REPUBLIQUE DU TCHAD UNITE * TRAVAIL * PROGRES

==========MINISTERE DE LA SANTE

PUBLIQUE=========

SECRETARIAT GENERAL

GUIDE PRATIQUE DE TRANSFUSION SANGUINE

A l’usage du personnel des centres de transfusion et banque de sang.

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Avril 2004

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I. LE DON DE SANG

I.1. Prise en charge du donneur

- Accueil - Entretien - Suivi

I.2. Gestion du fichier des donneursI.3. Prélèvement I.4. Geste d’urgence de réanimationI.5. Préparation I.6. Conservation et stockage

II. IMMUNO – HEMATO

II.1. Groupe sanguin ABO et RhII.2. Difficultés de groupageII.3. Test de coombs direct et indirectII.4. Test de compatibilitéII.5. Recherche d’ACP irrégulier

III. QUALIFICATION BIOLOGIQUE DU DON

III.1. Dépistage

VIHHBsHbcSyphilis

IV. PRPARATION CONDITIONNEMENT CONSERVATION DISTRIBUTION DES PSL

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I. PRISE EN CHARGE DU DONNEUR

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I.1. Accueil

Il est un indéniable qu’en matière de transfusion sanguine, le plus important est le donneur. Sans les donneurs, aucun service de transfusion ne peut fonctionner. C’est pourquoi le don de sang doit s’effectuer dans les meilleurs conditions de sécurité et de confort pour le donneur si non la réputation du service en pâtit favorisant ainsi la réticence au don de sang volontaire.

Par conséquent les personnels des centres de transfusion doivent faire preuve de beaucoup de courtoisie et de professionnalisme. Ils doivent avoir une tenue élégante et soignée, symbole d’un haut degré d’hygiène personnel. Ils doivent être d’un abord facile et communiquer avec les donneurs surtout lors de la prise de sang. Ils doivent avoir une attitude amicale, mais aussi ils doivent faire preuve de professionnalisme lors des différents contacts pour que les donneurs aient l’impression d’être en de bonnes mains.

S’il faut beaucoup de temps d’effort et d’argent pour recruter avec succès des donneurs volontaires, il suffit pour les perdre d’une petite négligence ou d’une maladresse du personnel avant, pendant ou après le don.

Voici la liste de quelques manquements qui peuvent faire du don de sang une expérience désagréable pour le donneur.

- Recevoir les donneurs dans un local dont l’hygiène ou la sécurité laissent à désirer ;

- Ne pas veiller à ce que l’entretien pré – don se déroule dans l’intimité ;

- Leur imposer une attente prolongée au cours du prélèvement ;- Ne pas accueillir personnellement chaque donneur à son

arrivée ;- Bavarder avec d’autres membres du personnel en ignorant les

donneurs ;- Faire des commentaires indiscrets au sujet du donneur a

propos de ses résultats ;- Négliger de remercier les donneurs ou de leur exprimer sa

gratitude sous une autre forme ;- Ne pas servir au donneur une collation pendant qu’il se repose

après le don du sang.

1.1.1. Entretien

L’entretien vise à sélectionner les donneurs et dont le but est d’une part de protéger ces derniers de possibles effets nocifs du don sur leur santé, et d’autre part à éviter la transfusion d’éventuelles maladies aux receveurs. L’entretien repose sur la pratique d’un interrogatoire au moyen d’un questionnaire. Les questions devraient permettre au donneur de

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comprendre le rapport entre le don et certaines maladies transmissibles par celui – ci, de lui rappeler qu’il est susceptible d’être infecté par l’une d’elle et d’explorer son état de santé en général. La mesure de la tension artérielle, la détermination du taux d’hémoglobine où de l’hématocrite et dans une moindre mesure la température corporelle devrait permettre de déterminer si le donneur est apte ou non au don.Cet examen doit se faire dans des conditions garantissant la confidentialité la confiance et respect du secret médical.Ainsi,

- Le prestataire de service recherche les affections qui contre - indiquent le don du sang. Si une contre indication existe, le prestataire doit préparer psychologiquement le donneur sans l’effrayer.

- En début d’entretien, le prestataire donne quelques informations sur le don de sang bénévole :

o Le principe éthiqueo Le déroulement du prélèvement(quantité prélevée,

intervalle entre deux dons etc.…)o Les analyses qui seront effectuées sur le prélèvement

dans l’intérêt du donneur et du receveuro Le devenir de son sang(transfusion en pédiatrie par

exemple)

- Le prestataire doit ensuite informer le donneur que l’entretien est couvert du secret médical et qu’il doit répondre sincèrement

- Le prestataire doit s’assurer que le donneur a bien compris le questionnaire et l’aider à compléter certaines réponses

- Le prestataire doit rappeler au donneur sa responsabilité en matière de sécurité transfusionnelle

- Le prestataire rappelle au donneur les analyses qui seront effectuées sur le don en vue de garantir sa propre sécurité mais aussi celle du receveur. Il profite de cette occasion pour l’informer de la nécessité de connaître les résultats des analyses en vue de sa propre sécurité. IL prépare ainsi le donneur en vue de l’acceptation des résultats

- Le prestataire rappelle enfin les principales contre - indications au don de sang et les comportements à risque.

Etant donné que certaines personnes se sentent déjà anxieuses lors qu’elles se présentent dans un centre de transfusion pour donner leur sang, pensez à ce qu’elles pourraient ressentir à l’idée de répondre à des questions très personnelles au sujet de leur comportement sexuel à

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risque . En ce qui concerne la formulation des questions relatives à la vie sexuelle, il doit prêter une attention particulière au respect de la dignité du donneur tout en rappelant le couvert du secret médical.

Pour atteindre les objectifs ci – dessus défini, il faut nécessairement établir un bon rapport avec les donneurs. Pour établir un bon rapport, il faut maîtriser les techniques de communication verbale c’est à dire la façon de parler et de poser des questions aux donneurs ; et les techniques de communication non verbale c’est à dire la façon de se comporter envers aux.

1.1.1.1. Communication non verbale

La clé d’une communication non verbale efficace est de traiter le patient avec respect et de lui accorder toute votre attention. Ces quatre points très simple peuvent s’avérer déterminants lorsqu’il s’agit de gagner la confiance des donneurs.

Préserver le caractère privé et confidentielle de l’entretien : l’entretien doit avoir lieu dans un endroit calme où l’on ne vous dérangera pas ;

Regarder le patient en face ; de façon à percevoir les émotions clés qui vous permettront de réagir convenablement ;

Ecouter attentivement le donneur ; montrez au donneur que vous l’écoutez en vous penchant légèrement vers lui, à l’occasion faites un signe de tête affirmatif où faite des commentaires pour l’encourager ;

Inviter le donneur à s’asseoir ; restez aussi près de donneur qu’il est culturement acceptable de la faire ; il vaut mieux se tenir à coté d’une table ou d’un bureau que dernière.

1.1.1.2. Communication verbale

Pour recueillir les informations nécessaire à l’acception ou à l’exclusion au don du sang, il faut poser beaucoup de questions non seulement sur ses symptômes et ses antécédents médicaux, mais aussi sur son passé sexuel pour ce faire, il est utile de savoir poser des questions.

- Formulez toujours vos questions de façon polie et respectueuse ;

- Employez des mots que les donneurs comprennent ;- Posez des questions précises ;- Posez des questions qui ne comportent aucun jugement

moral ;- Demandez aux donneurs la permission de les interroger sur

leur IST ou leur comportement sexuel.

N.B. : il y a en gros deux sortes de questions que l’on peut poser :

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- Des questions fermées, qui appellent de la part du donneur une réponse en quelques mots, souvent « oui’ ou « non » ;

- Des questions ouvertes permettant aux donneurs de donner une réponse plus longue, d’expliquer à leur façon ce qui ne va pas ou ce qui ressentent.

La meilleure façon d’utiliser chacun des deux types de questions est de commencer l’entretien par des question ouvertes, lorsqu’on sait que les personnes éprouvent souvent des difficultés à fournir des renseignements au sujet de leur propre sexualité ; les questions ouvertes leur permettront de se sentir à l’aise.

Une fois que vous êtes sûr d’avoir cerner les appréhensions du donneur, les questions fermées peuvent s’avérer utiles pour obtenir des détails spécifiques que vous souhaitez connaître.

1.1.2. Examen clinique

Chaque donneur qui se présente pour donner son sang doit être soumis à un examen physique afin de faire un bilan complet de son état de santé

Examen général

Etat général : taille, poids (être prudent si poids < 50 kg, appréciation de coloration des muqueuses) ;

Contrôle de certains constantes physiologiques (tension artérielle, poids, température) ;

Examen appareil par appareil

Cœur ; à la recherche d’une cardiopathie, Poumons ; à la recherche d’une affection

pulmonaire(tuberculose asthme) Abdomen (hépato – splénomégalie) , Examen de la peau, à la recherche de cicatrice de

zona, de tatouage etc.…, Aires ganglionnaires à la recherche d’une

adénopathie, Examen ORL/Stomatologie, à la recherche d’une

carie, d’un goitre ;

Contrôle des paramètres biologiques (hématocrite, hémoglobine)

1.1.2.1. Critère de prélèvement

Age : 17 à 60 ans ; Antécédent sans particularité ; Examen physique normal en particulier la TA ;

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Paramètre biologique normal ; Donneur pas sous médicaments interdits.

1.1.2.2. Contre – indications au don du sang

L’entretien médical et l’examen clinique permettent d’identifier les contre – indications au don du sang. Ces contre – indications sont nombreuses et une seule suffit comme critère d’exclusion.

