DETERMINATION DE LA TENEUR EN CARBAMATE … · Préparation des solutions d’étalonnage L1 à L6...

LAB 23 I-MET-086-Ethyle carbamate-v11 1/21

Agence fédérale

pour la Sécurité

de la Chaîne alimentaire

Administration des Laboratoires

MET-LFSAL-086

DETERMINATION DE LA TENEUR EN CARBAMATE D’ETHYLE DANS LES BOISSONS FERMENTEES PAR GC/MS

Version V11

Date d’application 2014/08/01

Rédaction par : Thierry De Tandt (Expert technique) (24/07/2013)

Vérification par : Luc Bollen (Quality Manager) (28/07/2013)

Autorisation de publication par : Fabian Etienne-Thewissen (Chef de section) (25/07/2013)

Gestion et localisation de la

version valide :

LFSAL : disque local M:\Qualité\ Méthode\

Destinataires : Membres du personnel de la section Phyto/Résidus.

Mots clefs : Boissons fermentées, yaourt, alcool, bière, vin, vinaigre,

uréthane, éthyle carbamate, GC/MS

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Aperçu des modifications

Révision

par/date*

Motif de la révision Partie du texte/portée de la

révision

2006-07-24

Etienne-

Thewissen F.

Rédaction méthode initiale

2009-04-28 Adaptation au nouveau Template Page de garde et pied de

page

2009-06-17

Pallares O.

Adaptation méthode

2010-03-01

De Tandt T.

Adaptation au nouveau Template

Adaptation Flow chart, critères qualité, cas du

vinaigre, référence formulaire, objectif,

caractéristiques de performances,…

Table des matières et mise en

page

2010-09-27

De Tandt T.

Passage de 8 levels à 6, précision sur la

séquence d’injection

Points 8.2.2 ; 10.4 et 11.1

2010-12-15

De Tandt T.

Légères modifications concernant le SI

(volume/concentration), précisions sur

l’évaporation (multi-évaporateur ajouté) et sur la

séquence d’injection.

Points 8.2 ; 10.2 et 10.4

2011-04-08

Pallares O.

Suppression du SI de MethylCarbamate

Adaptation solution de dopage, colonne

analytique, conditions chromatographiques et

séquence injection.

Points 8, 8.2.3, 9 et 10.1,

10.3, 10.4, 11.2

2011-06-29

Pallares O.

Adaptation au nouveau template, ajout des

données pour les vinaigres, insertion exemples

de chromatogrammes. Ajout critère de qualité

Points 6.3, 9 et 10.1, 10.1.1,

10.1.2, 10.2, 10.2.1, 10.2.2,

11.1, 11.4, 11.5, 12, 14.2

2013-06-14

De Tandt T.

Ajout texte au paragraphe 3.

Ajout de niveaux de calibration.

Ajout possibilité d’utiliser un échantillon type

(carte de contrôle) au lieu d’un échantillon dopé.

Préparation : restructuration du texte et

adaptation du flowchart.

Adaptation de point 6 Critères de performances.

Tout. Les modifications ne

seront pas apparentes pour

plus de clareté.

2013-09-20

De Tandt T.

Correction du texte (tableau correct).

Ajout de la possibilité de doper à différents

niveaux.

8.2.2 Préparation des

solutions d’étalonnage L7 à

L10.

8.2.3 Solution de dopage.

10.1 Préparation de

l’échantillon de contrôle.

2014-07-24

De Tandt T.

2 corrections mineures suite à l’audit interne du

07/07/14.

8.2. Solutions

* L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.

