La cytométrie en flux est une technologie qui permetl'analyse quantitative, non destructive et rapidede cellules isolées considérées individuellement:

100.000 cellules par minute

Le cytomètre à flux détecte la fluorescence de marqueursmoléculaires présents à la surface ou à l'intérieur des cellules:

- Marqueurs membranaires révélés par immunofluorescence:- Leucémies, typage lymphocytaire, immunophénotype

- Marqueurs nucléaires révélés par une sonde fluorescente:

- Quantification des acides nucléiques (ADN, ARN)- Cinétique cellulaire des tumeurs.

Certains cytomètres à flux sont aussi des trieurs de cellulesqui sont alors récoltées, intactes, avec un très haut degré de pureté

CYTOMETRIE EN FLUX: DEFINITION ET APPLICATIONS CLINIQUES

L’analyse (et le tri) ne se limite pas aux cellules humaines:Toute particule ISOLEE d’une taille supérieure au micron mais inférieure à 400 microns peut être considérée:

Bactéries plaquettes chromosomes isolés (= cytogénétique en flux)MitochondriesChampignons unicellulaires, levuresLeucocytesPhytoplanctonProtoplaste végétalFDC

L’obligation d’obtenir des suspensions cellulaires monodisperséesimplique la destruction de l’organisation tissulaire:

La perte du microenvironnement et des relations histologiques estun défaut majeur de la cytométrie en flux

Solution: réaliser les mêmes études (sauf le tri) par la technologie complémentaire à la cytométrie en flux:

La cytométrie d’images

alliant microscopes , caméras, morphologie mathématiqueet informatique

CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX

1. ANALYSE

2. TRI CELLULAIRE

3. APPLICATIONS

Un cytofluorimètre-trieur à flux

Echantillon

Liquide de gaine

InjecteurUne cellule

Gicleur

Faisceau laser

Liquide de gaine

Veine porteuse

(diamètre 70 µm)

(diamètre 10 µm)

= Flux

+

Diffusion lumineuse,"Ombre portée""Taille cellulaire"

Fluorescence

Le gicleur(« nozzle= tuyère »)

Les cellules sont injectéesen file indienne et traversent un laserUNE à UNE.

régime laminaire régime turbulent

ligne de flux

FOCALISATION HYDRODYNAMIQUE

La grande force de la cytométrie est de considérer chaque cellule

INDIVIDUELLEMENT

Le cytomètre peut alors:

Faire la différence entre un marqueur faiblement exprimé parune grande partie d’une population cellulaire

et l’expression forte de ce même marqueur par une minorité de cellules

Le cytomètre peut aussi:

Détecter, analyser et trier des cellules rares dont l’intérêt biologiquepeut être considérable.

FACTEURS ENDOGENES

TISSU NORMAL

"CIBLE"

FACTEURS EXOGENES

CARCINOGENES

CELLULES

PRENEOPLASIQUES

CELLULES

NEOPLASIQUESINVASION

METASTASES

FACTEURS ENDOGENES

MODULATION

PROMOTION

FACTEURS EXOGENES

PROMOTION

INITIATION PROGRESSION

1 – 1000 cellules ?? XXX Millions cellulesCellules rares

Cancérogenèse

0 10-15 ans

Le cytomètre mémorise TOUS les paramètres de CHAQUE celluleconsidérée INDIVIDUELLEMENT dans une LISTE INFORMATIQUE (list mode)Une cellule différente de 10.000 à 30.000 autres cellules

peut être retrouvée dans cette liste et analysée Dans ce graphique, chaque point représente UNE cellule:Sur 100.000 cellules, 14 cellules différentes sont repérées.

Témoin Traité

Faisceau laser

Diffusion lumineuse,"Ombre portée""Taille cellulaire"

Fluorescence

Quels sont les paramètresétudiés en cytométrie ?

1) La diffusion lumineuse« Scatters »(diffraction, réflexion, réfraction),TOUJOURS émise)

2) Les émissions de fluorescence

(SI il y a une sonde excitable par le laser)

Diffusion lumineuse axiale:La réflexion et diffraction dominent.

"Forward Scatter, FSC"

Ombre cellulaire,taille relative de la cellule

Diffusion lumineuse orthogonale:La réfraction domine"Side Scatter, SSC"

Texture cellulaire,granularité.