Sujet de moins de 17 ans ou plus de 60 ans ; Poids < à 45 kg ; T.A : maxi > 20

mini < 05 Don de sang moins de 2 mois ; Fièvre ; Subictère ou ictère ; Pâleur ; Amaigrissement (altération de l’EG) ; Grossesse ; Allaitement ; Dermatose ; Traitement en cours ; Convalescence ; Terrain allergique ; Antécédent de pathologie chronique ; Perturbation de paramètre biologique.

1.1.3. Suivi des donneurs

Les donneurs volontaires et bénévoles ne viendront que si le service leur laisse une bonne impression et s’ils se sentent nécessaires, importants et si leur geste est apprécié.

1.1.3.1. Suivi médical

Nous évoluons dans un contexte où les pathologies sont fréquentes, et où l’accès aux soins est difficile pour les populations ; en plus de la possibilité d’être informé sur son état de santé, un suivi à minima (consultation et examen de labo simple), s’il vient à être instauré, contribuera à montrer au donneur que le service l’apprécie.

Il peut également être nécessaire d’organiser le suivi des donneurs si les épreuves de laboratoires révèlent la présence d’une infection transmissible comme le VIH ou l’Hépatite B. Il est nécessaire de mettre au point une politique sur la manière d’informer les donneurs de sang qui sont séropositif. Chaque fois que cela est possible, on communiquera les résultats des tests à l’intéressé au cours d’un entretien particulier. On

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pourra éventuellement orienter le donneur vers d’autres services de soutient tel que l’APMS du Centre Polyvalent Al – Nadjma.

1.1.3.2. Suivi – non médical

Les activités de relations publiques sont une importante forme de suivi qui aide à renforcer le lien entre le service de transfusion et les donneurs, en rendant ces derniers encore plus conscient de leur importance et de la nécessité d’une poursuite de leur collaboration avec le service. Aussi chaque service devrait s’efforcer d’entreprendre certaines activités pour entretenir la motivation des donneurs ;

Leur adresser des lettres de remerciements individuelles ;

Leur remettre une carte de groupe sanguin, puis une carte de donneur, puis des attestations au bout de plusieurs dons ;

Leur donner des récompenses diverses en fonction du nombre de don ;

Prévoir des opérations types porte ouverte à l’intention des donneurs dans le service.

1.2. GESTION DU FICHIER DES DONNEURS

Les dossiers des donneurs doivent rester confidentiels et leur accès doit être interdit à des tiers, dans les limites permises par la législation nationale. Ils devraient malgré tout permettre de constituer un tableau de donneur de sang volontaire et régulier d’une part ; d’autre part de déterminer les informations nécessaire à l’établissement des rapports.

Fiche de renseignement personnel (coordonnées du donneur, consentement éclairé, interrogatoire et examen sommaire) ;

Fiche de donneur d’une collecte mobile ; Registre des dons ; Registre des donneurs volontaires et de groupe

sanguin rare ; Une cartographie des lieux de collectes.

En effet la gestion rigoureuse de ces dossiers est indispensable pour définir un certains nombres d’indicateurs permettant de contrôler l’efficacité des collectes, d’identifier les donneurs régulier à récompenser, d’établir des statistiques (séro – prévalence des ITT) et de prendre des mesures pour préserver la santé des receveurs.

1.3. PRELEVEMENT

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Un des moments sinon le seul où un microbe peut s’infiltrer dans la poche est celui de la ponction veineuse. Une hygiène scrupuleuse du personnel, une décontamination soigneuse du site de ponction veineuse, le port de gants peuvent contribuer à limiter ce risque.

Un bon prélèvement doit être minutieusement préparé.

1.3.1. Le matériel doit être prêt avant le début du prélèvement

Coton ; Désinfectant (alcool ou autres) ; Garrot ; Poche de sang ; Pansement ; Portoirs ; Tubes ; Conteneur pour aiguilles usagées Poubelle. Des fauteuils adopté au prélèvement Des pinces à clamper Des pairs de ciseaux Des pèses poches Le matériel pour pansement adhésif Une trousse médicale d’urgences

1.3.2. Identification du donneur avant le prélèvement

Souhaiter la bienvenue au donneur ; Vérifier l’identité au moyen de la fiche de

renseignement en lui demandant

Nom et prénom ; Sexe ; Age ; Profession etc. …

Vérifier que le numéro du don est le même sur la fiche et sur la poche ;

1.3.3. Prélèvement

Le donneur doit être bien installé, allonger sur le fauteuil ;

Le préleveur doit choisir une bonne veine de préférence au pli du code ;

Rassurer le donneur ; Repérer la veine à ponctionner ;

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Désinfecter la zone (ne pas frotter vigoureusement) ;

Poser le garrot, décapuchonner l’aiguille et inciser rapidement en tenant l’aiguille à un angle d’environ 45°

Abaisser l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à la surface de la peau

Piquer la veine pour y faire délicatement pénétrer l’aiguille ;

Déclamper la tubulure dès que l’on se trouve dans la veine ;

Enfoncer l’aiguille de 1 à 2 cm dans la lumière de la veine ;

Fixer l’aiguille avec deux morceaux de ruban adhésif et enclencher la minuterie pour calculer le temps de prélèvement ;

Placer un tampon de gaz stérile à l’endroit de la ponction veineuse ;

Assurer régulièrement le mélange sang / anticoagulant au cours du prélèvement ;

Prélever 7 ml de sang par kilogramme de poids corporel sans dépasser le volume de 450 ml pour un sujet de plus de 60 kg et éviter de prélever moins de 300 ml dans les poches ayant 500 ml de capacité ;

Une fois le volume atteint, mesurer la durée du prélèvement, clamper la tubulure et sectionner en amont ;

Remplir les tubes d’examens au 2/3 ;

1.3.4. Fin de prélèvement

Préparer un pansement stérile et des tubes a vide en prenant soins de désinfecter le bouchon ;

Décoller le sparadrap qui fixe l’aiguille à l’avant bras ;

Retirer l’aiguille vers l’arrière parallèlement à la peau (pour éviter la rupture de la veine) ;

Demander au donneur de comprimé le pansement et lever le bras de prélèvement.

1.3.5. Collecte des échantillons pour le laboratoire

Introduire l’aiguille dans le bouchon en caoutchouc du tube et ouvrir le clamp jusqu’au remplissage du tube ;

Clamper à nouveau la tubulure et extraire l’aiguille du bouchon ;

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Introduire l’aiguille dans le conteneur par aiguille usagées ;

Couper la tubulure au dessous du clamp afin que l’aiguille tombe dans le conteneur.

1.4. GESTE D’URGENCE DE REANIMATION, REPOS, COLLATION

Le personnel de la zone de prélèvement doit avoir une compétence suffisante pour déceler le cas échéant les signes des différentes réactions pouvant survenir au cours du prélèvement. Ces incidents de gravité variable peuvent être contrôler par la vigilance et la discrétion dans l’action.

1.4.1. Le malaise +++

Les malaises apparus lors du don de sang sont dus au stress psychologique qui est surtout l’apanage de nouveau donneurs et qui est le résultat d’un syndrome vaso – vagal qui provoque une insuffisance temporelle d’irrigation sanguine du cerceau.

Circonstances

Jeûne (risque d’ypoglycémie) ; Prélèvement abondant chez les jeunes ; Attente prolongée ; Local exigu, confiné ; Vu du sang ;

Signes

Pâleur ; Lipothymie avec sueur ; Perte de connaissance ; Crise convulsives ; Vomissements

Conduite à tenir

Arrêter le prélèvement ; Isoler le donneur ; L’allonger en rehaussant ses jambes au dessus du

niveau de sa tête ; Desserrer les vêtements ; Libérer les voies respiratoires ; Surveiller la TA, le poids , la respiration.

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Laisser le donneur se reposer le temps nécessaire, le faire asseoir doucement et l’envoyer à la collation en l’accompagnant.

Autres incidents.

1.4.2. Ponction artérielle : sang rouge vif, grand débit

Retrait immédiat de l’aiguille ; Compression manuelle en amont au moins 10

minutes ; Surveillance pendant 30 minutes au moins.

1.4.3. Blessure d’un nerf

picotement, fourmillement, rarement décharge électrique Retirer l’aiguille.

1.4.4. Hémorragie :

Pansement compressif.

1.4.5. Hématome

Pansement compressif ; Pose de glace ; Surrelation du membre.

1.5. PREPARATION

1.5.1. Contrôle de poids et enregistrement des anomalies

La quantité de sang prélevé doit être de 450 ml # 50 ml environ 475 g. Il faut donc peser toutes les unités de sang et porter le poids sur l’étiquette de la poche, les poches de moins de 425 g et plus de 525 g ne doivent pas être utilisé pour élaborer les concentré de plaquettes. Il en serra de même pour les poches dont le prélèvement a duré plus de 15 mn.

Au fin de la préparation correcte des unités, il s’avère utile d’établir une liste détaillée de toutes les anomalies de poids et/ou de durée du prélèvement sans oublier le numéro du don correspondant.

1.5.2. Séparation

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La simple sédimentation des globules rouges sous l’effet de la pesanteur sépare le sang total recueilli sur l’anticoagulant en concentré globulaire, surnageant plasmatique et à l’interface des deux, la couche leuco – plaquettaire.

But de la séparation :

Préparer plusieurs produits sanguins à partir d’un même don ;

Conserver les produits sanguins à une température adaptée à chacun des constituants – 30° pour le plasma, 4° pour le culot et 22° pour les plaquettes ;

Eviter au cours de la conservation toute interaction métabolique entre constituant.

