Post on 04-Apr-2015
La cytométrie en flux est une technologie qui permetl'analyse quantitative, non destructive et rapidede cellules isolées considérées individuellement:
100.000 cellules par minute
Le cytomètre à flux détecte la fluorescence de marqueursmoléculaires présents à la surface ou à l'intérieur des cellules:
- Marqueurs membranaires révélés par immunofluorescence:- Leucémies, typage lymphocytaire, immunophénotype
- Marqueurs nucléaires révélés par une sonde fluorescente:
- Quantification des acides nucléiques (ADN, ARN)- Cinétique cellulaire des tumeurs.
Certains cytomètres à flux sont aussi des trieurs de cellulesqui sont alors récoltées, intactes, avec un très haut degré de pureté
CYTOMETRIE EN FLUX: DEFINITION ET APPLICATIONS CLINIQUES
L’analyse (et le tri) ne se limite pas aux cellules humaines:Toute particule ISOLEE d’une taille supérieure au micron mais inférieure à 400 microns peut être considérée:
Bactéries plaquettes chromosomes isolés (= cytogénétique en flux)MitochondriesChampignons unicellulaires, levuresLeucocytesPhytoplanctonProtoplaste végétalFDC
L’obligation d’obtenir des suspensions cellulaires monodisperséesimplique la destruction de l’organisation tissulaire:
La perte du microenvironnement et des relations histologiques estun défaut majeur de la cytométrie en flux
Solution: réaliser les mêmes études (sauf le tri) par la technologie complémentaire à la cytométrie en flux:
La cytométrie d’images
alliant microscopes , caméras, morphologie mathématiqueet informatique
CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX
1. ANALYSE
2. TRI CELLULAIRE
3. APPLICATIONS
Un cytofluorimètre-trieur à flux
Echantillon
Liquide de gaine
InjecteurUne cellule
Gicleur
Faisceau laser
Liquide de gaine
Veine porteuse
(diamètre 70 µm)
(diamètre 10 µm)
= Flux
+
Diffusion lumineuse,"Ombre portée""Taille cellulaire"
Fluorescence
Le gicleur(« nozzle= tuyère »)
Les cellules sont injectéesen file indienne et traversent un laserUNE à UNE.
régime laminaire régime turbulent
ligne de flux
FOCALISATION HYDRODYNAMIQUE
La grande force de la cytométrie est de considérer chaque cellule
INDIVIDUELLEMENT
Le cytomètre peut alors:
Faire la différence entre un marqueur faiblement exprimé parune grande partie d’une population cellulaire
et l’expression forte de ce même marqueur par une minorité de cellules
Le cytomètre peut aussi:
Détecter, analyser et trier des cellules rares dont l’intérêt biologiquepeut être considérable.
FACTEURS ENDOGENES
TISSU NORMAL
"CIBLE"
FACTEURS EXOGENES
CARCINOGENES
CELLULES
PRENEOPLASIQUES
CELLULES
NEOPLASIQUESINVASION
METASTASES
FACTEURS ENDOGENES
MODULATION
PROMOTION
FACTEURS EXOGENES
PROMOTION
INITIATION PROGRESSION
1 – 1000 cellules ?? XXX Millions cellulesCellules rares
Cancérogenèse
0 10-15 ans
Le cytomètre mémorise TOUS les paramètres de CHAQUE celluleconsidérée INDIVIDUELLEMENT dans une LISTE INFORMATIQUE (list mode)Une cellule différente de 10.000 à 30.000 autres cellules
peut être retrouvée dans cette liste et analysée Dans ce graphique, chaque point représente UNE cellule:Sur 100.000 cellules, 14 cellules différentes sont repérées.
Témoin Traité
Faisceau laser
Diffusion lumineuse,"Ombre portée""Taille cellulaire"
Fluorescence
Quels sont les paramètresétudiés en cytométrie ?
1) La diffusion lumineuse« Scatters »(diffraction, réflexion, réfraction),TOUJOURS émise)
2) Les émissions de fluorescence
(SI il y a une sonde excitable par le laser)
Diffusion lumineuse axiale:La réflexion et diffraction dominent.
"Forward Scatter, FSC"
Ombre cellulaire,taille relative de la cellule
Diffusion lumineuse orthogonale:La réfraction domine"Side Scatter, SSC"
Texture cellulaire,granularité.