Les « Scatters » : une lumière diffusée DE MEME COULEUR que lelaser incident, dont l ’intensité est proportionnelle à la taille (FSC) ouà la granularité (SSC) cellulaire.

Le diagramme de dispersion (« Dot plot »)

Les scatters sont TOUJOURS émis, même en l’absence de fluorescence.FSC et SSC sont les deux paramètres discriminants fondamentaux.

Les Fluorescences sont émises dans TOUTES les directions; elles sont toujours de couleur différente de celle du laser.

La couleur est fonction de la nature de la sonde fluorescenteL ’intensité de fluorescence est proportionnelle au nombre de molécules-sondes fixées sur la cellule, et donc au nombre de récepteurs-cibles.

Un anticorps « vert » reconnaitra un récepteurmembranaire.

Une sonde « rouge »quantifiera l ’ADN

700600

478

438

672

500400300 800 nm

Déplacement de Stockes

ABSORPTION ET FLUORESCENCE DE PerCP (Peridinine chlorophyll –-protein complex)

a.u

FITC TR R-PE Tandem R-PE*TR

PI 7-AAD B-PE APC

PRINCIPAUX FLUOROCHROMES UTILISES EN CYTOMETRIE EN FLUX

Les « Fluorescences » et « Scatters » sont SIMULTANEMENTémis dans toutes les directions. Par construction, le cytomètre « regarde »À zéro degré (FSC) et à 90 degrés (SSC et Fluorescences)

Détecteurs SSC et fluos

Détecteur FSC

.

0 255

100

intensité relative

nom

bre

de

cell

ule

s

petites cellules

grandes cellules

structure homogène

structure granuleuse

brillance faible

brillance élevée

Diffusion axiale Diffusion orthogonale Fluorescence

Interprétation d ’un histogramme selon le paramètre mesuré

Le diagramme de densité (numérique): chaque carré représente un GROUPE de cellules, le nombre de cellules du groupe est donné par une FAUSSE COULEUR

<10

10-100

100-500

500-2000

2000-5000

5000-10000

> 10000

R1 R1

FSC FSC

FL1 FL1

FSC FSC

FL1 FL1Données brutes Données sélectionnées

LA SELECTION INFORMATIQUE DES DONNEES

La fenêtre R1 estVOTRE choix !!!

Se tromper conduità des analyses Invalides.

Filtres

optiques

Détecteurs de

fluorescences

Miroirs dichroïques

LASER

Suspension cellulaire

Liquide de

gaine

Chambre de flux

Interception laser-Flux= Point d’analyse

Barre d'obscurationDétecteur de

Diffusion axiale, FSC

Détecteur

de diffusion

orthogonale , SSC

Le cytomètre –analyseur.

.

100

% transm

ission

100

100

% transm

ission

100

Passe-haut Passe-bas

Bande passante Filtre de densité

50

50

10

Les filtres optiques:

520488

575

Miroir DichroïqueDM 560 LP:Plaçé à 45°,Il est transparentAux ondes < 560 nmet réfléchit les ondes > 560 nm

BP 520

BP 575

620

Les filtres BPsélectionnent la bonnefluorescence et sontLe dernier rempartavant les détecteurs

FITC

R-PE

Veine porteuse

Une cellule

1,00

0,00

0,95

0,56

1,00

0,99

0,97

Laser #1

Laser #2

Laser #3

ALIGNEMENT LASER - FLUX

A: Injection lente B: Injection rapide

Laser

Injecteur

Veine porteuse:

mince large

Gicleur

Une cellule

Trajectoire précise, linéaire, homogène Trajectoire erratique

A B

C D

a

b

c

d

FSC

FL1

FSC

N

Alignement laser/flux et vitesse d ’injection: deux réglages fondamentaux

A: optimal B: injection rapide

C: flux désaligné D: bouchon

Détection et traitement des impulsions lumineuses.

Chaque cellule, durant son bref passage dans le laser, émet un flash de lumière par paramètre étudié:

-Un flash de scatter axial et orthogonal (il existe des scatters sous d’autres angles, non considérés içi)

-Un ou plusieurs flash de fluorescences.

Ces flash ou impulsions ne sont pas quelconques:

-Leur durée est égale au temps de passage de la cellule dans le laser (temps de vol moyen: 10 microsecondes)

-Leur intensité VARIE tout au cours de la traversée du laser !!!!