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TABLE DES MATIERES

1. OBJECTIF .......................................................................................................................... 4

2. CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4

3. DOCUMENTS LÉGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 4

4. DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS ................................................................................... 4

5. PRINCIPE ........................................................................................................................... 5

6. CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE ................................................................... 5

7. CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUES ........................................... 5

8. RÉACTIFS ET SOLUTIONS .............................................................................................. 6

8.1 RÉACTIFS ....................................................................................................................... 6 8.2 SOLUTIONS ..................................................................................................................... 6

8.2.1 Solution de standard interne ................................................................................ 6 8.2.2 Solutions d'étalonnage ......................................................................................... 6 8.2.3 Solutions de dopage (si nécessaire) .................................................................... 7

9. APPAREILS ....................................................................................................................... 8

10. MÉTHODE .......................................................................................................................... 9

10.1 PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON DE CONTRÔLE .......................................................... 9 10.2 PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS INCONNUS .............................................................. 9

10.2.1 Absorption sur terre de diatomée ........................................................................ 9 10.2.2 Elution, concentration et mise en vial d’injection ............................................... 10

10.3 CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES ........................................................................ 10 10.4 SÉQUENCE D’INJECTION DES SOLUTIONS ................................................................... 10

11. CONTRÔLE DE LA QUALITÉ ......................................................................................... 11

11.1 CONSTRUCTION DE LA COURBE D’ÉTALONNAGE .......................................................... 11 11.2 CONTRÔLE DE LA STABILITÉ DU SYSTÈME ................................................................... 11 11.3 CONTRÔLE DES TEMPS DE RÉTENTION ....................................................................... 12 11.4 CONTRÔLE DES ÉCHANTILLONS DE CONTRÔLE ........................................................... 12 11.5 CONTRÔLES SECONDE ET TROISIÈME LIGNES : ........................................................... 12

12. CALCUL ET RAPPORTAGE ........................................................................................... 12

13. RÉFÉRENCE AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFÉRENTS .................................................................................................... 13

13.1 PROCÉDURES ........................................................................................................... 13 13.2 FORMULAIRES .......................................................................................................... 13

14. ANNEXES ........................................................................................................................ 13

14.1 SPECTRES ............................................................................................................... 13 14.2 CHROMATOGRAMMES ............................................................................................... 13 14.3 MÉTHODE INSTRUMENTALE ....................................................................................... 13 14.4 FLOW CHART ............................................................................................................ 13

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1. Objectif

« Le carbamate d’éthyle est naturellement présent dans les aliments fermentés tels que le pain, la sauce de soja, le yaourt et le vinaigre, ainsi que dans les boissons alcoolisées tels que le vin, la bière, les spiritueux et, plus particulièrement, les eaux-de-vie de fruits à noyau. Plusieurs précurseurs présents dans les aliments et les boissons tels que l’acide cyanhydrique, l’urée et l’éthanol peuvent conduire à la formation de carbamate d’éthyle pendant le traitement et la conservation des aliments. Le carbamate d’éthyle est un composé génotoxique et cancérogène multi-site chez les animaux et il est probablement cancérogène aussi chez l’homme. La Commission européenne a demandé au groupe scientifique CONTAM d’émettre un avis scientifique sur les risques pour la santé humaine liés à la présence de carbamate d’éthyle et d’acide cyanhydrique dans les aliments et les boissons alcoolisées, en particulier les eaux-de-vie de fruits à noyau …. Le groupe scientifique a conclu que le carbamate d’éthyle dans les boissons alcoolisées constitue un risque pour la santé, notamment lorsqu’il s’agit d’eaux-de-vie de fruits à noyau. … Des mesures de limitation devraient être prises afin de réduire les taux de carbamate d’éthyle dans certaines boissons alcoolisées telles que les eaux-de-vie de fruit. »* Le but de la méthode est d’évaluer quantitativement le carbamate d’éthyle dans les boissons fermentées à des concentrations supérieures à 10 µg/kg par GC-MS. *source : EFSA (European Food Safety Authority) - extrait du résumé « Carbamate d’éthyle et acide cyanhydrique

dans les aliments et les boissons », avis du groupe scientifique sur les contaminants, question N° EFSA-Q-2006-076, adopté le 20 septembre 2007.

