du codon « GAT » du cadre de lecture ouvert a été changée afin de créer un

nouveau codon.

Amorce « Reverse » : PCRmutagenRev

TGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAG

NdeI

PstI XbaI→ XhoI GAA=Glu (PCRmutagenGAA) TAT=Tyr (PCRmutagenTAT) GTT=Val (PCRmutagenGTT)

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm

http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html


38

Méthode : (Groupes de 2)

Préparez vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50µL. Dans des tubes de PCR

étiquetés (utilisez des tubes de PCR à paroi mince de 200 µL), ajoutez les ingrédients dans l’ordre

indiqué dans le tableau ci-dessous. Pour chaque composante ajoutée, utilisez un nouvel embout

autoclavé. Notez : la polymérase Taq sera ajoutée par l’aide enseignant.

Préparation de la matrice d’ADN pUC19 :

1. Obtenez la préparation de pUC19 que vous avez isolée à la semaine 2.

2. Diluer un échantillon de votre préparation par un facteur de 10

3. Utiliser 5µL de la matrice diluée pour votre réaction de PCR

Ingrédients Conc. mère Conc. finale Volume


Tampon PCR Taq 10X 1X

Amorce « Forward » assignée 2µM 0.2µM

Amorce « Reverse » 2µM 0.2µM

MgCl2 50mM 1.5mM

dNTP 2mM 200µM

pUC19 - 5µL

Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL

Une fois que votre mélange réactionnel est complété, remettez-le à l’aide enseignant. Votre

échantillon vous sera retourné la semaine prochaine.

Conditions d’amplifications par PCR:

1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer.

2. 30 cycles de 30sec, 94oC dénaturation; 30sec, 57

oC appariement; 45sec, 72

oC extension.

3. 1 cycle de 5min, 72oC.

4. Refroidir à 4oC, indéfinie.


39

Exercice 4

Qu’est qu’on fait aujourd’hui !

Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ; PCR

Électrophorèse des amplicons de PCR

Purification des amplicons de PCR

Digestion des amplicons de PCR et du vecteur pUC19

Ligature des amplicons de LacZ



40

Projet II


ANALYSE DE RESTRICTION PAR DIGESTIONS DOUBLES (II)

Suite aux résultats de vos expériences et de vos mesures de la semaine passée, vous devriez

maintenant avoir une liste d’enzymes de restrictions qui coupent à l’intérieur du fragment cloné ainsi

que les tailles des fragments produits par ces digestions. D’après cette information, vous avez généré

une carte de restriction préliminaire (ou plusieurs cartes, s’il n’y avait pas une carte unique non

ambigüe).

Cette semaine, vous aurez à utiliser ces données pour vérifier la validité de la carte que vous

proposez. Il existe plusieurs tests possibles, mais vous allez utiliser votre carte pour prédire la (les)

taille (s) des fragments produits par des digestions doubles avec deux enzymes de restriction.

Un exemple simple vous démontre l’approche. Supposons qu’après la première digestion avec une

seule enzyme vous avez trouvé un site de restriction dans l’insertion pour l’enzyme X et aucun site de

restriction pour l’enzyme EcoR1. Sachant qu’EcoR1 se retrouve dans le site de clonage multiple, une

digestion double avec EcoR1 et X vous donnera la distance entre X et le site connu d’EcoR1.

Préparation de vos digestions : 1. Préparer vos digestions telles que précédemment. Puisque différentes enzymes requièrent

différents tampons, vous devrez être flexible afin de faire vos digestions. Si les deux enzymes

fonctionnent dans le même tampon, ajoutez simplement 1.0 L de chacune des enzymes. Par

contre, si les deux enzymes fonctionnent dans des tampons différents, consulter le tableau de

compatibilité afin de déterminer le tampon approprié pour une activité maximale des deux

enzymes.

2. Incuber vos digestions pour 60 minutes à 37oC.

3. Migrer vos digestions tel que précédemment sur un gel d’agarose de 1%. Assurez-vous d’utiliser

le peigne approprié; celui qui fournira le nombre minimal de puits requis.


41

Projet II

Mutagenèse dirigée de LacZ; PCR

La semaine passée vous avez fait un PCR avec des amorces dirigées contre LacZ pour amplifier et

faire la mutagenèse dirigée du gène LacZ. Cette semaine vous utiliserez l’électrophorèse sur gel

d’agarose afin de vérifier la réussite de l’amplification avant d’initier le clonage.

ÉLECTROPHORÈSE DES AMPLICONS de LacZ

1. Récupérez vos réactions de PCR

2. Transférez 8µL de votre produit de PCR et placez-le dans un nouveau tube, puis ajoutez 2.5µL

de tampon de chargement 5X. Entreposer le restant sur glace pour des expériences subséquentes.

3. Charger vos échantillons sur un gel d’agarose de 1% précoulé qui contient du bromure

d’éthidium avec une échelle de poids moléculaire appropriée.

4. Observer sous les UV. Prendre une photo pour l’analyse.

CLONAGE DES AMPLICONS:

Consulter les sites web suivants pour un survol du clonage dans un vecteur plasmidique:

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/plasmidcloning.html

http://biology.kenyon.edu/courses/biol09/plasmid/plasmidtut1.htm

Les produits de PCR amplifiés et analysés par électrophorèse sur gel peuvent maintenant être clonés

dans un vecteur approprié. Rappelez-vous que durant votre réaction de PCR des sites de restriction

étaient présents dans chacune des amorces afin de permettre le clonage directionnel du produit de

PCR dans un vecteur. Maintenant, nous devrons digérer le vecteur ainsi que le produit de PCR afin

de générer des extrémités compatibles pour la ligature subséquente. Puisque le PCR, les digestions et

la ligature sont faites dans différents tampons, nous devrons purifier l’ADN entre ces étapes afin

d’optimiser la prochaine réaction. La suite des étapes est:

Réaction de PCR (entreposer dans le congélateur)

Purification des produits de PCR par la méthode de Qiaquick

Digestion des amplicons et du vecteur pUC19

Purification des produits de PCR digérés avec PstI et NdeI par la méthode de Qiaquick

Migration sur gel de pUC19 digéré avec PstI et NdeI suivi de sa purification par la méthode de

Qiaquick

Ligature des amplicons dans pUC19 pour les transformations subséquentes

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/plasmidcloning.html

http://biology.kenyon.edu/courses/biol09/plasmid/plasmidtut1.htm


42

PURIFICATION DES PRODUITS DE PCR

Protocole pour la purification des produits de PCR en utilisant le kit de purification Qiaquick

(voir l’organigramme sur la prochaine page)

NOTEZ: toutes les centrifugations auront lieu à la température de la pièce et à vitesse maximale.

ASSUREZ-VOUS D’UTILISER POUR CHAQUE CENTRIFUGATION UN AUTRE TUBE

POUR BALANCER (celui d’un autre groupe!?!).

1. Mesurez le volume de la réaction de PCR.

2. Ajoutez 5 volumes de tampon PB à 1 volume de la réaction de PCR et mélangez par inversion.

3. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.

4. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.

5. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK

dans le même tube.

6. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.