Les « Scatters » : une lumière diffusée DE MEME COULEUR que lelaser incident, dont l ’intensité est proportionnelle à la taille (FSC) ouà la granularité (SSC) cellulaire.
Le diagramme de dispersion (« Dot plot »)
Les scatters sont TOUJOURS émis, même en l’absence de fluorescence.FSC et SSC sont les deux paramètres discriminants fondamentaux.
Les Fluorescences sont émises dans TOUTES les directions; elles sont toujours de couleur différente de celle du laser.
La couleur est fonction de la nature de la sonde fluorescenteL ’intensité de fluorescence est proportionnelle au nombre de molécules-sondes fixées sur la cellule, et donc au nombre de récepteurs-cibles.
Un anticorps « vert » reconnaitra un récepteurmembranaire.
Une sonde « rouge »quantifiera l ’ADN
700600
478
438
672
500400300 800 nm
Déplacement de Stockes
ABSORPTION ET FLUORESCENCE DE PerCP (Peridinine chlorophyll –-protein complex)
a.u
FITC TR R-PE Tandem R-PE*TR
PI 7-AAD B-PE APC
PRINCIPAUX FLUOROCHROMES UTILISES EN CYTOMETRIE EN FLUX
Les « Fluorescences » et « Scatters » sont SIMULTANEMENTémis dans toutes les directions. Par construction, le cytomètre « regarde »À zéro degré (FSC) et à 90 degrés (SSC et Fluorescences)
Détecteurs SSC et fluos
Détecteur FSC
.
0 255
100
intensité relative
nom
bre
de
cell
ule
s
petites cellules
grandes cellules
structure homogène
structure granuleuse
brillance faible
brillance élevée
Diffusion axiale Diffusion orthogonale Fluorescence
Interprétation d ’un histogramme selon le paramètre mesuré
Le diagramme de densité (numérique): chaque carré représente un GROUPE de cellules, le nombre de cellules du groupe est donné par une FAUSSE COULEUR
<10
10-100
100-500
500-2000
2000-5000
5000-10000
> 10000
R1 R1
FSC FSC
FL1 FL1
FSC FSC
FL1 FL1Données brutes Données sélectionnées
LA SELECTION INFORMATIQUE DES DONNEES
La fenêtre R1 estVOTRE choix !!!
Se tromper conduità des analyses Invalides.
Filtres
optiques
Détecteurs de
fluorescences
Miroirs dichroïques
LASER
Suspension cellulaire
Liquide de
gaine
Chambre de flux
Interception laser-Flux= Point d’analyse
Barre d'obscurationDétecteur de
Diffusion axiale, FSC
Détecteur
de diffusion
orthogonale , SSC
Le cytomètre –analyseur.
.
100
% transm
ission
100
100
% transm
ission
100
Passe-haut Passe-bas
Bande passante Filtre de densité
50
50
10
Les filtres optiques:
520488
575
Miroir DichroïqueDM 560 LP:Plaçé à 45°,Il est transparentAux ondes < 560 nmet réfléchit les ondes > 560 nm
BP 520
BP 575
620
Les filtres BPsélectionnent la bonnefluorescence et sontLe dernier rempartavant les détecteurs
FITC
R-PE
Veine porteuse
Une cellule
1,00
0,00
0,95
0,56
1,00
0,99
0,97
Laser #1
Laser #2
Laser #3
ALIGNEMENT LASER - FLUX
A: Injection lente B: Injection rapide
Laser
Injecteur
Veine porteuse:
mince large
Gicleur
Une cellule
Trajectoire précise, linéaire, homogène Trajectoire erratique
A B
C D
a
b
c
d
FSC
FL1
FSC
N
Alignement laser/flux et vitesse d ’injection: deux réglages fondamentaux
A: optimal B: injection rapide
C: flux désaligné D: bouchon
Détection et traitement des impulsions lumineuses.
Chaque cellule, durant son bref passage dans le laser, émet un flash de lumière par paramètre étudié:
-Un flash de scatter axial et orthogonal (il existe des scatters sous d’autres angles, non considérés içi)
-Un ou plusieurs flash de fluorescences.
Ces flash ou impulsions ne sont pas quelconques:
-Leur durée est égale au temps de passage de la cellule dans le laser (temps de vol moyen: 10 microsecondes)
-Leur intensité VARIE tout au cours de la traversée du laser !!!!