2. Champ d’application

Cette méthode s’applique à la détermination de la teneur carbamate d’éthyle dans les boissons fermentées par GC-MS. Les matrices cibles sont les yaourts, les laits fermentés, les bières, les vins, les alcools et les vinaigres.

3. Documents légaux et normatifs

Pas de base juridique actuellement. Les analyses servent à la collecte de données (monitoring) à la demande de la Commission Recommandation de la Commission du 2 mars 2010 concernant la prévention et la réduction de la contamination des eaux de vie de fruits à noyaux et des eaux de vie de marc de fruits à noyaux par le carbamate d’éthyle ainsi que le suivi des teneurs en carbamate d’éthyle dans ces boissons (recommandation 2010/133/UE).

4. Définitions et abréviations

SIM : Selected Ion Monitoring (enregistrement de certains fragments uniquement)

Full Scan : balayage complet (enregistrement de spectres de masses complets)

GC-MS : système chromatographique gazeux avec détection par spectrométrie de masse.

Carbamate d’éthyle

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http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:052:0053:0057:FR:PDF



5. Principe Les échantillons sont soumis à une extraction liquide/liquide au dichlorométhane sur un support de terre diatomée. L’éluat est concentré par évaporation « sous vide » et injecté dans un GC-MS. La quantification se fait sur base d’une calibration externe.

6. Caractéristiques de performance

Résumé issu du dossier de validation :

Groupe de matrice Boissons fermentées Domaine de validation Gamme de quantification 5 à 50 µg/kg

Modèle mathématique Linéaire Etalonnage

Critère sur l'étalonnage ± 10 %

Critère sur l'identification par temps de rétention

± 0,1 min Spécificité

Technique analytique Spectrométrie de masse

LOQ 5 µg/kg LOQ

LOD 2,5 µg/kg LOD

Critère sur le rendement entre 70 et 120 %

Justesse Rendement le plus bas observé 82% 84% 89%

Rendement le plus haut observé 117% 105% 109%

Rendement moyen obtenu 99% 96% 100%

CVr MAX (= 2/3 CVHOR) 21%

Répétabilité CVr 9,0% 5,5% 6,0%

Répétabilité 2,48 µg/kg 1,49 µg/kg 1,69 µg/kg

CVr MAX (= 2/3 CVHOR) 32% Reproductibilité intra-laboratoire

CVr 9,0% 5,9% 6,0%

Reproductibilité 2,48 µg/kg 1,59 µg/kg 1,69 µg/kg

Incertitude de mesure basée sur la fidélité intermédiaire et le biais

24,3% 19,3% 16,6% Incertitude de

mesure

bière vin yaourt

7. Consignes de sécurité et mesures spécifiques Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs. Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte. Le port des gants de protection est vivement conseillé lors des manipulations. En effet, il s’agit de produits cancérigènes.

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8. Réactifs et solutions

8.1 Réactifs

Carbamate d’éthyle (= Uréthane) : standard analytique (≥99.0 %)

Carbamate d’éthyle-d5 (Uréthane-d5) : standard analytique (≥ 98.0 %)

Acétate d’éthyle (qualité HPLC)

Dichlorométhane (qualité HPLC)

Chlorure de sodium (qualité pour analyse)

Terre de diatomée (Kieselgur, Célite, Hydromatrix, Chem Elut) en vrac pour les échantillons peu fluides comme le yaourt, ou en cartouche de 10 ml pour les échantillons fluides.

Hydroxyde de sodium 5 N (qualité pour analyse) (pour les vinaigres)

8.2 Solutions

8.2.1 Solution de standard interne

Peser environ* 10 mg du standard analytique dans un ballon jaugé 10 ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle, homogénéiser la solution (1000 µg/ml) (* la concentration exacte de la solution de SI n’intervient pas dans le calcul des teneurs en carbamate d’éthyle dans les échantillons). Transférer 100 µl de la solution précédente dans un ballon jaugé de 50 ml, compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle et homogénéiser la solution (2 µg/ml).

