Physiopathologie des IOA Biofilm Internalisation · 09/12/2014 3 Ahmed S et al, Infect Immun. 2001...

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Mécanismes physiopathologiques

de la persistance au cours des IOA

Frédéric Laurent

CRIOAc Rhône-Alpes Auvergne

Laboratoire de bactériologie, Hôpital de la Croix Rousse, Hospices Civils de Lyon

Centre National de Référence des Staphylocoques

CIRI-INSERM U1111 Equipe ”Pathogénèse des infections à staphylocoques”

IOA aiguë

récurrence et chronicité observée chez de nombreux patients

Physiopathologie des IOA

InternalisationBiofilm

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IOA aiguë




Internalisation

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Ahmed S et al, Infect Immun. 2001

Ost

eobl

ast c

ell l

ine

MG

63

S. aureus

Rcp fibronectine +

Internalisation

Rcp fibronectine -Ostéoblaste MG3

Invasion des ostéoblastes par S. aureus

N°6

S. aureus

FnBP

Fibronectine

Traction du

cytosquelette

Invagination

membranaire

Formation d’une

vacuole

d’internalisation

ou phagosome

Membrane

cellulaire

intégrine α5β1

Microscopie

électronique à balayage

Hoffmann et al., Eur J

Cell Biol 2011 6

Internalisation

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Persistance intracellulaire

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Bactéries (points noirs) internalisées dans les ostéocytes entourés par des lamelles

osseuses.

(Internalization of S. aureus by osteoblasts in a patient with long term recurrent

osteomyelitis JBJS 2005)

Internalisation

Marquage sélectif / microscopie à fluorescence

N°8

S. aureus extracellulaires S. aureus intracellulaires

10 µm

S. aureus marqués au Bodipy FL

Actine marquée à la rhodamine - phalloïdine

Internalisation

Ostéoblaste MG3

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Gentamicin-lysostaphin protection assay (GLPA)

GENTAMICIN

LYSOSTAPHIN

INFECTION INVASION SELECTIVE KILLING

OF EXTRACELLULAR

BACTERIA

OSMOTIC CELL LYSIS

& BACTERIAL

RELEASE

Lignée cellulaire MG-63

MOI: 100 bactéries / OB

LDH RELEASE

MEMBRANE

LEAKAGE IN

DAMAGED CELLS

0h 2h 3h 24h

Internalisation

N°10

La charge bactérienne est de ≈ 1 SARM-C / cellule vs ≈ 5 SARM-H / cellule

Internalisation initiale

SARM-Communautaires vs SARM-Hospitaliers

Internalisation

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II - INVASION DES OB PAR LES SARM N°11

Dommages causés aux cellules infectées :

SARM-C >> SARM-H

Cytotoxicité des SARM-Communautaires et SARM-Hospitaliers

24h après internalisation

Internalisation


Survie intracellulaire : SARM-H >> SARM-C

Survie intracellulaire des SARM-C et SARM-H après 24h

Internalisation

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≈ 1 SARM-C / cellule � 50% de mortalité chez les OB après 24h

≈ 5 SARM-H / cellule � 20% de mortalité chez les OB après 24h

Pourcentage de mortalité des ostéoblastes

(mêmes expériences que précédemment)

ST80 EMRSA2

Internalisation

S. epidermidis vs S. aureus

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N°15

Internalisation

• Internalisation = sanctuarisation des bactéries

- protection vis à vis du système immunitaire

- protection vis à vis des ATB

• Capacités d’invasion et de survie intracellulaire

variables d’une espèce à l’autre et d’une souche à

l’autre

. rôle de l’internalisation dans la persitance

= variable

. symptomatologie clinique et évolution clinique

différentes d’un patient à l’autre

IOA aiguë




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IOA aiguë




Biofilm

Wikipedia

• Un biofilm est une communauté multicellulaire plus ou moins

complexe, souvent symbiotique, de micro-organismes (bactéries,

champignons, algues ou protozoaires), adhérant entre eux et à une

surface, et marquée par la sécrétion d'une matrice adhésive et

protectrice.

• Il se forme généralement dans l'eau ou en milieu aqueux. Le biofilm

est une étape normale ou potentielle du cycle de vie de la plupart

des bactéries, qui affichent alors un comportement coopératif et

produisent des phénotypes différenciés conduisant à des fonctions

spécifiques, parfois en réaction à un stress.