1.5.2.1. Matériel

Centrifugeuse réfrigéré ; Extracteur de plasma ; Soudeuse électronique de tubulure ou clip Poches multiples (double ou triple) ; Enceinte adapté à chaque produit ; Banque de sang à 4° Congélateur à – 80° Congélateur à – 30°.

1.5.2.2. Méthodes

Respecter la bactériémie naturelle du sang total en maintenant 1 à 2 heures à température ambiante les unités prélevés.

Centrifugation du sang total

Centrifugation rapide : 40.000 g x min permet d’obtenir trois composants : le plasma et le concentré de globule rouge et bien sur la couche leuco – plaquettaire ou buffy coat.

Centrifugation lente : 2.500 g x min permet d’obtenir deux composants : un plasma riche en plaquette et un concentré de globule rouge.

A défaut, sédimentation à 4° pendant 12 à 24 heures

Séparation

La séparation la plus simple est l’expression du plasma dans une poche vide attachée à partir de la poche primaire dans laquelle les globules rouges et la couche leuco – plaquettaire restent. D’autres techniques

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permettent de séparer la couche leuco – plaquettaire des globules rouges et du plasma.

La séparation peut être manuelle ou automatique.

Solution additives

Les solutions additives ont pour but d’apporter des éléments nutritifs aux globules rouges et de les diluer dans une concentration utile dans un milieu approprié pour réduire la viscosité (80 – 100 ml de S.A pour 450 ml de sang). La solution additive la plus communément utilisées contient du sérum physiologique salé, de l’adénine, du glucose du mannitol (SAGM).

1.6. CONSERVATION ET STOCKAGE

1.6.1. Principes généraux

Deux heures maximum après leur prélèvement, les unités de sang doivent être placé à 4° pendant le transport, et lors de leur traitement.

La chaîne de froid devrait par la suite être respectée pour garantir la qualité des produits sanguins. Toute variation de température au cours de la conservation altère la qualité des cellules ou des facteurs de coagulation des opérations de séparation et d’étiquetage devrait s’effectuer en chambre froide et /ou climatisée.

Une règle : dès qu’un produit sanguin est placée à la température requise pour sa conservation (+22°C, 4°C ou – 30°C) il doit y rester jusqu’au moment de sa transfusion.

Le transport des poches de sang de l’établissement de transfusion jusqu’à l’établissement de soins voire jusqu’au lit du malade doit se faire dans des containers ou des bacs isothermes.

1.6.2. Condition de conservation des produits sanguins

Globules rouges

Le sang total prélevé sur CPD Adénine peut être conservé entre +4° et 8°C pendant 5 semaines.

Les concentrés de globules rouges préparé avec du SAG mannitol peuvent être conservés entre 4° et 8°C pendant 5 à 6 semaines.

Plasma congelé

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Doit être conservé à – 30°C pendant 1 an si possible mais jamais au dessus de – 20°C.

Plaquettes

La température doit être de + 22°C et la conservation sous agitation continue pendant 36 à 72 heures.

II. IMMUNO – HEMATOLOGIE

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2.1. Rappel : éléments d’immunologie

2.1.1. antigènes

un antigène est une substance qui, introduit dans un organisme et reconnue comme étrangère, va susciter une réponse immunitaire. Cette réponse immunitaire débouche sur la production de cellules immuno – compétentes, mais aussi sur la production d’anticorps qui vont réagir de manière spécifique et observable avec cet antigène.

2.1.2. Anticorps

Un anticorps est un produit de la réponse immunitaire qui va réagir de manière spécifique avec l’antigène qui lui a donné naissance.

Les anticorps ou immunoglobulines sont de cinq types en fonction de leur caractéristiques physico – chimiques et leur propriétés. On les distinguent en Ig G, Ig A, Ig M, Ig E et Ig D néanmoins ils ont un structure de base commune : deux chaînes lourdes et deux chaînes légères unies entre elles par des ponts d’isulfures.

Pont d’isulfures chaîne légère

Chaîne lourde

2.1.3. Réactions antigènes – anticorps

Lorsqu’un antigène est mis en présence d’un anticorps correspondant, il se produit une union antigène – anticorps. Cette combinaison spécifique représente le phénomène fondamentale en immunologie. Cette combinaison est due à l’existence sur les molécules d’anticorps de sites de combinaison complémentaire des déterminants antigéniques présent sur les antigènes.

2.1.3.1. Condition de mise en évidence des réactions antigènes – anticorps

Il y a deux facteurs

Facteurs non spécifiques

La concentration du milieu La température

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Le PH

Facteurs spécifiques

La multivalence spécifiques des antigènes et des anticorps

L’existence d’un rapport convenable entre antigène et anticorps.

Pour que les réactions antigènes – anticorps soient visibles in vitro, il faut que ces facteurs soient respectées.

Les facteurs spécifiques relèvent de la théorie du réseau de MARRACK qui permet la visualisation de la réaction antigène – anticorps.

2.1.3.2. Condition de visualisation des réactions antigènes – anticorps

Pour que la réaction antigène – anticorps soit visible, il faut que la molécule d’antigène ait au moins trois déterminants et la molécule d’anticorps deux sites de combinaisons. Dans ces conditions, il se forme un réseau tridimensionnel qui va être visualisé soit par la précipitation, soit par l’agglutination qu’il s’agisse d’une solution ou d’une particule.

2.1.3.3. Méthodes de mise en évidence de la réaction antigènes – anticorps

Il existe plusieurs méthodes pour mettre in vitro la réaction antigène – anticorps. Ces différentes méthodes permettent au laboratoire de rechercher :

La présence d’un anticorps dans un sérum La présence d’un antigène dans un organisme.

Deux méthodes obéissent à la théorie du réseau de MARRACK. Il s’agit de la précipitation et de l’agglutination. Les autres méthodes relèvent d’autres artifices techniques.

Dans le présent chapitre nous allons traiter essentiellement de l’agglutination.

2.1.4. Agglutination

Il y a deux types d’agglutination

L’agglutination immunologique L’agglutination non immunologique

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2.1.4.1. Agglutination immunologique

L’agglutination immunologique met en jeu des anticorps d’une part et d’autres part des particules.

Ces particules peuvent posséder des antigènes correspondant à la spécificité des anticorps : on parle d’agglutination direct. Dans d’autres cas, la particule peut servir de support inerte tel que les globules rouge, les particules de latex ou les cristaux de cholestérol : on parle d’agglutination passive.

Lorsqu’une suspension de particules portant des déterminants antigéniques est mise en présence d’un sérum contenant des anticorps spécifiques, il se produit un rassemblement des particules ; la réunion en amas de ces cellules avec clarification du liquide environnant constitue l’agglutination immunologique.

L’agglutination immunologique comporte donc deux étapes :

Réaction antigène – anticorps correspondant à la fixation spécifique de l’anticorps sur l’antigène ;

Formation de l’agglutination si les conditions le permettent.

2.1.4.2. Agglutination non immunologique

Il existe des agglutinations non immunologiques provoqués par certaines substances non spécifiques des cellules à agglutiner tels que les contaminant chimique (détergents par exemple) les composés neutres (sulfate de protamine, dextran etc. …) les substances végétales (concanavaline A).

2.1.4.3. Mécanisme de l’agglutination des globules rouges

La réaction d’agglutination est beaucoup plus sensible que la précipitation. Elle est beaucoup employée en immunologie et plus particulièrement en immuno – hématologie. L’agglutination des globules rouges relève donc de la théorie du réseau du MARRACK. Mais également d’autres facteurs notamment.

La surface des globules rouges ; Le type d’anticorps ; Et le type de milieu.

Surface des globules rouges

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Le nombre de sites récepteurs spécifiques est probablement le facteur le plus important ;

La situation des sites, à la surface ou en profondeur dans la membrane des globules rouges aussi a un rôle fondamental ;

Le mécanisme physico – chimique : le produit zêta.

Une suspension de globules rouges est soumise à deux types de forces ; des forces de répulsion dues à la charge électrostatique des globules rouges ; des forces de cohésions liées à la tension inter faciale des globules rouges.

En effet les globules rouges se comportent comme des particules à caractéristiques anionique. L’origine de cette charge est liée à la présence sur la surface de l’hématie de groupement carboxyliques des acides sciatiques attachées à des glycoprotéines de la membrane. Toutes les hématies étant porteuses de la même charge négative, il se crée en suspension saline une force de répulsion interrogatoire.

Aucune agglutination ne peut survenir si les globules rouges ne se rapprochent pas suffisamment. Dans une solution électrostatique, les globules rouges sont entourés d’un nuage de charge opposé (positif) dont la densité diminue au fur et à mesure que l’on s’éloigne de l’érythrocyte, ce qui crée une différence de potentiel entre le nuage de cathion entourant le globule rouge et le milieu environnant. C’est le potentiel (£) Zêta. La force de répulsion entre deux globules rouges va dépendre de la valeur du potentiel Zêta au dessous de la quelle la suspension reste stable et au dessus de la quelle la suspension reste instable.

ANTICORPS AGGLUTINANTS ET NON AGGLUTINANTS

Un anticorps est dit agglutinant quand il est capable de produire une agglutination des hématies en suspension en solution physiologique. Au contraire un anticorps est dit non agglutinant, quand sa fixation à la surface de l’hématie ne suffit pas à provoquer l’agglutination des hématies en suspension en eau physiologique.

