PROCEDURE Réf. BIO-INFECT Détection et …. POS BIO-INFECT... · 2014-09-25 · indices...

PROCEDURE Réf. BIO-INFECT

Détection et évaluation des infections plasmodiales par

sérologie des anticorps anti-Plasmodium

Version : 4.1

Date : 05/07/2014

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REDACTEURS VERIFICATEURS APPROBATEUR DESTINATAIRES

David COURTIN Franck REMOUE Participants au projet PALEVALUT

Biologistes

Date : 25/08/13 Date : 28/08/2013 Date : 20/11/2013

Objet : La procédure définit la méthode d’évaluation du niveau d’exposition à Plasmodium falciparum (transmission / infection) de l’homme par la mesure quantitative (ELISA) des réponses anticorps IgG spécifiques d’antigènes de stades pré-érythrocytaires (CSP) et érythrocytaires (AMA-1, MSP-119, GLURP). Cette procédure a été mise au point dans le cadre du réseau AMANET (African Malaria Network Trust). Ces indicateurs immunologiques servent à évaluer non seulement la présence (OUI/NON) et l’intensité de transmission/infection présentes et/ou passées (1 à 6 mois) mais également l’efficacité opérationnelle de la lutte antipaludique. Application : Le document est élaboré pour le personnel chargé de l’évaluation immunologique intégrée aux études épidémiologiques et parasitologiques. Documents associés : 0 Annexes : 8 (A à H)

Historique des modifications : Date Version Nature de la modification

25/08/2013 0 Création de la POS

28/08/2013 1 Correction FR (Bénin)

01/09/2013 2 Prise en compte des remarques DC (Bénin)

24/09/2013 3 Approbation FR

14/11/2013 4.0 Modification IVW et prise en compte DC

05/07/2014 4.1 Correction coquille coating (5.2.1)

Table des matières 1 Introduction ..................................................................................................................................... 2

2 Objectif ............................................................................................................................................ 3

3 Responsabilités ................................................................................................................................ 3

4 Matériels.......................................................................................................................................... 3

4.1 Chimiques ................................................................................................................................ 3

4.2 Solutions .................................................................................................................................. 3

4.3 Anticorps secondaire: .............................................................................................................. 3

http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/





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4.4 Echantillon de références ........................................................................................................ 4

4.5 Antigènes ................................................................................................................................. 4

4.6 Matériels.................................................................................................................................. 4

4.7 Instruments et logiciel ............................................................................................................. 4

4.8 Echantillons ............................................................................................................................. 4

4.8.1 Sérums ............................................................................................................................. 4

4.8.2 Préparation de la gamme de référence .......................................................................... 5

5 Méthodes ........................................................................................................................................ 5

5.1 Précautions .............................................................................................................................. 5

5.2 Mode opératoire ..................................................................................................................... 5

6 Références ....................................................................................................................................... 7

7 Annexes ........................................................................................................................................... 8

