LES OUTILS DE GENETIQUE MOLECULAIRE

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LES OUTILS DE GENETIQUE MOLECULAIRE

LES OUTILS DE GENETIQUE MOLECULAIRE

4 modules

Module 1: Les techniques lies aux acides nucliques

Module 2: La cartographie

Module 3: Le squenage

Module 4: Les gnes et leur expression

I. LES TECHNIQUES LIEES AUX ACIDES NUCLEIQUES

Sommaire

Prparation des acides nucliques

Extraction/Purification

Les enzymes agissant sur les acides nucliques

Dosage et conservation

Synthse in vitro

Sparation des acides nucliques

Electrophorse

Ultracentrifugation

Dtection, caractrisation et identification des acides nuclique

Marquage et suivi des acides nucliques

Marquage radioactif

Marquages froids: colorimtrie, fluorescence; chimioluminescence;

Hybridation molculaire

Southern Blot

Northern Blot

Dot Blot

Hybridation in situ (HIS)

Amplification et slection dacides nucliques particuliers

PCR

RT-PCR

Clonage

Construction de banques

Criblage de banques

Utilisation des vecteurs recombins

I.1. Prparation des acides nucliques

I.1.1. Extraction/Purification

LADN (ou lARN) doit imprativement tre purifi partir de matriels biologiques dans des conditions optimales de qualit et de quantit.

Dans la pratique, les acides nucliques sont souvent extraits du sang total. Le procd classique est lextraction par le couple phnol-chloroforme. Le phnol est un excellent agent dnaturant des protines et il permet de sparer efficacement les protines et les acides nucliques. Il est ensuite limin par lextraction avec du chloroforme (non miscible avec leau). La sparation des phases aqueuse et organique peut se faire par centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucliques. Des traitements par des agents clivant les protines (protolyse) peuvent tre ncessaires. Les acides nucliques peuvent tre finalement rcuprs sous forme solide la suite de prcipitation par lalcool thylique ou par lalcool isopropylique. De nombreux ractifs sont disponibles, prts lemploi, ce qui permet de simplifier les oprations de purification. Il est possible dextraire les acides nucliques partir dchantillons biologiques varis: cultures cellulaires, tissus divers etc... Les mthodes dextraction doivent bien entendu tre adaptes aux quantits disponibles de matriel biologique.

ANNEXE1

Extraction dADN partir du sang

Faire clater les globules rouges du sang par choc osmotique en le mlangeant une solution hypotonique. Rcuprer des globules blancs par centrifugation. Ajouter un mlange de dtergent (SDS ou Sarcosyl) et de protinase K ; le dtergent dtruira les membranes et la protinase digrera les protines associes l'ADN. Extraire l'ADN des protines par un mlange phnol-chloroforme. Ajouter des sels pour augmenter la force ionique puis prcipitation de l'ADN par l'alcool thylique absolu froid (-20C).

L'ADN prcipite sous forme de filaments, visibles lil nu, qui sont rcuprs par enroulement sur une baguette de verre. Re-dissoudre l'ADN dans une solution tamponne. L'ADN peut tre ainsi conserve 4C plus d'un an.

Remarque : la taille des fragments engendrs par les cassures mcaniques au cours de cette extraction est suprieure 20kB. Le rendement de cette mthode est de quelques centaines de microgrammes d'ADN pour 10 20 ml de sang. Attention : viter de congeler l'ADN gnomique, la conglation provoquant de nombreuses cassures de la molcule.

Extraire des ARN

Extraction des ARN totaux

La mthode la plus sre est la mthode de Chirgwin (extraction d'ARN partir de pancras, tissu trs riche en RNAses). Broyer le tissu dans un homognisateur de Potter avec une solution adquate (dtergent SDS ou Sarcosyl + un agent dissociant + une solution tampon + un agent rducteur). Centrifuger l'homognat pour liminer les dbris cellulaires.

L'extraction des ARN se fait : soit par prcipitation diffrentielle de l'ARN et de l'ADN / soit par ultracentrifugation sur coussin de chlorure de csium (seul l'ARN peut, vue sa densit, traverser ce coussin et tre rcupr dans le culot

Laver l'ARN dans l'actate de sodium et prcipiter l'alcool. L'ARN peut tre conserv plus d'un an soit sous forme prcipite dans l'thanol, soit sous forme congele -80C .

Extraire de lARN partir de tissus ou cellules en culture

Les sources cellulaires : des biopsies (ex : de villosits choriales lors d'un diagnostic prnatal) ou cultures de cellules. Les cellules doivent pralablement tre dissocies et homognises lors du passage du tissu dans un homognisateur de Potter en prsence de dtergent. Le protocole est ensuite identique celui mentionn ci-dessus.

Purification des ARNm partir de ARN totaux

La majorit des ARNm eucaryotes possdent une queue polyadnyle (polyA) son extrmit 3', utilise pour purifier les ARNm par affinit.

Passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinit dont les sites de fixation sont des oligonuclotides polydT ou polyU. Les ARN polyA sont retenus alors que les ARNt et ARNr non. Eluer les ARNm et les rcuprer par prcipitation par l'alcool thylique absolu froid. On obtient ~50%d'ARN non polyA. Pour enrichir en ARN polyA, repasser sur la colonne.

Pour dautres informations sur les protocoles dextraction / purification de lADN, cliquez sur http://www.john-libbey-eurotext.fr/articles/abc/57/1/77-84/

I.1.2. Les enzymes agissant sur les acides nucliques

Les enzymes de restriction

Gnralits

Dcouvertes partir de 1973. Les enzymes de restriction sont capables de reconnatre spcifiquement une courte squence, de 4 10pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille rduite, ou de le couper tel ou tel site dsir. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments dont les extrmits sont franches. Cependant, la plupart ralisent une coupure dissymtrique : on parle dans ce cas d'extrmits cohsives (chaque fragment possde une chane qui dpasse l'autre de quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont t caractriss : ils reconnaissent une grande varit de sites de coupure.Les enzymes de restriction sont utiliss pour tablir une carte de restriction de toute molcule d'ADN que l'on souhaite caractriser. Cela consiste dterminer l'ordre des sites de restriction le long de cette molcule, qui vont produire, aprs "digestion enzymatique" de cette molcule, des fragments de tailles diffrentes dont la taille pourra tre dfinie par lectrophorse.

Les enzymes de restriction appartiennent la classe des endonuclases, cest--dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nuclotides lintrieur dun acide nuclique. Les endonuclases se diffrencient des exonuclases qui dgradent la molcule dADN partir de lune de ses extrmits (3 ou 5).

Squences dadn reconnues par les enzymes de restriction.

Les squences de nuclotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des squences dites palindromiques. Les squences palindromiques sont des squences o la succession des nuclotides lue dans le sens 53 (gauche-droite) pour le premier brin est identique la squence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 53). Ces squences palindromiques sont le plus souvent constitues de 4, 5 ou 6 paires de bases. Il faut remarquer que dans les ADN, on rencontre statistiquement des squences reconnues par des enzymes de restriction. Ainsi, la squence GATC reconnue par lenzyme Mbo I est prsente avec une frquence statistique de 1 / 256 paires de bases (1/ 44). En effet, la frquence de coupure dun ADN par une enzyme de restriction donne peut tre approche statistiquement en considrant le nombre de nuclotides de la squence spcifique reconnue par lenzyme. Ainsi, par exemple, dans la squence de six nuclotides: GGATCC reconnue par lenzyme Bam HI, on aura donc une frquence de coupure statistique de 1 / 46, soit 1 coupure tous les 4096 nuclotides.

Origine des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactries. Les bactries peuvent tre parasites par des virus ADN. Les bactries fabriquent des enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN trangers. Pour viter une auto-destruction de leur propre ADN, elles se protgent contre leurs propres enzymes de restriction par une modification des sites de restriction correspondants.

Nomenclature des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction prsentent une nomenclature bien prcise. Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4). La premire lettre de dnomination de lenzyme est crite en majuscule, elle correspond au genre de la bactrie do a t extraite lenzyme. La seconde lettre et la troisime lettre (en minuscules) correspondent lespce de la bactrie do lenzyme est extraite. On peut avoir une quatrime lettre crite en majuscule correspondant la souche bactrienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique lordre de caractrisation de ces enzymes.

Exemples:

Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC

Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG

Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G

Notion disoschizomres

Des enzymes de restriction diffrentes peuvent reconnatre des mmes sites spcifiques, on les appelle isoschizomres. Les isoschizomres fournissent souvent aprs clivage enzymatique des fragments dont les extrmits sont diffrentes.

Exemple:

Soit la squence suivante: GGTACC, cette squence est coupe par lenzyme Kpn I et lenzyme Acc65 I:

Kpn I:

5-G-G-T-A-C/C-33-C/ C-A-T-G-G-5

Acc65 I:

5-G/G-T-A-C-C-33-C-C-A-T-G/G-5

Ces enzymes sont des isoschizomres, elles reconnaissent en effet la mme squence nuclotidique GGTACC. On voit tout de suite que les extrmits des fragments obtenus diffrent.

Types de coupures realises par les enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure bouts francs et la coupure bouts collants.

La coupure bouts francs aboutit une coupure au milieu de la squence palindromique. La coupure bouts collants (ou extrmits adhsives) correspond une coupure qui se fait de part et dautre du centre de symtrie.

Les sites de restriction sont reprs dans lADN par lenzyme de restriction qui coupe lADN en principe autant que fois quil y a de sites de restriction. Ceci est valable pour une enzyme de restriction donne, pour une autre enzyme, la coupure se fera en une position diffrente sur lADN. On voit tout de suite les possibilits considrables de ce type doutils enzymatiques. LADN est dcoup en fragments variables et ceci aussi bien lADN circulaire des bactries ou des plasmides que lADN linaire.