Très schématiquement, les anticorps de type IgM sont généralement agglutinants alors que les anticorps de Ig G ne le sont pas, mais il apparaît que certains anticorps de type IgG (par exemple anti – A) sont agglutinant, alors que d’autres de nature IgM ne le sont pas (par exemple anti – Jka). Ce qui veut dire que l’activité agglutinante d’un système n’est pas uniquement liée au type moléculaire des anticorps utilisés, mais aussi à

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d’autres facteurs telle que la qualité des structures réactives propre à l’antigène lui même.

Type de milieu

Les substances hydrosolubles utilisées telles que l’albumine se polarise dans le champ électrique des globules rouges et diminue la force de répulsion inter globulaire. L’effet de ces molécules est donc d’élever la constante électrique du milieu, ce qui entraîne une diminution de potentiel Zêta et favorise le phénomène d’agglutination.

2.2.LES GROUPES SANGUINS ERYTHROCYTAIRES

Il existe plusieurs systèmes de groupes sanguins dont les plus importants sont : le système ABO et le système Rhésus (Rh).

2.2.1. Le système ABO

Il est défini par deux éléments :

Les antigènes présents à la surface des globules rouges de chaque individu ;

Les anticorps présents dans son plasma ;

Ainsi, le sujet de groupe A possède :

Sur les globules rouges l’antigène A ; Dans son plasma l’anticorps anti – B.

Le sujet de groupe B possède :

Sur les globules rouges l’antigène B ; Dans son plasma l’anticorps anti – A.

Ces anticorps sont dits naturels ; ils sont actifs à froid, ce sont des IgM.

TABLEAU 1 : Antigènes et Anticorps du système ABO

Groupe sanguin A B AB O

Antigène

globulaire

A B A + B Ni A, ni B

Anticorps plasmatique

Anti - B Anti - A Ni anti – ANi anti – B

Anti -A et Anti- B

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2.2.2. Le système Rhésus

Le système Rhésus est défini par la présence ou l’absence de l’antigène D sur les hématies. Les sujets qui le possèdent sont dits Rhésus positifs et ceux qui ne le possèdent pas, Rhésus négatifs.

Il faut cependant savoir qu’en dehors de l’antigène D, le système Rhésus comprend une mosaïque d’antigène ; C, c, E, e etc. …….

Dans le système Rhésus, il y a pas d’anticorps naturels. Les anticorps sont acquis par allo – immunisation et sont de type IgG, actifs à chaud.

2.3.LE GROUPAGE SANGUIN

Le groupage sanguin consiste à déterminer le groupe d’un sujet ; groupe qui signifie ensemble des antigènes allotypiques de la membrane du globule rouge. Nous parlerons ici essentiellement des systèmes ABO et Rhésus.

2.3.1. Groupage ABO

Dans le système ABO, le groupage sanguin s’effectue obligatoirement par deux épreuves complémentaires :

Epreuve globulaire (Beth – Vincent) qui consiste à mettre en évidence les antigènes présent à la surface des hématies du sujet grâce à des sérums tests connus anti – A, anti – B, anti – AB.

Epreuve sérique (Simonin) qui consiste à rechercher les anticorps présents dans le plasma ou sérum du sujet grâce à des globules rouges connus A1, B et O.

Ces deux épreuves (globulaire et sérique) doivent être réalisées par deux techniciens différents.

TECHNIQUES

Sang coagulé :

Préparer le sang à tester, en séparant le caillot sanguin du sérum exudé. Celui – ci recueilli dans un tube soigneusement noté, doit être débarrassé par centrifugation des hématies en suspension.

Sang prélevé sur anti – coagulant

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Centrifuger le sang à tester afin d’obtenir d’une part le culot globulaire tassé, d’autre part le plasma ; décanter à l’aide d’une pipette pasteur le plasma ; centrifugé et le recueillir dans un second tube soigneusement noté.

Préparer une suspension des globules rouges à tester dans leur propre plasma ou en sérum physiologique (Na CI à 9%).

à 10% pour le groupage sur plaque ; à 5% pour le groupage en tube.

2.3.1.1. Groupage sur plaque (à la température du laboratoire)

Réactifs et matériel

Suspension globulaire à 10% des globules rouges à tester ;

Sérum ou plasma centrifugés à tester ; Plaque d’opaline ou de verre ; Sérums – tests anti – A, anti – B, anti – AB ; Globules rouges tests A1, B et O ; Baguette de verre à bout rode ; Tampon d’ovate ou papier absorbant ; Pipette pasteur.

Epreuve globulaire (Beth – Vincent)

Déposer sur la plaque d’opaline une goutte de chacun des sérums – tests anti - A, anti – B et anti – AB ;

Ajouter une goutte de globule rouge à tester à 10% ;

Mélanger les réactifs à l’aide d’une baguette de verre ou le fond d’un tube, afin d’obtenir un cercle de 2 à 3 cm de diamètre ;

Prendre la plaque à deux mains et lui imprimer un mouvement de rotation (chalouper) ;

La lecture définitive sera effectuée au bout de 3 minutes.

Epreuve sérique (Simonin)

A l’aide d’une pipette pasteur, déposer sur la plaque 3 fois 2 gouttes de sérum ou plasma à tester ;

Ajouter une goutte des hématies tests, A1, B et O en suspension à 10% en milieu salin ;

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Mélanger à l’aide d’une baguette de verre ou le fond d’un tube ;

Imprimer à la plaque un mouvement de rotation (chalouper) ;

Lire la réaction.

Pour ces deux épreuves, prendre soins d’essuyer soigneusement la baguette de verre ou le fond du tube entre le passage d’un antigène à l’autre, ou d’un sérum – test à l’autre.

FIGURE 1 : Technique sur plaque d’opaline

EPREUVE GLOBULAIRE(Beth – Vincent)

EPREUVE SERIQUE(Simonin)

Anti – A Anti - B Anti - AB A1 B O

1 goutte de réactif (anti-A, anti–B, anti- AB)1 goutte d’hématies du malade à 10% en saline ou en plasma/sérum autologue

2 gouttes de sérums / plasma du malade1 goutte d’hématies test à 10% en saline.

2.3.1.2. Groupage en tube (à la température du laboratoire)

Réactifs et matériels

Suspension des hématies à tester à 5% en milieu salin, plasma / sérum autologue ;

Sérum ou plasma centrifugé ; Tube à hémolyse ; Serums – tests anti – A, anti – B, anti – AB ; Globules – tests A1, B, O en suspension à 5% en

milieu salin.

Epreuve globulaire (Beth – Vincent)

- Répartir dans 3 tubes disposés et bien étiquetés sur un portoir une goutte de suspension des hématies à tester ;

- Ajouter une goutte de chacun de sérums – tests ;- Agiter doucement pour bien mélanger ;- Centrifuger 1 minute à 1000 tours / minute ;

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- Lire par simple agitation sur un fond blanc.

Epreuve sérique (Simonin)

- Répartir dans 3 tubes marqués : A1, B, O deux gouttes du sérum ou du plasma à tester ;

- Ajouter une goutte des globules rouges test A1, B, O ;- Centrifuger 1 minute à 1000 tours / minute ;- Lire par simple agitation sur un fond blanc.

FIGURE 2 : Technique en tubes

Anti - A Anti - B Anti - AB A1 B O

Beth - Vincent Simonin1 goutte de réactif (anti – A, anti B, anti – AB) + 1 goutte des hématies à tester à 5% en saline, plasma / sérum

2 gouttes de sérum ou plasma à tester + 1 goutte des globules rouges tests A1, B, O en milieu salin

LES TEMOINS- AUTO : 1 goutte de sérum / plasma du malade + 1 goutte GR

du malade à 10% ou 5% en saline- AB : 1 goutte de sérum + 1 goutte GR du malade à 10% ou 5%

en saline- ALLO : 1 goutte du sérum / plasma du malade + 1 goutte du

panel en saline (échantillon sélectionne)

Les témoins sont effectués dans les mêmes conditions que la détermination des groupages ABO sur plaque et en tube en cas de discordance entre épreuve globulaire et sérique.

AUTO AB ALLO

1 2 3 4

La concordance des résultats entre l’épreuve globulaire et l’épreuve sérique est impérative. Il ne faut jamais conclure en cas de discordance.

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2.3.1.3. Interprétation des résultats du groupage ABO

TABLEAU 1 : Résultats du groupage ABO

Beth – Vincent (épreuve

globulaire)

Simonin (épreuve sérique

Témoins

Résultats

Fréquence au Tchad

Sérums - tests Globules - test -Anti a Anti b Anti ab A1 B O -

- + + + - - - B- - - + + - - O+ + - - - - - AB+ - + + + - - A

L’apparition des agglutinants dans l’épreuve globulaire est très rapide ; parce que les anti – sérums anti – A, anti – B et anti – AB ont été sélectionnés pour leur avidité.

Par contre, l’apparition des agglutinants dans l’épreuve sérique est beaucoup lus lente car les anticorps anti – A et anti – B naturel ont un titre beaucoup plus faible et une avidité moins forte.

L’intensité de l’agglutination sera évaluée de la manière suivante :

Agglutination totale sans globules rouges libres +++Agglutination d’une dizaine d’agglutinants ++Agglutination de plus de dix (10) agglutinants +Micro agglutinants #Absence d’agglutination –

2.3.1.4. Quelques difficultés de groupage

Les agglutinines froides

Les réactions globulaires et sériques sont positives. Le témoin auto est positif, et le témoin allo le plus souvent l’est également.

La poly agglutinabilité  : relève d’un phénomène immunologique, un antigène anormalement présent à la surface du globule rouge est reconnue par un anticorps spécifique présent dans la plupart des sérums humains ; dans ce cas le témoin AB est positif.