.
0
10
niveau de seuil
niveau de bruit de fond
inten
sité
Direction du flux
section dufaisceau laser
une cellule
Temps de vol(microsec.)
0
Amplitude mesurée
10
Les impulsions: chaque cellule émet un « flash » de lumièredont l’amplitude maximale est atteinte au centre du laser et mesurée à cet instant…
.
0
10
niveau de seuil
niveau de bruit de fond
inten
sité
Direction du flux
section dufaisceau laser
une cellule
Temps de vol(microsec.)
0
Amplitude mesurée
10
La cellule est très petite comparéeau laser:
Le cytomètre, qui n’est pas équipéd’un objectif de microscope puissant, ne peut pas faire la différence entre une fluorescence nucléaire etune fluorescence de surface:
La cellules est considérée comme un point mathématique sans structureapparente.
Le cytomètre « voit » la quantité totalede lumière émise par une cellule morphologiquement non résolue
On dit que le cytomètre travaille àLa résolution zéro.
RESOLUTION ZERO
Photodiode
Filtre neutre 10%
Le détecteur de « Scatter axial »(FSC): une simple photodiode.
BarreD’obscuration
FSC
Laserdirect
électrons
électrons
Photocathode
Dynode
AnodeUn photon
10 6 électrons
+ 700 voltsTension PMT0-1000 volts
Le détecteur de fluorescence: Un tube photomultiplicateur (PMT)un amplificateur de lumière: UN photon génère un million d’électrons.
Impulsion de scatter: Jamais nulle.
Impulsion de fluorescence élevée
La fluorescence peut être nulle (=sous le seuil de détection)
Temps de vol (microsec)
Volts (0-10)
LES IMPULSIONS LUMINEUSES SONT CONVERTIES EN IMPULSIONS ELECTRIQUES
Le cytomètre: quelques chiffres….
Sensibilité: moins de 1000-3000 molécules fluorescentes par cellule.
Soit moins de 300-1000 récepteurs antigéniques par cellule(un anticorps par récepteur et 3 molécules FITC par anticorps)
Une cellule « positive » exprime en général de 50.000 à quelques MILLIONSde récepteurs cibles.
Une cellule négative émet une AUTOFLUORESCENCE naturelleéquivalent à 10.000-30.000 molécules FITC.
Corollaire: une cellule déclarée « négative » peut en réalitéexprimer un à plusieurs millier de récepteurs antigéniques, non détectés car situéssous le seuil de détection, ou sous le niveau d’autofluorescence naturelle.
==> La limite n ’est pas le cytomètre mais bien le matériel biologique.
La sensibilité d’un cytomètre varie selon la nature des fluorochromes:Il sera plus sensible avec PE qui brille 40 x plus que FITC.
Photocathode
Dynode
Anode
+ 700 volts
Un photon
106 électrons
Tension PMT0-1000 volts
0
10Seuil (Threshold)
Mesure
Volts
Amplification:Gain X1 à X16, Log
ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)
Le GAIN: Une amplificationsecondaire
Linéaire ou logarithmique.
0 50 100 150 200 250
0 50 100 150 200 250
GAIN 2.5
GAIN 5.0
AMPLIFICATION LINEAIRE: LE GAIN S’UTILISE COMME UN ZOOM
PopulationsHors échelle en Mode LIN
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Photocathode
Dynode
Anode
+ 700 volts
Un photon
106 électrons
Tension PMT0-1000 volts
0
10Seuil (Threshold)
Mesure
Volts
Amplification:Gain X1 à X16, Log
ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)
Le seuil de sensibilité:Souvent posé sur le scatteraxial (FSC), il permet au cytomètre de ne PAS « voir »des particules trop petites.
Le seuil ne peut jamais êtremis à zéro: à vérifier si votrecytomètre semble « aveugle »
0
10
niveau deseuil
Temps de vol(microsec.)
0
Amplitudemesurée
10
Volts
0
niveau deseuil
Temps de vol(microsec.)
0
Amplitudemesurée
10
Volts
FSC
FSC
10
Le niveau de seuilcorrectement ajustépermet de détecter, ou ignorer,des particules de tailledonnée…
Plaquettes Lymphocytes
Presque toujours placé sur FSC,
le seuil peut parfois être posé sur une fluorescence,
par ex.