1 Introduction Les stratégies de lutte ont pour objectifs de diminuer la morbidité/mortalité et la transmission du paludisme. Elles évoluent au fil des apparitions des résistances des moustiques vecteurs aux insecticides et des parasites aux traitements et le choix des stratégies de lutte devrait reposer sur l’identification des mesures les plus efficaces au moindre coût. Pour cela, il est nécessaire de développer des indicateurs fiables pour permettre d’évaluer les différents moyens mis en œuvre pour lutter contre le paludisme. La variabilité du risque de transmission palustre au sein des populations est fréquemment décrite mais difficile à évaluer avec les outils classiques d’entomologie et de parasitologie car leurs mises en œuvre sont contraignantes. Pour lutter efficacement, identifier le niveau de transmission/infection du paludisme (avant et après intervention) serait utile. Cibler les efforts de lutte rendrait cette dernière plus efficace. Il est donc nécessaire de disposer d’indicateurs fiables de la transmission des parasites dans le temps et dans l’espace. Les indicateurs immuno-épidémiologiques ont l’avantage de repérer les infections passées (effet cumulatif) au niveau individuel, d’être sensibles (détection Ac anti-Plasmodium chez un individu négatif pour méthodes parasitologiques) et simple d’utilisation. Cette mémoire de la réponse anticorps aux infections passées permet d’être moins sensible aux fluctuations saisonnières et même journalières de l’exposition au paludisme que des paramètres directs comme l’EIR ou les données de prévalences parasitaires [1, 2]. De plus, dans les zones où la transmission est faible, l’évaluation de la lutte par les indices paludométriques « conventionnels » (indice plasmodique, i.e. taux de prévalence des infections plasmodiales chez les enfants de 2-9 ans ; taux d’inoculation entomologique) est laborieuse. La sérologie est, dans ce contexte, un outil d’intérêt majeur, et en particulier le seul permettant d’identifier des infections antérieures (1 à 6 mois avant le prélèvement). La POS BIO-INFECT s’intègre aux évaluations épidémiologiques et parasitologiques (POS EfficacInfection et EfficacAPNC) pour lesquelles un prélèvement de sang au bout du doigt sera réalisé (voir POS BIO-PREL).






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2 Objectif Quantifier les anticorps IgG dirigés contre les antigènes des stades pré-érythrocytaire (CSP) et érythrocytaire (AMA-1, MSP-1, GLURP) de P. falciparum afin d’estimer l’intensité d’exposition des individus aux infections plasmodiales, intensité de transmission (stade pré-érythrocytaire) versus infection (stade érythrocytaire).

3 Responsabilités - Epidémiologiste : intégration de la procédure biomarqueur d’infection dans la demande de la clairance éthique ; coordination de la mise en œuvre des prélèvements de sang (sérum cf. POS BIO-PREL), de la formation et de la supervision du personnel infirmier responsable de la collecte des échantillons de sang.

- Infirmier de terrain : réalisation de la collecte des échantillons de sang au cours des études épidémiologiques et parasitologiques

- Biologiste/immunologiste : stockage des échantillons et dosage ELISA des réponses IgG anti-CSP (NANP), AMA-1, MSP1 et GLURP, analyse des résultats immunologiques.

4 Matériels

4.1 Chimiques

Acide Sulfurique (H2SO4 10M, Bie&Berntsen, Ref : BBB 133552)

Tween-20 (Merck Eurolab, Ref : 822184)

TMB ONE (KEM EN TEC, Ref : 4380)

PBS tablets (Gibco, Ref : 18912-014)

BSA (Bovine Serum Albumin IgG and protease free, Interchim, Ref : WU1640)

Lait en poudre (écrémé 0% de gras, Régilait/Vitamilk)

Chlorure de sodium (NaCl, Merck Eurolab, Ref : 10064045000)

Rouge de Phénol (Merck Eurolab, , Ref : 107241)

Azide de sodium 10% (Boom, Ref : 10066880)

Eau distillée

4.2 Solutions

Solutions : Annexes :

Tampon de coating (PBS 1X / Rouge de phenol 0,001%) Annexe A Tampon de saturation (PBS 1X / 0,1% Tween-20 / 3% Lait) Annexe B Tampon de dilution de l’échantillon biologique (PBS 1X / 0,1% Tween-20 / 1% Lait / 0,02% Azide de sodium)

Annexe C

Tampon de lavage (PBS 1X / 0,1% Tween-20 / 0,5% NaCl) Annexe D Tampon de révélation (TMB ONE) Annexe E Tampon de dilution des anticorps secondaires (PBS 1X / 0,1% Tween-20 / 1% lait)

Annexe F

Tampon de fixation (H2SO4 0,2M) Annexe G

4.3 Anticorps secondaire:

IgG de chèvre anti-IgG humaines couplées à la peroxydase –HRP (Caltag/Invitrogen , Ref: H10007)






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4.4 Echantillon de références