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Le groupes rares  : les hématies ne portent pas les antigènes attendu par rapport aux antigènes anti – A et/ou anti – B présent dans le sérum ; il s’agit d’un groupe rare mais normal (groupe a faible, B faible).

La détermination du groupe sanguin fait sur du sang du cordon peut provoquer de fausses réactions positives du fait de la gèle de Wharton.

On peut dans certaines circonstance être confronté aux phénomènes de double population (leucémies, hémopathies, malignes, sujet de groupe A et/ou B antérieurement transfusé par du sang O, chimère ou mosaïque etc..).

2.3.2. Le groupage Rhésus

Groupage sur plaque /Rhésuscope

Réactifs et matériels.

- Hématies à tester en suspension à 40% dans leur propre plasma ou sérum ;

- Rhésuscope (40°C environ) ;- Baguette de verre à bout rodé - Anti – D ;- Anti – CDE- Hématies test O Rh+ et O Rh- en suspension à 40% ;- Témoin albumineux (mélange sérum AB et albumine bovine ou

humaine à 30%).

Méthode

Déposer sur la plaque de gauche à droite

- 3 fois deux gouttes de réactifs anti – D rangée supérieure- 3 fois deux goutte de réactif anti –CDE rangée du milieu- 3 fois deux goutte de témoin albumineux rangée inférieure- étaler les gouttes à l’aide de la baguette en verre ou avec le

fond d’un tube pour obtenir un cercle d’environ 2 cm ;- essuyer soigneusement la baguette ou le fond du tube entre

chaque passage ;- imprimer à la plaque un mouvement de rotation (chalouper) ;- lire la réaction après 3 minutes.

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FIGURE 3 : Groupage Rhésus sur plaque

Hématies à tester

Témoin positif Témoin négatif 1 goutte (d’hématies)

Anti D 2gttes

Anti CDE 2 gttes

Témoin albumineux 2 gttes

Groupage en tube

Réactifs et matériels

- Hématies à tester en suspension à 5% dans leur propre sérum / plasma

- Tubes à hémolyse- Pipette pasteur- Anti – D- Bain marie ou étuve à 37°

Méthode

Dans une série de tubes soigneusement marqués, disposer :

1 goutte d’anti - D + 1 goutte de suspension des hématies à tester 1 goutte d’anti – D + 1 goutte d’hématie témoin Rh+1 goutte d’anti – D + 1 goutte d’hématie témoin Rh-

- agiter doucement pour mélanger les réactifs - incuber 1 h 30 à 37°C

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- lire la réaction au microscope après éclatement sur lame effectuer simultanément et dans les mêmes conditions, le témoin albumine.

Difficultés de groupage Rhésus

- Phénomène de rouleaux : dû à la présence d’une grande concentration d’immunoglobuline (myélome, waldenstrom).

Le témoin albumineux est positif enlevant toute valeur à la réaction avec le réactif anti – D.

Refaire le groupage sur les hématies lavées et remises en suspension en sérum AB.

- Cas d’anémies hémolytiques auto – immune (auto – anticorps IgG). Ici aussi le témoin albumineux est positif. Refaire le groupage Rhésus avec un anti – D salin (agglutinant).

- Cas des D faibles (Du) du à une faible expression des antigènes Rhésus standard. Leur mise en évidence nécessite des techniques plus élaborés.

TECHNIQUES DE DEPISTAGE DES FAIBLES (Du)

Le Rh D faible apparaissent sur plaque comme des Rh négatif . il faudra donc employer des techniques de laboratoires plus élaborés pour les mettre en évidence. Il s’agira ici de la technique de Coombs indirect.

REACTIONS DE COOMBS INDIRECT

1. temps : fixation de l’anti – D (sensibilisation)

- mettre en suspension à 5% en eau physiologique les hématies que l’on veut tester, préalablement lavées 3 fois en eau physiologique.

- Dans un tube marqué, mettre une goutte de suspension globulaire et ajouter 2 gouttes de sérum test.

- Incuber à 37°C pendant 1 heure

2. temps : révélation de la sensibilisation

- laver 3 fois la suspension- au dernier, décanter soigneusement le surnageant- ajouter 2 gouttes lavage d’anti – globuline polyvalente ou anti

– IgG - centrifuger à 1000 tours / mn pendant une minute- agiter et faire la lecture sur le fond blanc

Ne pas oublier les témoins O Rh+ et O Rh -

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2.2.3. Recherche d’hémolysines chez les donneurs du groupe O

Certains donneurs du groupe O sont dits dangereux, par ce que possédant dans leur plasma des anticorps anti A et / ou anti B immuns. Ces anticorps sont des IgG, actifs à chaud, propriété qui va être utilisée pour les rechercher.

TECHNIQUE

- Préparer une suspension à 5% d’hématies A et B lavées ;- Préparer du sérum du donneur fraîchement prélever (moins de

6 heures) ;- Dans deux tubes marqués A et B, mettre respectivement une

goutte de suspension d’hématie A et B ;- Ajouter dans chaque tube, 9 gouttes de sérum frais du

donneur ;- Incuber les tubes à 37° pendant 2 heures ;

Sortir les tubes et remettre les globules rouges en suspension ;

Centrifuger les tubes une minute à 1000 tours / minutes ;

Examiner la couleur su surnageant :

Couleur jaunâtre : absence d’hémolysine Couleur rosâtre : présence d’hémolysines

La présence d’hémolysines signifie que le donneur est dangereux. Son sang ne peut être transfusé qu’à un sujet du groupe O.

2.3.4. Les épreuves de compatibilité

Consiste à mettre en présence le sérum du receveur et les hématies des poches de sang que l’on se propose de transfuser. Dans nos pays où la recherche d’anticorps irréguliers est souvent irréalisable, le test de compatibilité est indispensable et doit – être fait avant toute transfusion pour éviter d’éventuel accident surtout chez les polytransfusés.

2.3.4.1. Le cross – match

Consiste à tester le sérum du receveur contre les globules rouges du ou des donneurs.

TECHNIQUE

Sur une plaque propre et dégraissée ; Mettre deux gouttes de sérum du malade ;

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Ajouter sur le sérum 1 goutte de globules rouges du donneur ;

Mélanger avec le fond d’un tube Lire le résultat.

La présence d’une agglutination traduit une incompatibilité.

2.3.4.2. Compatibilité tube

Il faut utiliser conjointement plusieurs techniques ; au moins trois :

- une réaction en milieu salin à 20° (température du laboratoire) ;

- une réaction de Coombs indirect ;- une réaction de Coombs à basse force ionique.

TECHNIQUES

- Tests d’agglutination en saline à 22°C

o Globules rouges à transfuser lavés 3 fois ;o Remise en suspension à5ù en eau ;o Dans une série de tubes, mettre 1 gouttes de suspension

de chacun des globules rouges ;o Ajouter une goutte de sérum à tester ;o Laisser incuber 1 h 30 à 20° ;o Lire au microscope après étalement sur lame.

- Test de Coombs indirect

o Lavage des globules rouges à transfuser 3 fois en eau & et remise en suspension à 5% en eau &

o Sensibilisation : dans une série de tubes marqués, mettre 1 volume de sérum à tester et un volume de suspension globulaire ;

o Laisser incuber 1 heure à 37° ;o Lavage du hématies sensibilisées 3 fois en eau & ;o Ajouter une à 2 gouttes d’antiglobuline ;o Centrifuger pendant une minute à 1000 tours / minute ;o Lecture macroscopique et microscopique.

- Test de Coombs à basse force ionique (BFI)

o Sensibilisation :

1 goutte de sérum ;1 goutte d’hématies lavée en suspension à 2% BFI

o incubation :

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10 minutes au bain – marie ou 15 minutes à l’étuve puis lavage en solution saline.

o Réaction à l’antiglobuline :

1 goutte d’hématies sensibilisées lavées, 2 gouttes d’antiglobulines polyvalente,centrifugation 1 minute à 1000 tours / minute,lecture au microscopique.

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III.DEPISTAGES DES INFECTIONS TRANSMISSIBLES

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3.1. DEPISTAGE DE VIH

Le syndrome d’immunodéficience acquise reste encore de nos jours, une maladie incurable. Sa transmission à un patient signifie une condamnation à mort ou long terme.

Il est donc particulièrement important de s’assurer que le sang que nous proposons à nos malades n’est pas une source de transmission du VIH.

3.2. LA STRUCTURE DU VIH

Le VIH est un rétrovirus : virus à ARN. Il comprend

- un noyau- une matrice- une enveloppe

1 = ARN ; 2 = Capside ; 3 = P24 ; 4 = P7/P9 ; 5 Reverse transcriptase ; 6 = P17 ; 8 = gp 120 ; 9 = enveloppe ; 10 = virion.

Figure n° 1 : structure du VIH

On en distingue deux types : le VIH – 1 et le VIH – 2. Le VIH - 1 est le plus répandu dans le monde. En effet on le trouve sur tous les continents et dans tous les pays. Le VIH – 2 découvert initialement sur la cote – ouest Africaine a été retrouvé en Europe, en Amérique du Nord et du Sud. Sur le plan de la structure, les deux virus ont la même configuration. Cependant ils différent au niveau des protéines qui les composent. C’est ainsi que :

- au niveau de l’enveloppe de la gp 160 est remplacée par la gp 140 la gp 120 par la gp 125 ou gp 105

- au niveau du noyau la p 24 par la p 26- au niveau de la matrice la p 17 par la p 16.

Il faut cependant retenir qu’il existe 40 à 45% d’homologie entre le VIH – 1 et le VIH – 2.

N.B. la gp 160 est le précurseur de la gp 120, la gp 140 le précurseur de la gp 125 ou gp 105.