Les classes denzymes de restriction.

La plupart des enzymes de restriction utilises au laboratoire prsentent un site de reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de reconnaissance, ce sont des enzymes de type II. Certaines bactries possdent dautres types denzymes de restriction.

Les enzymes de type I reconnaissent des squences sur lADN sans aucune symtrie. Ces enzymes coupent non pas au niveau de la squence de reconnaissance mais 1000 5000 paires de bases plus loin. Les enzymes de type III prsentent galement un site de reconnaissance mais coupent une vingtaine de nuclotides plus loin.

Mthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction.

LADN bactrien prsente des sites de restriction susceptibles dtre reprs par les enzymes de restriction que possdent la bactrie. Pour viter une auto-destruction, les enzymes de modification de lADN bactrien interviennent. Ces enzymes de modification sont des mthylases bactriennes (ou enzymes de mthylation). La mthylation de la cytosine (sur le carbone 5) ou de ladnine (sur lazote 6) appartenant des sites de restriction aboutit une inactivation de lenzyme de restriction correspondante. Cette mthylation peut se raliser sur une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les mthylases bactriennes sont trs spcifiques.

Utilisations des enzymes de restriction.

Les utilisations des enzymes de restriction sont trs nombreuses en biologie molculaire. Par exemple, elles permettent de fractionner lADN en multiples fragments susceptibles dtre spars par les techniques dlectrophorse. Les enzymes de restriction peuvent tre utilises pour prparer un fragment dADN dun gne donn (insert) tre insr dans un vecteur comme un plasmide. Les enzymes de restriction sont utilises couramment pour rechercher des mutations dans le gnome.

Les enzymes de restriction sont utilises pour rechercher dans lADN des cellules eucaryotes les mthylations de bases. Ces mthylations ont une signification compltement diffrente des mthylations de bases observes chez les procaryotes. Elles sont en relation directe avec des modifications de lexpression des gnes des eucaryotes. La mthylation provoque le verrouillage de lexpression de tel ou tel gne dans un tissu. Les mthylations dans le gnome des eucaryotes concerne les cytosines impliques dans les doublets dinuclotidiques CG. La recherche de ces doublets et de la prsence ou non dune mthylation sur les cytosines est ralise laide de deux enzymes de restriction, une enzyme insensible la mthylation des cytosines et une autre enzyme sensible la mthylation des cytosines.

Notion denzymes compatibles

Deux enzymes de restriction sont dites compatibles quand elles gnrent aprs digestion des fractions aux extrmits cohsives complmentaires. Ces fragments peuvent tre facilement ligaturs.

Exemple: Les enzymes Bam HI (G / GATCC) et Mbo I ( / GATC):

Aprs action de Bam HI:

Aprs action de Mbo I:

Ligatures possibles : 1+4 et 2+3.

Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction

Les enzymes coupant ladn.

La DNase

La DNase utilise au laboratoire est extraite du pancras de bovin. Il sagit dune endonuclase qui coupe lADN double brin (mais aussi lADN simple brin). Elle conduit des coupures ou nicks tout fait au hasard, sans reconnaissance dun site spcifique (ce qui la distingue des enzymes de restriction). On obtient des fragments de tailles varies (ou oligonuclotides) qui possdent en leur extrmit 5 un groupement phosphate. Cette enzyme est sensible des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+). Elle est utilise pour des marquages de sondes avec des radioisotopes.

La nuclase S1

Cette enzyme extraite dun champignon, nattaque que lADN simple brin. Elle nattaque pas en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN.

Les enzymes assurant la ligature.

Les ligases

Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement phosphate en 5 et un groupement OH en 3 et ceci en prsence dATP. Elles peuvent effectuer des ligatures sur des fragments dADN avec bouts francs ou des bouts collants (ou extrmits cohsives). Elles sont extraites de bactries. Il existe ADN et ARN ligases.

Les enzymes enlevant ou ajoutant des groupes phosphates.

Enzymes enlevant des groupes phosphates

Ces enzymes sont appeles phosphatases. Les phosphatases alcalines sont actives pH alcalin. Elles permettent denlever le groupement phosphate situ en 5 dune chane dADN. Elles sont extraites de bactries ou dorigine animale (intestins). Elles sont utilises pour prparer de lADN recombinant.

Enzymes ajoutant des groupements phosphates

Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en prsence dATP. Dans cette molcule dATP, le phosphate fix est celui situ en position gamma (position la plus externe) de la molcule dATP. Le groupement phosphate est fix lextrmit 5 dun ADN pralablement dphosphoryl. Ces kinases sont extraites de bactries.

Les enzymes recopiant les acides nucliques.

Proprites gnrales

Les enzymes recopiant aussi bien une chane dADN ou dARN ont les proprits gnrales suivantes:

- Elles synthtisent le nouveau brin dans le sens 53.

- Cette synthse seffectue de manire complmentaire et antiparallle.

- Elles ncessitent la prsence de nuclosides triphosphates (NTPs) ou de dsoxynuclosides triphosphates (dNTPs).

Les enzymes recopiant un adn en adn

Ces enzymes sont des ADN polymrases ADN dpendantes. Elles ne sont pas capables de synthtiser le brin nouveau dADN sans la prsence dune amorce dacide nuclique. Les ADN polymrases catalysent la raction gnrale suivante:

(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi

avec N = A, C, T ou G. (PPi = groupe pyrophosphate).

Toutes les ADN polymrases possdent les caractristiques suivantes:

- Elles ont besoin dune amorce avec une extrmit 3-OH libre.

- La chane nouvelle dADN est synthtise dans le sens 53.

- La chane nouvelle est complmentaire de la chane matrice dADN et antiparallle.

Exemple1 Ladn polymrase I (extraite de E. Coli) et le fragment de klenow

Comme exemple-type dADN polymrase, nous citerons lADN polymrase I qui est extraite dE..coli. Cette enzyme possde des proprits polymrasiques, mais aussi des proprits exonuclasiques. Il est important de prciser que les exonuclases peuvent couper les nuclotides un par un partir dune chane polynuclotidique avec une spcificit soit de lextrmit 5 (coupure 53), soit de lextrmit 3 (coupure 35). LADN polymrase I possde les deux activits exonuclasiques: 53 et 35. Cette enzyme est constitue par une seule chane polypeptidique.

Au laboratoire, on utilise souvent une enzyme prpare partir de lADN polymrase I qui est appele fragment de KLENOW. Cette enzyme ne possde plus dactivit exonuclasique 53, il reste les proprits polymrasiques et les proprits exonuclasiques 35. Lactivit 35 permet lenzyme au cours dune synthse dun fragment dADN de contrler si lappariement de la base qui vient dtre ajoute est conforme aux rgles de complmentarit. Cette remarquable activit exonuclasique 35 est encore appele la fonction ddition de lenzyme.

Pour plus dinformations sur la DNA polymrase et sa mise en vidence voire le chapitre synthse in vitro de ce cours.

Exemple2 La squenase

Cette enzyme est dorigine bactrienne mais elle ne possde plus dactivit 35. Elle est utilise dans le squenage de lADN.

Exemple3 La Taq polymrase

La Taq polymrase est une ADN polymrase extraite de bactries prsentes dans les sources chaudes. Elle permet de travailler des tempratures plus leves que les tempratures usuelles (ambiante ou 37C). Elle est trs utilise dans les ractions damplification gnique et galement dans les ractions de squenage de lADN. En principe, elle est dpourvue de lactivit exonuclasique 35.

Les enzymes recopiant un arn en un adn

Exemple1 la rtrotranscriptase ou transcriptase inverse

Cette enzyme est surtout prsente dans les rtrovirus (virus ARN). Elle permet de fabriquer partir dun ARN messager (mARN) un ADNc (ou squence dADN complmentaire dun mARN).

Elle possde les proprits suivantes:

- Cest une ADN polymrase qui synthtise le nouveau fragment dans le sens 53.

- Elle est ARN-dpendante.

- Elle est dpourvue dactivit exonuclasique 35, donc de fonction ddition. Elle peut donc insrer des bases par erreur.

- Elle a une activit RNAse.

La technique classique pour prparer un ADNc partir dun mARN consiste tout dabord fournir une amorce la rtrotranscriptase. Cette amorce peut tre une squence courte par exemple une squence oligo(dT) capable de shybrider avec lextrmit poly(A) du mARN. A partir de cette amorce, la rtrotranscriptase poursuit la copie en ADN du mARN (longation). De plus la fin de la copie, elle est capable de recopier son propre travail, donc elle ralise une boucle lextrmit 3 de lADN copi. Un traitement chimique doux permet de dtruire le mARN simple brin mais pas sa copie dADN simple brin. On ajoute ensuite de lADN polymrase pour raliser une copie de lADN simple en ADN double brin. La nuclase S1 peut ensuite liminer lextrmit de lpingle cheveu. On a ainsi form un ADNc double brin. Dautres techniques existent pour prparer du ADNc partir du mARN.

Les enzymes recopiant un adn en un arn

Les ARN polymrases ralisent des transcriptions de lun des deux brins dADN en un brin dARN. Elles sont extraites des bactries. Ces ARN polymrases possdent les proprits suivantes:

- Elles synthtisent le brin nouveau dans le sens 53.

- Elles nont pas besoin damorce pour commencer la synthse ( la diffrence des ADN polymrases).

- Elles ncessitent des ribonuclosides triphosphates (ou NTPs) et galement (comme les autres polymrases) des ions Mg2+.

- Elles sont dnues dactivit ddition.

- Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN polymrases ne peuvent dmarrer la transcription que si lADN transcrire possde le promoteur spcifique correspondant.

I.1.3. Dosage et conservation

Estimation des quantits dadn.

Cette estimation est indispensable aprs extraction dADN partir dun matriel biologique.