Echantillon Réference : Fournisseur : IgG humaines purifiées (5 mg/ml) BP055 The Binding Site Positif Pool d’individus immuns UMR216 IRD Négatif Pool Non Immuns UMR216 IRD Blanc : PBS 1X 18912-014 Gibco

4.5 Antigènes

Antigène Réference : Fournisseur :

AMA-1 25–545 Pichia pastorius BPRC (E. Remarque)

MSP-119 Baculovirus IP Paris (S. Longacre)

BSA-GLURP Peptide GPS 1358 GENECUST

BSA-CSP Peptide CSP GENECUST

BSA Interchim WU1640 ou GENECUST

Peptide GLURP (GPS 1358) couplé à la BSA : EDKNEKGQHEIVEVEEIL Peptide CSP couplé à la BSA: NANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNVDP

4.6 Matériels

Pipettes 1-20µl, 20-100µl, 40-200µl, 200-1000µl Pipettes Multicanaux (P200, P1000) Réservoir en plastique 50 ml (distribution des tampons, Dominique Dutscher, Ref : 034102)

Plaques 96 puits fond plat en polystyrène (Nunc / Dominique Dutscher, Ref : Maxisorp F 96 439454)

Film adhésif transparents pour plaque ELISA (SIGMA, Ref : A5596-100EA)

Cônes pour micropipettes de 0-20, 20-100 µl, 40-200 µl et 100-1000 µl

Tubes Falcon 50 mL et 15 mL (Dominique Dutscher, Ref : 010152 et Ref : 010151)

Tubes Eppendorf 1,5 mL et 2 mL (Dominique Dutscher, Ref : 442078 et Ref :012000A)

Tubes de transfert 1,2 ml (Dominique Dutscher, Ref : 104410)

Capuchon tube de transfert (Dominique Dutscher, Ref :104418)

Récipients / béchers (verrerie) de 500 ml, 1000, 2000 ml

Mouchoirs Sopalin

Papier aluminium

4.7 Instruments et logiciel

Laveur de plaque ELISA

Lecteur de plaque ELISA

Agitateur magnétique

Chronomètre

Ordinateur Logiciel de calcul des données (Excel)

4.8 Echantillons

4.8.1 Sérums

Sérums prélevés sur Microtainer : voir POS BIO-PREL






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Dilution de l'échantillon : 1/200 pour l’ensemble des antigènes excepté AMA-1 (dilution au

1/2000).

NB : Un ajustement de la dilution peut être nécessaire selon le type d’échantillons (Enfants,

Adultes), d’antigènes et le degré d’exposition au paludisme.

4.8.2 Préparation de la gamme de référence

Pour la quantification des anticorps, inclure dans chaque plaque, une gamme de référence (courbe

standard) composée d'IgG purifiée de concentration connue (1mg/ml). Pour la courbe standard, des

dilutions en séries (1/2) seront réalisées dans les colonnes 1 et 2 (duplicat, voir partie 5.2.12). Les

concentrations de la gamme sont 100; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 ng / ml.

Préparer la solution de gamme pour 12 plaques nécessite la préparation d'une solution stock à 500

ng/ml par transfert de 5 µl d'IgG purifiée standard à 1 mg / ml dans 9,995 ml de coating buffer

(1:2000).

Ensuite, préparer 8 tubes marqués de 1 à 8 pour réaliser une série de dilution (1/2) de la gamme

a. Dans le tube 1, déposer 8 ml de tampon de coating. b. Déposer 3 ml de tampon de coating dans les tubes 2 à 8. c. Transférer 2 ml de la solution stock (500 ng/ml) dans le tube 1, et bien mélanger. d. Transférer 3 ml du tube 1 dans le tube 2, et bien mélanger. e. Transférer 3 ml du tube 2 dans le tube 3, et bien mélanger. f. Transférer 3 ml du tube 3 dans le tube 4, et bien mélanger. g. Transférer 3 ml du tube 4 dans le tube 5, et bien mélanger. h. Transférer 3 ml du tube 5 dans le tube 6, et bien mélanger. i. Transférer 3 ml du tube 6 dans le tube 7, et bien mélanger. j. Transférer 3 ml du tube 7 dans le tube 8, et bien mélanger.