.

0

10

niveau de seuil

niveau de bruit de fond

inten

sité

Direction du flux

section dufaisceau laser

une cellule

Temps de vol(microsec.)

0

Amplitude mesurée

10

Les impulsions: chaque cellule émet un « flash » de lumièredont l’amplitude maximale est atteinte au centre du laser et mesurée à cet instant…

.

0

10

niveau de seuil

niveau de bruit de fond

inten

sité

Direction du flux

section dufaisceau laser

une cellule

Temps de vol(microsec.)

0

Amplitude mesurée

10

La cellule est très petite comparéeau laser:

Le cytomètre, qui n’est pas équipéd’un objectif de microscope puissant, ne peut pas faire la différence entre une fluorescence nucléaire etune fluorescence de surface:

La cellules est considérée comme un point mathématique sans structureapparente.

Le cytomètre « voit » la quantité totalede lumière émise par une cellule morphologiquement non résolue

On dit que le cytomètre travaille àLa résolution zéro.

RESOLUTION ZERO

Photodiode

Filtre neutre 10%

Le détecteur de « Scatter axial »(FSC): une simple photodiode.

BarreD’obscuration

FSC

Laserdirect

électrons

électrons

Photocathode

Dynode

AnodeUn photon

10 6 électrons

+ 700 voltsTension PMT0-1000 volts

Le détecteur de fluorescence: Un tube photomultiplicateur (PMT)un amplificateur de lumière: UN photon génère un million d’électrons.

Impulsion de scatter: Jamais nulle.

Impulsion de fluorescence élevée

La fluorescence peut être nulle (=sous le seuil de détection)

Temps de vol (microsec)

Volts (0-10)

LES IMPULSIONS LUMINEUSES SONT CONVERTIES EN IMPULSIONS ELECTRIQUES

Le cytomètre: quelques chiffres….

Sensibilité: moins de 1000-3000 molécules fluorescentes par cellule.

Soit moins de 300-1000 récepteurs antigéniques par cellule(un anticorps par récepteur et 3 molécules FITC par anticorps)

Une cellule « positive » exprime en général de 50.000 à quelques MILLIONSde récepteurs cibles.

Une cellule négative émet une AUTOFLUORESCENCE naturelleéquivalent à 10.000-30.000 molécules FITC.

Corollaire: une cellule déclarée « négative » peut en réalitéexprimer un à plusieurs millier de récepteurs antigéniques, non détectés car situéssous le seuil de détection, ou sous le niveau d’autofluorescence naturelle.

==> La limite n ’est pas le cytomètre mais bien le matériel biologique.

La sensibilité d’un cytomètre varie selon la nature des fluorochromes:Il sera plus sensible avec PE qui brille 40 x plus que FITC.

Photocathode

Dynode

Anode

+ 700 volts

Un photon

106 électrons

Tension PMT0-1000 volts

0

10Seuil (Threshold)

Mesure

Volts

Amplification:Gain X1 à X16, Log

ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)

Le GAIN: Une amplificationsecondaire

Linéaire ou logarithmique.

0 50 100 150 200 250

0 50 100 150 200 250

GAIN 2.5

GAIN 5.0

AMPLIFICATION LINEAIRE: LE GAIN S’UTILISE COMME UN ZOOM

PopulationsHors échelle en Mode LIN

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Photocathode

Dynode

Anode

+ 700 volts

Un photon

106 électrons

Tension PMT0-1000 volts

0

10Seuil (Threshold)

Mesure

Volts

Amplification:Gain X1 à X16, Log

ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)

Le seuil de sensibilité:Souvent posé sur le scatteraxial (FSC), il permet au cytomètre de ne PAS « voir »des particules trop petites.

Le seuil ne peut jamais êtremis à zéro: à vérifier si votrecytomètre semble « aveugle »

0

10

niveau deseuil

Temps de vol(microsec.)

0

Amplitudemesurée

10

Volts

0

niveau deseuil

Temps de vol(microsec.)

0

Amplitudemesurée

10

Volts

FSC

FSC

10

Le niveau de seuilcorrectement ajustépermet de détecter, ou ignorer,des particules de tailledonnée…

Plaquettes Lymphocytes

Presque toujours placé sur FSC,

le seuil peut parfois être posé sur une fluorescence,

par ex.