Mthode base sur la fluorescence

Le principe est un fluorochrome qui se fixe sur le DNA et dont le taux de fixation est directement li a la quantit de DNA mettra une quantit de fluorescence qui sera proportionnelle a la quantit de DNA prsente.

Les diffrents fluorochromes:-Se fixant spcifiquement sur des paires de bases:

Bases A-T: Hoechst 332 et DAPI

Bases G-C: mithramycine

- Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui ont l'avantage d'tre moins chers )

Mthode base sur la spectrophotomtrie

Le dosage seffectue par spectrophotomtrie dans lultra-violet 260 nm. Il est indispensable de mesurer galement labsorption 280 nm. Cette dernire longueur donde permet destimer la contamination ventuelle de lextrait par des protines. Labsorption se dfinit par lunit de densit optique mesure 260 nm. Une unit de densit optique correspond labsorption dune solution dADN double brin la concentration de 50 g/ml ou labsorption dune solution dADN simple brin (ou dARN) la concentration de 25 g/ml.

Conservation de ladn

Le stockage des acides nucliques se fait au froid:

Pour un stockage court terme, l'ADN est gard +4CPour un stockage long terme, l'ADN est plac -20C

I.1.4. Synthse in vitro

Premire manipulation gntique

Les sries d'expriences ralises par Kornberg et son groupe prfigurent la gntique molculaire moderne et mritent que l'on s'y arrte.

Le mode semi-conservatif de la synthse de l'ADN implique les lments suivants :

- une molcule d'ADN double brin capable de servir de modle,

- des dsoxyribonuclotides prcurseurs de la chane nouvelle,

- une enzyme : ADN-polymrase, capable de les relier, cette enzyme (hypothtique pour l'instant) est fondamentale car non seulement elle devra assurer la liaison covalente (3'-5' phosphodiester) entre les nuclotides mais elle devra aussi tre capable de "choisir" ceux-ci en fonction du modle prsent selon la rgle d'appariement des bases.

Polymerisation de desoxyribonucleotides in vitro

Pour purifier et tudier cette enzyme, Kornberg a mis au point un systme de synthse in vitro partir d'extraits d'abord assez grossiers d'E. coli.

Comment valuer de tels systmes ? Comment prouver qu'une synthse a bien lieu in vitro ? Comment distinguer l'ADN nosynthtis de celui qui est obligatoirement prsent dans l'extrait comme modle ?Kornberg va lui aussi faire appel des marqueurs isotopiques : des nuclotides comportant des phosphores 32 radioactifs (32P), si une synthse a lieu, elle fera appel ces prcurseurs radioactifs et le polymre rsultant sera "marqu", sera radioactif et facilement reprable. D'aprs l'analyse des nuclotides libres prsents dans le cytoplasme, Kornberg dcide de choisir des nuclotides triphosphoryls en 5' alors que les constituants de l'ADN sont monophosphoryls et que bien souvent, l'hydrolyse de polynuclotides produit des mononuclotides phosphoryls en 3' ! On verra que sans cette dcision, l'exprience tait voue l'chec : la cellule utilise effectivement des nuclotides 5' triphosphoryls et l'nergie fournie par la libration du pyrophosphate.

*Remarque concernant l'utilisation de prcurseurs radioactifs

Dans son mlange ractionnel, Kornberg dispose d'ADN modle, de prcurseurs naturels, de l'ADN polymrase active (il l'espre), auquel il ajoute des prcurseurs radioactifs. Aprs la raction, la radioactivit se trouvera partage entre l'ADN ventuellement synthtis in vitro (en incorporant des monomres marqus) et l'excdent de prcurseurs qui n'ont pas t incorpors. Il est donc essentiel d'liminer tous ces prcurseurs libres pour attribuer de la radioactivit une macromolcule. En pratique, les macromolcules sont prcipites par adjonction d'un acide organique et les petites molcules "acido-solubles" (y compris les prcurseurs radioactifs) sont limines par centrifugation. Le culot, aprs plusieurs lavages, contient les macromolcules (y compris l'ADN) dbarrasses de tout prcurseur non incorpor dans la chane.

En suivant la stratgie expose et ses contraintes, Kornberg fut capable de trouver quelque radioactivit dans des fractions acido-prcipitables. Radioactivit qui, l'poque ne dpassait gure le seuil de confiance des compteurs, mais Kornberg y croyait !

Plusieurs quipes, partant de kilogrammes de pte d'E.coli, l'aide de mthodes d'analyse biochimique classiques de nos jours mais que l'on dcouvrait l'poque, ont peu peu concentr l'activit de l'ADN polymrase jusqu' purifier cette enzyme qui fut nomme "polymrase de Kornberg".

Le bilan (provisoire) de ces expriences est le suivant :

Replication in vitro

L'exprience dcrite ci dessus prouve qu'une synthse de polydsoxyribonuclotide est ralisable in vitro mais ne prouve pas que l'ADN synthtis est conforme au modle ni que la synthse soit une rplication semi-conservative.La suite du travail va consister tenter la synthse in vitro d'un ADN "biologiquement actif", l'activit biologique la plus facile dtecter tant, l'poque, la capacit d'infection d'un ADN de bactriophage.

Le modle choisi est le phage X 174 soit une molcule circulaire d'environ 5000 nuclotides seulement. Nuclotides et non pas paires de nuclotides car il s'agit, pour la particule phagique d'un ADN simple brin que nous appellerons le brin +. Le changement d'un seul de ces nuclotides rend la molcule inactive (non infectieuse). La ralisation d'une copie infectieuse in vitro va prfigurer la technologie de l'ADN recombinant.

- In vivo, la premire tape de l'infection par ce bactriophage simple brin est la synthse d'un brin complmentaire pour raliser une forme circulaire double brin partir de laquelle seront reproduits des brins + qui assureront la descendance phagique.

- Un premier problme se posa pour la synthse in vitro d'un brin - : l'ADN polymrase purifie ne peut qu'attacher l'extrmit 5' d'un nuclotide l'extrmit 3' d'une chane en cours de synthse, elle ne peut relier des polynuclotides et donc ne peut pas raliser la liaison phosphodiester qui permet de circulariser un brin d'ADN. Le problme a t rsolu par la purification d'une enzyme qui, in vivo, remplit cette fonction : l'ADN ligase dont nous aurons souvent l'occasion de parler.

Le systme va donc comprendre :

des molcules d'ADN purifies de X 174 (brin +)

les 4 dsoxyribonuclotides

l'ADN polymrase

la ligase

en principe, il doit assurer la synthse de brins - complmentaires du brin plus et circulaires (Figure II.6 1 - 3).

- Deuxime problme : comment sparer les brins - des brins + ?

Ce deuxime problme a t surmont par l'utilisation d'un prcurseur particulier la synthse d'ADN : la 5-bromodsoxy uridine, cet analogue de nuclotide est utilis par la cellule comme de la thymidine (sera appari l'adnine) mais le brome va "alourdir" la molcule d'ADN qui utilise ce prcurseur. La diffrence de densitest suffisante pour permettre la sparation de brins + (comportant de la thymidine) de brins - (comportant de la bromodsoxyuridine) par ultracentrifugation sur un gradient de densit de CsCl (Figure II.6 4 et 5).

- Troisime problme : le brin - synthtis in vitro n'est pas infectieux, seul un brin + peut l'tre. Il va donc falloir recommencer une synthse in vitro en utilisant les brins - comme modles.

Cette stratgie a permis de synthtiser des molcules qui vont s'avrer infectieuses : aucune erreur sur 5000 nuclotides assembls in vitro !

I.2. Sparation des acides nucliques

I.2.1. Electrophorse

Technique qui permet de sparer des molcules en fonction de leur taille et de leur charge en utilisant un courant lectrique. On peut ainsi analyser et purifier dans un milieu glifi (gel d'agarose, gel de polyacrylamide...) l'ADN, l'ARN, les protines.

Migration lectrophortique des fragments dadn.

Les fragments dADN aprs digestion par les enzymes de restriction peuvent tre spars par lectrophorse sur un gel dagarose. Dans ce type de gel, les migrations des fragments dADN dpendent de la taille du fragment plus que de la charge de celui-ci. Plus le fragment a une taille leve, moins la migration lectrophortique par rapport au puits dinclusion sera importante. A loppos les fragments de petite taille auront une distance de migration la plus leve. La dtermination prcise des tailles des fragments spars par lectrophorse est effectue en faisant migrer des marqueurs de poids molculaire en parallle avec les chantillons analyser. La dtection de lADN sur ce type de gel est ralise par exposition aux rayons UV aprs raction avec un ractif spcifique (bromure dthidium par exemple, agent sintercalant entre les brins dADN).

Llectrophorse des fragments dADN en gel dagarose permet des sparations jusqu 20-25 kb (20000-25000 pb). Le tampon utilis pour la migration lectrophortique a un pH basique (par exemple: 8,3 dans le cas du tampon appel TBE = Tris-Borate-EDTA).

Des fragments dADN de taille restreinte (infrieure 1000 paires de bases) peuvent tre spars par lectrophorse sur gel de polyacrylamide.

Dautres techniques lectrophortiques existent comme llectrophorse en champ puls qui permet de sparer des grands fragments dADN (taille suprieure 50 kb). Le support dlectrophorse est constitu par de lagarose et on applique au gel un champ lectrique de nature variable. Ainsi, le champ lectrique peut tre appliqu dans une direction donne pendant 1 minute puis dans une direction perpendiculaire au champ prcdent pendant une minute et ainsi de suite. Le processus de rorientation des macromolcules dans le champ lectrique dpend de leur taille.

Illustration dune lectrophorse en gel dagarose aprs migration et coloration par le bromure dethidium.

Lgendes des figures:

FIGURE DE GAUCHE

- PISTE 1: Marqueurs de taille (en paires de bases).