Les 12 plaques permettent de quantifier les anticorps de 432 échantillons dirigés contre un même antigène

5 Méthodes

5.1 Précautions

- Respecter les temps et les conditions d'incubation - Bien laver les plaques afin d'éviter des biais issus de résidus de lavage - Préparer les tampons selon les protocoles et bien respecter les conditions de conservation (c.f. annexes)

5.2 Mode opératoire

5.2.1. Sensibiliser (coater) la plaque en déposant a) 100 µl/puits de la gamme (voir 4.8.2.)

dans les colonnes 1 et 2 de chaque plaque et b) 100 µl/puits d'Ag (CSP, MSP1, AMA1, GLURP et BSA)

dilué dans du coating buffer (Annexe A) à 1 µg/ml dans les colonnes 3 à 12. Couvrir la plaque avec un

film en plastique. Chaque plaque doit être identifiée : nom de l’antigène, type d’anticorps, numéro






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de série, date et le nom du manipulateur. Incuber les plaques une nuit à 4°C. Les plaques peuvent

être stockées pendant 7 jours entre 2 et 8°C.

5.2.2. Les échantillons biologiques (plasmas ou sérums ou éluats) doivent être dilués au

1:200 (antigènes CSP, MSP1, GLURP) ou au 1:2000 (antigène AMA1) dans le tampon de dilution

d'échantillon (Annexe C). Les dilutions peuvent être stockées pendant 2 jours. entre 2 et 8°C

5.2.3. Retirer la plaque du réfrigérateur et laver 4 fois avec du tampon de lavage (Annexe D).

Après chaque étape de lavage, laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn. Tapoter la

plaque sur du papier absorbant après le dernier lavage. Déposer 150 µl de tampon de saturation

(Annexe B) et incuber la plaque à température ambiante (22°C-25°C) pendant 1h.

5.2.4. Vider la plaque, tapoter et laver 4 fois avec du tampon de lavage. Après chaque étape

de lavage, laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn. Déposer 100 µl de tampon de

dilution (Annexe F) dans les puits des colonnes 1 et 2, 100 µl de contrôles positifs, de contrôles

négatifs, et de blanc en duplicat dans les puits correspondants des colonnes 3 et 4 (voir plan de

plaque en 5.2.12), puis 100 µl des échantillons tests dilués dans les puits correspondants des

colonnes 3 à 12 selon le plan de plaque. Incuber pendant 2h sous agitation à température ambiante

(22°C-25°C).

5.2.5. Laver 4 fois les plaques avec du tampon de lavage. Après chaque étape de lavage,

laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn et bien tapoter la plaque après le dernier

lavage

5.2.6. Déposer 100 µl/puits d'anticorps secondaire anti-IgG humaines couplé à la peroxidase

dilué au 1:3000 dans du tampon de dilution (Annexe F). Incuber pendant 1h sous agitation à

température ambiante (22°C-25°C).

NB : Attention, sortir et laisser revenir le tampon de révélation (TMB ONE) à température (22°C-

25°C) ambiante 1h avant utilisation

5.2.7. Laver 4 fois les plaques avec du tampon de lavage. Après chaque étape de lavage,

laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn et bien tapoter la plaque après le dernier

lavage

5.2.8. Déposer 100 µl/puits de tampon de révélation (Annexe E). Incuber à température

ambiante (22°C-25°C) pendant 30 mn à l'abri de la lumière.

5.2.9. Déposer 100 µl de H2SO4 à 0,2M (Annexe G) et lire la plaque à 450 nm dans le lecteur

de plaque. Enregistrer les résultats sous fichier texte sans la colonne des lettres (A à H) et la ligne des

nombres (1 à 12), et sans les espaces dans les données. Ce fichier texte peut être enregistré sous

notepad ou wordpad.

