Lerat Du Hepatites Virales

PATHOGENPATHOGENÈÈSE DES LSE DES LÉÉSIONS SIONS HHÉÉPATIQUES DU VHC :PATIQUES DU VHC :

MODMODÉÉLISATION ANIMALELISATION ANIMALE

Hervé LERATHervé LERAT

INSERM U955INSERM U955Département de Virologie Moléculaire et ImmunologieDépartement de Virologie Moléculaire et Immunologie

Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)

Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.

Nécessité de développement de Nécessité de développement de modèles animauxmodèles animaux

Contexte d’un organe entier Contexte d’un organe entier dans un animal vivant.dans un animal vivant.

Pathologies viro-induites: contribution du virus?

Modèles animaux pour l’étude des Modèles animaux pour l’étude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC

Primates non-humainsPrimates non-humains ChimpanzéChimpanzé OuistitiOuistiti

Modèles d’infectionModèles d’infection

Problème de disponibilité et de coût.Problème de disponibilité et de coût.

Rongeurs (“humanisés”)Rongeurs (“humanisés”) uPA/SCIDuPA/SCID TrimeraTrimera ratrat


Modèles d’infectionModèles d’infection

Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007

Modèles d’infection (rongeurs)Modèles d’infection (rongeurs)

Modèles d’infection (rongeurs)Modèles d’infection (rongeurs)

Adapted from Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007

Techniquement très complexes à mettre en œuvreTechniquement très complexes à mettre en œuvre

uPA/SCID

Trimera mice

Rat

Rodent models HumanizationViremia

Copies/mLDuration of infection

(Months)

Human hepatocyte transplantation

Xenograft of human liver tissues

Immunotolerization and transplantation of

human hepatoma cell line

104 to 8x107

7x104

1-2x104

Up to 9

Around 1

Up to 4

Peak viremia

1 month

18 days

3 months

Transgenèse murine Transgenèse murine Classique Classique Conditionnelle (système Cre/Lox)Conditionnelle (système Cre/Lox)


Modèles d’expression des protéines viralesModèles d’expression des protéines virales

Avantages Avantages :: Facilité d’élevage, technique rodéeFacilité d’élevage, technique rodée Expression chronique à long termeExpression chronique à long terme Pas de réponse immunePas de réponse immune Pas de réplication virale Pas de réplication virale

Protéine(s) virale(s) Article princeps Principales pathologies

Core Core Moriya 1997Moriya 1997StéatoseStéatose,, Inhibition de MTTP et VLDL sécrétion, IRInhibition de MTTP et VLDL sécrétion, IRCHC, stressstress oxydatif, stress REoxydatif, stress REModulation de la voie de l’IFN,Modulation de la voie de l’IFN,

Core Core Honda, 2000 Honda, 2000 Modulation de l’apoptose induite par la voie FAS,Modulation de l’apoptose induite par la voie FAS,IR (IRS-1)IR (IRS-1)

Core Core Ishikawa, 2003Ishikawa, 2003 Lymphome et Lymphome et adénomes hépatocellulairesadénomes hépatocellulaires

CoreCore Kato, 2003Kato, 2003 Co-carcinogèneCo-carcinogène (+CCl4)(+CCl4)

CoreCore Kamegaya, 2005Kamegaya, 2005 Co-carcinogèneCo-carcinogène (+DEN)(+DEN)

Core (mutants)Core (mutants) Wang, 2004Wang, 2004 Dysplasie pour le mutant S99QDysplasie pour le mutant S99Q

Core-E1-E2Core-E1-E2 Honda, 1999Honda, 1999 Modulation de l’apoptose induite par la voie FASModulation de l’apoptose induite par la voie FAS

Core-E1-E2Core-E1-E2 Kamegaya, 2005Kamegaya, 2005 Co-carcinogèneCo-carcinogène (+DEN)(+DEN)Inhibition of Fas-mediated apoptosis Inhibition of Fas-mediated apoptosis

Core-E1-E2Core-E1-E2 Naas, 2005Naas, 2005 SteatoseSteatose, , CHCCHC

Core-E1-E2-p7Core-E1-E2-p7 Lerat, 2002Lerat, 2002 StéatoseStéatose,, CHC, sensibilité au stress oxydatif

Core-E1-E2-p7Core-E1-E2-p7 Korenaga, 2002 Korenaga, 2002 Production ROS augmentée