- PISTE 2: Echantillon dADN dont la taille est dterminer.

FIGURE DE DROITE

-Courbe dtalonnage en abscisses, les distances par rapport au puits dinclusion:et en ordonnes les poids molculaires (chelle logarithmique).

I.2.2. Ultracentrifugation

La centrifugation est une technique de sparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes).

Une suspension de macromolcules peut ventuellement laisser sdimenter celles-ci sous l'effet du champ de pesanteur. Cependant, l'agitation thermique met en uvre des nergies bien suprieures l'nergie potentielle de gravitation, pour une macromolcule se dplaant sur quelques centimtres.

Pour rendre possible la sparation, il faut travailler avec de trs grandes acclrations. Ceci est possible avec des centrifugeuses ou ultracentrifugeuses. Ces appareils, sont composs des lments suivants:

- un moteur capable de tourner plusieurs dizaine de milliers de tours par minute

- un rotor, capable de supporter des rotations aussi rapides (en titane gnralement pour les rotors des ultracentrifugeuses)

- une enceinte dans laquelle est dispos le rotor, qui est rfrigre et sous vide. En effet, pour les vitesses de rotation les plus rapides, le dplacement des extrmits du rotor (diamtre de l'ordre de 20-40 cm) est supersonique. Ceci entranerait un chauffement insupportable dans l'air.

- cette enceinte est de plus blinde pour viter des accidents en cas d'explosion du rotor.

Cette technique de centrifugation a t mise au point par Svedberg (1923), qui l'utilisa pour dterminer des masse molculaires. Elle fut applique la biologie par le physiologiste belge Albert Claude (Prix Nobel 1974), qui isola grce elle les microsomes, c'est--dire ce qui reste de la cellule lorsque l'on spare les mitochondries et les rticulums. A des vitesses de l'ordre de 20 000 tours/minute, il est possible de:- sparer les constituants cellulaires (membranes/cytosol) sous un champ suprieur 100 000 g entre des couches de saccharose de diffrentes densits.

- sparer diffrents types A.D.N. (chromosomique et plasmidique) dans un gradient de chlorure de csium. La vitesse de dplacement des molcules est exprime en Svedberg. S=10-13 secondes.

Note : L'ADN satellite peut tre spar du reste de l'ADN gnomique par centrifugation en gradient de densit.

I.3. Dtection, caractrisation et identification des acides nuclique

I.3.1. Marquage et suivi des acides nucliques

Le marquage est principalement employ dans toutes les techniques qui utilisent une sonde (hybridation, northern, ..). On distingue le marquage dit chaud utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages froids qui utilisent des molcules aux proprits fluorescentes, luminescentes. Ces dernires sont de plus en plus employes car plus pratiques.

Marquage radioactif

On distingue plusieurs mthodes selon la localisation du marquage (extrmits ou interne la molcule) et selon la nature de la squence marque (simple ou double brin).

Le Phosphore 32 est le radioisotope le plus utilis. Incorpor dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou plusieurs nuclotides triP radiomarqus Il existe des sondes mono ou double brins Soufre 35, H 3 utiliss plutt pour le squenage et hybridation in situ. On peut aussi raliser un marquage en 5' : avec la T4 polynuclotide kinase. La radioactivit est aussi utile pour le marquage des oligonuclotides de synthse.

Les sondes double brins

Marquage par amorage au hasard (Random Printing) : Trs employ dans les laboratoires pour par exemple les Southern et Northern Blot, il permet d'obtenir des activits spcifiques plus leves, ncessaires pour dtecter un gne sur quelques mG d'ADN gnomique.

Dans cette technique de marquage, les deux brins dADN de la sonde sont pralablement spars par chauffage suivi dun refroidissement brutal. Puis, on ajoute un mlange doligonuclotides (hexanuclotides) de synthse correspondant toutes les combinaisons mathmatiquement possibles (soit 46 = 4096 nuclotides). Ces oligonuclotides vont shybrider avec le sonde pour une partie dentre eux. Ces oligonuclotides fixs vont servir damorces au fragment de Klenow de lADN polymrase I qui va reconstituer lintgrit des deux fragments en prsence de dsoxynuclosides triphosphates marqus au 32P. Des ADN polymrases par exemple drive du phage T7 sont actuellement les plus utilises.

Marquage en 3' : *avec une ADN pol. : fragment de Klenow, T4 ADN pol., Taq pol., transcriptase reverse.

*avec une exonuclase *avec une terminal transfrase

LADN peut tre marqu son extrmit 5 laide dune kinase, par exemple, la T4 polynuclotide kinase extraite dE. coli infect par le bactriophage T4. En prsence dATP avec du 32P en position g ou [32P]g-ATP, il est possible dchanger le groupement 5-phosphate prsent sur le fragment dADN avec le phosphate radio-actif en position g sur lATP. Cette mthode est gnrale. Elle est plus efficace si les extrmits 5- sont pralablement dphosphoryles, par exemple par laction dune phosphatase alcaline.

Marquage par translation de coupure (Nick Translation) : utilise 2 enzymes :

*DNAseI dans des conditions mnages pour gnrer quelques coupures simple brin dans le fragment d'intrt

*DNA pol.I pour dgrader l'ADN dans sens 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymriser en prsence d'un nuclotide chaud.

Nous avons vu dans les outils enzymatiques utiliss en biologie molculaire que lADN double brin trait par la Dnase I tait cliv au hasard. La rparation des coupures ralises par la Dnase I ncessite laction de lADN polymrase I en prsence de dsoxynuclosides triphosphates marqus au phosphore radioactif (32P). Les dsoxynuclosides triphosphates utiliss sont marqus en position alpha au 32P. Cette technique est appele "technique de nick translation ". Cette technique est actuellement en retrait par rapport la technique suivante.

Les sondes simple brin

- d'ADN : *sondes activit spcifique importante (Southern, Northern Blot)

*protection contre la nuclase S1, hybridation in situ. Avantage : ne se renature pas sur elle-mme lors de l'hybridation.

- d'ARN : ribosondes. *rendements d'hybridation meilleurs par rapport aux hybrides ADN-ADN, plus stables *pour hybridation in situ

*cartographie des ARN

Attention: Les sondes radioactives prsentent de nombreux inconvnients:

ncessitde se protger du rayonnement mis, un maniement des sondes inconfortables.

Dcroissance rapide du P32, dou un besoin de marquer les sondes frquemment.

Pour pallier ces inconvnients, on peut utiliser les sondesfroides.

Marquages froids: fluorescence; colorimtrie;chimioluminescence;

Fluorescence:

Absorption d'nergie lumineuse par une molcule (fluorochrome)

Passage l'tat de Molcule excite

Relaxation partielle avec perte de chaleur par change avec le milieu ambiant

Retour l'tat fondamental par mission lumineuse ( de plus grande longueur d'onde que l'onde de stimulation) = spectre de fluorescence

Colorimtrie:

Colorants: biotine, digoxygnine, fluoresceine

Exemple: lADN cible est fix sur une membrane et les sondes sont biotinyles. La dtection est ralise par ajout dun complexe streptavidine-HRP (HorseRadish peroxidase ou Peroxydase de Raifort), lenzyme permettant loxydation dun chromogne. La mesure du signal est ralise par colorimtrie

Chimioluminescence

La chimioluminescence se produit au cours d'une raction chimique lorsque l'excs d'nergie est libre sous forme de lumire.De nombreuses ractions produisent ce phnomne et chacune met une lumire de longueur d'onde spcifique, et d'intensit proportionnelle la quantit de molcules ractives prsentes.

Attention : ces sondes froides prsentent un problme de sensibilit et leur utilisation ne fait pas toujours l'unanimit.

I.3.2. Hybridation molculaire

Lhybridation molculaire dsigne lassociation qui peut avoir lieu entre deux acides nucliques simples brins de squences complmentaires et qui conduit la formation dun double brin ou duplex. Cette association seffectue par ltablissement de liaisons hydrognes spcifiques : deux liaisons entre ladnine (A) et la thymine (T) (ou luracile U) et trois entre la cytosine (C) et la guanine (G). La formation et la stabilit des duplex dpendent de nombreux facteurs en plus de la composition en bases : longueur des duplex, complexit de la squence.

Lhybridation est la base de nombreuses techniques de biologie molculaire impliquant la mise en prsence d au moins deux brins simples dacides nucliques dans des conditions physico chimiques prcises. Le brin, dont on connat au moins une partie de la squence, est une sonde, lautre brin, celui que lon souhaite caractriser constitue la cible. Lun des deux brins est marqu par couplage chimique avec une molcule pouvant gnrer un signal.

Les sondes nuclotidiques

Dfinition

Une sonde nuclotidique est un segment de nuclotides qui permet de rechercher de manire spcifique un fragment dacide nuclique que lon dsire tudier. Cette raction sonde-fragment correspond une raction dhybridation molculaire.

Caractristiques gnrales

Une sonde nuclotidique peut tre soit une squence dADN ou dARN, mais obligatoirement monobrin. Sa taille est trs variable: oligonuclotide de 20-30 nuclotides ou loppos de plusieurs centaines de nuclotides. La sonde est complmentaire et antiparallle du fragment recherch. Dans un mlange complexe o seffectue lhybridation molculaire, la sonde doit tre facilement reprable grce un marquage avec un radioisotope (marquage chaud), mais il existe galement des sondes appeles sondes froides sans marquage par un radioisotope.

Obtention dune sonde

Il existe plusieurs possibilits pour obtenir une sonde nuclotidique:

- Une sonde oligonuclotidique peut tre fabrique par synthse chimique, si la squence de lADN reprer est connue. Si elle est inconnue, on peut tudier la protine correspondante et remonter grce au code gntique la squence dADN. Dans ce dernier cas, le travail est particulirement laborieux (nombre de codons lev pour un mme acide amin).