5.2.10. La conversion des valeurs de l'absorbance en Unité Arbitraire est réalisée en utilisant

Microsoft Excel et un autre logiciel






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5.2.11. Pour chaque manipulation, remplir le protocole de travail (Annexe H)

5.2.12. Plan de plaque

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ref IgG

100 ng/ml

Ref IgG

100 ng/ml Ctrl+-1 Ctrl+-1 Ech -5 Ech -5 Ech 13 Ech 13 Ech 21 Ech 21 Ech 29 Ech 29

B 50 ng/ml 50 ng/ml Ctrl--1 Ctrl--1 Ech -6 Ech 6 Ech 14 Ech 14 Ech 22 Ech 22 Ech 30 Ech 30

C 25 ng/ml 25 ng/ml Blanc Blanc Ech -7 Ech 7 Ech 15 Ech 15 Ech 23 Ech 23 Ech 31 Ech 31

D 12.5 ng/ml 12.5 ng/ml Blanc Blanc Ech 8 Ech 8 Ech 16 Ech 16 Ech 24 Ech 24 Ech 32 Ech 32

E 6.25 ng/ml 6.25 ng/ml Ech - 1 Ech -1 Ech 9 Ech 9 Ech 17 Ech 17 Ech 25 Ech 25 Ech 33 Ech 33

F 3.13 ng/ml 3.13 ng/ml Ech -2 Ech -2 Ech 10 Ech 10 Ech 18 Ech 18 Ech 26 Ech 26 Ech 34 Ech 34

G 1.56 ng/ml 1.56 ng/ml Ech -3 Ech -3 Ech 11 Ech 11 Ech 19 Ech 19 Ech 27 Ech 27 Ech 35 Ech 35

H 0.78 ng/ml 0.78 ng/ml Ech -4 Ech -4 Ech 12 Ech 12 Ech 20 Ech 20 Ech 28 Ech 28 Ech 36 Ech 36

6 Références 1 Drakeley CJ, Corran PH, Coleman PG, et al. 2005. Estimating medium- and long-term trends in malaria transmission by using serological markers of malaria exposure. Proc Natl Acad. Sci. U S A 102:5108–5113.

2 Bousema T, Drakeley C, Gesase S, et al. 2010. Identification of Hot Spots of Malaria Transmission for Targeted Malaria Control J.Infect.Dis. 201:1764-1774

3 Dodoo, D., M. Theisen, J. A. Kurtzhals, B. et al. 2000. Naturally acquired antibodies to the glutamate-rich protein are associated with protection against Plasmodium falciparum malaria. J.Infect.Dis. 181:1202-1205.

4. Oeuvray, C., Theisen M., Rogier C.et al. 2000. Cytophilic immunoglobulin responses to Plasmodium falciparum glutamate-rich protein are correlated with protection against clinical malaria in Dielmo, Senegal. Infect.Immun. 68:2617-2620.

5. Courtin D., Oesterholt M., Huissman H et al., 2009. The quantity and quality of African children’s IgG responses to Plasmodium falciparum asexual stage antigens reflect protection against infection and disease. PLoS ONE 4:e7590.






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7 Annexes

Annexe A

Tampon de coating

PBS 1X contenant 0,001% rouge de phénol

Volume: 1L

Date de production: ________________

Produits Volume lot no.: Volume

utilisé

Etapes effectuées

()

PBS

2 tablettes

0,001% rouge de phénol Déposer 1 ml de 1 % de

rouge phenol dans 1L

H2O distillée

1000 ml

PROCEDURE:

1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une flaque contenant 1000 ml d'H2O distillée et un barreau

magnétique,

2. Placer la bouteille sur agitateur magnétique sans chauffage.

3. Ajouter 1 ml d'une solution à 1 % de Phénol rouge. La solution de 1 % de Phénol rouge est

préparée par ajout de 0,1 g de Phénol rouge dans 10ml d'H2O distillée.