7. Jeter l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES.

8. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.

9. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le

même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon

PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.

10. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.

11. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la

colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.

12. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne

QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.

13. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez

jusqu’au besoin. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30.0µL, ajoutez assez du tampon

d’élution afin de compléter le volume à 30.0µL).


43

Protocole pour la Purification QIAquick

Produit de PCR

ou

Morceau de gel solubilisé

ou

Réaction enzymatique

Liaison

Lavage

Élution


44

DIGESTIONS DES AMPLICONS DE PCR ET DU VECTEUR pUC19

Méthode: (Groupes de 2 assignés)

Un des groupes de deux fera la digestion du produit de PCR purifié tandis que l’autre groupe

de deux fera la digestion du vecteur pUC19!

1. Préparer comme suit un mélange réactionnel de 30µL ou 50uL pour faire une digestion double

PstI-NdeI de vos produits de PCR ainsi que du vecteur pUC19 que vous avez isolé à la semaine

2.

Volume PCR Volume Vecteur

Produit de PCR 10uL ---------

OU Vecteur pUC19 --------- 5uL

Tampon de restriction O range 10X 1X 1X

Pst I 1uL 1uL

Nde I 1uL 1uL

Eau Compléter à 50uL Compléter à 30uL

2. Faire la digestion à 37oC pour 1 heure.

Pour les digestions des produits de PCR

3. Suite à la digestion, purifier tel que précédemment les produits de PCR digérés une fois de plus

par la méthode de QiaQuick.

Pour les digestions de pUC19

4. Couler un gel de 1% avec le peigne de huit puits sur lequel vous avez collé deux des puits

ensemble à l’aide de papier collant. (Voir l’image ci-dessous)

5. Faire la migration de la totalité de votre digestion du vecteur pour approximativement 45

minutes.

6. Examiner votre gel sous les UV, découper la bande d’agarose qui contient le vecteur digéré et la

mettre dans un tube de microcentrifuge.

7. Poursuivre avec la purification par la méthode de QiaQuick tel qu’indiqué sur la page suivante.


45

PURIFICATION D’ADN SUR GEL AVEC LE KIT DE PURIFICATION QIAQUICK

NOTEZ: toutes les centrifugations auront lieu à la température de la pièce et à vitesse maximale.

ASSUREZ-VOUS D’UTILISER POUR CHAQUE CENTRIFUGATION UN AUTRE TUBE

POUR BALANCER (celui d’un autre groupe!?!).

Méthode : (Groupes de 2 assignés)

1. Déterminer le poids de votre bande d’agarose.

2. Ajouter 300µL du tampon QG pour chaque 100mg de gel.

3. Incuber à 50°C pour 10 min (ou jusqu’a ce que la bande d’agarose soit totalement dissoute)

4. Ajouter 100µL d’isopropanol pour chaque 100mg de gel.

5. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.

6. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.

7. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK

dans le même tube.

8. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.

9. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES.

10. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.

11. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le

même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon

PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.

12. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.

13. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la

colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.

14. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne

QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.

15. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez

jusqu’au besoin. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30.0µL, ajoutez assez du tampon

d’élution afin de compléter le volume à 30.0µL).

LIGATURE DES AMPLICONS

Vous pouvez maintenant préparer les ligatures de produits de PCR au vecteur pUC19 digéré.

Préparation de vos ligatures:

Ingrédient Tube 1 Tube 2

Vecteur 5.0 L 5.0 L

Tampon de ligature 10 X 2.0 L 2.0 L

Amplicon de PCR (insertion) 5.0 L 0.0 L

Eau ajouter de l’eau pour compléter le volume à 20.0 L

Ligase 1.0 L 1.0 L

DONNER VOS ÉCHANTILLONS ÉTIQUETÉS À VOTRE AIDE ENSEIGNANT

Les ligatures seront incubées à la température de la pièce jusqu'à demain puis entreposées à -20oC


46

Exercice 5

Qu'est-ce qu’on fait aujourd'hui!

Projet I: Mutagénèse dirigée de LacZ Transformation des ligatures


(dernière chance)

Project III: Empreinte génomique Isolation d’ADN génomique humain des cellules de joues

Amplification par PCR du VNTR d’ApoC2

Amplification du RFLP d’ApoB


47

Projet II


(Dernière chance) Dans le meilleur des mondes, les digestions doubles que vous avez exécutées la semaine dernière

étaient idéales et ont toutes fonctionné. Suite à l’analyse de vos résultats, vous avez pu déterminer la

position d’autant de sites de restriction que possible. Malheureusement, les choses ne fonctionnent

pas toujours parfaitement la première fois, même pour les chercheurs les plus expérimentés. Vous

pouvez répéter vos digestions, faire des digestions différentes, les faire migrer sur un gel d’un

différent pourcentage, etc.

SI NÉCESSAIRE, FAITES LES EXPÉRIENCES REQUISES AFIN DE PRÉCISER VOTRE

CARTOGRAPHIE.

Projet I

Mutagenèse dirigée de LacZ

Transformation des ligatures dans des cellules d’E.coli : La semaine dernière, vous avez fait des ligatures afin d’introduire vos amplicons dans pUC19. Afin

d’isoler, d’amplifier et de maintenir les recombinants voulus vous allez maintenant introduire ces

plasmides recombinant dans E.coli. Vous allez transformer des cellules d’Escherichia coli TOP10

avec vos ligatures de la semaine passée. E. coli n’incorpore habituellement pas facilement l’ADN

mais ces cellules ont subi un traitement au CaCl2 afin de modifier leur paroi cellulaire. Les cellules

que vous allez recevoir sont donc COMPÉTENTES pour la transformation d’ADN. Mais, même

avec ce traitement, seulement qu’un faible pourcentage des cellules prendront de l’ADN. Afin

d’identifier celles-ci, un marqueur de sélection, la résistance à l’ampicilline, est inclus dans le

vecteur. Donc, seulement les cellules qui auront incorporé un plasmide circulaire, qui peut être

répliqué et maintenu, exprimeront cette résistance et seront capables de croître sur des géloses qui

contiennent de l’ampicilline. Toutes les cellules qui n’auront pas incorporé d’ADN ou qui auront

incorporé de l’ADN linéaire n’exprimeront pas cette résistance est ne pourront pas croître sur des

géloses sélectives.


48

Matériaux :

Cellules d’E.coli TOP10 compétentes

Géloses YT-AMP: (supplémentées avec 50μg/mL d’ampicilline pour la sélection).

Méthode :

1. Étiqueter 2 tubes jetables (tubes “snap-cap” de polypropylène de 15mL) et entreposés sur glace.

2. Transférer 100µL de cellules dans chaque tube, en vous assurant de ne pas contaminer les parois

du tube avec votre pipette.

3. Ajoutez 5µL de la ligature appropriée au tube étiqueté. Mélangez en remuant, et garder 30

minutes sur glace.

4. Incubez pour exactement 45 secondes dans un bain d’eau à 42ºC. Ce choc thermique est

nécessaire afin d’obtenir une bonne efficacité de transformation, mais si vous gardez les cellules à

42ºC pour trop longtemps, elles vont mourir. Ensuite, transférez immédiatement sur glace.