- Une sonde peut tre un ADNc. Une partie seulement du ADNc est utilise (aprs action denzymes de restriction et clonage des fragments obtenus).

- Une sonde peut tre thoriquement du mARN.

Lhybridation molculaire avec la sonde

Lhybridation molculaire sonde-fragment dADN reprer ncessite des conditions physico-chimiques parfaites (tampon, pH, temprature, etc..). Ces conditions sont appeles la stringence. Plusieurs facteurs peuvent galement intervenir comme la longueur de la sonde et la complmentarit sonde-fragment avec possibilit de mauvais appariements.

I.3.3. Southern Blot

Cette mthode a t initialement dcrite par E.M. SOUTHERN en 1975. Elle consiste dtecter spcifiquement des fragments dADN transfrs sur filtre par leur hybridation des squences complmentaires marques par un radioisotope. Les tapes successives de cette technique sont les suivantes:

-Extraction de lADN gnomique.

Cette extraction seffectue partir des leucocytes circulants par exemple obtenus partir de sang total.

-Digestion par des enzymes de restriction diffrentes du mme ADN gnomique.

LADN gnomique est digr par des enzymes de restriction diffrentes: dans le tube 1, on ralisera une digestion par lenzyme 1; dans le tube 2, une digestion par lenzyme 2; etc....). On peut bien entendu raliser des digestions par deux enzymes dans un mme tube. Dans ces conditions, on obtient un trs grand nombre de fragments, mais seuls quelques fragments correspondent une partie ou la totalit du gne tudi.

-Sparation lectrophortique des fragments dADN par lectrophorse dans un gel dagarose.

Aprs sparation lectrophortique en gel dagarose des fragments dADN bicatnaires obtenus par digestion enzymatique, on ralise une dnaturation des fragments par un traitement alcalin du gel dlectrophorse. Ce traitement transforme les fragments dADN double brin (ou bicatnaires) en fragments dADN monobrin (ou monocatnaires).

-Transfert des fragments monocatnaires du gel dagarose un support souple (feuille de nylon par exemple).

Le transfert des fragments monocatnataires du gel dagarose un support type nylon seffectue par simple capillarit.

-Fixation des fragments monocatnaires dADN sur le support souple et hybridation dans des conditions optimales de stringence avec une sonde complmentaire marque un radioisotope.

Les fragments monocatnaires dADN transfrs sur un support solide souple (nylon) sont mis en prsence dune sonde qui va shybrider dans des conditions physico-chimiques bien dfinies. on parle de conditions optimales de stringence. La sonde sapparie avec les fragments dADN monocatnaire selon les rgles de complmentarit. De plus, elle est marque avec un radioisotope (soit son extrmit 5, soit lintrieur de la chane polynuclotidique).

-Lavages et rvlation (dans ce cas par autoradiographie).

Aprs de nombreux lavages, le support solide est mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs jours. Le film est ensuite rvl. Les bandes dADN monocatnaires hybrides avec la sonde radioactive sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc. La position de ces bandes par rapport des tmoins de poids molculaire permet de dterminer la taille de ces fragments.

Pour vous aider mieux visualiser les diffrentes tapes de la technique du southern blot , nous vous proposons une animation. Pour dmarrez, il vous suffit de cliquer sur http://vector.cshl.org/Shockwave/southan.html

Nous citerons parmi les applications de la technique de SOUTHERN:

Ex1:Carte de restriction de lADN.

Les enzymes de restriction coupent lADN au niveau de squences parfaitement dfinies. Il est donc possible dtablir une vritable carte dun gne donn par la technique de Southern Cette carte porte le nom de carte de restriction.

En pratique, lADN tudier est rparti en diffrentes fractions. Chaque fraction est traite par une enzyme de restriction ou un couple denzymes de restriction. Ainsi dans lillustration ci-dessous. Dans le puits 1, on dpose lADN digr par Eco RI seule; dans le puits 2, on dpose lADN digr par Hind III seule et dans le puits 3, lADN digr par Eco RI et Hind III. La dtection des diffrents fragments est ralise laide dune sonde marque du gne tudi (voir illustration).

Illustration des fragments aprs migration

Illustration des positions sur lADN

Lgende:

(1): Position des coupures par Eco RI.

(2): Position des coupures par Hind III.

(3): Position des coupures par Hind III + Eco RI.

Ex2: Si on dispose de sondes spcifiques du gne explorer. Mise en vidence des dltions dans un gne ou une zone juxta-gnique. Ltendue de la dltion peut tre estime par la dtermination de la taille des fragments dADN.

Ex3: Comparaison de lADN de diffrents individus avec mise en vidence des polymorphismes de restriction.

En prsence de mutation(s) ponctuelle(s) dans des sites de restriction, des variations dans la taille de certains fragments seront observes et ceci par exemple lintrieur dune mme population. Ces petites diffrences entre des individus dans une mme population sont appeles de polymorphisme de taille des fragments de restriction (ou RFLP pour restriction fragment length polymorphism ).

Ex4: Mise en vidence des recombinaisons entre des gnes.

I.3.4. Northern Blot

Le principe est le mme que pour le Southern Blot mais ici ce sont les ARN qui sont tudis. donc plus besoin de digrer par enzyme de restriction.

La visualisation d'un ARN par une sonde permet de :

apprcier sa distribution dans les tissus, tudier son abondance relative

dterminer sa taille

dtecter les intermdiaires de maturation et les diffrentes formes d'pissage de l'ARN.

I.3.5. Dot Blot

Cette technique permet de quantifier un ARN ou fragment d'ADN donn sans sparation pralable sur gel d'lectrophorse.

I.3.6. Hybridation in situ (HIS)

On appelle hybridation in situ (HIS) l'utilisation de sondes d'acides nucliques pour mettre en vidence et localiser, dans des cellules ou des tissus, des squences d'acides nucliques, complmentaires de la sonde par leurs bases. L'HIS est un outil incomparable pour tudier l'expression des gnes. Elle est trs proche, dans son principe, des Southern et des Northern blots et repose, comme eux, sur l'hybridation d'une sonde d'acide nuclique (ADN ou ARN) marque avec une squence complmentaire d'acides nucliques que l'on cherche identifier et localiser. Mais les Southern et Northern blot se font sur des broyats de tissus, alors que l'HIS s'effectue sur une coupe histologique de tissu, apportant ainsi des informations prcises sur la localisation des acides nucliques tudis. Les sondes utilises sont le plus souvent de l'ADN (double brin ou plus rarement monobrin) ou un ARN-messager (riboprobes) ou des oligonuclotides synthtiques (de 20 50 nuclotides). Le marquage des sondes peut tre ralis par des isotopes radio-actifs (sondes chaudes : tritium H3, phosphore P32 ou P33, soufre S35) ou par des produits non radio-actifs (sondes dites froides) soit fluorescents (FISH) soit non-fluorescents comme la biotine (sondes biotyniles), la digoxignine ou des enzymes (phosphatase alcaline par exemple). Le mode de rvlation varie en fonction de la nature du marquage, autoradiographies en cas de sondes radioactives, microscopie fluorescence en cas de FISH, avidine ou streptavidine pour la biotine, anticorps marqus par un enzyme et/ou par l'or collodal pour la digoxignine, anticorps ou chromognes pour les enzymes. Le comptage des grains d'argent sur les autoradiographies permet une tude quantitative (ou plutt semi-quantitative).

Primitivement dcrite pour la microscopie optique, l'HIS est actuellement tout fait ralisable en microscopie lectronique grce en particulier l'introduction de milieux d'inclusion hydrosolubles comme le Lowicryl. L'or collodal est considr comme le marqueur de choix pour les mthodes d'HIS en ME. Plusieurs tailles de grains (permettant des doubles marquages) peuvent tre utilises (0.8 20 nm) ; la taille des grains peut tre augmente par des mthodes l'argent

Hybridation sur colonies

Transfert de colonies de cellules d'une boite de Petri sur un filtre ou une membrane avant de procder une hybridation molculaire de leur matriel gntique avec une sonde marque.

Hybridation sur chromosomes (FISH)

La FISH (Fluorescence in Situ Hybridization) repose sur la capacit d'hybridation de deux brins d'ADN complmentaires. La rgion tudier (situe sur un chromosome pralablement lgrement dnatur par traitement chimique pour le dbarrasser des protines associes) est repr grce une sonde oligonuclotidique complmentaire. Certains de ces nuclotides de cette sonde sont coupls une molcule antignique reconnue par un anticorps fluorescent. En utilisant diverses sondes, greffes des antignes diffrents, on peut ainsi visualiser simultanment plusieurs squences sur un ou plusieurs chromosomes. Technique permettant de dterminer la position d'un fragment d'ADN dans le gnome : le reprage se fait par rapport au bras du chromosome (p:bras court et q:bras long) et par rapport aux bandes (mises en vidence par la coloration Giemsa) du chromosome.

I.4. Amplification et slection dacides nucliques particuliers

I.4.1. PCR

Cette technique dcrite en 1985 (K. MULLIS et collaborateurs) permet damplifier des squences dADN de manire spcifique et daugmenter de manire considrable la quantit dADN dont on dispose initialement. Elle ncessite de connatre la squence des rgions qui dlimitent lADN amplifier. Ces squences serviront synthtiser des amorces oligonuclotidiques complmentaires (de longueur de 20 30 nuclotides en gnral). Ces oligonuclotides serviront dlimiter la portion dADN amplifier. LADN polymrase les utilisera comme amorces.

Ralisation pratique.

La technique comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession de trois phases:

- Une phase de dnaturation par la chaleur pour sparer les deux brins dADN (92-95C)(30 secondes-1 minute).