ETIQUETTE:

- “Tampon de coating” + date + initiales

STOCKAGE:

3 mois entre 2°C et 8 oC

Rédigé par: ______________________________________, le _______________

Nom Date






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Annexe B

Tampon de saturation

PBS 1X contenant 3 % de lait en poudre, 0,1% Tween-20

Volume: 1L

Date de production : ________________

Produits Volume Lot no.: Volume utilisé Etapes

effectuées ()

PBS 2 tablettes

Lait en poudre 30 g

Tween 20 1 ml

H2O distillée 1000 ml

PROCEDURE:

1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une flasque contenant 1000 ml d'H2O distillée et un barreau

magnétique, puis placer la flasque sur agitateur magnétique sans chauffage.

1. Ajouter 30 g de lait en poudre.

2. Ajouter 1 ml de Tween 20 et agiter jusqu'à obtenir une solution homogène.

ETIQUETTE:

- “Tampon de saturation” + date + initiales

STOCKAGE:

Utiliser le tampon de saturation frais.

Rédigé par : ______________________________________, le _______________

Nom Date






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Annexe C

Tampon de dilution de l’échantillon biologique (plasma, sérum ou éluat de sang)

PBS 1X contenant 1 % lait en poudre, 0,1% Tween-20 et 0,02% d’azide de sodium (Na-az)

Volume: 1L



effectuées

()

PBS 2 tablettes

Lait en poudre 10 g

Tween 20 1 ml

10% azide de sodium 2 ml


PROCEDURE:

1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une flasque contenant 1000 ml d'H2O distillée et un barreau

magnétique,

2. Placer la flasque sur agitateur magnétique sans chauffage.


4. Ajouter 1 ml de Tween 20

5. Ajouter 2 ml de la solution d’azide de sodium à 10 % et agiter jusqu'à obtenir une solution

homogène. La solution à 10 % d’azide de sodium est préparée par dissolution de 4 g d’azide

de sodium dans 40 ml d'H2O distillée.

ETIQUETTE:

- “Tampon de dilution de l’échantillon biologique + date + initiales

STOCKAGE:

3 semaines entre 2 et 8 oC

Rédigé par:__________________________, le _______________

Nom Date






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Annexe D

Tampon de lavage

PBS 1X contenant 0,1% de Tween-20 et 0,5 M de NaCl

Volume: 5L


Produits Quantité Lot no.: Quantité

utilisée

Etapes

effectuées

()

PBS 10 tablettes

Tween-20 5 ml

NaCl 145 g


PROCEDURE :

1. Mettre 10 tablettes de PBS dans une boîte contenant 5000 ml d'H2O distillée et un barreau

magnétique, puis placer la bouteille sur agitateur magnétique sans chauffage.

2. Ajouter 145g de NaCl.

3. Ajouter 5 ml de Tween-20 et agiter jusqu'à obtenir une solution homogène.

ETIQUETTE:

- “Tampon de lavage”+ date + initiales

STOCKAGE:

1 semaine à température ambiante

Rédigé par: ______________________________________, le _______________

Nom Date






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Annexe E

Tampon de révélation

TMB ONE

Volume: 10 ml par plaque de 96 puits

Produits Quantité Lot no.: Volume utilisé Etapes effectuées

()

TMB (3,3’, 5,5’-

Tetramethylbenzidine)

Solution de substrat

Prêt à

l'emploi,

Ajouter

100ul/puits

4380

PROCEDURE:

La solution de TMB commerciale est prête à l'usage.

1. Transférer la quantité nécessaire dans un réservoir de 50ml – couvrir avec du papier

aluminium avant utilisation.

ETIQUETTE:

- “TMB solution de substrat

STOCKAGE:

La solution de TMB est stockée à 4C; Attention, laisser revenir à température (22°C-25°C) ambiante

avant utilisation

Rédigé par: ______________________________________, le _______________

Nom Date






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Annexe F

Tampon de dilution des anticorps secondaires

PBS 1X contenant 1 % lait en poudre et 0,1% Tween-20

Volume: 1L



effectuées

()

PBS 2 tablettes

Lait en poudre 10 g

Tween-20 1 ml


PROCEDURE:

1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une bouteille contenant 1000 ml d'H2O distillée et un

barreau magnétique, puis placer la bouteille sur agitateur magnétique sans chauffage.