5. Ajoutez 0.9mL de bouillon SOC préchauffé (37ºC). Incubez 1 heure à 37

ºC en mélangeant afin de

permettre l’expression du gène de résistance à l’antibiotique.

6. Étalez 100µL et 200 L de chacun des mélanges de transformation sur des géloses YT-AMP et

incubez toute la nuit à 37°C. Assurez-vous que vos plaques sont clairement étiquetées et placées à

l’envers dans l’incubateur à 37°C pour la soirée.

Les témoins de transformation suivants seront faits par vos aides enseignants:

Cellules traitées avec de l’ADN plasmidique (~5 pg de pUC circulaire)

Toujours utiliser les contenants à déchets de biohazard pour jeter les déchets microbiens et

d’ADN recombinant.

LE LENDEMAIN, VOS GÉLOSES SERONT ENTREPOSÉES À 4oC.


49

Projet III

Empreintes génomiques

L’analyse de polymorphismes de nucléotides simples (SNP) est devenue chose courante pour

identifier des génotypes de maladies et autres.

VNTR

Le principe de la variation évolutionnaire parmi une population est une des fondations de la biologie.

Ces variations sont le résultat de différences subtiles dans la séquence d'ADN des individus d'une

espèce donnée. Les variations surviennent souvent à cause d'erreurs de duplication de courtes

séquences de nucléotides où seulement qu'une copie était présente avant la réplication. Ceci résulte

en une répétition en tandem de la séquence originale. Si cette erreur survient encore une fois dans

une autre ronde de réplication, alors trois copies de la séquence seront en tandem (figure). Ces

répétitions en tandem font partie de nos chromosomes et sont donc héritées d'après le principe de la

génétique de Mendel. Au cours des siècles, le nombre de répétitions en tandem a augmenté ce qui

fait que chacun d'entre nous a hérité un nombre variable de répétitions en tandem (VNTRs) à

plusieurs loci dans nos génomes. On peut penser à un VNTR comme un loci avec chaque nombre de

répétitions d'une unité particulière étant analogue à différents allèles. Donc, chaque être humain (sauf

pour les vrais jumeaux) possède une combinaison unique de VNTRs et ces allèles peuvent être

utilisés dans les études de populations ou pour identifier un individu particulier.

Figure. Illustration du nombre de répétitions en tandem variable (VNTRs). Un simple brin d'ADN

du même locus de trois différents individus est montré. Dans cette région, le trinucléotide répété

CAT est présent une, deux ou trois fois ce qui donne des allèles de trois différentes longueurs.

RFLP

Un autre type de polymorphisme qui survient est appelé un polymorphisme de restriction de longueur

(RFLP). Ces polymorphismes surviennent quand un nucléotide unique est changé dans un site de

restriction, ce qui l'abolit ou le change. En conséquence, une région donnée du génome peut avoir un

site de restriction qui est absent dans la même région d'une autre copie du génome ou dans le génome

d'un autre individu.

Dans ce projet, vous déterminerez votre génotype de deux polymorphismes, un VNTR et un RFLP,

associé avec les gènes ApoC2 et ApoB respectivement.


50

Isolation d’ADN génomique des cellules de joues:

Méthode: (Groupes de 2)

1. Une personne de chaque groupe de deux devrait utiliser un écouvillon stérile afin de se frotter

l’intérieur d’une des joues six fois. Sans tourner l’écouvillon, le déplacer de l’autre côté et frotter

l’intérieur de l’autre joue six fois.

2. Placer la portion de coton de l’écouvillon dans un tube de microcentrifuge de 1.5mL. Ensuite,

briser la tige juste au dessus du coton pour qu’il tombe dans le tube.

3. Ajouter 400µL de PBS 1X pH 7.4 dans le tube.

4. Ajouter 20µL de protéinase K puis 400µL du tampon AL. Mélangé immédiatement au vortex

pour 15 secs. Ne pas ajouter la protéinase K directement au tampon AL.

5. Incuber à 56oC pour 10 min. Centrifuger brièvement pour récolter le liquide sur les parois.

6. Ajouter 400µL d’éthanol à 99%. Mélanger sur le vortex pour 8 à 10 sec. Centrifuger brièvement

pour récolter le liquide sur les parois.

7. Appliquer 600µL de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols et

centrifuger à 8k rpm pour 1min. Changer le tube de collecte.

8. Appliquer le restant de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols

et centrifuger à 8k rpm pour 1min. Changer le tube de collecte.

9. Ajouter 500µL du tampon AW1. Fermer et centrifuger à 8k rpm pour 1min. Changer le tube de

collecte.

10. Ajouter 500µL du tampon AW2. Fermer et centrifuger à vitesse maximale pour 3min. Changer le

tube de collecte.

11. Centrifuger à vitesse maximale pour 1 min afin de retirer le tampon résiduel et prévenir le

transfère.

12. Placer une colonne QIAprep dans un nouveau tube de 1.5mL de microcentrifuge duquel vous

avez coupé le capuchon. Ajouter 150µL du tampon AE à la colonne. Attendre 1 min puis

centrifuger à 8k rpm pour 1 min afin d’éluer.

13. Transférer l'ADN élué à un nouveau tube de microcentrifuge étiqueté et entreposé pour une

utilisation ultérieure.


51

Amplification par PCR des gènes ApoC2 et ApoB

Méthode: (Groupes de 2)

Les groupes pairs amplifieront le gène ApoB

Les groupes impairs amplifieront le gène ApoC2

Préparer vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50 L. Dans des tubes de PCR

étiquetés (utiliser des tubes de PCR de 200 L à paroi mince) ajouter les ingrédients suivants dans

l'ordre indiqué dans le tableau ci-dessous. Utiliser un nouvel embout autoclavé pour chaque

composante. Notez: la polymérase Taq sera ajoutée par A.E.

Ingrédients Conc. mère Conc. Finale Volume


Tampon de PCR Taq 10X 1X

Amorce ApoB For ou D1S80 For 2µM 0.2µM

Amorce ApoB Rev ou D1S80 Rev 2µM 0.2µM

MgCl2 50mM 2.0mM

dNTP 2mM 200µM

ADN Génomique de joue 5µL 5µL

Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL

Une fois que vous aurez complété l'assemblage de votre réaction, donnez là à votre aide enseignant.

Vos échantillons vous seront retournés la semaine prochaine.

Conditions d'amplification par PCR:

1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer;

2. 35 cycles de 30sec, 94oC dénaturer; 30sec, 55

oC (ApoB) ou 65

oC (ApoC2) appariement;

1min, 72oC extension.

3. 1 cycle de 5min, 72oC.