- Une phase dhybridation avec les deux amorces spcifiques entre 55-60C. La premire amorce se fixe sur un brin dADN, lautre sur le brin complmentaire (30 secondes-1 minute).

- Une phase dextension par lADN polymrase partir des amorces 70-72C (1-2 minutes).

Cette technique a pris un essor considrable avec lintroduction dune ADN polymrase rsistante la chaleur. Cette ADN polymrase ou Taq polymrase est extraite dune bactrie thermophile (Thermus aquaticus). Elle permet une automatisation des diffrents cycles (dans des appareils appels thermocycleurs). Le nombre de cycles est gnralement compris entre 30 et 40. Cette mthode permet damplifier lADN compris entre les deux amorces dun facteur de 105 106. Les rsultats doivent tre optimiss en fonction dun certain nombre de paramtres: concentration en MgCl2, concentration en amorces, spcificit des amorces etc... Le choix des amorces est particulirement crucial pour obtenir des rsultats satisfaisants (spcificit, taille, paramtres physico-chimiques.....). Lintroduction de logiciels spcialiss et des bases de donnes nuclotidiques a permis de raliser des choix plus rationnels.

La Taq polymrase extraite de Thermus aquaticus prsente une activit exonuclasique 53, mais elle est dnue dactivit exonuclasique 35, cest--dire de la fonction ddition. Elle peut insrer des bases qui ne suivent pas la rgle classique dappariement et ceci au hasard. On estime quelle ralise une mauvaise incorporation toutes les 104 105 bases.

Cette technique a volu considrablement. De nouveaux types de PCR ont t introduits. Nous citerons brivement:

- La PCR dite Multiplex pour amplifier des gnes avec de nombreux exons (le gne CFTR impliqu dans la mucoviscidose possde 27 exons), il est possible dintroduire dans le milieu damplification des couples damorces spcifiques diffrentes.

- La PCR dite Nested PCR . Elle correspond une seconde PCR ralise en utilisant des nouvelles amorces situes lintrieur du domaine dfini par les amorces de la premire PCR.

- La PCR quantitative. Dans ce type de PCR, on cherche estimer le nombre de copies prsent dans la squence cible dADN ou dARN. La proportionnalit entre le nombre damplifications et le nombre de copies nest valable que pour un nombre de cycles PCR faible.

Pour vous aider mieux visualiser les diffrentes tapes de la technique, nous vous proposons une animation. Pour dmarrez, il vous suffit de cliquer sur http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

Si vous prfrez une figure statique

Si vous souhaitez une autre version du cours, vous pouvez consulter un autre document propos par GENET (Universit dAngers) : http://sciences.univ-angers.fr/~jalouzot/courshtm/chap4/chap4-1.htm

Utilisations des produits PCR.

Les utilisations des produits PCR sont trs varies, nous citerons quelques exemples (cette liste nest pas exhaustive):

-Mise en vidence de mutations ponctuelles par hybridation des produits PCR avec des sondes oligo-nuclotidiques (technique dite du dot-blot ).

Les produits PCR peuvent aprs transformation en monobrins tre hybrids avec des sondes oligonuclotidiques fixes sur un support solide. Ces sondes correspondent des squences normales et pathologiques (prsence de mutations ponctuelles par exemple) pour un gne donn.

-Analyse de restriction.

Le produit PCR est soumis une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une mutation ponctuelle modifie le site de restriction initialement prsent, la taille des fragments dADN obtenus aprs digestion sera modifie et dcelable aprs lectrophorse des fragments dADN (sur gel dagarose ou gel de polyacrylamide).

A titre dexemple, la mutation ponctuelle (GAGGTG) sur le sixime codon du premier exon du gne b de la globine humaine entrane lapparition dune hmoglobine anormale appele hmoglobine S (mutation ponctuelle dun acide amin: GluVal). Cette anomalie est rpandue dans le monde entier. Elle est responsable ltat homozygote dune pathologie grave: la drpanocytose homozygote. Cette mutation entrane une modification du site de restriction de lenzyme Dde I: C / TNAG (N = A, T, C ou G).

La mutation Hb S conduit une mutation ponctuelle au niveau du codon 6 avec disparition du site de restriction pour lenzyme Dde I:

Llectrophorse des produits PCR aprs digestion par lenzyme Dde I permet daffirmer ou dinfirmer la prsence dune mutation GAGGTG sur le codon 6 par la comparaison des tailles des fragments. On peut donc confirmer ltat htrozygote ou ltat homozygote pour cette mutation.

-Introduction du produit PCR dans un vecteur: clonage du produit PCR .

-Squenage direct du produit PCR (voir cours sur le squenage).

-Analyse lectrophortique des produits PCR: technique DGGE et technique SSCP.

Ces techniques danalyse lectrophortiques des produits PCR sont particulirement utiles pour mettre en vidence des mutations ponctuelles au niveau dun gne. Des produits PCR (ou amplimres) particuliers sont forms si des mutations sont prsentes sur lADN initial. Les produits PCR seront diffrents en fonction de la prsence dune squence normale, dune squence mute (homozygote, htrozygote ou composite)(voir schmas).

Technique DGGE (pour denaturating gel gradient electrophoresis ).

La temprature de fusion dun produit PCR (ADN double brin), cest--dire la temprature moyenne de sparation des deux brins est fonction de sa squence. Une mutation ponctuelle qui change donc la squence entrane une modification de la temprature de fusion. Cette modification est mise en vidence par lectrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence dun gradient dagent dnaturant.

Technique SSCP (pour single strand chain polymorphism .

La technique SSCP est base sur lanalyse lectrophortique des produits PCR sous forme de fragments simple brin. On amplifie par PCR une rgion que lon dsire tudier et on compare la mobilit de lADN dnatur portant une mutation par rapport celle dun fragment de rfrence comportant une squence normale. Une mutation ponctuelle au sein dune squence modifie suffisamment la structure secondaire de lADN monobrin pour quil en rsulte des changements de migration lectrophortique sur gel de polyacrylamide.

Les techniques DGGE et SSCP sont concurrences par des techniques de chromatographie liquide haute performance avec des tempratures dlution variables (DHPLC: denaturing high pressure liquid chromatography ).

I.4.2. RT-PCR

La RT-PCR se droule en deux phases. Une premire phase correspond la copie dARN messager en ADN complmentaire (ADNc) et une seconde phase correspond une raction PCR classique sur le ADNc synthtis.

Dans la premire phase, lARN messager tudier est rpr en utilisant une sonde oligonuclotidique spcifique (amorce 1 qui shybride lextrmit 3 du seul mARN auquel on sintresse), puis la transcriptase inverse (ou rtrotranscriptase) permet la synthse du brin complmentaire (sous une forme de ADNc simple brin), une seconde amorce oligonuclotidique spcifique (amorce 2) permettra la synthse du second brin par extension.

LADN complmentaire synthtis servira ensuite de matrice pour une raction PCR classique.

La technique RT-PCR a permis de montrer que la transcription de tous les gnes seffectuait dans tous les tissus et ceci mme pour les gnes qui prsentent une trs grande spcificit tissulaire. On parle dans ces conditions de transcription illgitime. Il est vident quavant les techniques damplification gnique, la sensibilit des mthodes classiques navait pas permis de mettre en vidence un tel phnomne.

I.4.3. Clonage

Un clone correspond un grand nombre de molcules ou de cellules identiques provenant dun seul anctre (cellule ou molcule). Lopration qui consiste obtenir ce grand nombre de cellules ou de molcules sappelle le clonage.

Le clonage nuclique consiste en l'insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur, ce vecteur tant propag dans une cellule hte. La culture de cette cellule et la purification ultrieure du vecteur permettent de produire des quantits quasiment illimites du fragment d'ADN clon que l'on dsire tudier.

ADN recombinant

Il sagit dun ADN hybride obtenu au laboratoire par la combinaison de deux ADN appartenant deux espces diffrentes.

Les banques de clones

La construction d'une banque de clones est une tape pralable ncessaire la cartographie physique. L'tude d'un gnome dbute toujours par le dcoupage de l'ADN (digestion par des enzymes de restriction) en fragments qui sont insrs dans des constructions molculaires appeles vecteurs de clonage. Ces derniers sont ensuite intgrs dans des cellules qui assureront le maintien et la rplication du fragment d'ADN. Un ensemble de cellules portant des fragments d'ADN de l'espce tudie constitue une banque de clones (un fragment par clone).

L'objectif de la banque est donc de conserver une collection de fragments dADN:

bien identifis,

facilement manipulables,

que l'on peut produire en grande quantit (en vue de leur tude).

On pourra notamment alors procder au squenage de chacun de ces fragments.

Les vecteurs de clonage: plasmides; cosmides; BAC; PAC; YAC

Gnralites

On appelle vecteur lADN dans lequel on insre le fragment dADN tudier. LADN insr est appel insert ou ADN tranger ou ADN exogne. Cette squence nuclotidique est capable de sauto-rpliquer.

Les vecteurs sont donc des petits ADN dans lesquels on insre un fragment dADN que lon veut tudier. Ces petits ADN sont gnralement des plasmides ou des bactriophages. Il est ncessaire dintroduire ces bactriophages ou plasmides dans les bactries pour raliser une multiplication de ceux-ci.

Les plasmides

Les plasmides sont des petits fragments dADN circulaire prsents dans la cellule bactrienne et indpendants du gnome bactrien.

Proprits gnrales des plasmides

Les plasmides prsentent les caractristiques suivantes:

- Leur ADN est bicatnaire, circulaire avec un nombre de nuclotides infrieur 10 kb (1 kilobase = kb = 1000 nuclotides).

- Le nombre de plasmides dans une cellule bactrienne peut tre considrable (plusieurs centaines).

- Les plasmides portent normalement des gnes qui leur confrent un avantage slectif, par exemple une rsistance un antibiotique.