Core-E1-E2-p7-NS2Core-E1-E2-p7-NS2 Wakita, 1998Wakita, 1998 Lésions hépatiques induites par VHC spécifiques CTLLésions hépatiques induites par VHC spécifiques CTLInhibition voie FASInhibition voie FAS

Modèles transgéniques pour le VHCModèles transgéniques pour le VHC

Protéine(s) virale(s) Article princeps Principales pathologies

E1-E2 E1-E2 Koike, 1997Koike, 1997 Exocrinopathie: Sialadenitis (glandes salivaires) Exocrinopathie: Sialadenitis (glandes salivaires)

NS3-4ANS3-4A Frelin, 2006Frelin, 2006 Modulation de la voie TNFαModulation de la voie TNFα

NS5ANS5A Majumder, 2003Majumder, 2003 Modulation de la voie TNFαModulation de la voie TNFα

Polyprotéine entièrePolyprotéine entière Lerat, 2002Lerat, 2002

StéatoseStéatose, , CHCCHC, sensibilité au stress oxydatif, sensibilité au stress oxydatifinhibition voie FAS et réponse immune intra-hépatiqueinhibition voie FAS et réponse immune intra-hépatiqueInhibition des protéines pro-apoptotiques CIDE-B et BidInhibition des protéines pro-apoptotiques CIDE-B et BidCHCCHC par surcharge en fer, inhibition de l’hepcidinepar surcharge en fer, inhibition de l’hepcidine

Polyprotéine entièrePolyprotéine entière Blindenbacher, 2003Blindenbacher, 2003 StéatoseStéatose, nécrose , nécrose Inhibition de la voie IFN (STAT)Inhibition de la voie IFN (STAT)

Polyprotéine entière + HbXPolyprotéine entière + HbX Keasler, Lerat et al. 2006Keasler, Lerat et al. 2006 Augmentation de l’incidence des Augmentation de l’incidence des CHCCHC et de la et de la StéatoseStéatose

Modèles transgéniques pour le VHCModèles transgéniques pour le VHC (suite)

micro-injectionsC57BL6J x C3H/HeJ

X C57BL6Jsouris F0, ADN VHC + souris F1, ARN VHC +

X C57BL6J jusqu’à F8

FoieFoie

Les modèles transgéniques FL-N/35 et S-N/863 (Lerat et al., Gastroenterology, 2002)

S-N/863SL-139

FL-N/35

S-N SV40 PolyA

FL-NE1 E2core

NS

4a

NS3 NS4b NS5a NS5bNS2p7Promoteur albumine

Promoteur albumine E1 E2 p7

SV40 PolyA

core

Carcinomes hépatocellulaires

1 cm

1 cm

FL-N/35-170

FL-N/35-171A

Lerat et al., Gastroenterology 2002.

CHC viro-induits: CHC viro-induits: mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?

CHC viro-induits: CHC viro-induits: mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?Modulation du cycle cellulaireModulation du cycle cellulaire

Incorporation de BrdU

HCV TGNon TG

ARNmCyclin B1 MYC

1

3

5

7

9

mR

NA

(F

old

incr

ease

)HCV TGNon TG HCV TGNon TG

Détection PCNA

HCV TGNon TG

% a

po

pto

tic

hep

ato

cyte

s

0

10

20

30

40

50

non TG

HCV TG

P<0.05

in vivo

P<0.01

ex vivo

HCV TGNon TG

Hoe

chst

+

-

Flu

ore

sc

en

ce

in

ten

sit

y

DownDown--regulation ofregulation of apoptosis apoptosis in HCV-transgenic mice in HCV-transgenic mice

0 1 6 15

Non TG

HCV TG

activated Casp 3 (17kDa)

Hours post FasL injection

BidBid

GAPDHGAPDH

LIVERLIVER KIDNEYKIDNEY

HCV tgHCV tg -- ++ -- ++

BidBid24 kD24 kD

ActivatedActivatedcaspase 8caspase 8

Bid-NBid-N10 kD10 kD

Bid-tBid-t14 kD14 kD

Cytochrome CCytochrome C

++

Apoptosis

Down-regulation of pro-apoptotic proteins in HCV-transgenic miceDown-regulation of pro-apoptotic proteins in HCV-transgenic mice(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

WTWT HCV tgHCV tg00

0.40.4

0.20.2

0.60.6

0.80.8

11

1.21.2

Bi

Bi d

pro

tein

le

ve

l (A

U)

d p

rote

in l

ev

el

(AU

)