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Biofilm

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• Bactérie d’origine

- hématogène

- inoculation

- contiguité

Biofilm

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Biofilm et impact sur la physiopathologie des IOA

Evans et al., Clin Orthop. 1998,

Prothèse Sequestre

(cassure d’une couche

épaisse de biofilm d’un

séquestre infecté)

Tissu

Johansen et al., J. Comp Patho., 2012

Tissu ostéomyélite

Biofilm

• Matériel ou os nécrosé

• Exopolysaccharides bactériens

• Organisation en colonies

• Répartition hétérogène des bactéries

• Canaux de circulation (nutrition,

élimination)

• Stratification de colonies bactériennes

• Métabolisme bactérien adapté

• Associations bactériennes fréquentes

Le biofilm : « substance visco-élastique »

Biofilm

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Expression d’adhésines de surfaceDe l’adhérence au biofilm …

Matrice extracellulaireExtracellular polymeric substance (EPS)

De l’adhérence au biofilm …

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Aap = Adhesion-associated-protein

AtlE = Autolysine E

Bap = Bone-associated-protein

LTA = Lipo-Teichoic Acid

Otto, M. Nat Rev Microbiol, 2009.

PGA = Poly-gamma-Glutamyl Acid

PNAG = Poly-N-acetyl-glucosamine ;

Sdr = Serin domain repeat

WTA = Wall Techoic Acid


S. epidermidis

JW Costerton (1999) Science, 284:1318-1322

Bactéries planctoniques :

. élimination par les mécanismes de défense

naturels (anticorps, phagocytes…)

. Facilement accessibles aux antibiotiques

× Antibiotique Anticorps Enzymes phagocytes

Bactéries planctoniques Bactérie Biofilm

Biofilm et infection sur matériel

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Bactéries séssiles = adhésion sur

une surface inerte et entre elles

un biofilm

. résistante aux anticorps

. aux phagocytes

. à certains antibiotiques





• phagocytes attirés par les biofilms

• phagocytose inopérante

mais enzymes phagocytaires libérées

localement





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Libération enzymes phagocytaires

= endommage les tissus autour du

biofilm

descellement

essaimage des bactéries

planctoniques à partir du biofilm :

. dissémination de l’infection

. infection dans un tissu voisin

ou à distance






chaque bactérie occupe un microenvironnement spécifiquechaque bactérie occupe un microenvironnement spécifique

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Hétérogénéité du biofilm

chaque bactérie = un microenvironnement spécifique

Gradient physico chimique

Gradient métabolique

Gradient oxygène

Toutes les bactéries ne "voient" pas la même chose :

. accès aux nutriments

. pH

. oxygène

. …

. position dans le biofilm

fonction de . proximité d’un canal

. proximité bactéries

MétabolitesMétabolites

Hétérogénéité du biofilm / micro environnement

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oxygèneoxygène


Mesure de la synthèse

protéiqueExpression GFP

Biofilm S. epidermidis (Rani et al.,, 2007)

Mesure de la synthèse

ADN

5 bromo2-deoxyuridine

(BrdU)

État métaboliqueÉtat métabolique


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microcolonies biofilm = le village gaulois

antibiotiques = les romains

Streptococcus mutans biofilm + ATB / Baclight

Antibiotiques

Biofilm et antibiotiques

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Nous testons :

CMI

Le patient a :

CMEB

Donlan et al., CMR 2002


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Olson et al., 2002

• architecture du biofilm = séquestre physique des ATB

• ESP = barrière physique à la pénétration

• ESP = adsorbant ou réactant des ATB = ↓ ATB disponible

Ex: S. aureus et PNAG et acides téchoïques

• métabolisme réduit = ↓ activité antibiotiques actifs sur division

• métabolisme anaérobie ++ = inactivité des aminiglycosides

• effet stress : ↑osmolarité = ↓ porines transmembranaires

• effet inoculum: densité biofilm >> densité planctonique

• induction de gènes de résistance spécifiques : pompes efflux ndvB

Biofilm et antibiotiques"Tolérance aux antibiotiques"

Génome = "hypothetical protéine " biofilm ???

Résistances spécifiques: génes de résistance

Résistances non spécifiques :

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Daptomycine et résistance spécifique : exceptionnelle

Daptomycine et vitesse de pénétration

Biofilm S. epidermidis sur dispositif en flux

Marquage Bodipy Daptomycine

Coeff diffusion = 28%

Stewart, AAC, 2009

Raad et al., AAC 2007

Modèle = disque de silicone colonisé in vitro / ATB = 2 mg/ml


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Biofilm

. environnement complexe chimique et microbiologique

. Sanctuarisation des bactéries:

- protection contre le système immunitaire

- protection contre les antibiotiques

Biofilm

Certains antibiotiques ont un meilleur profil

”biofilm”

. études nécessaires

D’autres molécules, d’autres approches sont à venir

. Protéger contre les phases initiales de formation

. Attaquer le biofilm pour facilité la pénétration des ATB

. ….

