Sécurité et Sécurité et cytométrie en fluxcytométrie en flux

Formation permanente Marseille 23 novembre 2007

Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines CNRS UMR 6117 163 Avenue de Luminy - Case 901- Bât TPR1, 13288 Marseille cedex 9

Tél. : (+33) 4.91.82.91.14 Fax : (+33) 4.91.82.96.41

Contact : gerald.gregori@univmed.fr

Adapté du Cours de Cytométrie organisé dans le cadre du congrès ISAC (Québec, 2006) par G. Grégori et L. Krebs (Elly Lilly, USA)

Gérald Grégori

Les risquesLes risques

Risques biologiquesRisques biologiques

Risques électriquesRisques électriques

Irradiation par les LASERSIrradiation par les LASERS

Source:http://www.compliancesigns.com/

Risques biologiquesRisques biologiques

Risques biologiques

Sources communes de risques Sources communes de risques biologiques en cytométrie en fluxbiologiques en cytométrie en flux

Echantillons frais (non fixés)Echantillons frais (non fixés) Matériel humain ou animal (singes, porcs)Matériel humain ou animal (singes, porcs) Vecteurs viraux pour transfections génétiquesVecteurs viraux pour transfections génétiques Transmission de maladies entre espècesTransmission de maladies entre espèces Pathogènes résistants aux traitementPathogènes résistants aux traitement OGMOGM Certains virus carcinogènes (hépatite)Certains virus carcinogènes (hépatite)

Fausses idées préconçuesFausses idées préconçues

Le matériel non humain/primate ne présente Le matériel non humain/primate ne présente pas de risquepas de risque

Les échantillons préparés pour les analyses de Les échantillons préparés pour les analyses de virus HIV ou Hépatite, & autres maladies sont virus HIV ou Hépatite, & autres maladies sont sûrssûrs

Les cellules issues de cultures ne présentent Les cellules issues de cultures ne présentent pas de risquepas de risque

Impossible d’obtenir un soutien institutionnel Impossible d’obtenir un soutien institutionnel pour améliorer les procédures de manipulation pour améliorer les procédures de manipulation des échantillonsdes échantillons

Le risque induit par les aérosols Le risque induit par les aérosols générés lors du tri générés lors du tri

(buse Jet-in-air)(buse Jet-in-air)

Génération de gouttelettes Génération de gouttelettes “Normales”“Normales”

Petites (40-200Petites (40-200µµm)m) Micro (3-7Micro (3-7µµm)m)

Le “splash” dans le réceptacle Le “splash” dans le réceptacle pour la collectepour la collecte

Problème instrumental Problème instrumental (bouchage)(bouchage)

Tri à haute vitesse / haute Tri à haute vitesse / haute pression augmente le risquepression augmente le risque

Perfetto et. al.,Cytometry A. 2003 Apr;52(2):122-30

Les aérosols : Les aérosols : Source de risque élevéSource de risque élevé

Quand risque d’infection potentiel :

-Niveaux plus élevés de confinement-Multiples barrières secondaires

pour empêcher le dispersion et la propagation dans l’environnement

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Fourth Edition April 1999

Questions sur les risques Questions sur les risques biologiquesbiologiques

ISAC 2005 ISAC 2005 Surveillance Committee SurveySurveillance Committee Survey

Tri à haute vitesse dans 85% des labosTri à haute vitesse dans 85% des labos 65% des tris dans labos standards65% des tris dans labos standards <10% des tris se font en BioSafetyLevel (BSL) 3<10% des tris se font en BioSafetyLevel (BSL) 3 67% des labos ne mesurent pas la présence 67% des labos ne mesurent pas la présence

d’aérosolsd’aérosols Seulement 21% des tris nécessitent une formation Seulement 21% des tris nécessitent une formation

particulière pour du matériel potentiellement à risqueparticulière pour du matériel potentiellement à risque Seulement ~ 50% des labos utilisent un questionnaire Seulement ~ 50% des labos utilisent un questionnaire

pour identifier la nature et le risque des échantillons pour identifier la nature et le risque des échantillons avant d’accepter le tri.avant d’accepter le tri.

J.Lannigan Communication – Ingrid Schmid, UCLA, Chair, ISAC Biosafety Committee

Dépôts potentiels des aérosolsDépôts potentiels des aérosolsS

ourc

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/nio

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101)

Risque relatifRisque relatif

Tous les échantillons ont un niveau de risqueTous les échantillons ont un niveau de risque

Les manipulations doivent être appropriées au Les manipulations doivent être appropriées au risquerisque

Risque faible Risque faible – échantillons fixés – échantillons fixés Risque faible à modéré Risque faible à modéré – lignées cellulaires non-– lignées cellulaires non-

humaines/primates et non manipulées (BSL1)humaines/primates et non manipulées (BSL1) Risque élevé Risque élevé – lignées cellulaires humaines/primates, – lignées cellulaires humaines/primates,

manipulées génétiquement ou cellules infectées manipulées génétiquement ou cellules infectées (BSL1/2)(BSL1/2)