8.2.2 Solutions d'étalonnage

Préparation de la solution mère à 1mg/ml (SM)

Peser précisément à la balance analytique (à 0,1 mg près) 20 mg du standard analytique de Carbamate d’éthyle dans un ballon jaugé 20 ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.

Préparation de la solution fille à 10 µg/ml (SF) Transférer 200 µl de la solution mère à 1 mg/ml dans un ballon jaugé de 20 ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.

Préparation des solutions d’étalonnage L1 à L6 Prélever V µl de la solution fille à 10 µg/ml, en ballon jaugé de 10ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution. Ces solutions doivent être conservées au frais à l’abri de la lumière. La durée de validité de ces solutions a été déterminée à un mois.

Solution V (µl) SF Volume final (ml) [ng/ml]

L1 100 10 100

L2 150 10 150

L3 200 10 200

L4 300 10 300

L5 600 10 600

L6 1000 10 1000

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Préparation des solutions d’étalonnage L7 à L10 Dans le cas d’échantillon présentant des teneurs supérieures à 50 µg/kg (comme des eaux-de-vie de fruits à noyaux), il est nécessaire de réaliser des niveaux d’étalonnage supplémentaires. Prélever V µl de la solution mère à 1 mg/ml, en ballon jaugé de 50 ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution. Ces solutions doivent être conservées au réfrigérateur frais à l’abri de la lumière. La durée de validité de ces solutions a été déterminée à un mois.

Solution V (µl) SM Volume final (ml) [ng/ml]

L7 100 50 2000

L8 250 50 5000

L9 500 50 10000

L10 1000 50 20000

Préparation des vials des levels de calibration Lors de chaque série d’analyse la réalisation d’une nouvelle courbe est effectuée de la manière suivante. Prélever en vial de 2 ml, 500 µl de chaque solution d’étalonnage et ajouter ensuite 200 µl de la solution de standard interne. Les vials des levels de calibration sont prêts pour l’injection. Si le mode opératoire pour la préparation des échantillons est respecté, les vials des levels de calibration ainsi préparés correspondent à des échantillons aux concentrations suivantes en carbamate d’éthyle :

Vial Correspond à un échantillon contenant

L1 5,0 µg/kg

L2 7,5 µg/kg

L3 10,0 µg/kg

L4 15,0 µg/kg

L5 30,0 µg/kg

L6 50,0 µg/kg

L7 100,0 µg/kg

L8 250,0 µg/kg

L9 500,0 µg/kg

L10 1000,0 µg/kg

8.2.3 Solutions de dopage (si nécessaire)

Cette solution est préparée fraîchement pour chaque série d’analyse.

Préparation de la solution mère à 1mg/ml

Peser précisément à la balance analytique (à 0,1 mg près) 20 mg du standard analytique de Carbamate d’éthyle dans un ballon jaugé 20 ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.

Préparation de la solution de dopage à 10 µg/ml

Transférer 200 µl de la solution mère à 1 mg/ml dans un ballon jaugé de 20 ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.

Préparation de la solution de dopage à 1 µg/ml Prélever 1000 µl de la solution fille à 10 µg/ml dans un ballon jaugé de 10 ml et compléter au trait à l’aide d’acétate d’éthyle. Homogénéiser la solution.

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9. Appareils

Chaîne Chromatographique gazeuse équipée au minimum d’un détecteur type « simple quadrupole » et d’une colonne adaptée à la recherche des molécules visées (exemple : Bp-21).

Agitateur mécanique pouvant accepter les tubes à centrifuger.

Balance analytique.

Trébuchet (précision minimale : 0,1 g).

Tube à centrifuger de 50 ml (type Falcon).

Système d’évaporation « sous vide ».

Ampoules en verre piriformes de 100ml ou plus.

Micropipettes à volume variable de 100 à 1000 µl et 50 à 200µl.