1) pour ignorer des cellules négatives majoritaires et repérer de rares cellules positives…par exemple pour les trier.

Corollaire: vous ne pouvez plus calculer le % de cellules marquées, mais juste les repérer pour la pose d’une fenêtre de tri.

2) Pour ignorer les trop nombreux débris nucléaires à faible teneur en DNA

(de fluo non nulle !!!)

et focaliser l’analyse sur les rares vrais noyaux

(de fluo supérieure)

Photocathode

Dynode

Anode

+ 700 volts

Un photon

106 électrons

Tension PMT0-1000 volts

0

10Seuil (Threshold)

Mesure

Volts

Amplification:Gain X1 à X16, Log

ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)

Résumé:

1) PMT voltage, déterminel’amplification primaire de la fluorescence

2) Le GAIN,Amplification secondaireLIN (DNA) ou LOG (Immuno)Les scatters sont souvent LIN

3) Le SEUIL:Toujours utilisé en Scatter FSC; parfois (jamais) utilisé en fluorescence

0

10

Mesure

Volts

ConvertisseurAnalogique => Digital0 volts => canal 010.23 volts => canal 1.023 (ou 255)

0 200 400 600 800 1000

Classement

INTENSITE LUMINEUSE RELATIVE (Pas d’Unité )

NOMBRE De cellules

CLASSEMENT DES DONNEES

1) Le cytomètre ne capture que de la lumière2) Il sélectionne la couleur (longueur d’onde) grâce à des FILTRES

Bleu = ScattersVert, orange, rouge = Fluorescences

3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électriqueÀ l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences)

4) Les signaux sont amplifiés à l’aide:du PMT voltage (uniquement fluorescences)du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters)

5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général)

7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues: !! cytomètre = voltmètre !!

8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique (LIST MODE)

9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate »)

RESUME

1) Le cytomètre ne capture que de la lumière2) Il sélectionne la couleur grâce à des FILTRES

Bleu = ScattersVert, orange, rouge = Fluorescences

3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électriqueÀ l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences)

4) Les signaux sont amplifiés à l’aide:du PMT voltage (uniquement fluorescences)du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters)

5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général)

7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues.

8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique

9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate »)

VOUS Intervenez

à tous niveaux

CONCLUSION: le cytomètre donne TOUJOURS des résultats, quelque soit son état !!!

C’est de VOUS, qui intervenez à de nombreux niveaux, que dépend la validité des mesures.

NE PAS SE LAISSER GUIDER

PAR DES AUTOMATISMES PREPROGRAMMES

SANS LES AVOIR COMPRIS.

Intensité relative

Microscope Cytomètre à flux :

1

2

3

4

A

B A

B

B

A

Faisceau laser large Faisceau laser mince

A

B

Le cytomètre et le microscope: difficultés d’interprétations100.000

50.000

L’Analyse multicouleur: le problème des compensations dans le couple FITC - PE

.BP575/42BP530/30

Longueur d'onde (nm)

Fluorescence (intensité relative)

FITC émet une fluorescence de prédominanceverte à nos yeux, et majoritairement détectéepar le PMT 1.En réalité, l'émission se poursuit dans lerouge et contamine le détecteur PMT2:

On parle de "fuite optique" ou de"contamination optique" qui toucheTOUS les détecteurs à des degrés divers:

en général, PMT2 reçoit 25 à 35% du signalPMT1

PMT1 PMT2Le problème des fuites optiques:Les compensations de 2 couleurs

.BP575/42BP530/30

Longueur d'onde (nm)

Fluorescence (intensité relative)

PE émet une fluorescence de prédominanceorange à nos yeux, et majoritairement détectéepar le PMT 2.En réalité, l'émission commence dans lejaune-vert et contamine le détecteur PMT1, etcontinue dans le rouge et contamine un PMT3éventuel....

On parle de "fuite optique" ou de"contamination optique" qui toucheTOUS les détecteurs à des degrés divers:

en général, PMT1 reçoit moins de 2% du signalPMT2.

PMT1 PMT2

FITC R-PEBP575/42

BP530/30

Longueur d'onde (nm)F

luo

resce

nce

(inte

nsité

rela

tive)

400 450 500 550 600 650 700UV IR

FL2= FL2-30%FL1FL1=FL1-2%FL2

La compensationélectronique:Pour chaque celluleet chaque fluorescenceon retranche la fractioncontaminante que VOUSavez déterminée.