3.3. LA REPONSE DE L’ORGANISME DE L’INFECTION PAR LE VIH

La pénétration du VIH dans l’organisme, n’entraîne pas tout de suite une protection d’anticorps. Il existe au début de l’infection une période de latence plus ou moins longue, allant de deux semaines à quelques mois, pendant laquelle aucun anticorps anti VIH ne peut être mis en évidence (figure 2) : c’est la fenêtre sérologique.

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C’est pour cette raison qu’il est recommandé d’être particulièrement rigoureux dans la sélection des donneurs de sang. Toute personne suspecte et appartenant à un groupe à risque, doit être exclue du don de sang.

Après la période de latence, l’organisme produit des anticorps dirigés contre les différentes protéines virales. Les différents tests de dépistage du VIH consistent à rechercher ces anticorps, qui une fois produits, persistent toute vie, à l’exception de l’anticorps anti p24 qui à la phase ultime de la maladie voit son taux décroître et même tomber à zéro au profit d’une remontée du taux de l’antigène p24 dans le sang.

3.4. LES MOYENS DU DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE DES INFECTION VIH

Le diagnostic des infections à VIH repose chez l’adulte sur détection des anticorps. Le développement des techniques de biologie moléculaire ne permet pas pour l’heure de remplacer les techniques sérologiques qui restent partout dans le monde les techniques de références pour le dépistage et la confirmation des infections VIH de l’adulte. Seul le diagnostic précoce dans les premiers mois de vie chez l’enfant né de mère séropositive nécessite la mise en évidence du virus, de ses composants ou de son génome.

3.5. PRINCIPES DES TESTS DE DEPISTAGE

Le dépistage des anticorps anti VIH 1 et anti VIH 2 s’effectue souvent par des tests dits ELISA (Enzyme – linked Immunosorbent Assay) ou par des tests rapides utilisant comme antigènes des lysats viraux ou des protéines recombinantes ou synthétiques. Ces protéines correspondent aux épitopes immuno – dominants de 2 virus VIH 1 du sous – type B (souche LAI, MN) et VIH 2 du sous – type A (souche ROD). Ces tests « mixtes » sont donc capables de dépister les anticorps anti VIH 1 et anti VIH 2. Plusieurs formats de tests sont disponibles.

Les tests ELISA :

Les tests EIA indirect : la fixation des anticorps du patient sur les antigènes du kit est relevée par une anti – globuline humaine anti – Ig G marquée par une enzyme. Ce sont des test robustes. Peu sensibles aux variations des épitopes des variants VIH surtout si les antigènes sont du lysat viral. Mais ils manquent de sensibilité lors de la primo – infection car ils sont incapables de détecter les iso types d’immunoglobulines non – G. Leur spécificité est médiocre, des immunoglobulines non spécifiques pouvant se fixer sur le support solide et être révélées par l’anti – globulines marquée.

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Les tests EIA « Sandwich » : la révélation de la réaction antigène du kit anticorps anti – VIH du patient se fait non plus par une anti – globuline mais par une antigène marqué, se fixant sur les anticorps restés libres. Ce sont les tests les plus sensibles pour la détection des anticorps anti – VIH du sous – type B lors de la séroconversion. La spécificité est également excellente. Ils sont les plus utilisés dans le cadre du dépistage des dons de sang. Ils peuvent être pris en défaut lors d’infections par variants majeur comme les VIH – 0 et manquent de sensibilité lors des séroconversion par les variants non – B.

Les tests EIAs par immunocapture : les immunoglobulines du patients se lient par leur extrémité Fc à des antiglobulines anti – Fc de la phase solide. La révélation de liaison se fait par des antigènes marqués, se fixant sur les sites Fab des anticorps restés libres. Ils permettent de détecter des immunoglobulines même en cas de forte dilution dans des milieux comme l’urine ou la salive. Cependant ils sont légèrement moins sensibles que les tests de troisième génération lors des séroconversions (4) mais leur spécificité est bonne.

Les tests EIA par compétition utilisent la différence d’affinité pour un antigène entre les anticorps anti – VIH du patient et un anticorps anti – VIH marqué par une enzyme. Les tests par compétition commercialisés utilisent uniquement des antigènes VIH – 1 du groupe M. Ces tests sont hautement spécifiques. En cas de forte réactivité, l’infection VIH – 1 groupe M est certaine. Les infections par VIH – 2 et VIH – 0 sont non ou mal détectées et cette spécificité peut être utilisé pour différencier le type de souche infectante.

Les tests rapides :

Ce sont le plus souvent des tests par filtration du sérum sur une membrane ou un support recouvert d’antigènes recombinants VIH 1 et VIH 2. Ils ne nécessitent aucun équipement et sont réalisées en moins de 30 minutes. La simplicité d’emploi leur assure une large diffusion dans les pays en voie de développement. D’autres tests de réalisation simples sont les tests par agglutinations de particules sensibilisées aux antigènes VIH. Ils sont généralement sensibles et de réalisation simple mais l’interprétation peut être parfois difficile. De réalisation unitaire et rapide. Ils sont faciles d’exécution. Pour l’ensemble de ces tests, l’absence de résultats quantifiés et enregistrés sur support papier sont des obstacles à la traçabilité des manipulations.

Les tests de confirmation

La technique du Western Blot (WB) est une méthode de référence mais son interprétation peut – être délicate. Le recours au WB pour une

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confirmation VIH n’est pas systématique dans tous les pays, y compris dans les pays industrialisés. Elle est parfois informative permettant d’évoquer une séroconversion récente ou une infection par des variants. Le plus souvent en cas d’infection VIH, le WB sera pleinement réactif et donnera peu d’information complémentaire. Inversement, en cas de non infection, des réactivités non spécifiques sont fréquentes et d’interprétation difficile. Aussi des alternatives au WB sont nécessaires pour éviter un recours systématique à cet examen coûteux. Le WB est une technique de transfert sur la nitrocellulose, après migration électrophorétique en gel de polyacrylanide, de protéines d’un lysat viral VIH–1 ou VIH– 2 . Sur la bandelette de WB, différentes protéines constitutives des virus seront reconnus par des anticorps spécifiques anti VIH- 1 ou VIH- 2.

VIRUS L’HEPATITE B

Structure : virus (42 nm) de l famille des hepadnavirus ; c’est un virus à ADN à symétrie icosaédrique. Il possède une enveloppe ;

Epidémiologie :

- La transmission du virus se fait par voie parentérale ; il y a environ 0,5% de porteurs chronique du virus en France (jusqu’à 20% dans certaines régions du globe) ; l’exposition au WHB est suivie chez le sujet normal d’une infection chronique dans 10% des cas. Mortalité : environ 1% des cas.

- Chez les donneurs de sang : l’incidence de l’Ag HBs est d’environ 10 pour 10.000 chez les nouveaux donneurs et 0,1 pour 10.000 chez le donneurs connus. Malgré une forte diminution du nombre de nouvelles infections VHB qui doit être en partie liée à l’augmentation de la couverture vaccinale, c’est toujours pour le VHB que l’on identifie le plus grand nombre de nouvelles contaminations.

- Clinique : après une incubation de 4 à 12 semaines suivant le contact avec le virus, survient un ictère avec ne asthénie intense et des signes de cytolyses. Environ 90% des hépatites B sont anictériques. Le risque de survenue d’une hépatite fulminante est de 1%.

Spécificité antigéniques :

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- enveloppe antigènes HBs, préS1 préS2- core ; antigènes HBc et Hbe ; ADN polymérase ; ADN

bicaténaire

Diagnostic

- sérologie : recherche des antigènes et anticorps spécifiques ; Ag HBs ; Ac HBs ; Ac HBc (Ig totales et IgM) Ag HBe ; Ac HBe.

- L’antigène HBs apparaît en premier, avant les signes cliniques. Il persiste de quelques jours à quelques années (hépatite chronique si > 6 mois)

- L’antigène anti HBe apparaît juste l’Ag HBs ; il est un témoin de la réplication du virus ;

- L’anticorps anti HBe apparaît après la disparition de l’Ag HBs ; il est bon de pronostic ;

- L’anticorps anti HBc est détecté peu de temps après l’Ag HBs. Les IgM signent l’infection aiguë ; les Ig G persistent très longtemps (témoins d’un contact avec le VHB) ;

- L’anticorps anti HBs (neutralisant) signe de la guérison de l’hépatite B ; il est le seul signe biologique après une vaccination.

- Diagnostic spécialisé : recherche de l’ADN viral (hybridation ou PCR) ; recherche de l’ADN – polymérase.

VIRUS DE L’HEPATITE C

Structure :

virus d’environ 50 mm de la famille des Flaviviridae, genre Hepacavirus ; c’est un virus à ARN à symétrie icosaédrique. Il a été identifié par biologie moléculaire en constitutive de core, les régions E1 et E2 – NSI pour les protéines d’enveloppe, les régions NS2 – NS5 pour des protéines non structurales (hélicase, ARN polymérase …) On décrit 6 génotypes principaux, divisés pour certains sous – types.

Epidémiologie :

Transmission parentérale, > 85% de la population Française serait porteuse du virus. Environ 20 à 40% des cas prévalences ont liés à une transfusion sanguine (avant la sérologie VHC systématique lors de chaque don du sang depuis le 1er mars 1990) et 25% à 30% à une toxicomanie IV. Outre le risque transfusionnel maintenant maîtrisé (risque résiduel = 1/380.000), la transmission par le VHC. Les contamination par voie sexuelle et maternofoetale existent mais probablement rares ( ?). Les risque de contamination par le HHC chez les personnes s’étant piquées accidentellement avec une aiguille souillée par le sang est évalué 5 – 10%. Enfin la vie courante offre de nombreuse occasions de contaminations percutanées parentérales peu évidents (partage de rasoirs, brosse à dents

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…) chez environ 20% des sujets, le mode de contamination reste de mécanisme non identifié.