IOA aiguë




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IOA aiguë



InternalisationBiofilm Small Colony Variant

S. aureus SCV

S. aureus « sauvage »

Culture de sonicat

Strepto B

SCV

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« small colony variant » difficulté de détection

Normale

Small colony variant

Von Eiff C

Même souche (génétiquement)

En bas : S. aureus normale

En haut : S. aureus SCV

SCV

Particularités des micro-colonies in vitro:

. adhérence +++

. tps de génération (doublement) x 10

. perte de l ’activité bactéricide de certains ATB

. persistance des bactéries dans des niches

cellulaires protectrices (ostéoblastes, cellules

endothéliales , …)….

. peu de réaction inflammatoire locale

. à l’origine d’échec thérapeutique

SCV existent chez de nombreuses espèces : S.

aureus, E. coli, P. aeruginosa, P. acnes, …

Physiologie des SCV

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Auxotrophie = incapacité d'un organisme

vivant à synthétiser un composé organique

nécessaire à son développement.

Physiologie des SCV

+ altération large du protéomeKriegeskorte A, Protéomics 2011

Vesga JID 1996

SCV, IOA et diagnostic bactériologique

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SCVs emerge naturally during exponential-phase of Normal Colony Population growth.

Edwards A M J. Bacteriol. 2012;194:5404-5412

Physiologie des SCV

In vitro

Physiologie des SCV

Modèle cellulaire

Infection culture cellulaire par NCP

Tuchscherr et al.,2010 EMBO Molecular Medecine

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In vivo

Physiologie des SCV


Physiologie des SCV

Culture de sonicat

SCV révertant

SCV stable

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Sélection des SCV


Pb pour le diagnostic : SCV révertants vs. SCV stables

SCV et capacité d’internalisation


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SCV et virulence

S. epidermidis S. epidermidis de phénotype SCV

� Comparaison des antibiogrammes : SCV plus résistants

Choix thérapeutiques orientés et adaptés

SCV et résistance

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Sonication des prothèses et matériels

SCV et biofilm

. bactéries "collées" sur le matériel

. bactéries empaquettées dans la matrice

. bactéries métaboliquement peu actives

avec signaux de quiescence interne

au biofilm

Juin 2011 –Mars 2012

Prothèses explantées

SCV et biofilm

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Prothèses explantées

Culture bactérienne classique (1-10 prélèvementsper-opératoires)

Juin 2011 –Mars 2012

SCV et biofilm

Population

57 patients

52 patients

35 « descellement

aseptique »

17 « suspicion d’infection »

5 exclus de l’étude

SCV et biofilm

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Résultats – Culture classique VS sonication (3)

Apport de la sonication dans le diagnostic des SCV

17 ”suspicion d’infection” � 9 cultures + � 6 avec SCV +

S. aureus SCV

S. aureus « sauvage »

Culture de sonicat

S. aureus

S. epidermidis

P. aeruginosa

S. gallolyticus

P. acnes

S. sanguinis

SCV et biofilm

SCV et biofilm

Réplication ADN

Synthèse protéique

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Questions qui reste sans réponse car aucune étude seulement des séries de quelques cas:

- Faut-il traiter différemment les patients avec IOA à SCV + ?

- Faut-il préférer certains ATB ? (activité intracellulaire, intra biofilm, …)

- Faut-il traiter plus longtemps? … mais combien de temps

On aurait envie de répondre oui …

SCV et résistance

Conclusion

• SCV = physiologique ? Présent tout le temps ?

• Rôle physiopathologique clair in vitro et dans les modèles

• Prise en charge au laboratoire:

– examiner tous les aspects

– Identifier tous les aspects (Maldi-tof: colonie blanches qui

sont des S. aureus, Strepto non hémolytique qui sont des

StreptoA, …)

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Les SCV en clinique

Pr. Tristan [email protected]

Service de Maladies Infectieuses et TropicalesHôpital de la Croix-Rousse, Hospices Civils de Lyon

Université Claude Bernard Lyon1, Lyon

Centre International de Recherche en Infectiologie, CIRI, Inserm U1111, CNRS UMR5308, ENS de Lyon, UCBL1, Lyon, France

Centre Interrégional Rhône-Alpes Auvergnede Référence des IOA complexes

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Von Eiff, Clin Infect Dis, 1997, 25:1250-1251

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Mbio 2014

Subjects infected with S. aureus were more likely to fail(HR, 4.03, 95%CI, 1.80-9.04)

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Comparison of bacterial growth between a wild-type strain (ATCC 51331) and a typical SCV S. maltophilia isolate from patient A on various routine agar medi a after 48 h of incubation

at 35°C.

Anderson S W et al. J. Clin. Microbiol. 2007; doi:1 0.1128/JCM.01444-06

BMJ case report 2013

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Conclusion

• Physiopathologie des IOA encore méconnue

• Multiples stratégies bactériennes de persistance

• Mieux comprendre ces mécanismes est un enjeu important

- Pour la prévention- Pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques

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