BidBid

N=13N=13N=10N=10

p<0.01p<0.01

Towards a mechanism for HCVTowards a mechanism for HCV-induced carcinogenesis-induced carcinogenesis??Apoptotic signaling alteration in HCV miceApoptotic signaling alteration in HCV mice

HCV

APOPTOSISAPOPTOSISAPOPTOSISAPOPTOSIS

caspase 3 caspase 9

cytochrome C

caspase 8

Fas

FasL

Bid

Cell membrane

mitochondria

HCVCIDE-B

DNA fragmentation

A step toward A step toward cancercancer

CIDE-B

Annexin V

HCV TG +-

Erdtmann et al., J Biol Chem 2003.

Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

Day 3

Day 21

non TG HCV TG

Ad Gal108 pfu/g

D +3 Liver biopsy

D +21(sacrifice)

Liver and spleen removal

-gal histology

+ enzymatic assay

10+ 4

10+ 5

10+ 6

10+ 7

+3 +21 +3 +2110+ 3

10+ 4

10+ 5

10+ 6

ßG

AL

act

ivit

y in

th

e liv

er (

RL

U)

ßG

AL

act

ivit

y in

th

e sp

leen

(R

LU

)

LIVER SPLEEN

p<0.05

N.S.

Ad Gal108 pfu/g

D +3 Liver biopsy

D +21(sacrifice)

Liver and spleen removal

-gal histology

+ enzymatic assay

Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

CHC viro-induits: CHC viro-induits: mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?Lésions mitochondrialesLésions mitochondriales

Surcharge en FER

CHC

inflammation

fibrose

Lésions ADN

Coloration Perls (Fer)

Nishina, Gastroenterology 2008

Chaîne de transport électrons (1)

VHC (capside)

ROS

Glutathion

Ca2+Coloration au dihydroethidium (ROS)

Chronicity of infectionChronicity of infection

Towards mechanismTowards mechanismss for HCV for HCV-induced carcinogenesis-induced carcinogenesis??

LIVER CARCINOMALIVER CARCINOMA

HCV expressionHCV expression

Immune response Inhibition

Immune response Inhibition

Increased cell Increased cell divisiondivision

Increased cell Increased cell divisiondivision

Up-regulation of cyclins and oncogenes

Up-regulation of cyclins and oncogenes

DDNA DamageNA DamageDDNA DamageNA Damage

ROS productionROS production

AApoptosis evasionpoptosis evasionAApoptosis evasionpoptosis evasion

Down-regulation of pro-apoptotic proteinDown-regulation of

pro-apoptotic protein

Stéatose micro-vésiculaire

Non TGNon TG VHC TGVHC TG

VHC TGVHC TG VHC TGVHC TG

Lerat et al., Gastroenterology 2002.

Stéatose micro-vésiculaire

coloration Oil Red O

analyse in silico

HCV TGNON TGM

F

M

0

5

10

15

20

25

12.5 ± 0.4

13 ± 0.8 14.4 ± 0.8

14.1 ± 0.3

n=12

n=12 n=10

n=7

p<0.001

% d

e l’a

ire t

otal

HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS

de novo TG synthesis

TG secretion default

Increased TG serum uptake

TG degradation default (oxydation)

ER Stress?

VIRALPROTEINS

? ?

?

?

Stéatose viro-induitStéatose viro-induitee: : mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?

Défaut d’exportation des triglycérides.La sécrétion des VLDL hépatiques chez la souris à jeun a été mesurée par l’augmentation des triglycérides plasmatiques (A et B) et de l’apolipoprotéine B (C) après inhibition de la lipoprotéine lipase par le triton WR1339 (B et C).

Pla

sm

ati

c T

G (

g/L

)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

A

WT HCV-tg

14 14n

4

6

8

10

12

14

Pla

sm

ati

c T

G (

g/L

)

B

WT HCV-tg

13 13n

1

2

3

4

5

6

Pla

sm

ati

c A

po

B

(g/L

)

C

WT HCV-tg

13 13n

Inhibition de la « Microsomal Transfer Protein »