Chez les donneurs de sang : l’incidence est d’environ 10 pour 10.000 chez les nouveaux donneurs et de 1 pour 10.000 chez les donneurs connus.

Sur 633 donneurs confirmés positifs pour le VHC entre le 01/01/1994 et les 31/12/1997, 109 (17%) étaient des séroconversions : la facteur de risque identifié le plus fréquemment (31% des donneurs interrogés) était l’exposition nosocomiale (explorations fonctionnelles et chirurgie sans transfusion). Le risque lié à l’usage de drogue, malgré la sélection en amont du don, représentait 22%. La notion de partenaire sexuel positif pour le VHC a été évoquée chez 8% des donneurs.

Clinique : après une incubation d’environ 5 à 12 semaines suivant le contact avec le virus, survient un ictère avec une asthénie et une cytolyse (transaminases ALT modérément augmentées et fluctuantes). Les formes anictériques sont très fréquentes : au moins 2/3 des cas. Il n’a pas été décrit d’hépatites fulminantes à VHC hormis des associations avec d’autres virus (VHB). Le passage à la chronicité s’observe dans environ 60 – 80% des cas ; au sein de ces formes chroniques, au moins 20% risquent de développer une cirrhose dans un délai de 7 à 30 ans.

Diagnostic

- sérologie : techniques ELISA et tests de validation (immunoblots) les tests de 3ème génération utilisent des protéines recombinantes et/ou des peptides synthétiques. La fenêtre sérologique reste importante : environ 66 jour.

- Biologique moléculaire (PCR) : une recherche d’ARN viral est utile en cas de discordance entre le tests de dépistage et / o de RIBA indéterminé. Dans le cas d’un traitement par interféron, la recherche d’ARN viral est effectué avant le début du traitement puis à intervalles réguliers. La persistance de l’ARN viral après 3 mois de traitement serait prédictive d’une absence de réponse à long terme ou d’une rechute.

Prophylaxie : en fonction des facteurs de risque, mais chez environ 20% des sujets, le mode de contamination reste de mécanisme non identifié !

Risque résiduel transfusionnel : 1/380.000.

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SYPHILIS (Infection à Treponema pallidum)

La syphilis est l’infection causée par Treponema pallidum dont la transmission est essentiellement vénérienne, bien qu’elle puisse également être transmise par contact avec des muqueuses lésées. Autrefois, la transfusion, surtout de sang frais, était un mode d’infection potentiel ; la conservation du sang pendant 24 à 48 heures à 4°C élimine le risque en tuant le tréponème qui est sensible au froid. Il existe encore quelques cas de transmission par piqûre accidentelle des doigts.

Le fait que des donneurs soient infectés par la syphilis est souvent utilisé comme marqueur fiabilité, en mettant en évidence un comportement sexuel à risque. Ce comportement augmentant leur risque d’exposition au VIH, il est préférable de les exclure.

L’agent infectieux

Treponema pallidum est une bactérie de la famille des spirochètes. Il existe quatre tréponèmes humains si semblables qu’ils sont décrits comme des sous – espèces de T. pallidum :

- T. pallidum, sous – espèce pallidum (syphilis)- T. pallidum, sous – espèce pertenue (pian)- T. pallidum, sous – espèce carateum ( pinta)- T. pallidum, sous – espèce endemicum (bejel).

T. pallidum est le plus important et c’est essentiellement de cette sous – espèce que nous traiterons, n’envisageons les autres que brièvement. Pour simplifier, nous la désignerons par T. pallidum.

Les spirochètes ont des parois souples, Gram – négatif, composées d’une membrane externe glycopeptidique portant les antigènes et d’un membrane cytoplasmique interne.

Histoire naturelle de l’infection

Après l’infection initiale, l’évolution naturelle de la syphilis peut être divisée en trois étapes cliniques :

1. La syphilis primaire : après le contact infectant, les spirochètes traversent la muqueuse et pénètrent dans le système lymphatique, laissant une lésion pleine de tréponème à la porte d’entrée.

2. La syphilis secondaire : alors que la lésion initiale guérit, des lésions secondaires apparaissent sur la peau et les muqueuses. Elles fourmillent de tréponèmes et sont donc très

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infectieuses. Il peut, à ce stade, y avoir dissémination non vénérienne de la maladie.

3. La syphilis tertiaire : apparaît 5 à 40 ans plus tard. Les lésions affectent le système nerveux central et l’appareil cardio – vasculaire, où elles peuvent causer des altérations majeures.

L’infection congénitale constitue une autre mode de transmission. Le tréponème traverse le placenta et infecte le fœtus. Ceci aboutit à la mort fœtale ou à une syphilis congénitale qui, non traitée, conduit à des incapacités graves telles que cécité, surdité et lésions osseuses.

Diagnostic biologique de l’infection

Bien que l’observation directe des spirochètes soit possible en microscope sur fond noir, elle se limite à certains stades de l’infection.

Le diagnostic repose donc sur la sérologie, à l’aide de tests spécifiques ou non spécifiques.

Les tests non spécifiques ( réaction à antigène non tréponémique)

Principe

Les réactions du groupe 1 de la nomenclature utilisent un antigène non tréponèmique permettant la détection d’anticorps non spécifiques des tréponèmes appelés réagines.

Il s’agit des techniques d’agglutination du VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) et dérivées qui utilisent une suspension de microcristaux de cholestérol sensibilisés par du phosphatidyl – glycérol (cardiolipide).

Résultats

Le résultat qualitatif est exprimé en croix selon la taille de l’agglutinat (0+++).

Le VDRL permet une mesure semi – quantitative du titre d’anitcorps par dilutions successives du sérum de raison 2 : le titre d’anticorps correspond à l’inverse de la dernière dilution donnant encore une réaction positive.

Intérêt

Le VDRL est une technique peu coûteuse et facile à réaliser. Son principal intérêt est de permettre un suivi thérapeutique : un déclin significatif ( d’au moins deux dilutions) du titre des anticorps indique une réponse favorable au traitement. Son inconvénient majeur est l’existence de réactions non spécifiques ( faux positifs).

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Les tests spécifiques (réactions à antigène tréponèmique)

Les réactions du groupe 2 de la nomenclature permettent la détection des anticorps dirigés contre les antigènes tréponémiques.

Les réactions d’hémagglutination : le TPHA

Principe

Le TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutination Assay) est une réaction d’hémagglutination passive utilisant des hématies tannées et formolées (homme, mouton, oiseau) sensibilisées par une lysat de T. pallidum.Une absorption préalable du sérum dans un ultrasonat de tréponèmes de Reiter (sorbent) est effectuée pour éliminer les anticorps de groupe non spécifiques.

Laboratoire de dépistage des maladies transmissibles E.TS. de Strasbourg

Résultats

Pour le dépistage, le sérum est dilué au 1/80e dans le sorbent avant d’être mis en réaction. Si le dépistage est positif, le résultat est exprimé en titre d’anticorps, obtenu par dilutions successives du sérum de raison 2 : le titre d’anticorps correspond à l’inverse de la dernière dilution donnant encore un réaction positive.

Le seuil de positivité du QTPHA est de 80 unités.

Intérêt

Le TPHA est technique simple à réaliser et très spécifique. A la différence du VDRL, les titres sont peu influencés par un traitement efficace sauf s’il est très précoce et ne permettent pas d’évaluer l’évolutivité de la maladie.

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TRAVAUX PRATIQUES

Les techniques du groupages sanguins sont relativement simples néanmoins ils ne sont pas toujours correctement exécutés avec la clé du conséquences qui peuvent être très graves. Il est donc indispensable de rappeler quelques principes fondamentaux qu’il ne faut pas négliger à savoir :

- bien s’installer à la paillasse- bien connaître le matériel- s’avoir se servir de ce matériel- apprendre à bien étaler et à lire correctement une

agglutination

4. INSTALLATION A LA PAILLASSE

Le technicien doit être installé confortablement devant sa paillasse en ayant à portée de main, tout le matériel dont il a besoin afin de n’avoir pas à se déplacer constamment.

A droite il doit disposer

- cellulose ou papier buvard- béchers pour lavage- cristallisoir- flacon de sérum &- marqueur - fiches de résultats- différentes pipettes utilisés.

A gauche

- Réshuscope- Pipette d’eau &- Minuteur ou chronomètre- Microscope

En face

- portoirs - réserves de tubes- échantillons de sang à tester - plaque d’opaline- réactif - centrifugeuses de paillasse.

Autre matériel

- réfrigérateur- congélateur- étuve

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- bain – marie- agitateurs- balance de précision de 0,1 – 300g

5. BIEN CONNAITRE LE MATERIEL

5.1. PETIT MATERIEL

- les tubes : ces tubes en verre ou en matière plastique et ont les dimension suivantes : 75 mm de hauteur, 12 à 10 mm de diamètre intérieur, et pour les micro tubes : 50 mm de hauteur, 5 à 6 mm de diamètre intérieur.

- Plaque d’opaline ou de porcelaine blanche : 15 x 30 cm, 15 x 20 cm, certaines plaques comportent des godets.

- Lames porte – objet pour lecture au microscope : sont présentées en boites, prêtés à l’emploi.

- Cellule (papier buvard) découpé en carré 15 x 15 cm, indispensable pour sécher les pipettes ou dégraisser les plaques et les lames.