- Leur rplication est indpendante de celle du gnome bactrien.

Prparation des plasmides

Les bactries contenant les plasmides sont mises en culture dans un grand volume (jusqu 2 litres de milieu de culture). Quand la concentration bactrienne atteint une valeur suffisante, on traite par un antibiotique (comme le chloramphnicol) qui empche la croissance bactrienne sans affecter la rplication des plasmides. On rcupre les bactries par centrifugation. Puis, on permabilise la paroi bactrienne par un traitement doux permettant dobtenir un passage en solution des plasmides qui sont plus lgers que lADN bactrien. La purification des plasmides peut tre ensuite ralise par chromatographie liquide haute performance ou ultra-centrifugation en gradient de densit.

Prparation des plasmides pour la recombinaison, constitution de lhybride et transformation bactrienne.

Linsertion dune squence dADN bicatnaire dans un plasmide ncessite un traitement pralable par une enzyme de restriction. On choisit une enzyme qui a un site unique dans la squence plasmidique. Aprs action de lenzyme de restriction, le plasmide circulaire est linaris. Pour maintenir la linarisation, il est indispensable de traiter le plasmide linaire par une phosphatase alcaline qui enlve les groupements phosphates en 5. Le plasmide linaris et trait par une phosphatase alcaline est ajout au fragment dADN insrer en prsence dune ligase. Lensemble de ces tapes produit un plasmide recombinant.

Les bactries peuvent tre places dans certaines conditions physico-chimiques pour permettre aux plasmides dtre incorpors lintrieur de celles-ci. Les bactries traites et prtes recevoir lADN tranger sont appeles bactries comptentes. Lincorporation des plasmides dans les bactries est appele transformation bactrienne.

Slection des bactries transformes par des plasmides

Le taux de transformation des bactries est gnralement trs faible. Il est fondamental de disposer de mthodes permettant dobtenir des bactries transformes par les plasmides et seulement celles-ci. Pour cela, lartifice consiste utiliser une rsistance un antibiotique (par exemple: lampicilline). La transformation dune bactrie sensible un antibiotique par des plasmides portant un gne de rsistance au mme antibiotique aboutit lapparition dune rsistance uniquement pour les bactries ayant incorpor les plasmides.

Cette technique permet de sparer les bactries comportant des plasmides et les bactries sans plasmides car ces dernires sont tues. Cependant, elle ne permet pas de distinguer les bactries avec plasmides intacts des bactries avec plasmides recombinants. On utilise pour cela une rsistance un second antibiotique, par exemple: une ttracycline. Linsertion du fragment dADN dans le plasmide doit inactiver le gne de rsistance au deuxime antibiotique. Les bactries transformes par les plasmides recombinants sont donc rsistantes au premier antibiotique (ampicilline) et sensibles au deuxime antibiotique (ttracycline). Les bactries non transformes sont sensibles aux deux antibiotiques.

Un exemple de plasmide: le puc19

Un plasmide classique est le pUC19. La squence complte est connue (2686 nuclotides). Il comporte les particularits suivantes:

- Un gne de rsistance lampicilline (antibiotique). La prsence de ce gne permettra la bactrie porteuse de ce plasmide de ne pas tre sensible leffet de cet antibiotique.

- Le gne lac Z qui code pour la b-galactosidase dans lopron lactose.

- Enfin, une rgion avec des sites multiples et uniques pour des enzymes de restriction connues. Cette rgion est appele " polylinker ". Son rle est de permettre linsertion du fragment dADN tranger.

Commentaires sur le plasmide pUC 19. Ce type de plasmide est intressant car il montre un systme de slection des bactries ayant t transformes par les plasmides recombinants. Un systme enzymatique appartenant lopron lactose peut tre utilis la place dun second antibiotique. Linsertion du fragment dADN dans le plasmide pUC 19 aboutit linactivation du gne qui code pour la b-galactosidase. Pour vrifier la prsence ou labsence de lactivit enzymatique b-galactosidase, on utilise un galactoside dont la couleur passe de lincolore au bleu quand il est cliv par la b-galactosidase, ce compos sappelle X-gal. Pour pouvoir mtaboliser le X-gal, la cellule doit tre expose un inducteur, cet inducteur est le IPTG (isopropylthio-b-D-galactoside).

En culture et en prsence dIPTG et de X-gal, les bactries rsistantes lampicilline et transformes par les plasmides recombinants se prsentent sous forme de colonies blanchtres car elles ont perdu la capacit de clivage de lquivalent color du lactose (le X-gal) par la b-galactosidase. Par contre, les bactries rsistantes lampicilline et non transformes par les plasmides recombinants se prsentent sous forme de colonies bleues. La slection visuelle des bactries transformes par les plasmides recombinants est donc possible.

Avantages et dsavantages des plasmides

Avantages:

- Petite taille du vecteur, permettant un travail exprimental ais.

- Slection des plasmides recombinants (slection par les antibiotiques).

Dsavantages:

- Faible efficacit pour la transformation des bactries (pntration de plasmides).

- Impossibilit dinsrer des larges fragments dADN.

Les phages

Proprits gnrales des phages

Les phages sont des virus qui infectent les bactries. Deux phages sont trs utiliss comme vecteurs: le phage lamba et le phage M13 (mais maintenant les phages drivs de ces deux phages). Les squences de ces phages utiliss comme vecteurs sont connues (40 50 kb dADN double brin). Les extrmits de cet ADN sont simples brins sur une longueur rduite, et complmentaires lune de lautre et surtout formant des extrmits cohsives. Ces squences sont appeles squences cos (pour cohsives).

Deux parties sont individualises dans le phage lamba:

- La tte du virus: elle renferme lADN viral.

- La queue du virus: elle renferme des protines. Elle permet la fixation du virus sur la cellule-hte bactrienne.

Le virus lamba se multiplie selon deux modes possibles: soit par multiplication lytique, soit par multiplication lysognique.

- La multiplication lytique.

Le virus sadsorbe spcifiquement la surface des bactries. Il injecte son ADN la cellule-hte. LADN viral se circularise dans la bactrie. Puis, une phase complexe de rplication dbute et aboutit la constitution de nombreuses particules virales lintrieur du cytoplasme bactrien. La lyse bactrienne provoque la libration des particules virales.

- La multiplication lysognique.

Comme dans la multiplication lytique, le virus sadsorbe et pntre dans la bactrie. LADN viral sintgre lADN bactrien et sera rpliqu en mme que lui.

Le gnome du phage lambda peut tre divis en:

- Parties essentielles comprenant:

- les gnes codant pour les protines situes dans la tte et les protines situes dans la queue du virus.

- Les sites cos.

- Le site de rplication de lADN viral.

- Parties non essentielles:

- Ce sont les gnes impliqus dans la lysognie.

Un exemple de vecteur de cette catgorie est le phage lambbda-GEM-11 propos par la socit de biotechnologie Promega. Ce phage accepte des fragments dADN de 9 kb 23 kb. Il possde des promoteurs pour la T7 ARN polymrase et la SP6 ARN polymrase. Ces promoteurs dARN polymrases permettent la synthse de sondes ARN partir dune extrmit du fragment clon. La T7 ARN polymrase est extraite des colibacilles (E. coli) infects par le phage T7. La SP6 ARN polymrase est extraite dune souche de Salmonella typhimurium.

Sur le bras gauche (20 kb), on retrouve successivement dans le sens 5 3, un site pour lenzyme Sfi I, puis le promoteur T7, suivi par des sites de restriction uniques (Sac I, Xho I, Bam HI, Avr II, Eco RI et Xba I). Sur le bras droit (9 kb), on retrouve dans le sens 5 3, des sites de restriction uniques pour Xba I, Eco RI, Avr II, Bam HI, Xho I et Sac I, suivis par le promoteur SP6 et enfin un site Sfi I. Il est important de noter lorientation des promoteurs des ARN polymrases T7 et SP6 pour la synthse des ARN messagers correspondants.

Notes complmentaires pour comprendre le fonctionnement des ARN polymrases:

Les ARN polymrases copient lADN double brin en ARN. Elles possdent les proprits suivantes:

- Elles nont pas besoin damorce pour commencer la synthse de lARN.

- Elles ont besoin bien entendu des quatre nuclosides triphosphates (NTPs; N = A, G, U et C) et de Mg2+.

- Elles nont pas de fonction ddition.

- Elles doivent imprativement reconnatre un promoteur spcifique.

- Comme toutes les polymrases, elles synthtisent le nouveau brin dans le sens 5 3.

Avantages et dsavantages des phages

Avantages:

La taille des fragments dADN insrables est suprieure celle des plasmides (40-50 kb).

La transformation des bactries (=incorporation des phages) est plus efficace que pour les plasmides.

Dsavantages:

Nombre de sites de restriction restreints dans le gnome des phages.

Obligation dempaqueter lADN.

Contraintes de taille pour lADN insrer.

Les cosmides

Proprits gnrales des cosmides

Les cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides: phage lambda-plasmides. En fait, ils se comportent comme des plasmides avec des sites de restriction permettant linsertion dADN tranger. Ils renferment galement un gne de rsistance aux antibiotiques (ampicilline). De plus, un site cos dun virus lambda a t inclus dans leur ADN circulaire ce qui permettra au cosmide dtre empaquet dans la tte dun virus lambda.

Avantages et dsavantages des cosmides

Avantages:

La taille des fragments insrables peut atteindre 50 kb.

Leur incorporation dans les bactries (transformation) est plus efficace que pour les plasmides.

Dsavantages:

Obligation dempaqueter lADN.

Autres types de vecteurs

Dautres vecteurs existen tavec possibilit de cloner des fragments dADN de taille leve (au moins jusqu 500 kb)

Les BAC

(Bacterial Artificial Chromosome)

Peuvent cloner des fragments d'ADN de taille variant de 100 200kb.