Colonnes chromatographiques d’extraction en verre avec robinet (matrices épaisses) ou cartouche ChemElut (10g) complétée avec un robinet (matrices fluides) :

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10. Méthode

10.1 Préparation de l’échantillon de contrôle A chaque séquence d’analyses, un échantillon de contrôle est analysé : il peut s’agir d’un échantillon type (stable) associé à une carte de contrôle ou, à défaut, d’un échantillon de la série qui est dopé. Un échantillon de contrôle est réalisé pour chacun des 3 types de préparation présents dans la séquence d’analyses, à savoir :

Vinaigre

Echantillon fluide autre que vinaigre (ex : bière, alcool, vin)

Échantillon peu fluide (ex : yaourt) Pour supplémenter un échantillon, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, mais ajouter précisément à la micropipette le volume désiré de la solution de dopage à la prise d’essai de 10 g en tube falcon. A titre d’exemples :

- Un ajout de 100 µl de la solution de dopage à 1 µg/ml correspond à un ajout d’environ 10 µg/kg (11 µg/kg dans le cas d’un vinaigre). Ce niveau de dopage convient pour un échantillon à faible teneur (vin, bière, vinaigre, yaourt).

- Un ajout de 300 µl de la solution de dopage à 10 µg/ml correspond à un ajout d’environ 300 µg/kg. Ce niveau de dopage convient pour un échantillon à haute teneur (alcool de fruit à noyau).

10.2 Préparation des échantillons inconnus

10.2.1 Absorption sur terre de diatomée

10.2.1.1 Echantillons fluides

Remarque préliminaire : les vinaigres sont neutralisés avant de les mettre en contact avec la terre de diatomée : - En bécher de 150 ml, peser environ 50 g d’échantillon avec une précision minimale

de 0,1 g. - Neutraliser ensuite la matrice pour atteindre un pH se situant entre 6 et 8, par ajout

de NaOH 5N (il faut environ 1ml de NaOH 5N pour 10 g de matrice). Relever la quantité de NaOH utilisée pour la neutralisation de la matrice.

en tube Falcon, peser environ 10 g d’échantillon (neutralisé pour un vinaigre) avec une précision minimale de 0,1 g.

ajouter 1g de NaCl. Agiter manuellement

transférer le contenu du Falcon sur une cartouche d’extraction Chem-Elut. Laisser équilibrer pendant 10 minutes.

10.2.1.2 Echantillons épais

en tube Falcon, peser environ 10 g d’échantillon avec une précision minimale de 0,1 g.

ajouter 1g de NaCl. Agiter manuellement.

ajouter 10 g de terre de diatomée dans le Falcon et agiter fortement mécaniquement pendant 5 minutes.

transférer ce mélange dans une colonne d’extraction en verre.

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10.2.2 Elution, concentration et mise en vial d’injection

éluer avec 100 ml de dichlorométhane et récupérer l’éluat en laissant couler goutte à goutte (placer un robinet sous les cartouches) dans la verrerie adaptée au système d’évaporation utilisé.

évaporer presqu’à sec (garder environ 500 µl) à l’évaporateur rotatif (t° = 40°C) ou à l’aide d’un système similaire*.

ajouter 200 µl de solution de standards internes à l’échantillon concentré.

rincer les parois avec son contenu puis le transvaser dans un vial 2ml (utiliser des vials avec filtre incorporé si la solution est trouble).

injecter et analyser par GC/MS. * exemple : système multi-évaporateur Buchi Syncore avec volume final réfrigéré de 300 µl (T° réfrigérant : 6°C ; T° bloc chauffant : 40°C ; T° prise d’air : 60°C, vitesse d’agitation : 200 rpm ; dépression : débuter à 650 mbar puis diminuer de sorte à obtenir une évaporation douce mais continue ; T° reflux : non utilisé pour le dichlorométhane).