Compensations optimalesPas decompensation

Trop de compensations

1 2

3 4

FL2

FL1N

Pas de compensation Compensations optimales

Trop compensé

PMT FL1= 900 VPMT FL2 = 550 V

Disproportion des signaux: Compensation difficile ou impossible

Plus de 70 % de contamination

Mauvais !!Les PMT doivent êtreÀ un voltage plus ou moins Égaux.

CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX

1. ANALYSE

2. TRI CELLULAIRE

3. APPLICATIONS

++

+

+++

Filtresoptiques

Détecteurs defluorescences

Miroirs dichroïques

LASER

Suspension cellulaire

Liquide degaine

Chambre de flux

Interceptionlaser-flux:région d'analyse

Formation desgouttes:région de tri

-2500 Volts +2500 Volts

---

Cellules triées Cellules triéesPoubelle

Plaques de charge:

Barre d'obscurationDétecteur dediffusionaxiale, FSC

Détecteurde diffusionorthogonale, SSC

.

Z

Qu

artz

Ao

ro r

Tri cellulaire: formation des gouttes

La longueur de la partie intacte du jet

est fonction de l’AMPLITUDE de

l’oscillation que VOUS donnez au qartz:

elle doit être la plus courte possible, mais pas au point de déformer les « scatters »

La distance qui sépare deux gouttes (=)

Est fonction de la FREQUENCE de

l’oscillation que VOUS donnez au qartz.

AMPLITUDE et FREQUENCE

L’analyse d’une cellule ET

la décision de tri se passent ici

La même cellule sera enfermée dans unegoutte qui se forme PLUS TARD:La charge de la goutte se fera ici

DELAI DE CHARGE d’une goutte =Le temps que met une cellule pour aller du point d’analyse à la formation de la goutte

LE DELAI DE CHARGE: définition

110 microsecondes séparent l’analyse du tri: C’est le temps que doit attendre le cytomètre entre analyseet tri d’une cellule donnée.La procédure est séquentielle, et non simultanée:pour chaque cellule il y a analyse et ensuite tri

0,25 mm

Sommet du gicleur

Impact laser

Distance 'D'mesurée

Distance 'D'

reportée

==> Délai de charge =temps de formation de

11.75 gouttes

Goutte n°1

Lien

ESTIMATION DU DELAI DE CHARGE

?

Temps 0 Temps 1A B

Temps 0 Temps 1

La position d’une cellule dans le flux est incertaine

Pour cette raison, on dévie un TRAIN de 3 gouttes successives pourchaque cellule triée: 1) la probabilité que la cellule désirée soit présentedans l’une des gouttes du train est très grande.2) La probabilité qu’il y ait plus d’une cellule par train est faible maisn’est pas nulle: c’est une coïncidence qu’il faudra détecter et rejeter du tri.

.

temps

Am

plitudeVolts

A

B

L’onde de charge (A) et l’onde de fragmentation du flux (B) sont physiquement indépendantes: elles DOIVENT être mises en phaseafin que chaque goutte soit correctement chargée puis déviée.

Gicleur

Champ électrique

3 jets cohérents:phase correcte

Multitude de jets:déphasage important

Flux

Goutte principaleGoute satellite

Satellite lent……rattrapé parLa goutte principale

Temps 1

Temps 2

T e m p s 0T e m ps 1 :

S ate l l i tele nt

Tem ps 1 :

S ate l l i terap ide

L i e n

C harg e né g ativ eC harg e nulle C harg e nulle

1

1

C A B

S a te l l i te l e n t rattrapé par la g o utte suiv ante

A

B C

D E3

THYMUS DE SOURIS ADULTE: TRI DES 4 SOUS-POPULATIONS DE CELLULES T

TRI DE MASSE: ON RECOLTE UN MAXIMUM DE CELLULES

Clones

Lignée MP2

4

3

2

1

- + +-Lyt-2 (CD8) L3T4 (CD4)

CLONAGE DE CELLULES PAR CYTOMETRIE EN FLUX:

Le clonage démontre que la cytométrie en flux est une méthode

-Non destructive, la cellule est intacte et reste en vie …-Propre, les conditions d’aseptie peuvent être réunies….