4. Refroidir indéfiniment à 4oC.


52

Exercice 6


Projet I: Mutagénèse dirigée de LacZ Criblage par PCR des transformants

Analyse des produits de la PCR de colonies

Repiquage sur X-Gal

Projet III: Empreintes génomiques Digestion par enzyme de restriction et analyse sur gel du produit d'amplification

d'ApoB

Analyse sur gel du produit d'amplification d'ApoC2


53

Projet I

Mutagenèse dirigée de LacZ

Criblage et repiquage des transformants d’E.coli (Groupes de 4) Si vos transformations ont été une réussite, vous allez voir plusieurs colonies représentant des clones

indépendants d’E.coli qui possèdent des plasmides avec ou sans insertions. Votre première tâche

consiste à compter toutes les colonies sur toutes les géloses des ligatures, incluant les témoins de

ligatures et de transformation. Enregistrer le nombre de colonies sur chacune des géloses.

ASSUREZ-VOUS DE GARDER UN RAPPORT PRÉCIS DES DONNÉES; CELLES-CI NE

VOUS SERONT PAS DONNÉES À UNE DATE ULTÉRIEURE!!

Une fois les comptes enregistrés vous utiliserez la PCR pour cribler les recombinants pour des

insertions (et visualiser les produits de PCR suite à une électrophorèse). Ceci sera accompli en

utilisant des amorces contre des régions du vecteur pUC19 qui bordent le gène LacZ.

Méthode:

1. Étiqueter 4 tubes de microcentifuge de 1-4 et faire une grille sur une gélose YT+ amp + Xgal

étiquetée de 1-4.

2. Préparer un cocktail de PCR pour 5 réactions de 20 L. GARDÉE SUR GLACE Ci-dessous est

la recette pour un mélange réactionnel de 20 L.

Réactions de PCR

Solution Conc. mère Conc. finale

Eau L pour un volume final de 20 L

Tampon Taq 10X 1 X

Amorce MutScreenFor 2 M 0.2 M

Amorce MutScreenRev 2 M 0.2 M

MgC12 50 mM 2.5 mM

dNTPs 2mM 200 M

ADN Pol. Taq 5U/µL 2.5U

3. Distribuer 20 L du cocktail à chacun des 4 tubes de PCR étiquetés (SUR GLACE)

4. Utiliser un embout de pipetteur et toucher délicatement une de vos colonies, strier sur un des

quartiers de votre gélose, puis placer l’embout dans le tube de PCR correspondant.

5. Répéter l’étape 4 avec 3 autres colonies.

6. Retirer les embouts de chacun des tubes de PCR, fermer le capuchon et donner vos tubes à votre

aide enseignant pour qu’ils soient placés dans le cycleur thermique.

7. Mettre vos géloses à l’endroit désigné pour qu’elles soient incubées.

Conditions de PCR:

i. 1 cycle de 5 min, 94oC pour dénaturer;

ii. 30 cycles de 30s, 94oC dénaturer; 30s, 55

oC appariement; 1.5min, 72

oC extension.

iii. 1 cycle de 5 min, 72oC

iv. Refroidir à 4oC.

8. Préparer un gel d’agarose de 1.25% contenant du bromure d’éthidium


54

Analyse des produits de PCR: 1. Obtenir vos réactions de PCR puis poursuivre comme suit :

Digestions avec XbaI

2. Préparer 4 digestions, une pour chacune de vos réactions de PCR, dans un volume final de 20µL

qui contient 5µL de chacun de vos produits de PCR.

3. Faire la digestion pour une heure.

Digestions avec XhoI

2. Préparer 4 digestions, une pour chacune de vos réactions de PCR, dans un volume final de 20µL

qui contient 5µL de chacun de vos produits de PCR.

3. Faire la digestion pour une heure.

Migration sur gel

4. Pour chaque réaction de PCR préparez les échantillons suivant pour l’analyse sur gel :

5µL du produit de PCR

+ 5µL

Tampon de chargement

Non digéré

Digéré avec XbaI

Digéré avec XhoI

5. Charger 5 L de chaque mélange, ainsi que l’échelle de poids moléculaire sur votre gel d’agarose

de 1.25%. Faites migrer pour 1 à 1.5 heures à 100 V.

6. Prendre une photo de votre gel.

Projet III

Empreintes génomiques Méthodes (Groupes de 2)

Gène ApoB:

1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoB.

2. Dans le cas du gène ApoB, utiliser 10µl de la réaction de PCR pour préparer une digestion par

enzyme de restriction avec l'enzyme EcoRI dans un volume final de 20µl.

3. Un groupe de la classe préparera aussi un témoin non digéré.

4. Après avoir fait la digestion pour une heure, ajoutée du tampon de chargement et chargée sur le

gel précoulé.

5. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise pour

votre analyse.

Gène ApoC2 1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoC2.

2. Ajouter du tampon de chargement à un échantillon de 10µl de votre réaction de PCR.

3. Charger sur le gel précoulé.

4. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise pour

votre analyse.


55

Exercice 7


Projet IV : Contrôle transcriptionnel du gène de Mel1 Isolation d’ARN de levures

Électrophorèse d’ARN

Transfert Northern

RT-PCR


56

Projet IV

Contrôle transcriptionnel du gène Mel1

Cette semaine vous initierez des expériences qui vous permettront d’examiner la régulation

transcriptionnelle du gène Mel1 qui code pour l’enzyme alpha galactosidase. Vous examinerez

l’abondance relative du transcrit de Mel1 sous différentes conditions de croissances. Deux méthodes

seront utilisées. La première, une analyse Northern, semblable au Southern, implique l’isolation, la

séparation et le transfert de l’ARN plutôt que de l’ADN. La deuxième technique utilisée sera le RT-

PCR qui sera discuté plus loin.

Isolation d’ARN totaux:

Comme dans toutes expériences, la purification du matériel de départ est cruciale. Vous allez isoler

de l’ARN de cellules de levures de S. pastorius et utiliser ensuite la spectrophotométrie afin

d’estimer la concentration et la pureté de l’ARN.

Les manipulations de l’ARN sont plus exigeantes que les manipulations de l’ADN puisque l’ARN est

moins stable et plus susceptible à la dégradation. Vous devez donc faire très attention de ne pas

contaminer aucune des solutions.

Toujours porter des gants!!

Dans l’expérience suivante, vous ferrez l’isolation d’ARN total de différentes conditions de

croissances. Une culture de levure a initialement été crue dans un bouillon avec du glucose. Au début

du laboratoire, cette culture a été transférée dans soit un milieu contenant du galactose ou un milieu

contenant du glucose plus du galactose. Chaque groupe isolera l’ARN total d’une des conditions de

croissances après le transfert à différentes périodes de temps après le transfert (T = 0, 2, 4, 6 h.).

Vous allez ensuite partager votre ARN avec celui des autres groupes qui ont isolé l’ARN d’une

différente condition de croissance afin de comparer l’abondance relative de l’ARN de Mel1 entre ces

conditions.

À la fin de cette expérience, vous devriez donc générer une membrane avec l’ARN des différentes

conditions de croissances.


57

Méthode : (Groupes de 2) (les étapes 1-3 ont été faites pour vous)

1. Obtenir une culture de levure de 10mL qui représente un transfert au galactose ou au glucose +

galactose tel qu’assigné.

2. Centrifuger pour 10 minutes à 7 000 rpm.

3. Jeter le surnageant.

4. Suspendre le culot dans 200μL de tampon de lyse.

5. Transférer à un nouveau tube avec un bouchon à vis qui contient des billes de verres et 200μL de

phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1).