1) pour ignorer des cellules négatives majoritaires et repérer de rares cellules positives…par exemple pour les trier.
Corollaire: vous ne pouvez plus calculer le % de cellules marquées, mais juste les repérer pour la pose d’une fenêtre de tri.
2) Pour ignorer les trop nombreux débris nucléaires à faible teneur en DNA
(de fluo non nulle !!!)
et focaliser l’analyse sur les rares vrais noyaux
(de fluo supérieure)
Photocathode
Dynode
Anode
+ 700 volts
Un photon
106 électrons
Tension PMT0-1000 volts
0
10Seuil (Threshold)
Mesure
Volts
Amplification:Gain X1 à X16, Log
ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)
Résumé:
1) PMT voltage, déterminel’amplification primaire de la fluorescence
2) Le GAIN,Amplification secondaireLIN (DNA) ou LOG (Immuno)Les scatters sont souvent LIN
3) Le SEUIL:Toujours utilisé en Scatter FSC; parfois (jamais) utilisé en fluorescence
0
10
Mesure
Volts
ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)
0 200 400 600 800 1000
Classement
INTENSITE LUMINEUSE RELATIVE (Pas d’Unité )
NOMBRE De cellules
CLASSEMENT DES DONNEES
1) Le cytomètre ne capture que de la lumière2) Il sélectionne la couleur (longueur d’onde) grâce à des FILTRES
Bleu = ScattersVert, orange, rouge = Fluorescences
3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électriqueÀ l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences)
4) Les signaux sont amplifiés à l’aide:du PMT voltage (uniquement fluorescences)du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters)
5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général)
7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues: !! cytomètre = voltmètre !!
8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique (LIST MODE)
9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate »)
RESUME
1) Le cytomètre ne capture que de la lumière2) Il sélectionne la couleur grâce à des FILTRES
Bleu = ScattersVert, orange, rouge = Fluorescences
3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électriqueÀ l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences)
4) Les signaux sont amplifiés à l’aide:du PMT voltage (uniquement fluorescences)du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters)
5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général)
7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues.
8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique
9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate »)
VOUS Intervenez
à tous niveaux
CONCLUSION: le cytomètre donne TOUJOURS des résultats, quelque soit son état !!!
C’est de VOUS, qui intervenez à de nombreux niveaux, que dépend la validité des mesures.
NE PAS SE LAISSER GUIDER
PAR DES AUTOMATISMES PREPROGRAMMES
SANS LES AVOIR COMPRIS.
Intensité relative
Microscope Cytomètre à flux :
1
2
3
4
A
B A
B
B
A
Faisceau laser large Faisceau laser mince
A
B
Le cytomètre et le microscope: difficultés d’interprétations100.000
50.000
L’Analyse multicouleur: le problème des compensations dans le couple FITC - PE
.BP575/42BP530/30
Longueur d'onde (nm)
Fluorescence (intensité relative)
FITC émet une fluorescence de prédominanceverte à nos yeux, et majoritairement détectéepar le PMT 1.En réalité, l'émission se poursuit dans lerouge et contamine le détecteur PMT2:
On parle de "fuite optique" ou de"contamination optique" qui toucheTOUS les détecteurs à des degrés divers:
en général, PMT2 reçoit 25 à 35% du signalPMT1
PMT1 PMT2Le problème des fuites optiques:Les compensations de 2 couleurs
.BP575/42BP530/30
Longueur d'onde (nm)
Fluorescence (intensité relative)
PE émet une fluorescence de prédominanceorange à nos yeux, et majoritairement détectéepar le PMT 2.En réalité, l'émission commence dans lejaune-vert et contamine le détecteur PMT1, etcontinue dans le rouge et contamine un PMT3éventuel....
On parle de "fuite optique" ou de"contamination optique" qui toucheTOUS les détecteurs à des degrés divers:
en général, PMT1 reçoit moins de 2% du signalPMT2.
PMT1 PMT2
FITC R-PEBP575/42
BP530/30
Longueur d'onde (nm)F
luo
resce
nce
(inte
nsité
rela
tive)
400 450 500 550 600 650 700UV IR
FL2= FL2-30%FL1FL1=FL1-2%FL2
La compensationélectronique:Pour chaque celluleet chaque fluorescenceon retranche la fractioncontaminante que VOUSavez déterminée.