10.3 Conditions chromatographiques

Un chromatographe gazeux couplé à un spectromètre de masse est utilisé pour la séparation et la détermination du carbamate d’éthyle dans les échantillons.

Les paramètres instrumentaux principaux sont les suivants (plus de détails en annexe):

chromatographe: trace 2000 avec autosampler AS 2000 (à titre d’exemple) colonne : Bp21 (SGE) ; 30 m X 0.25mm ; épaisseur de phase: 0,25 µm

(ou colonne équivalente) volume d’injection: 1 µl mode d’injection: splitless/1 min. température d’injection: 180°C

four (paramètres à adapter en fonction de la colonne utilisée): température initiale: 40°C/0,75min.

rampe1: 15°C/min. 60°C/5 min

rampe2: 5°C/min. 150°C.

rampe3: 30°C/min. 220°C/5 min

fragmentation (impact électronique70 éV) : Scan 1 SIM m/z 62 (carbamate d’éthyle) Scan 2 SIM m/z 64 (carbamate d’éthyle-d5)

10.4 Séquence d’injection des solutions Injecter d’abord en Full Scan un level de calibration pour contrôler les temps de rétention et ajuster les fenêtres de la méthode SIM si nécessaire. Un maximum de 10 échantillons seront injectés avant une nouvelle injection des levels 2 et 5 (et 9 dans le cas d’une courbe à 10 niveaux), le nombre exact sera adapté en fonction de la série : ex pour 14 échantillons, les contrôles seront placés après 7 échantillons. Toujours terminer la séquence d’injection par les levels 2 et 5 (et 9 le cas échéant).

courbe d’étalonnage L1 L6 (ou L10) échantillons de contrôle échantillons inconnus L2 et L5 (et L9 le cas échéant) (tous les 10 échantillons au maximum et

en fin de séquence)

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11. Contrôle de la qualité

11.1 Construction de la courbe d’étalonnage A chaque séquence d’analyse, la nouvelle courbe d’étalonnage doit répondre aux critères suivants :

- elle doit comporter au moins 5 levels de calibration.

- Le rejet d’un des points de calibration est autorisé à condition que cela ne soit ni le premier ni le dernier level.

- un level ne peut être pris en compte pour la construction de la courbe d’étalonnage que si la différence entre sa concentration théorique, calculée en tenant compte de la concentration exacte de la solution mère d’éthyle carbamate, et la concentration mesurée est inférieure à 10%.

11.2 Contrôle de la stabilité du système Pendant la séquence, la validité de la courbe est vérifiée en continu par l’injection régulières des levels L2 et L5 (et L9 le cas échéant). Le critère d’acceptation est le même que celui utilisé pour la construction de la courbe : la différence entre la concentration théorique de chaque level et sa concentration mesurée doit être inférieure à 10 %.

5

7,5

10

15

30

50

0 10 20 30 40 50 60

Facte

ur

de r

ép

on

se d

es levels

Teneur en Carbamte d'éthyle (µg/kg)

exemple de courbe d'étalonnage

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11.3 Contrôle des temps de rétention

L’identification du carbamate d’éthyle dans les échantillons se fait sur base de l’ion m/z 62, le temps de rétention ne devant pas varier de plus de 0,1 minute par rapport à celui de la solution de calibration la plus proche. Ce contrôle peut se faire par l’introduction de cette valeur dans les paramètres d’identification de la méthode de processing utilisée.

11.4 Contrôle des échantillons de contrôle

Dans le cas de l’utilisation d’un échantillon type, établir et interpréter sa carte de contrôle comme décrit au point 5 de la procédure LAB23 P018 «Création et suivi des cartes de contrôle qualité ».