6. Mélanger au vortex pendant 2 minutes et ensuite placer sur glace pour 2 minutes.

7. Répéter l’étape 6 deux fois de plus.

8. Centrifuger à vitesse maximale pour 5 minutes. Transférer la phase aqueuse supérieure à un

nouveau tube.

9. Ajouter 0.1 volume de 3M NaOAc et 1mL d’ETOH de 99%, bien mélangé par inversion et

centrifuger à vitesse maximale pour 2 minutes.

10. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 100μL d’eau traitée au DEPC.

11. Déterminer le rendement et la pureté.

Détermination de la concentration d’ARN et la quantité récupérée par spectrophotométrie.

Préparer une dilution de votre échantillon d’ARN de 1/20 avec de l’eau dans un volume final de 100

µl. Mesurer l’absorbance aux longueurs d’onde de 260 nm et 280 nm en utilisant de l’eau comme

témoin. Vous pouvez estimer la concentration d’ARN en utilisant le rapport suivant (pour de l’ARN

simple brin): absorbance de 1.0 à 260 nm = une concentration d’ARN de 40 g/mL Si le rapport

A260/A280 >1.90, l’ARN est relativement pure et sans protéine.

Calculer la quantité d’ARN récupérée. Vous désirez obtenir 5 g dans un volume maximal de 9 lL

Électrophorèse d’ARN et transfert Northern (Groupe de 8)

On peut utiliser l’analyse Northern afin de détecter une seule espèce d’ARN à l’intérieur d’une

population d’ARN total provenant d’un organisme (ou organite). Avant qu’un transfert Northern

puisse être fait, les molécules d’ARN sont séparées en fonction de leurs tailles sur un gel d’agarose

dénaturant. Le type de gel d’ARN les plus couramment utilisés est celui fait de formaldéhyde. Ce

type de gel procure des conditions dénaturantes qui empêchent l’appariement des bases, réduisant

ainsi la formation de structures secondaires chez les molécules d’ARN. Ceci est important puisque,

contrairement aux fragments d’ADN bicaténaires qui ont la même conformation malgré les

différentes longueurs, les ARN monocaténaires peuvent avoir différentes conformations en raison de

l’appariement de bases à l’intérieur du brin. De telles structures secondaires affecteraient la

migration électrophorétique et rendraient l’estimation de la taille imprécise.


58

Matériaux: Les ribonucléases sont partout! Afin de réduire le risque de dégradation de l’ARN, portez des gants

et conservez vos échantillons sur glace. Le formaldéhyde est toxique. Portez des gants et des

lunettes de sécurité lorsque vous manipulez cette solution et travaillez sous la hotte autant que

possible.

Solutions :

Tampon MOPS 5X pour gel d’électrophorèse d’ARN 0.2 M acide morpholinopropanesulfonique (MOPS) pH 7.0

50 mM acétate de sodium

5 mM EDTA

Cette solution tampon est d’une couleur allant du clair au jaune pâle, mais devient jaune plus foncé

après avoir été autoclavé. Son changement de couleur ne semble pas affecter sa fonction.

Formaldéhyde: Solution stock 37%

Formamide désionisée: Mélangé à une résine (BioRad AG501-X8) jusqu’à pH neutre. Entreposé au congélateur en petits

aliquotes ou fraîchement préparés.

Tampon de chargement pour l’ARN

0.8 mL de tampon MOPS 5X

0.2 mL glycérol,

0.7 mL formaldéhyde,

0.005 mL 0.5M EDTA (pH 8.0),

0.2 mL eau DEPC

10 mg bleu de bromphénol.

10 g/mL conc. finale de bromure d’éthidium.

Complétez à 2.0 mL.


59

Méthodes :

A. Préparation d’un gel d’agarose au formaldéhyde (Un gel par table ou groupe de 8)

1. Combinez les composantes suivantes pour la préparation d’un gel d’agarose-formaldéhyde de

1.5% (25mL) pour l’appareil BRL Horizon (en utilisant le peigne à 8 puits):

Tampon MOPS 5X, pH 7.0 5 mL

H20 15.5 mL

Agarose 0.375 g

2. Dissoudre l’agarose dans le four à micro-ondes. Laissez refroidir un peu. Ensuite, sous la hotte,

ajoutez 4.5mL de formaldéhyde (solution 37%) (ATTENTION! VAPEURS VOLATILES).

Mélangez en remuant et coulez le gel immédiatement.

3. Fermer le couvercle et laisser le gel solidifier au moins 30 minutes.

B. Préparation des échantillons d’ARN (par table ou groupe de 8) Vous allez préparer quatre échantillons d’ARN différents. Il est important que chaque voie de

migration du gel contienne la même quantité d’ARN.

Vous aurez besoin des échantillons d’ARN suivants :

Un échantillon d’ARN totaux de levure 0h après le transfert




1. Afin de préparer les échantillons d’ARN pour la migration sur le gel, mélangez les composantes

suivantes en utilisant des tubes étiquetés SUR GLACE:

Volume final = 30 µL

Échantillon d’ARN: µL (Ce volume d’échantillon devrait contenir 5 g d’ARN)

Tampon de chargement: 21µL (Tampon de chargement pour l’ARN et non pas pour l’ADN)

Eau (jusqu’à 30 µl): µL

2. Incubez vos échantillons 10 minutes à 70ºC et ensuite, placez rapidement les échantillons sur

glace. S’il y a du liquide sur le bord du tube, centrifugez quelques secondes.

3. Chaque groupe de 8 doit préparer un gel comme suit : Charger 14 µL des échantillons d’ARN des

différentes conditions de croissances sur un gel comme suit :


60

VOIES ÉCHANTILLONS

1 Vide

2 Vide

3 ARN de cellules de levure 0h après le transfert au galactose ou glucose + galactose




7 Vide

8 Vide

Ceci génèrera un gel qui contient des échantillons de deux groupes de 4.

C. Électrophorèse sur gel 1. Le tampon de migration sera du MOPS 1X. Faire migrer le gel à 80 V (courant de ~ 80 mA)

jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol dépasse la moitié du gel.

2. Enlevez le gel du boîtier d’électrophorèse, examinez sous les UV et prenez une photo.

Notez : Les gels de formaldéhydes sont plus FRAGILES que les gels non dénaturants, faites

très attention!

3. Lavez le gel 2 fois avec 5 volumes d’eau, et ensuite 1 fois en utilisant 2 volumes de 10X SSC

pour environ 5 minutes chaque fois. Ceci est nécessaire afin d’enlever le formaldéhyde qui

préviendrait l’hybridation.

D. Transfert capillaire

On vous fournira une membrane de nylon ainsi que des papiers-filtres coupés de la même taille que le

gel. Éviter autant que possible de manipuler la membrane avec vos doigts.

1. Étiqueter une extrémité de la membrane avec le jour du labo, votre no de groupe, et « ARN ».