- Les pipetteso La pipette pasteur avec tétine est la plus couramment

utilisée. Elle est fabriquée par étirement au bec Busen d’une baguette de verre creux. La pipette pasteur est calibré de manière à délivrer 20 gouttes pour 1 ml.

Le point très important est l’étanchéité absolue de la zone par un élastique très serré.

La façon de tenir la pipette est très personnelle à chaque technicien. On peut tenir le corps entre le majeur et l’annulaire de la main droite, de manière à saisir la tétine entre le pouce et l’index. Il est très important de pouvoir contrôler la pression du pouce et de l’index sur cette dernière. A partir d’une certaine expérience, cette sensation devient automatique pour le technicien.

Rinçage et séchage de la pipette

Ces deux opérations sont probablement les temps les plus importants de tout le travail technique en immunohématologie.

Rinçage : la pipette dont la tétine est serrée entre le pouce et l’index, est plongée dans un premier bécher ; par de pression sur la tétine, le liquide monte alors jusqu’à environ le deux tiers de la pipette. Le liquide est ensuite rejeté dans le cristallisoir, par pression forte sur la tétine. L’opération est à recommencer dans le deuxième bécher, une première et une seconde fois.

Toute pipete mal rincée peut contaminer toutes les réactions des différentes manipulation. Le liquide ne doit jamais monter jusque dans la tétine.

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Séchage : maintenir la pipette verticalement contre le tampon de cellulose. Ce dernier repose sur un plan dur. Par pression sur la tétine, le liquide est rejeté dans la cellulose.

Autres pipettes :

- pipettes graduées- pipettes jaugées - micro pipettes automatique avec une gamme de pointe

permettant des prélèvements de 5 à 1000 ml.- Les pipettes en matière plastique de 250 ml pour les lavages - Cristallisoir : 20 cm de diamètre sur 8 cm de hauteur, permet

de recueillir l’eau souillée des rinçage des pipettes et le matériel sale utilisé (lames, tubes etc…)

- Portoir en bois ou en plastique, parfois en acier- Baguettes de verre vidé : pour mélanger ou étaler les réactifs - Eau physiologique : à 9% en flacon stérile, peut être préparée

au laboratoire (9 g de Na Cl Q.S.P 1000 ml d’eau distillée)- Crayons marqueurs résistants à l’eau et spéciaux pour le verre

et le plastique- Rhésuscope : il existe de nombreux modèles. La source de

lumière et de chaleur est fournie soit par des lampes, soit par des tubes électriques au dessus desquels est glissée une plaque de verre dépoli.

5.2. LES CENTRIFUGEUSES

De très ombreux types différents de centrifugeuse de paillasse sont actuellement disponibles. Il faut en pratique disposer d’une petite centrifugeuse de paillasse simple et pour les grands laboratoires d’une centrifugeuse plus élaborée disposant d’une panoplie plus étendue de couronnes différentes verreries.

5.3. LES SYSTEMES DE CONSERVATION

Une température de 4° est nécessaire et suffisante pour conserver les réactifs. Il faut pour cela un simple réfrigérateur ou pour des grands laboratoires une chambre froide.

Les stocks de sérums tests et quelque fois des échantillons nécessite des congélateurs de –20°C à –80°C que n’atteignent pas la partie congélateur des réfrigérateurs.

6. BIEN ETALER ET LIRE CORRECTEMENT UNE AGGLUTINATION

6.1. SUR PLAQUE D’OPALINE

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Un mélange sur plaque d’opaline doit être étalé sur un cercle de 2 à 3 cm de diamètre. A l’aide d’une baguette de verre rodée ou d’un fond de tube, on effectue sur la plaque le mélange entre sérum test et globule rouge en décrivant une spirale excentrique jusqu’à étaler sur une surface de 2 à 3 cm de diamètre. La plaque est alors habilement chaloupé par une mouvement lent de relation – oscillation. On pourra ainsi apprécier la vitesse de l’agglutination, mais aussi reconnaître facilement une double avec son image typique comprenant du agglutination au milieu d’une nappe d’hématies libres.

6.2. EN TUBE

- L’agglutination en tube de Kahn nécessite généralement une légère centrifugation. Elle se lit alors en regardant le fond du tube incliné après centrifugation légère, sur le fond blanc.

- L’agglutination en micro tube se lit après sédimentation spontanée des hématies. La lecture se fait alors après étalement sur lame, au microscope, ou après étalement sur plaque d’opaline.

Comment étaler sur une lame

La pipette pasteur dont la tétine est fortement pressé entre le pouce et l’index est introduite dans le tube en guidant sur le rebord. Grâce à une légère dépression de la tétine, ou aspire ensemble le réactif et les globules rouges (culot). La pression entre le pouce et l’index doit être maintenue alors constante de manière à ce que le mélange agglutinants – réactifs ne soit ni aspiré ni refoulé par la tétine. On dépose alors délicatement le mélange sur la lame inclinée à 45° en le laissant tomber de sorte qu’il s’y écoule sans traumatisme. La lame est alors chaloupée avec ménagement, et l’étalement se fait donc spontanément.

Etalement sur plaque d’opaline

On dépose le mélange réactif – globules rouges sur la plaque où elle doit tomber, et non en y parvenant par capillarité. La tétine étant bien serrée entre le pouce et l’index, on étale alors avec le bout de la pipette, de l’intérieur vers l’extérieur, par des traces circulaires excentriques, jusqu’à obtenir un cercle de 2 cm de diamètre.

7. QUELQUES MANIPULATIONS ELEMENTAIRES

7.1. SEPARATION DU SERUM ET DES GLOBULES ROUGES D’UN PRELEVEMENT COAGULE

Lorsque le sérum est bien exudé et séparé du caillot, il est possible de prélever à la pipette pasteur la quantité nécessaire pour le groupage ABO

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(épreuve sérique), sinon on séparera le sérum et les globules rouges pour centrifugation.

Pour préparer la suspension d’hématies, le caillot est décollé des bords du tube à l’aide d’une baguette de verre, puis le tube est agité légèrement : les hématies se mettent ainsi spontanément en suspension dans leur propre sérum.

7.2. LAVAGE DES HEMATIES

Il s’agit de débarrasser les hématies de tout plasma ou de tout sérum qui les environnent et de les mettre ensuite en suspension dans un milieu adéquat (eau physiologique, sérum humain compatible, solution à basse force ionique). Pour ce faire, on utilise des centrifugations successives séparant les hématies du plasma, puis du liquide surnageant. Après trois lavages, les hématies sont pratiquement débarrassées de toute trace de plasma ou de sérum ambiant. Cependant, dans certains cas, il est nécessaire d’effectuer un plus grand nombre de lavage (6 cm minimum).

TECHNIQUE

- Donner un tube à hémolyse, à un volume de globules rouges déplasmatisé, on ajoute 5 (ou plus) volume d’eau physiologique ;

- Centrifuger pendant 5 minutes à 3000 tours / munite : éliminer le surnageant soit avec une troupe à vide, soit avec un pipette pasteur, ainsi que la péllicule blanche superficielle riche en leucocytes et en plaquettes ;

- Remplir le tube avec un nouveau volume d’eau périphérique : mélanger l’ensemble par agitation ;

- Remplir à nouveau le tube de sérum physiologique et recommencer trois fois.

Les globules rouges ainsi pourront être :

- soit remis en suspension- soit traités par des enzymes protéolytiques- soit utilisés sous forme de culot globulaire (absorption, fixation

– élution)

7.3. PREPARATION DES SUSPENSION DE GLOBULES ROUGES

Selon les techniques utilisées, les globules rouges sont mis en suspensions dans différents milieux, par exemple :saline, albumine, sérum AB. Ces différentes suspensions doivent être préparées si possible chaque jour et conservé à 4°C dans la journée.

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- pour les techniques d’agglutination sur plaque à la température du laboratoire, exemple groupage ABO, suspension saline à 10% (1 volume de globule rouge 10 volume d’eau physiologique) ;

- Pour les techniques fines d’agglutination sur plaque à la température du laboratoire, exemple l’étuve d’un A faible, suspension saline à 5 % (1 volume de culot pour 20 volume de liquide physiologique) ;

- Pour les techniques d’agglutination sur plaque chauffée, détermination d’un Rhésus par exemple : suspension à 40% (2 volumes de culot + 5 volumes de liquide) ;

- Pour les techniques d’agglutination en tube : suspension à 2% (1volume de culot + 50 volumes de liquide) ou 5%.

8. UTILISATION DES REACTIFS

Les réactifs utilisés en immunohématologie ne sont pas des produits chimiques stables, mais des produits biologiques fragiles parfois, souvent d’origine humaine, donc précieux.

- Pour l’usage courant, ils ont généralement conservés à + 4°C, mais certains d’entre eux, comme les antiglobulines, auront intérêt a être conservés à – 20°C, voire 80°C. Il faut alors éviter de les décongeler et recongeler . Lors de la première décongélation, on fractionnera le réactif en petite quantité correspondant à une utilisation d’une journée de travail.

- La distribution des réactifs doit éviter toute souillure ;- Il est impératif de se conformer au mode d’emploi indiqué par

le laboratoire qui a produit le réactif, de même que les conditions (température, temps d’incubation etc…) doivent respectées.

- Ne pas omettre d’utiliser les témoins négatif et positif ;- Savoir utiliser le hématies pour tests afin d’éviter des erreurs

o Bien laver les hématies pour les débarrasser de toutes trace de protéines plasmatiques

o Utiliser les hématies tests à des concentrations correctes.

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