Dans le cas de l’utilisation d’un échantillon supplémenté, une carte de contrôle est construite sur les rendements obtenus dans chaque série d’analyses (point 6 de la procédure LAB23 P018 «Création et suivi des cartes de contrôle qualité »). Si "n" est le nombre de résultats disponibles sur la carte de contrôle, la fourchette de résultat acceptable est calculée pour "n = 8", puis revue pour "n = 15" et "n = 30", et enfin fixée pour "n = 50". Si le résultat obtenu est en-dehors de la fourchette acceptable, rechercher la cause du problème et y remédier. En fonction de la nature de la cause du problème, la séquence d’analyse sera soit préparée une seconde fois, soit réinjectée. Le calcul du rendement d’un échantillon supplémenté se fait comme suit :

Taux de récupération CT

100CA (%)

Où : CA = concentration trouvée analytiquement dans l’échantillon dopé (en µg/kg) CT = concentration théorique dans l’échantillon dopé (en µg/kg) = CAND + (VD x CD x1000 / PD) Où : CAND = concentration trouvée analytiquement dans l’échantillon non dopé (en µg/kg) VD = volume de solution de dopage utilisée pour doper l’échantillon (en ml) CD = concentration de solution de dopage utilisée pour doper l’échantillon (µg/ml) PD = prise d’essai de l’échantillon (corrigée si vinaigre) dopé (g)

11.5 Contrôles seconde et troisième lignes : Selon la procédure : LAB23 P020 : « Gestion des contrôles qualité »

12. Calcul et rapportage Les teneurs à introduire dans le logiciel pour les levels de calibration doivent tenir compte de la concentration exacte de la solution mère de carbamate d’éthyle. Ces teneurs sont calculées sur base d’une prise d’essai de 10 g et sont exprimées en µg/kg d’échantillon. Il faut également tenir compte de la pesée exacte de chaque échantillon inconnu. Cela se fait généralement via l’introduction d’un facteur de correction dans le logiciel : il faut multiplier le résultat par le facteur 10/prise d’essai (g).

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Remarque pour les vinaigres : lors du calcul des teneurs en carbamate d’éthyle, il faut également prendre en considération la neutralisation effectuée sur cet échantillon pour calculer sa pesée exacte. En effet, lors de la mise en Falcon d’échantillon neutralisé, la prise d’essai ne contient pas uniquement du vinaigre, mais aussi une certaine proportion de NaOH (environ un dixième). La correction sur la pesée se fait par la multiplication par le facteur suivant : pesée échantillon non neutralisé (g) . pesée échantillon non neutralisé (g) + quantité de NaOH utilisée (g) Le rapport comportera les données brutes (surfaces et temps de rétention des pics), ainsi que les contrôles visés au point 11 (contrôle de la qualité) et la courbe de calibration. Si une confirmation spectrale est nécessaire, joindre les spectres obtenus pour l’échantillon et celui de référence (base de données ou spectre d’un dopé). Le rapport d’exécution final résumera les résultats obtenus pour tous les échantillons de la série.

13. Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents

13.1 Procédures

LAB 23 P 020 Gestion des contrôles qualité LAB 23 P 018 Création et suivi des cartes de contrôle qualité

13.2 Formulaires LAB23 F543-PR03-ETHYLCARBAMATE : « RAPPORT D'EXECUTION – DOSAGE DE

L'ETHYLCARBAMATE – MET-LFSAL-086 »

14. Annexes

14.1 Spectres Annexe 1 : Spectres du carbamate d’éthyle et du carbamate d’éthyle-d5

14.2 Chromatogrammes Annexe 2 : exemples de chromatogrammes d’échantillons non dopés contenant naturellement du carbamate d’éthyle. Un chromatogramme est présenté pour chacune des trois matrices validées (vin, bière et vinaigres). Les teneurs respectives calculées pour ces trois matrices sont d’environ :

- 10 µg/kg pour le vin - 12 µg/kg pour la bière - 4 µg/kg pour le vinaigre

14.3 Méthode instrumentale

Annexe 3 : Méthode instrumentale : printscreen du logiciel Excalibur.