2. Tremper la membrane dans de l’eau distillée et ensuite dans du 2X SSC.

3. Assembler votre transfert Northern tel qu’illustré sur la page suivante. Assurez-vous que la

périphérie de votre gel est entourée avec de la pellicule de plastique afin d’éviter un court-circuit.

4. Après le transfert, la membrane est séchée, étiquetée, fixée aux UV et entreposée dans un sac de

plastique.


61

Transfert Capillaire Northern

Membrane de nylon coupée à

la taille exacte du gel

Gel

Face vers le bas

Deux feuilles de papiers

filtres trempés dans du

SSC 20X

Papier filtre qui trempe

dans du SSC 20X

Panneau de verre ou de plastique

pour le support sur un plateau

remplit de SSC 20X

Pile de papiers absorbants Poids

Direction capillaire


62

L'AMPLIFICATION DE L'ARNm DE MEL1 PAR RT-PCR

Une autre méthode qui peut être utilisée pour comparer l’abondance relative d’un transcrit sous

différentes conditions est le RT-PCR. Contrairement à une analyse Northern, cette méthode est plus

sensible et idéale pour l’analyse de transcrits faiblement exprimés.

Contrairement aux réactions de PCR traditionnelles, tel que celle que vous avez faite avec l’ADN

génomique, le RT-PCR utilise l'ARN plutôt que l'ADN comme matrice. Par contre, puisque l’ADN

polymérase thermostable utilisé dans la réaction de PCR fonctionne seulement avec une matrice

d'ADN, l'ARN doit préalablement être transcrit en ADN. Ceci est accompli par un ADN polymérase

ARN-dépendante, la transcriptase inverse (RT). La transcriptase inverse est utilisée pour synthétiser

un ADN complémentaire (ADNc) simple-brin à partir de l'ARN d'intérêt. Une amorce oligo dT sera

utilisée pour cette réaction. Une fois que l'ADNc a été généré, une réaction de PCR standard, utilisant

les amorces contre Mel1 ou actine, sera faite pour amplifier la séquence correspondant à l'ARNm.

Pour un survol sur la technique de RT-PCR consultez le site web suivant :

http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Flash/RT_PCR.htmL

NOTEZ: CHAQUE GROUPE DE DEUX DEVRA FAIRE UNE RÉACTION DE

TRANSCRIPTASE INVERSE SUR L’ARN QU’ILS AURONT ISOLÉ DE LEVURES CRUES

SOUS LA CONDITION DE CROISSANCE ASSIGNÉE.


Traitement de l’ARN total avec ADNase :

1. Avant de commencer votre réaction de RT, vous devez vous assurer d'éliminer tout ADN

contaminant de vos échantillons d'ARN. Dans un volume final de 25 L, ajouter les composantes

suivantes:

2.0 g de votre échantillon d'ARN

2.5 L de tampon de l’ADNase I de 10X

Eau pour un volume final de 24 L

1 L d’ADNase I

2. Incubez 15 minutes à la température de la pièce. Après le traitement à l'ADNase, inactivez

l'enzyme en ajoutant 2.5µL d’EDTA 25mM et en incubant 5 minutes à 65ºC. Refroidir sur glace.

http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Flash/RT_PCR.html


63

Réaction de transcriptase inverse :

3. Préparer une réaction RT dans un tube de PCR tel qu’indiqué ci-dessous. Utiliser un nouvel

embout autoclavé pour chacune des composantes ajoutées.

4. Mettre 19.0 L d’eau DEPC dans un tube.

5. Ajouter 4.0 L d’amorce oligo-dT.

6. Ajouter 4.0 L d’un mélange de dNTP à 2mM.

7. Ajouter 2 L de votre ARN traité à l’ADNase.

8. Permettre l’appariement de l’amorce oligo-dT en incubant votre mélange pré-réactionnel de RT à

70oC pour 5 minutes.

9. Laisser le tube refroidir sur votre table de travail pour 5 minutes.

10. Ajouter 8.0 L du tampon RT 5X

11. Ajouter 2.0 L de DTT à 100mM pour obtenir une concentration finale de 5mM.

12. Ajouter 1.0 L de la transcriptase inverse de MMLV à 200U/ L pour obtenir une concentration

finale de 5U/ L.

13. Incuber à 42oC pour 60 minutes.

14. Inactiver la transcriptase inverse en incubant le mélange réactionnel à 70oC pour 15 minutes.


64

Réactions de PCR : (Chaque groupe de 2 préparera 2 réactions de PCR. Une avec les amorces

de Mel1 et l’autre avec les amorces d’actine)

14. Suite à la réaction de transcriptase inverse, préparer les réactions de PCR comme suit :

Amorces :

mel1RTpF: GCAGATGTCCCTGTGATGGCGATG

mel1RTpR: ACCGTGAGCTGGAACAGTCGTGT

ACTIN (FOR) CGATATGGAAAAGATCTGGC

ACTIN (REV) AGAACCACCAATCCAGACGG

Échantillon Conc. mère. Conc. finale

Eau l pour un volume final de 49 L

Tampon de la polymérase Taq 10 X 1X

Amorce mel1RTpF ou Actine (For) 2 M 0.2 M

Amorce mel1RTpR ou Actine (Rev) 2 M 0.2 M

MgCl2 50mM 2.0mM

dNTP 2mM 200 M

Polymérase Taq 5unités/µL 2.5U/réaction

15. Ajouter 1 L de votre réaction de RT (ADNc) à chacun des mélanges réactionnels de PCR. Une

fois vos mélanges réactionnels complétés, entreposés les dans le bac à glace à l’avant pour faire le

PCR.

16. Vos réactions de PCR vous seront retournées la semaine prochaine.

Vos PCR seront effectuées sous les conditions suivantes:

i. 1 cycle: 5 min, 94oC pour dénaturer;

ii. 30 cycles: 30 sec, 94oC pour dénaturer; 30 sec, 58

oC l’appariement; 30 sec, 72

oC pour élongation.

iii. 1 cycle: 5 min, 72oC.

iv. Refroidir à 4oC.


65

Exercice 8


Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1 Hybridation Northern

Analyse des réactions de RT-PCR


66

Projet IV

Contrôle transcriptionnel de Mel1

HYBRIDATION NORTHERN

Dans les dernières semaines, vous avez généré un Northern. Cette semaine vous allez préparer les

membranes pour l’hybridation avec une sonde étiquetée avec Dig.

Informations générales sur l’hybridation d’acides nucléiques:

Avant de faire l’hybridation de la sonde à la membrane, une étape de pré hybridation est faite. Cette

étape est nécessaire afin de réduire le bruit de fond et l’hybridation non spécifique. Le bruit de

fond se définit comme la liaison non spécifique de la sonde à la membrane et elle n’implique pas

d’hybridation. L’hybridation non spécifique représente l’hybridation de la sonde à des séquences

qui possèdent un faible pourcentage d’identité. Afin de réduire ces deux évènements, les membranes

sont initialement assujetties à un réactif de blocage qui inclut habituellement une concentration

élevée d’ADN non spécifique, tel que de l’ADN de sperme de saumon. Le but de ce réactif est de

saturer tous les sites de liaisons sur la membrane ainsi que les sites d’hybridations non spécifiques sur

les acides nucléiques.