Compensations optimalesPas decompensation
Trop de compensations
1 2
3 4
FL2
FL1N
Pas de compensation Compensations optimales
Trop compensé
PMT FL1= 900 VPMT FL2 = 550 V
Disproportion des signaux: Compensation difficile ou impossible
Plus de 70 % de contamination
Mauvais !!Les PMT doivent êtreÀ un voltage plus ou moins Égaux.
CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX
1. ANALYSE
2. TRI CELLULAIRE
3. APPLICATIONS
++
+
+++
Filtresoptiques
Détecteurs defluorescences
Miroirs dichroïques
LASER
Suspension cellulaire
Liquide degaine
Chambre de flux
Interceptionlaser-flux:région d'analyse
Formation desgouttes:région de tri
-2500 Volts +2500 Volts
---
Cellules triées Cellules triéesPoubelle
Plaques de charge:
Barre d'obscurationDétecteur dediffusionaxiale, FSC
Détecteurde diffusionorthogonale, SSC
.
Z
Qu
artz
Ao
ro r
Tri cellulaire: formation des gouttes
La longueur de la partie intacte du jet
est fonction de l’AMPLITUDE de
l’oscillation que VOUS donnez au qartz:
elle doit être la plus courte possible, mais pas au point de déformer les « scatters »
La distance qui sépare deux gouttes (=)
Est fonction de la FREQUENCE de
l’oscillation que VOUS donnez au qartz.
AMPLITUDE et FREQUENCE
L’analyse d’une cellule ET
la décision de tri se passent ici
La même cellule sera enfermée dans unegoutte qui se forme PLUS TARD:La charge de la goutte se fera ici
DELAI DE CHARGE d’une goutte =Le temps que met une cellule pour aller du point d’analyse à la formation de la goutte
LE DELAI DE CHARGE: définition
110 microsecondes séparent l’analyse du tri: C’est le temps que doit attendre le cytomètre entre analyseet tri d’une cellule donnée.La procédure est séquentielle, et non simultanée:pour chaque cellule il y a analyse et ensuite tri
0,25 mm
Sommet du gicleur
Impact laser
Distance 'D'mesurée
Distance 'D'
reportée
==> Délai de charge =temps de formation de
11.75 gouttes
Goutte n°1
Lien
ESTIMATION DU DELAI DE CHARGE
?
Temps 0 Temps 1A B
Temps 0 Temps 1
La position d’une cellule dans le flux est incertaine
Pour cette raison, on dévie un TRAIN de 3 gouttes successives pourchaque cellule triée: 1) la probabilité que la cellule désirée soit présentedans l’une des gouttes du train est très grande.2) La probabilité qu’il y ait plus d’une cellule par train est faible maisn’est pas nulle: c’est une coïncidence qu’il faudra détecter et rejeter du tri.
.
temps
Am
plitudeVolts
A
B
L’onde de charge (A) et l’onde de fragmentation du flux (B) sont physiquement indépendantes: elles DOIVENT être mises en phaseafin que chaque goutte soit correctement chargée puis déviée.
Gicleur
Champ électrique
3 jets cohérents:phase correcte
Multitude de jets:déphasage important
Flux
Goutte principaleGoute satellite
Satellite lent……rattrapé parLa goutte principale
Temps 1
Temps 2
T e m p s 0T e m ps 1 :
S ate l l i tele nt
Tem ps 1 :
S ate l l i terap ide
L i e n
C harg e né g ativ eC harg e nulle C harg e nulle
1
1
C A B
S a te l l i te l e n t rattrapé par la g o utte suiv ante
A
B C
D E3
THYMUS DE SOURIS ADULTE: TRI DES 4 SOUS-POPULATIONS DE CELLULES T
TRI DE MASSE: ON RECOLTE UN MAXIMUM DE CELLULES
Clones
Lignée MP2
4
3
2
1
- + +-Lyt-2 (CD8) L3T4 (CD4)
CLONAGE DE CELLULES PAR CYTOMETRIE EN FLUX:
Le clonage démontre que la cytométrie en flux est une méthode
-Non destructive, la cellule est intacte et reste en vie …-Propre, les conditions d’aseptie peuvent être réunies….