Risque le plus élevé Risque le plus élevé – matériel primaire – matériel primaire humain/primate (BSL2+), cellules infectées (BSL3)humain/primate (BSL2+), cellules infectées (BSL3)

Eléments de confinementEléments de confinement

Equipement –Barrière primaireEquipement –Barrière primaireLaboratoire –Barrière secondaireLaboratoire –Barrière secondaireManagement du labo & pratiqueManagement du labo & pratique

Equipement de sécuritéEquipement de sécurité

Equipement personnel de Equipement personnel de protectionprotection

Hotte de protection (Biosafety Hotte de protection (Biosafety Cabinet (BSC))Cabinet (BSC))

Confinement des aérosolsConfinement des aérosols

Equipement de protection Equipement de protection personnelpersonnel

Vêtements (blouse)Vêtements (blouse)GantsGantsProtection faciale (lunettes et masque)Protection faciale (lunettes et masque)Appareil respiratoireAppareil respiratoire

Confinement d’aérosolsConfinement d’aérosolsau niveau du cytomètre au niveau du cytomètre

Trieur MoFlo™ (DAKO)Trieur MoFlo™ (DAKO)

Trieur FACSAria™ (BD)Trieur FACSAria™ (BD)

Source: Cytek Development website

Confinement d’aérosolsConfinement d’aérosolsau niveau du cytomètre au niveau du cytomètre

FACStar Plus™ & FACSVantage SE™FACStar Plus™ & FACSVantage SE™

Eléments de confinementEléments de confinement Equipement –Barrière primaireEquipement –Barrière primaire

Laboratoire –Barrière secondaireLaboratoire –Barrière secondaire Protection de l’opérateurProtection de l’opérateur Protection des autres membres du laboratoireProtection des autres membres du laboratoire Protection de l’extérieur du laboratoireProtection de l’extérieur du laboratoire

Management du labo & pratiqueManagement du labo & pratique Questionnaire sur la nature des échantillonsQuestionnaire sur la nature des échantillons Traçabilité des échantillonsTraçabilité des échantillons Formation du personnelFormation du personnel Zones à accès règlementésZones à accès règlementés Bonnes pratiques de laboratoire (pipetage, nettoyage, etc.)Bonnes pratiques de laboratoire (pipetage, nettoyage, etc.) Gestion des déchets : javelliser les déchets; fixer les échantillons Gestion des déchets : javelliser les déchets; fixer les échantillons

(Formaldéhyde) (Formaldéhyde) Tests/détection de contaminationTests/détection de contamination Procédure de décontamination si besoin (Péroxide)Procédure de décontamination si besoin (Péroxide)

Choc électriqueChoc électrique

Electrical Shock

Source:http://www.compliancesigns.com/

Plaques électriques des trieurs Plaques électriques des trieurs électromagnétiquesélectromagnétiques

Courant ~10Courant ~10µA (3X inférieur au seuil de µA (3X inférieur au seuil de dangerosité humaine)dangerosité humaine)

Voltage ~0-4000 V Courant alternatifVoltage ~0-4000 V Courant alternatif

Source: www.dakousa.comSource: MoFlo Owners Handbook

Choc électrique : Arc électrique des Choc électrique : Arc électrique des trieurs électromagnétiques trieurs électromagnétiques

Génération d’un arc: résulte de plaques Génération d’un arc: résulte de plaques électriques humidesélectriques humides

Parade:Parade:Arrêter l’alimentation des plaquesArrêter l’alimentation des plaquesEnlever les plaques et les sécherEnlever les plaques et les sécherRemonter les plaques, reprendre le triRemonter les plaques, reprendre le tri

Source: www.scienceclarified.comIllustration of electric arc between two metals. Reproduced by permission of Photo Researchers, Inc.

Choc électrique issu de la Choc électrique issu de la charge du jetcharge du jet

Les trieurs appliquent une charge Les trieurs appliquent une charge électrique au jet pour dévier les électrique au jet pour dévier les gouttelettes à triergouttelettes à trierCharge ~Charge ~±200 V Courant alternatif±200 V Courant alternatifCharge au niveau de la Charge au niveau de la

chambre de fluxchambre de flux

Source: www.dakousa.com

Choc électrique au niveau du Choc électrique au niveau du cristal piézoélectriquecristal piézoélectrique

Charge sur le cristal Charge sur le cristal Piézoélectrique 135 V ACPiézoélectrique 135 V AC

Source: w

ww

.cytopeia.com

Irradiation par les lasersIrradiation par les lasers

Irradiation Laser Attention

Source:http://www.compliancesigns.com/

Le terme “LASER” est un Le terme “LASER” est un acronyme …acronyme …

LLight ight AAmplification mplification by by SStimulated timulated EEmission of mission of RRadiationadiation

Irradiation par LASERIrradiation par LASER

Brûlures (le plus généralement)

…

À l’exception de quelques situations particulières les brûlures de la peau

sont moins graves que celles de l’oeil

Collimation (Parallélisme) de Collimation (Parallélisme) de la lumièrela lumière

Photons des Lasers cohérents (« parallèles ») Photons des Lasers cohérents (« parallèles »)