Temps mort et coïncidences

Temps mort du cytomètre: temps minimal incompressible, nécessaire à la détection, l’analyse et le tri d’UNE cellule

Durant ce temps, le cytomètre est exclusivement consacré à ces tâches:Le traitement de LA cellule en cours.

Si une seconde cellule arrive dans le cytomètre déjà occupé à traiterune première cellule, cette seconde cellule est dite « en coincidence » .

La cellule en coincidence peut être détectée mais pas analysée(ni triée), ou même peut ne pas être vue du tout !!!

Certaines coincidences sont détectables et bien gérées par le cytomètre quirejettera du tri l’ensemble des cellules concernées: cas du train de gouttes à plus d’une cellule.

Tout OKCoïncidenced’analyse

Coïncidencede tri

Agrégat:erreur

Coïncidences:

Certaines cellules sont détectées mais pas analyséesou analysées mais pas triées…Ou ne sont JAMAIS VUES !!!

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

110

90

70

50

30

10

1000 2000 3000 4000 5000

Ci

Débit cellulaire, U

FREQUENCE DES COÏNCIDENCES

Ci = 1 - exp ( - t . U )

85 75

65

55

45

35

25

15

5

6.000

4.000

2.000

00 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000

Rs

U

TRI DE CELLULES RARES: CONTRÔLE DE QUALITE

1% >99 %

CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX

1. ANALYSE

2. TRI CELLULAIRE

3. APPLICATIONS

500 600 700 (nm)

100

FITC R-PE 7-AAD

Marquent 2 protéines de surface Marque l'ADN total

ANALYSE SIMULTANEE DE 3 FLUORESCENCES

Cytométrie à 3 couleurs: Double phénotype corrélé au DNA

CD4CD8

DN

A

0 0

3 antigènes,3 anticorps.

R-PE

FITC

Biotine(Strept)-Avidine

Texas Red™ou Cyanines-5Cellule

LASER

TRANSFERT D'ENERGIE

FLUORESCENCE VERTE,520 nm

FLUORESCENCE ORANGE,575 nm

FLUORESCENCE ROUGE,>620 nm

Triple immunophénotype: Le diagramme de dispersion 3-D

500 600 700 (nm)l

FITC R-PE R-PE*TR APC PerCP

100

Excitation:

Emission:

UNE COMBINAISON POSSIBLE D'ANALYSE SIMULTANEE DE 5 FLUORESCENCES

PAR CYTOMETRIE EN FLUX - NECESSITE DE 2 LASERS.

FLUX

LASER #2

LASER #1

FSC

SSC

APC

FITC

LE CYTOMETRE A DEUX LASERS

Flux

Laser 1: 488 nm

Laser 2: 647 nm

MD 560 LP

MD 610 LP

MD 90/10

1/2 miroir

BP 530/30Fluo-3 / Fitc

BP 575/30R-PE

BP 670/14APC

BP 675/20PerCP

BP 488/10SSC

BP 488/10FSC

Deux fluorescences similaires (APC et PerCP) sont spatio-temporellement séparées dans un cytomètre bi-lasers.

Laser 1

Laser 2

0 5 10 15 20 Microsecondes

FSC

FL1

FL2

Time-gating: le signal FL2 du laser 2 est séparé Spatio-temporellement des signaux FSC-FL1 du laser 1

Laser 1

Laser 2

0 5 10 15 20 Microsecondes

FSC

FL1

FL2

Time-gating: conséquence : APC de meme couleur de fluorescence que PerCP est néanmoins distinctement analysé car 20 microsecondesséparent les deux émissions ET que 0,25 mm séparent les deux impacts lasers sur le flux.

PerCP

APC

R1

NOT R1

FSC

FL1

TIME(secondes)

0 512

0 256

Le paramètre "Temps"comme contrôle de qualité

Fluo-3/AM liposoluble

incapable de fixer Ca2+

Fluo-3/AM

séquestration

Mitochondries,RE.

Estérases cellulaires

Fluo-3hydrosoluble,fluorescence faible

[Ca2+] i

Fluo-3-[Ca2+] ifluorescence multipliée, X40

Fuites

[Ca2+]o

N

OCH2CH

2O

CN

CC COO O

O

OO

OCa

2 +

O

O O

ClCl CH3

OEmission 530 nm

Les flux calciques