Temps mort et coïncidences
Temps mort du cytomètre: temps minimal incompressible, nécessaire à la détection, l’analyse et le tri d’UNE cellule
Durant ce temps, le cytomètre est exclusivement consacré à ces tâches:Le traitement de LA cellule en cours.
Si une seconde cellule arrive dans le cytomètre déjà occupé à traiterune première cellule, cette seconde cellule est dite « en coincidence » .
La cellule en coincidence peut être détectée mais pas analysée(ni triée), ou même peut ne pas être vue du tout !!!
Certaines coincidences sont détectables et bien gérées par le cytomètre quirejettera du tri l’ensemble des cellules concernées: cas du train de gouttes à plus d’une cellule.
Tout OKCoïncidenced’analyse
Coïncidencede tri
Agrégat:erreur
Coïncidences:
Certaines cellules sont détectées mais pas analyséesou analysées mais pas triées…Ou ne sont JAMAIS VUES !!!
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
110
90
70
50
30
10
1000 2000 3000 4000 5000
Ci
Débit cellulaire, U
FREQUENCE DES COÏNCIDENCES
Ci = 1 - exp ( - t . U )
85 75
65
55
45
35
25
15
5
6.000
4.000
2.000
00 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000
Rs
U
TRI DE CELLULES RARES: CONTRÔLE DE QUALITE
1% >99 %
CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX
1. ANALYSE
2. TRI CELLULAIRE
3. APPLICATIONS
500 600 700 (nm)
100
FITC R-PE 7-AAD
Marquent 2 protéines de surface Marque l'ADN total
ANALYSE SIMULTANEE DE 3 FLUORESCENCES
Cytométrie à 3 couleurs: Double phénotype corrélé au DNA
CD4CD8
DN
A
0 0
3 antigènes,3 anticorps.
R-PE
FITC
Biotine(Strept)-Avidine
Texas Red™ou Cyanines-5Cellule
LASER
TRANSFERT D'ENERGIE
FLUORESCENCE VERTE,520 nm
FLUORESCENCE ORANGE,575 nm
FLUORESCENCE ROUGE,>620 nm
Triple immunophénotype: Le diagramme de dispersion 3-D
500 600 700 (nm)l
FITC R-PE R-PE*TR APC PerCP
100
Excitation:
Emission:
UNE COMBINAISON POSSIBLE D'ANALYSE SIMULTANEE DE 5 FLUORESCENCES
PAR CYTOMETRIE EN FLUX - NECESSITE DE 2 LASERS.
FLUX
LASER #2
LASER #1
FSC
SSC
APC
FITC
LE CYTOMETRE A DEUX LASERS
Flux
Laser 1: 488 nm
Laser 2: 647 nm
MD 560 LP
MD 610 LP
MD 90/10
1/2 miroir
BP 530/30Fluo-3 / Fitc
BP 575/30R-PE
BP 670/14APC
BP 675/20PerCP
BP 488/10SSC
BP 488/10FSC
Deux fluorescences similaires (APC et PerCP) sont spatio-temporellement séparées dans un cytomètre bi-lasers.
Laser 1
Laser 2
0 5 10 15 20 Microsecondes
FSC
FL1
FL2
Time-gating: le signal FL2 du laser 2 est séparé Spatio-temporellement des signaux FSC-FL1 du laser 1
Laser 1
Laser 2
0 5 10 15 20 Microsecondes
FSC
FL1
FL2
Time-gating: conséquence : APC de meme couleur de fluorescence que PerCP est néanmoins distinctement analysé car 20 microsecondesséparent les deux émissions ET que 0,25 mm séparent les deux impacts lasers sur le flux.
PerCP
APC
R1
NOT R1
FSC
FL1
TIME(secondes)
0 512
0 256
Le paramètre "Temps"comme contrôle de qualité
Fluo-3/AM liposoluble
incapable de fixer Ca2+
Fluo-3/AM
séquestration
Mitochondries,RE.
Estérases cellulaires
Fluo-3hydrosoluble,fluorescence faible
[Ca2+] i
Fluo-3-[Ca2+] ifluorescence multipliée, X40
Fuites
[Ca2+]o
N
OCH2CH
2O
CN
CC COO O
O
OO
OCa
2 +
O
O O
ClCl CH3
OEmission 530 nm
Les flux calciques