3. Ajouter 1 ml de Tween 20 et agiter jusqu'à obtenir une solution homogène.

ETIQUETTE:

- “Tampon de dilution des anticorps” + date + initiales

STOCKAGE:

1 semaine entre 2 et 8 oC

Rédigé par: ______________________________________, le _______________

Nom Date






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Annexe G

Tampon de fixation

Solution de H2SO4 à 0,2 M

Volume: 1L

Date de préparation: ________________

Produits Volume Lot no.: Volume utilisé Etapes effectuées

()

10M H2SO4 20 ml


PROCEDURE:

1. Ajouter le volume indiqué d'eau dans une flasque.

2. Ajouter le volume indiqué de 10M H2SO4.

3. Laisser refroidir à température ambiante

ETIQUETTE :

- “0,2 M H2SO4” + date + initiales

STOCKAGE:

- 8 mois à température ambiante

Rédigé par: ______________________________________, le _______________

Nom Date




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Annexe H

Fiche de suivi : IgG ELISA

Date:

N° de série.:

Init

Objectif: Valider

()

Coating Ajouter 100 µl/puits de a) la solution de gamme en duplicats dans les

puits des colonnes 1 et 2 et b) Ag : _________ dans du PBS 1X à 1

µg/ml dans les colonnes 3 à 12. Plaque: NUNC 439454 Maxisorp

Date du coating:

4C

Lavage Tampon de lavage 4 x 1 min.

Saturation 150 l/puits de tampon de saturation 1 h sous agitation à température ambiante


Incubation avec l'anticorps primaire

Echantillons dilués à 1:____ dans du tampon de dilution.

Ajouter 100 l/puits

2 h sous agitation à température ambiante


Incubation avec l'anticorps secondaire

anti-human IgG couplé à la peroxidase (Caltag) dilué 1:3000 dans le tampon de dilution. Ajouter 100µl/puits

1 h sous agitation à température ambiante


Ajout de tampon de révélation - réaction colorimétrique

100 l/puits de substrat 30 min. à température ambiante à l'abri de la lumière

Arrêt de la réaction 100 l/puits de 0,2 M H2SO4, Lire l'absorption à 450 nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Ref

IgG100ng/ml Ref IgG 100

ng/ml Ctrl+-1 Ctrl+-1 Ech -5 Ech -5 Ech 13 Ech 13 Ech 21 Ech 21 Ech 29 Ech 29

B 50 ng/ml 50 ng/ml Ctrl--1 Ctrl--1 Ech -6 Ech 6 Ech 14 Ech 14 Ech 22 Ech 22 Ech 30 Ech 30

C 25 ng/ml 25 ng/ml Blanc Blanc Ech -7 Ech 7 Ech 15 Ech 15 Ech 23 Ech 23 Ech 31 Ech 31

D 12.5 ng/ml 12.5 ng/ml Blanc Blanc Ech 8 Ech 8 Ech 16 Ech 16 Ech 24 Ech 24 Ech 32 Ech 32

E 6.25 ng/ml 6.25 ng/ml Ech - 1 Ech -1 Ech 9 Ech 9 Ech 17 Ech 17 Ech 25 Ech 25 Ech 33 Ech 33

F 3.13 ng/ml 3.13 ng/ml Ech -2 Ech -2 Ech 10 Ech 10 Ech 18 Ech 18 Ech 26 Ech 26 Ech 34 Ech 34

G 1.56 ng/ml 1.56 ng/ml Ech -3 Ech -3 Ech 11 Ech 11 Ech 19 Ech 19 Ech 27 Ech 27 Ech 35 Ech 35




16

H 0.78 ng/ml 0.78 ng/ml Ech -4 Ech -4 Ech 12 Ech 12 Ech 20 Ech 20 Ech 28 Ech 28 Ech 36 Ech 36

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