14.4 Flow chart Annexe 4 : Flow chart de la préparation des échantillons.

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Annexe 1

Spectres du carbamate d’éthyle et du carbamate d’éthyle-d5

Spectre1: carbamate d’éthyle : acquisition TIC m/z: 50 – 250

Spectre 2 : carbamate d’éthyle-d5: acquisition TIC m/z: 50 – 250 (Solution contenant le carbamate d’éthyle et le carbamate d’éthyle – d5).

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Annexe 2

Chromatogramme d’un vin ayant une teneur en carbamate d’éthyle d’environ 10 µg/kg

Chromatogramme : vin contenant environ 10 µg/kg en carbamate d’éthyle (chromatogramme de gauche : m/z = 64 : Carbamate d’éthyle d5 ; chromatogramme de droite : m/z = 62 : Carbamate d’éthyle).

Chromatogramme d’une bière ayant une teneur en carbamate d’éthyle d’environ 12 µg/kg

Chromatogramme : bière (Chimay bleue) contenant environ 12 µg/kg en carbamate d’éthyle (chromatogramme de gauche : m/z = 64 : Carbamate d’éthyle d5 ; chromatogramme de droite : m/z = 62 : Carbamate d’éthyle).

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Annexe 2 (suite)

Chromatogramme d’un vinaigre ayant une teneur en carbamate d’éthyle d’environ 4 µg/kg

Chromatogramme : vinaigre d’alcool contenant environ 4 µg/kg en carbamate d’éthyle (chromatogramme de gauche : m/z = 64 : Carbamate d’éthyle d5 ; chromatogramme de

droite : m/z = 62 : Carbamate d’éthyle).

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ANNEXE 3

Méthode instrumentale

1. INJECTEUR (AUTOSAMPLER AS2000)

2. FOUR (TRACE GC2000)

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3. DETECTEUR (TRACE MS Simple Quad)

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ANNEXE 4

Flow chart : « Détermination de la teneur en carbamate d’éthyle dans les boissons fermentées par GC/MS/MS»

10 g échantillon (vinaigre : neutralisation préalable)

+ 1 g NaCl (+ sol. dopage si échantillon dopé)

Agitation manuelle

+ 10 g terre de diatomée

5 min agitateur

10 min de stabilisation sur Chem-Elute

Echantillon épais Echantillon fluide

Transfert sur colonne en verre

Elution avec 100 ml de CH2Cl2

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http://images.google.be/imgres?imgurl=http://www.clker.com/cliparts/3/f/7/3/1195429527581033274falcon_tube_carlos_eduar_01.svg.hi.png&imgrefurl=http://www.clker.com/clipart-10573.html&usg=__jNefldStBjAnUlDzUEiN5LTNY9U=&h=594&w=180&sz=23&hl=fr&start=4&um=1&itbs=1&tbnid=80SU6L8xBVzcwM:&tbnh=135&tbnw=41&prev=/images?q=tube+falcon&um=1&hl=fr&sa=N&ndsp=20&tbs=isch:1

http://images.google.be/imgres?imgurl=http://medias.lepost.fr/ill/2009/01/08/h-3-1378937-1231417285.jpg&imgrefurl=http://www.lepost.fr/article/2009/01/07/1378131_liege-ils-violent-une-jeune-fille-avec-une-bouteille-de-biere.html&usg=__8yJ0WzGSwldVqOAKYAaKD1AiS1A=&h=350&w=289&sz=6&hl=fr&start=4&itbs=1&tbnid=CkQkKwqnFdowEM:&tbnh=120&tbnw=99&prev=/images?q=bouteille+de+biere&hl=fr&gbv=2&tbs=isch:1

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ANNEXE 4 (suite)

Flow chart : « Détermination de la teneur en carbamate d’éthyle dans les boissons fermentées par GC/MS/MS»

Evaporation jusqu’à environ 500µl

+200 µl SI

éluat

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DETERMINATION DE LA TENEUR EN CARBAMATE … · Préparation des solutions d’étalonnage L1 à L6...

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