Suite à l’étape de pré hybridation, les membranes sont assujetties à la sonde étiquetée en présence du

réactif de blocage. Dépendant des conditions de stringence, la sonde va facilement faire compétition

avec des liaisons non spécifiques et donc s’hybrider de façon spécifique aux séquences

complémentaires.

L’excédant de sondes, qui sont non hybridées ou qui sont faiblement hybridée à des séquences avec

une complémentarité faible, sera enlevée par une série de lavages de stringences variées. Notez que la

stringence est déterminée par la température et la concentration de sels. Ces deux paramètres

déterminent le niveau d’homologie qui est requis pour permettre l’hybridation. Une stringence plus

faible représente des conditions d’hybridation qui sont plus permissives et permet donc l’hybridation

avec des séquences dont le niveau de complémentarité est plus faible. De façon inverse, une

stringence élevée est moins permissive et exige donc un niveau de complémentarité élevé afin de

permettre la formation d’hybrides stables.


67

Préhybridation (Groupes de 8)

Par banc, vous devriez avoir une membrane Northern.

Solution de Préhybridation/Hybridation :

5X SSC (20X SSC: 3M NaCl et 0.3M NaCitrate)

0.02% sodium dodecyl sulfate (SDS)

20mM sodium maléate, pH 7.5

4M Urée

100μg/mL ADN de sperme de saumon

1. Placer votre membrane Northerns dans un tube Falcon de 50mL étiquetés clairement avec votre

numéro de groupe. Ajoutez 10mL du mélange de préhybridation et fermez en serrant fortement.

2. Introduire vos tubes dans les bouteilles de verres du four d’hybridation. Assurez-vous de ne pas

égratigner les parois intérieures des bouteilles de verre.

3. Positionnez le tube en verre dans le four à hybridation. Assurez-vous que les tubes sont

balancés en plaçant un deuxième tube en verre dans la position opposée de la roue.

4. Faites tourner lentement (position no3) à 42

oC pour un minimum de 1 heure.

Hybridations

À présent, vous êtes prêts pour l’hybridation avec la sonde Mel1. Mais avant de pouvoir faire

l’hybridation, l’ADN marqué doit être dénaturé.

1. Faites bouillir la sonde pour 3 min et refroidissez là rapidement sur glace. Centrifugez brièvement

afin que l’échantillon s’accumule au fond du tube.

PRÉPARATION DE VOS HYBRIDATIONS (GROUPE DE 8)

2. Déverser la solution de préhybridation des tubes contenants votre Northern.

3. Ajouter immédiatement 10mL de solution fraîche d’hybridation à chacun des tubes.

4. Ensuite, ajouter soigneusement 50µL de la sonde Mel1 dénaturée directement au liquide

d’hybridation du Northern. Évitez tout contact direct entre la sonde concentrée et la membrane.

Fermez les tubes fermement et installez-les dans le four à hybridation tel qu’auparavant.

5. Faire l’hybridation de vos Northerns à 42oC toute la nuit.

CES MEMBRANES SERONT ENTREPOSÉES POUR UNE UTILISATION ULTERIEUR


68

RT-PCR

Analyse de vos réactions de RT-PCR: (Groupe de 8)

1. Un gel d’agarose de 1.5% avec 2 X 10 puits a été coulé pour vous.

2. Retirer vos réactions de RT-PCR du congélateur.

3. Préparer les échantillons suivants pour l’analyse sur gel :

10 µL du RT-PCR Mel1 d’ARN de levure après un transfert de 0h au galactose.




10 µL du RT-PCR actine d’ARN de levure après un transfert de 0h au galactose.




Ou

10 µL du RT-PCR Mel1 d’ARN de levure après un transfert de 0h au glucose + galactose.




10 µL du RT-PCR actine d’ARN de levure après un transfert de 0h au glucose + galactose.



10 µL du RT-PCR actine d’ARN de levure après un transfert de 6h au glucose + galactose

4. Faire la migration à 80V.

5. Suite à la migration, visualiser sous les ultras violets et prendre une photo.

6. Une fois que vous aurez obtenu vos images, utiliser le logiciel ImageJ pour faire l'analyse de

densitomètre de vos gels. Le logiciel ainsi que des directives sur son utilisation sont disponible

sur la page web de ce cours sous la rubrique liens bioinfo.


69

EXERCICE 9


Projet I : Mutagénèse dirigé du gène LacZ

Essais de bêta galactosidase

Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1 Immunodétection des membranes Northern

Projet V: Contrôle posttranscriptionnel de l’alpha-galactosidase


70

Projet IV

Contrôle transcriptionnel de Mel1

Les hybridations des Northerns étant faites, vous allez maintenant suivre une procédure pour la

détection des hybrides. Notez que les membranes ont été lavées pour vous afin de retirer la sonde

libre ainsi que celle qui s’est faiblement hybridée.

DÉTECTION IMMUNOLOGIQUE DES MEMBRANES D’HYBRIDATION :

Tous les traitements se font à la température de la pièce.

1. Placer toutes les membranes dans un petit sac de plastique.

2. Ajouter 15mL de tampon d’acide maléique 1X. Incuber 15 min avec agitation. Jeter la solution.

3. Ajouter 20mL de solution de blocage. Incuber 30 min avec agitation. Jeter la solution.

4. Ajouter 10mL de solution d’anticorps. Incuber 30 min avec agitation. Jetez la solution.

5. Transférer les membranes dans le contenant de Tupperware. NE LAISSEZ PAS LES

MEMBRANES SÉCHER! Ajouter 50mL de tampon de lavage. Incuber 15 min avec agitation.

Jeter la solution et répéter l’étape 5 une fois de plus.

6. Ajouter 50mL de tampon d’acide maléique. Incuber 15 min avec agitation. Jeter la solution.

7. Ajouter 10mL de tampon de détection. Incuber 5 min avec agitation. Jeter la solution.

8. Les prochaines étapes doivent être faites rapidement et de façons coordonnés. Aviser votre aide

enseignant ou le technicien avant de procéder. Mettre 2.5mL de la solution CDP-Star dans un

coin du contenant et faire glisser la solution sur la membrane pour la recouvrir. NE METTEZ

PAS la solution directement sur la membrane. Incuber 5 minutes à l’obscurité dans votre tiroir.

9. Placer la membrane avec le côté contenant l’ARN vers le haut sur un papier Whatman.

10. Placer 2 membranes avec le côté contenant l’ARN vers le haut dans l’appareil photo. Prendre une

photo de la réaction de chimioluminescence (exposition de 2 à 10 minutes).


71

Projet I

Mutagénèse dirigé du gène LacZ

Essais de bêta-galactosidase

Essai : (Groupes de 4)

Groupes impairs Faire l’essai avec une dilution de 1/5 des cultures bactériennes pUC; GAT; TAT; GTT; GAA ainsi

que e le témoin avec le milieu de culture non-inoculé

Groupes pairs Faire l’essai avec une dilution de 1/10 des cultures bactériennes, pUC; GAT; TAT; GTT; et GAA.