Les PAC

(P1-derived Artificial Chromosome)

Peuvent cloner des fragments d'ADN de taille variant de 100 200kb.

Les YAC

(Yeast Artificial Chromosome : Chromosome artificiel de levure).

Peuvent intgrer des fragments de grande taille (jusqu' 400kb). Indispensables pour analyser les grands gnomes (notamment, le gnome humain). A noter : pour obtenir de grands fragments d'ADN, on utilise des enzymes de restriction qui ne coupent que trs rarement.

Inconvnient : les fragments insrs subissent parfois des rarrangements (insertions, chimrismes, dltions) : les YAC ne peuvent tre considrs comme absolument reprsentatifs de la rgion initiale introduite.

I.4.3.1. Les vecteurs dexpression et les cellules htes

D'une faon synthtique, lexpression dun ADN recombinant s'appuie sur la succession d'oprations suivantes, chacune gnrant ses propres difficults :

tout d'abord, il s'agit d'isoler un gne d'intrt, codant pour une protine dont la synthse artificielle en quantit est ncessaire: (mdicament, additif, );

le gne d'intrt est alors insr dans un vecteur (en gnral un plasmide), qui doit tre capable de se rpliquer et de rpliquer le gne tranger qui lui est rattach ;

la molcule d'ADN recombinant obtenue (vecteur + gne d'intrt) est ensuite introduite dans une cellule hte, qui excute les instructions qui lui sont fournies par le gne d'intrt, et ralise les modifications post-traductionnelles dans l'objectif de fabriquer la protine recherche. L'hte peut tre une bactrie (E. coli), une levure, une cellule de mammifre ou encore une plante ou un animal transgniques ;

il s'agit alors de passer par une phase de production, gnralement en fermenteur (en ce qui concerne les micro-organismes et cellules de mammifres), afin de produire les volumes de protine ncessaires ;

la protine doit enfin tre rcupre puis purifie, cette tape faisant appel des techniques plus classiques (sparation, extraction, purification) mais pouvant se rvler longue et onreuse ;

il s'ensuit des essais biochimiques et immunologiques (contrle qualit) permettant de contrler la puret de la protine obtenue, son activit, etc.

Les protines recombinantes sont ainsi qualifies dans la mesure o elles sont produites par des cellules dont l'ADN a t modifi par recombinaison gntique.

Au sens large, un systme de production adapt la fabrication d'une protine recombinante donne, est un process biotechnologique qui s'appuie principalement sur :

l'emploi d'un vecteur d'expression (en gnral un plasmide ou un virus -pour les vecteurs eucaryotes-), jouant le rle de transporteur gntique du gne d'intrt codant pour la protine recherche ;

l'utilisation d'une cellule hte, charge d'excuter les instructions fournies par le gne d'intrt qui lui est insr, dans l'objectif de synthtiser la protine recherche ;

une phase de production proprement dite permettant de fabriquer les volumes de protines souhaits ;

enfin, une sparation et extraction de la protine du milieu de culture, suivie par une purification de celle-ci.

Au sens restreint, un systme de production de protines recombinantes est caractris par un couple constitu d'un vecteur d'expression et d'un hte (cellule ou organisme).

Une vaste gamme de systmes de production de protines recombinantes -c'est--dire, au sens restreint, de couples vecteurs-htes- est aujourd'hui disponible, chacun d'eux prsentant des avantages et des inconvnients. Les htes les plus utiliss l'heure actuelle sont incontestablement la bactrie Escherichia coli, la levure Saccharomyces cerevisiae et les cellules CHO extraites des ovaires de hamster.

I.4.4. Construction de banques

I.4.4.1. Gnomique

Le clivage de lADN gnomique par des enzymes de restriction gnrent de nombreux fragments. Linsertion de ces fragments dans des vecteurs permet de constituer une banque dADN gnomique. Cette banque contient plus dinformation que le ADNc. En effet, elle contient potentiellement toutes les squences gniques (introns et exons) et intergniques. Il faut rechercher dans les nombreux vecteurs aprs insertion des fragments, les vecteurs possdant le fragment dADN recherch. Cette opration sappelle le criblage.

Vous trouverez des informations complmentaires sur les banques gnomiques en consultant un autre cours propos par GENET universit dAngers) en cliquant sur le lien suivant: http://sciences.univ-angers.fr/~jalouzot/courshtm/chap4/chap4-2.htm

I.4.4.2. ADNc (ADN complmentaire=ADN copie)

ADN simple brin artificiellement synthtis partir des ARN : il est obtenu aprs une raction de transcription inverse d'un ARN mture et reprsente ainsi la copie de l'ARNm. L'ADNc offre l'immense avantage d'tre plus stable que la molcule d'ARNm et de pouvoir tre stock, copi et squenc.

Les ADN complmentaires proviennent des mARN et donc ne possdent pas dintrons. A partir dun mme type de cellules, on prpare les mARN totaux de ces cellules puis les ADNc correspondants. Ces derniers insrs dans des vecteurs constituent une banque de ADNc.

Note: Une squence EST est une tiquette (fragment d'une extrmit) d'un ADNc.

Vous trouverez des informations complmentaires sur les banques dADNc en consultant un autre cours propos par GENET (Universit dAngers) en cliquant sur le lien suivant: http://sciences.univ-angers.fr/~jalouzot/courshtm/chap4/chap4-2.htm

I.4.5. Criblage de banques

Plusieurs techniques prouves permettent de construire des banques. Il reste les exploiter, mme avec une banque d'ADNc, le nombre de clones est important et le tri reprsente la partie la plus dlicate des expriences de clonage, il existe de nombreuses stratgies mais aucune n'est universelle.

* Remarque : les termes de cribler et de slectionner n'ont pas la mme signification: lors de la slection, on limine tous les clones non intressants, le criblage permet de reprer le clone intressant.

Le tri peut se faire par slection lorsque le gne intressant confre un phnotype particulier l'hte tel qu'une rsistance un antibiotique particulier auquel les cellules sauvages sont sensibles : la culture sur un milieu contenant cet antibiotique ne fera apparatre que les clones transforms contenant ce gne prcis.

Le tri par criblage reste le plus courant.

La dtection immunologique du produit du gne reprsente un crible intressant si le gne recherch est exprim dans la cellule transgnique ce qui n'est pas toujours le cas.

Le criblage par hybridation de l'ADN des clones transforms avec une sonde spcifique constitue une mthode de choix. L'hybridation peut se faire in situ : on effectue des rpliques de clones bactriens cultivs en bote de Ptri sur des disques de nitrocellulose, aprs un temps de culture suffisant, les bactries de ces rpliques sont ensuite lyses par la soude qui, en mme temps, dnature l'ADN, les molcules simple brin correspondantes se trouvent immobilises l'emplacement de chaque clone. Aprs hybridation, avec la sonde radioactive, l'autoradiographie rvlera les clones positifs.

Le problme est dplac vers celui de l'obtention de la sonde spcifique, correspondant au gne recherch.

s'il s'agit d'un gne peu volu, on peut utiliser une sonde "htrologue" (en fait une squence homologue mais provenant d'un autre organisme) en comptant sur une homologie de squence suffisante pour s'hybrider dans des conditions qui ne donnent pas de faux positifs.

lorsqu'une ligne cellulaire synthtise, un moment donn du dveloppement, un messager majoritaire, on peut tenter sa purification et raliser un ADN complmentaire qui, une fois clon servira de sonde pour une banque gnomique.

si l'on connat trs bien le produit du gne, c'est dire la squence, mme partielle, en acides amins, on pourra construire des oligonuclotides selon les codes possibles et "partir la pche" avec ces sondes artificielles.

Dans les cas dsesprs, c'est dire lorsque l'on ne possde pas de sonde et que l'on n'a aucune ide du produit du gne, connu uniquement par la manifestation phnotypique d'un allle mut, il reste d'autres solutions, par exemple, la "marche sur chromosome" (chromosome walking) : Par des mthodes faisant appel des croisement traditionnels et l'analyse mendlienne, on va essayer d'associer des marqueurs RFLP au locus considr. L'idal tant d'encadrer le locus par des marqueurs distants de moins d'un centiMorgan. Le premier marqueur constitue une sonde pour identifier un clone (parmi une banque gnomique) qui servira de dpart. La cartographie de restriction nous permettra d'identifier un segment situ une extrmit qui sera, son tour utilis comme sonde pour cribler un clone chevauchant et ainsi de suite jusqu' un second marqueur connu. La squence recherche se trouve obligatoirement parmi les clones identifis. Si l'un d'entre eux peut complmenter un mutant (par transgnie restituant le phnotype sauvage par exemple), c'est qu'il s'agit de la squence recherche.

I.4.6. Utilisation des vecteurs recombins

Technique des hybrides somatiques monochromosomiques

Collection de lignes cellulaires contenant chacune un unique chromosome humain. Ce sont des hybrides somatiques obtenus par fusion de cellules humaines avec des cellules de rongeur (hamster ou souris), qui aprs fusion, liminent la plupart des chromosomes humains (sauf un).Cette technique permet de dterminer de quel chromosome humain provient une squence d'ADN ou un clone donn (par hybridation ou par PCR avec ces hybrides). Voir FISH.

Techniques des double et triple hybrides

Le systme double-hybride a t dvelopp en 1989. Il consiste introduire dans une cellule les gnes codant les deux protines tudies. Si ces protines interagissent, la cellule adoptera un phnotype aisment reprable, par exemple le produit d'un gne rapporteur.

La variante simple hybride permet de tester l'interaction entre un fragment d'ADN et une protine.

La variante triple hybride permet de dtecter les interactions trimriques (tester la modulation d'une interaction protique connue par une 3e protine ...).