WT HCV-tg150

200

250

300

350

400

450

500

pm

ole

s/1

00

µg

/4h

Activité MTP

Stimulation de la lipogenèse

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

* p=0.01

** p=0.02

WT

HCV-tg

AR

Nm

(a

ug

me

nta

tion

re

lativ

e)

n 11

FAS SCD1

0

2

4

9

EMACCACL

11 14 11 118 8 16 8 8

*

**

**

** p=0.02

RT-qPCR

* p=0.01

FA

S/G

AP

DH

WT HCV-tg

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

4 9n

Western Blot

Stimulation de la lipogenèse

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

Régulation de la lipogenèse

SREBP1cDomaine de transactivation

(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


SREBP1c (clivé)

SREBP1c (précurseur)

Lamine A/C

Actine

noyau

microsomes

WT HCV-tg

Western Blot

AR

Nm

(a

ug

me

nta

tion

re

lativ

e)

n 14 16

0

1

2

3

4

WT HCV-tg

RT-qPCR


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


Lipogenèse induite par le stress du RE?

PERK ATF6IRE-1

Stress RERE

Epissage ARNm XBP1P-eiF2α

Arrêt traduction Dégradation protéique


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


PERK ATF6IRE-1

Stress RERE




(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

eIF

2-P

/eIF

2

0

1

2

3

4

WT HCV-tg

Western blot

Non-épisséEpissé

Non-Tg HCV Tg +

ARNm XBP1

RT-PCR


EDEM

7 4

PDI

11 8

WT

HCV-tg

CHOP TRB3

15 187 4n

GRP78

16 15

AR

Nm

(a

ug

me

na

tion

re

lativ

e)

0

2

4

6

12

RT-QPCR

1

2

3

0

4 9

Phospho-Perk

Ph

osp

ho

-Pe

rk /

PE

RK

Western Blot

PERK ATF6IRE-1

Stress RERE



RésuméRésumé


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

VLDLMTPExportation TG

ApoB

Accumulation TG intracellulairesSTEATOSE HEPATIQUE

=

=

NO

YESYES

de novo TG synthesis

TG secretion default

Increased TG serum uptake

HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS

TG degradation default (oxydation)

ER StressVIRAL

PROTEINS

?

?

Towards mechanismTowards mechanismss for HCV for HCV-induced steatosis-induced steatosis??

Modèles reproduisant les pathologies humainesModèles reproduisant les pathologies humaines Modèles permettant de décrypter les mécanismes Modèles permettant de décrypter les mécanismes

moléculaires moléculaires Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines

virales, en l’absence de réponse immunitaire (pas virales, en l’absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation, pas de cirrhose), même dans les modèles d’inflammation, pas de cirrhose), même dans les modèles exprimant très faiblement le transgène (FL-N/35).exprimant très faiblement le transgène (FL-N/35).

Pas de propriétés oncogéniques claires, mais des Pas de propriétés oncogéniques claires, mais des données sur la modulation de l’apoptose, du cycle données sur la modulation de l’apoptose, du cycle cellulaire et des lésions mitochondriales. cellulaire et des lésions mitochondriales.

Données solides sur la stéatose viro-induite Données solides sur la stéatose viro-induite Inhibition de la réponse immunitaire innée.Inhibition de la réponse immunitaire innée.

ConclusionsConclusions

Problèmes inhérents aux modèlesProblèmes inhérents aux modèlesde transgenèse développés pour le VHCde transgenèse développés pour le VHC

Difficultés à comparer les données de différents modèles dues Difficultés à comparer les données de différents modèles dues à l’hétérogénéité des séquences virales, du fond génétique de à l’hétérogénéité des séquences virales, du fond génétique de la souris, des promoteurs et des méthodes d’analyse la souris, des promoteurs et des méthodes d’analyse phénotypique.phénotypique.

La carcinogenèse est hautement dépendante du fond génétique de la souris.

Sur-expression d’une ou plusieurs protéines du VHC. Pas de manipulation génétique du transgène. Voies métaboliques différentes de l’homme.

PerspectivesPerspectives

Nouveaux modèles:Nouveaux modèles: Transgenèse Transgenèse utilisant des séquences pertinentes de utilisant des séquences pertinentes de

certaines pathologies (génotype 3/stéatose)certaines pathologies (génotype 3/stéatose)

Modèles de foie de souris transduitModèles de foie de souris transduit::o Vecteur d’expression adénoviral permettant l’expression Vecteur d’expression adénoviral permettant l’expression

hépatique des protéines du VHC: adénovirus “helper hépatique des protéines du VHC: adénovirus “helper dependent”dependent”

Avantages : réponse immune, expression à long terme, Avantages : réponse immune, expression à long terme, manipulation des séquences virales.manipulation des séquences virales.

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