Méthode :

1. Préparer une dilution dans un volume final de 200μL de chaque culture bactérienne dans des

microtubes pré-étiquetés.

2. Garder sur glace.

3. Pour chaque échantillon de votre essai transférer 80μL de la solution de perméabilization dans un

microtube pré-étiqueté.

4. Ajouter 20μL de la dilution des cultures bactériennes. Garder sur glace.

5. Quand tous vos échantillons d’essais seront prêts, incuber vos échantillons et votre solution de

substrat à 30oC pour 20 minutes.

6. Ajouter 600μL de la solution de substrat pré-chauffé à chacun de vos échantillons d’essais.

NOTER LE TEMPS ZERO. Incuber à 30oC pour 30 minutes.

7. Arrêter les réactions en ajoutant 700μL de solution d’arrêt à tous les tubes. NOTER LE TEMPS

DE REACTION.

8. Centrifuger à vitesse maximale pour 10 minutes tous les réactions d’essais.

9. Transférer 200μL de chacun des essais enzymatiques aux puits d'une plaque de 96 puits tel

qu'illustré sur la prochaine page.


72

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

B blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

C blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

D blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

E blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

F blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

G blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

H blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA

Tampon de perméabilization Solution de substrat 100mM dibasic sodium phosphate 60mM dibasic sodium phosphate

20mM KCl 40mM sodium dihydrogen phosphate

2mM MgSO4 1mg/mL ONPG

0.8mg/mL CTAB 2.7μL/mL β-mercaptoethanol

0.4mg/mL sodium deoxycholate

5.4μL/mL β-mercaptoethanol

Solution d’arrêt 1M carbonate de sodium (Na2CO3)

Calcul des unités de bêta galactosidase:

Β-galactosidase (Miller) unités = 1000 x FD x OD420 / [OD600 x (Vol. rxn ) x t]

où

FD = facteur de dilution

OD420 = absorbance OD420 de l’échantillon d’essai

OD600 = absorbance OD600 de la culture bactérienne

Vol. rxn = volume d’échantillon d’essai (0.020mL)

t = temps d’incubation (minutes) de la réaction (30 minutes)


73

Projet V

Contrôle traductionnel de l’alpha-galactosidase L'expression d'un gène peut être contrôlée à plusieurs niveaux incluant transcriptionnel et

traductionnel. En effet, le fait qu'un gène arrête d'être transcrit ne résulte pas nécessairement dans une

diminution concomitante du produit protéique. Il est donc nécessaire d'examiner le produit protéique

même afin d'obtenir une compréhension globale du profil d'expression d'un gène et de son produit.

Dans l'exercice suivant vous ferrez des essais de l'alpha galactosidase sur des cellules qui ont crues

sous les mêmes conditions sous lesquelles vous avez examiné l'expression du transcrit.

Cet essai consiste à examiner la conversion d'un substrat incolore le p-nitrophenyl α-d-

Galactopyranoside (PNP-α-Gal) à un produit de couleur jaune le p-nitrophenol (voir la réaction ci-

dessous).

PNP-α-Gal + H2O → α-galactosidase → p-nitrophenol + D-galactose (λmax = 410 nm)

Notez, étant donné que la levure exporte l'alpha galactosidase à l'extérieur de la cellule, ces essais

sont faits sur le milieu dans lequel les cellules ont crues plutôt que sur les cellules elles-mêmes.

Réactifs:

Solution PNP-α-Gal (100 mM p-nitrophenyl α-d-Galactopyranoside dans de l'eau déionizée)

Solution d'arrêt 10X (1 M Na2CO3 dans de l'eau déionizée)

Tampon NaOAc 1X (0.5 M sodium acétate, pH 4.5)

Tampon d'essai

o Préparé du tampon frais avant chaque usage en combinant 2 volumes de tampon NaOAc 1X

avec 1 volume de la solution PNP-α-Gal Solution [2:1 (v/v) rapport]. Bien mélanger.

Essai: (Groupes de 2)

Chaque groupe fera l'essai sur l'une des conditions de croissances suivantes tel qu'assigné:

Culture de levure après un transfert de 0h au galactose.




Culture de levure après un transfert de 0h au glucose + galactose.




1. Obtenir 1mL de la culture assigné et gardé sur glace.

2. Transférer 500µL à un nouveau tube de microcentrifuge.

3. Centrifuger à vitesse maximale l'échantillon de 500µL.

4. Transférez-le surnageant à un nouveau tube (NE PAS JETER).

5. Préparer des dilutions de 1/2, 1/4, et 1/10 dans un volume final de 500µL de tampon 1X

NaOAc du surnageant récolté. Garder tous les échantillons sur glace incluant l'échantillon

non dilué.

6. Étiqueter quatre séries de trois tubes de microcentrifuge tel qu'illustré sur la page suivante:


74

7. Transférer 16µL du surnageant du milieu de culture approprié à chacun des trois tubes de

microcentrifuge de la série appropriée.

8. Ajouter 48μL du tampon d'essai a chaque tube de microcentrifuge.

9. Étiqueter un tube "blanc". Ajouter 16 µL de milieu frais non inoculé + 48 μL du tampon

d'essai à ce tube.

10. Incuber à 30°C pour 60 min.

11. Terminer les réactions en ajoutant 136μL de la solution d'arrêt 10X à tous les tubes.

12. Transférer 150μL de chacun des essais enzymatiques aux puits d'une plaque de 96 puits tel

qu'illustré ci-dessous.

Par table ou groupe de 8:

13. Enregistrer les absorbances à 410nm.

Calcul des unités de α-galactosidase:

Une unité est de α-galactosidase est défini comme la quantité d'enzyme qui fait l'hydrolyse de 1

μmole p-nitrophenyl-α-d-galactoside à p-nitrophenol et d-galactose en 1 min à 30°C dans du tampon

acétate, pH 4.5.

α-galactosidase [milliunités/(mL x cell.)] = (OD410 x Vf x 1 000/[(ε x b) x t x Vi x OD600]) x FD

t = Temps d'incubation (en min.)

Vf= Volume final de l'essai (200 μL)

Vi= Volume du milieu de culture ajouté (16 μL)

ε x b = 10.5 (mL/μmol)

FD = facteur de dilution

Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 1

Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 2

Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 3

Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 4

Blanc Blanc Blanc Blanc

Surnageant de culture: Non dilué 1/2 1/4 1/10


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Annexes


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Acide aminé Code de 3 lettres Code d'une lettre

alanine ala A

arginine arg R

asparagine asn N

acide aspartique asp D

asparagine or acide aspartique asx B

cystéine cys C

acide glutamique glu E

glutamine gln Q

glutamine or acide glutamique glx Z

glycine gly G

histidine his H

isoleucine ile I

leucine leu L

lysine lys K

méthionine met M

phénylalanine phe F

proline pro P

serine ser S

thréonine thr T

tryptophane try W

tyrosine tyr Y

valine val V


77

Conversions Spectrophotométrique

1 unité A 260 d'ADN double brin = 50 µg/ml

1 unité A 260 d'ADN simple brin = 33 µg/ml

1 unité A 260 d'ARN simple brin= 40 µg/ml

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