L’œil focalise la lumière en un pointL’œil focalise la lumière en un pointFocalisation des photons Focalisation des photons risque potentiel risque potentiel

pour la rétine pour la rétine La lentille de l’oeil augmente la puissance par La lentille de l’oeil augmente la puissance par

unité de surface (W/cm2) de la lumière des unité de surface (W/cm2) de la lumière des LASERS par LASERS par ≥≥100 000 fois 100 000 fois

400 - 1400 nm

> 1400 nm

< 400 nm

Lentille

Cornée

Rétine

Comment les lasers ciblent les différentes structures de l’oeil

Risques majeurs Risques majeurs sur la rétinesur la rétine

Lumière Laser entre 400-1400nm (risque Lumière Laser entre 400-1400nm (risque pour la rétine) intensifiée par 100 000 X par pour la rétine) intensifiée par 100 000 X par l’effet lentille de l’oeil.l’effet lentille de l’oeil.

Focalisation sur la Focalisation sur la maculamacula, la région la plus , la région la plus sensible et la plus importante de la rétine.sensible et la plus importante de la rétine.

Cécité partielle (lumière directe ou réflexion).Cécité partielle (lumière directe ou réflexion).

Exemples de dommages induits Exemples de dommages induits par Laserpar Laser

Source: Laser-Professionals.com

Brûlure sur rétine

Most cytometer lasers are Class IMost cytometer lasers are Class Iwith coverings & interlocks operativewith coverings & interlocks operative

Classement des LasersClassement des Lasers

Classe Description Puissance (mW) Lasers

continus, Visibles (0.4 - 0.7 µm)

II Pas de dangerPas de danger < 0.5< 0.5

IIII Danger si longue expositionDanger si longue exposition 0.5 – 1.00.5 – 1.0

IIIIII Dangereux par lumière directe & réflexionDangereux par lumière directe & réflexion

IIIaIIIa IdemIdem 1.0 – 5.01.0 – 5.0

IIIbIIIb IdemIdem 5.0 – 500.05.0 – 500.0

IVIV idemidem > 500.0> 500.0

Exemple de lasers sur cytomètres Exemple de lasers sur cytomètres analyseurs-trieursanalyseurs-trieurs

DAKO MoFlo Laser OptionsDAKO MoFlo Laser Options Solid-State Lasers Solid-State Lasers

635nm, 25mW diode 635nm, 25mW diode 488nm, 200 mW diode488nm, 200 mW diode

Air-Cooled LaserAir-Cooled Laser Melles Griot HeNe 25mW, LHP 928Melles Griot HeNe 25mW, LHP 928

Water-Cooled Lasers from Coherent®Water-Cooled Lasers from Coherent® Enterprise II 621, 488 + UV Enterprise II 621, 488 + UV Innova 70-2W, Argon Innova 70-2W, Argon Innova 70-3W, Argon Innova 70-3W, Argon Innova 70-4W, Argon Innova 70-4W, Argon Innova 70-5W + UV, Argon Innova 70-5W + UV, Argon Innova 70-5W, Argon Innova 70-5W, Argon Innova 70K, Krypton Innova 70K, Krypton Innova 70-Spec, Argon Innova 70-Spec, Argon Innova 70-Spec + UV Innova 70-Spec + UV Innova 90C-3W Innova 90C-3W Innova 90C-4W Innova 90C-4W Innova 90C-4W + UV Innova 90C-4W + UV Innova 90C-5W Innova 90C-5W Innova 90C-5W + UV Innova 90C-5W + UV Innova 90C-6W Innova 90C-6W Innova 90C-6W +UV Innova 90C-6W +UV Innova 90C-K, Krypton Innova 90C-K, Krypton Innova 302-0.6W Krypton + UV Innova 302-0.6W Krypton + UV Innova 304-4W, Argon Innova 304-4W, Argon Innova 305-5W, Argon Innova 305-5W, Argon Innova 305 + UV Innova 305 + UV Innova 306-6W, ArgonInnova 306-6W, Argon

Source: www.dakousa.com

Source: www.cytopeia.com

Cytopeia inFlux™ V-GS Cytopeia inFlux™ V-GS Laser OptionsLaser Options

Solid-State LasersSolid-State Lasers UV 355nmUV 355nm Violet 408nmViolet 408nm Violet-Blue 479nmViolet-Blue 479nm Blue-488nmBlue-488nm Green-531nmGreen-531nm Red-635nmRed-635nm Red-647nmRed-647nm

Coherent Water-Cooled 70, 90, Coherent Water-Cooled 70, 90, 300 series lasers300 series lasers

Autres risques LASER Autres risques LASER

Choc électrique (voltage élevéChoc électrique (voltage élevéExposition chimiqueExposition chimiqueMatériel cryogéniqueMatériel cryogéniqueGaz compriméGaz compriméExplosions Explosions Contamination de l’airContamination de l’air……