Franck Touret, Stéphane Priet et Gilles Querat · A B C VC: Virus Control (no drug,) Plating of...
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Franck Touret , Stéphane Priet et Gilles Querat . [email protected] Unité des Virus Émergents Xavier De Lamballerie (UVE: Aix-Marseille Univ – IRD 190 – Inserm 1207 – IHU Méditerranée Infection), Marseille, France
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Franck Touret, Stéphane Priet et Gilles Querat [email protected]
Unité des Virus ÉmergentsXavier De Lamballerie
(UVE: Aix-Marseille Univ – IRD 190 – Inserm 1207 – IHU Méditerranée Infection), Marseille, France
Cycle de réplication
viral et inhibiteurs
Boldescu et al., 2017
Plateforme criblage viral Marseille-Timone
• La PCVMT est intégrée au sein de la plateformeAD2P (Antiviral Drug Design Platform). Réseau collaboratif labellisé IBISA et Plateforme technologique Aix-Marseille.
• La PCVMT est située sur le campus santé Timone dans l’unité des virus émergents (UVE).
• UVE fait partie du consortium European Virus Archive (EVAg) et a donc accès à un grand nombre de souches virales.
• La plate-forme est basée en p3/p3+ avec une animalerie (Hamster/souris).
• Certification pour la manipulation de MOT.
Plateforme criblage viral
Marseille-Timone
Criblage de chimiothèques
Caractérisation de composés
Validation in vivo
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
Criblage de chimiothèques
Criblage de chimiothèques
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
Criblage de chimiothèques
• La PCVMT propose du criblage de banque de molécules (30 K) à l’aide d’un virus réplicatif in cellulo
• Criblage basé sur l’inhibition de la mort cellulaire résultant des effets cytopathiques du virus
• Mesure de la viabilité cellulaire par test MTS
• Rapidité
• Faible cout
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
Defreeze Plates
prefilled
with compounds
(50 µl)
No virusToscanavirus
No compounds
Microscopic
Examination of
MTS positive hits
(≈ 1/100)
Toxicity score = 0
CPE score = 0
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
VC CC
Exemple de criblage: librairie Chembridge (30 000 cpds) avec Toscana(Bunyaviridae/Phlebovirus)
Add cells (75 µl)and virus (25 ul per wells)
Incubation2 H at 37 °C
MTS Readingat 590 nm
Tecan M200 Pro
Hits (≈ 1/1000)
MTS assay
Aspirate supernatant
Add 70 µl MTS mix (1/7)
4 days at 37°C, 5% CO2
Caractérisation de composés
Caractérisation de composés
• Caractérisation de leur activité à l’aide d’un “viral replication assay” in cellulo
• Basé sur une mesure quantitative de la production virale par qRT-PCR• Contre une ou plusieurs familles virales• Contre une ou plusieurs espèces de la même famille• Contre différents génotypes d’une même espèce virale.
• Des tests antiviraux sont disponibles pour un très nombres de virus (principalement arbovirus).
• Rendu d’EC50 et EC90 acceptable par la FDA (Audit de contrôle qualité).
• Caractérisation de la cytotoxicité in cellulo
Caractérisation de composés
Familles virales disponibles
Flavivirus:Dengue: > 25 souches virales; chaque génotype dans chaque sérotypesFièvre Jaune: 5 souches cliniques représentatives Afrique/ AmériqueZika: 3 souches cliniques Afrique/Asie/AmériqueWNV, JEV, TBE, 2-3 souches cliniques pour chaque
AlphavirusChikungunya: 7 souches cliniquesAlphavirus « Ancien monde »: 4 souchesAlphavirus « Nouveau monde »: 5 souches dont 3 VEEV
BunyaviralesPhlebovirus: 5 souches cliniques dont 2 RVFV1 orthobunyavirus + 1 nairovirus
Dispensing of 3 # compounds in 1/2 dilutions
from 20 µM to 0,16 µM finalin quadriplicates or triplicates (25 µl)
Then add virus (25 µl)
Cell viability assay
Rezazurine
RezorufineFluorescence 560/590nm
% of living cells (cytotoxicity)= 100 x (mean fluo – mean Bck)
(mean CC- mean Bck)
Viral replication assay
CC : mock cell control(no drug, no virus)
A B C
VC: Virus Control(no drug,)
Plating of Vero E6 cells(5 104 cells, 100 µl/wells)
In P96 plates 24h
Dispensing of 3 # compounds in 1/2 dilutions
From 60 µM to 1,9 µM final concentration in triplicates (50 µl)
CC : Cell Control
background
2-4 days2-4 days
Viral yield assay100 µl of supernatant to 200 µl of lysis buffer in deep well plates
CytotoxicitéCellules
Extraction of viral RNA from supernatantRNAs
Quantitative real-TimeqRT-PCR standardized withT7 Pol-generated synthetic
RNA standards
Quantitative qRT-PCR
Virus yield reductionmean quantity/mean VC
% inhibition100 X (mean VC-mean Qty)
mean VC
Viral replication assay
Multiple ways to obtain EC50 and EC90
Caractérisation de composés: Exemple
d’un inhibiteur de la Dengue
• Collaboration avec un industriel pour la caractérisation de molécules anti-Dengue:• Test de composés contre un panel de 10 souches cliniques• Tests de composés contre un panel de 6 flavivirus
• Obtention d’un « lead compound »• Nécessité de caractériser ce composé contre un panel plus représentatif de
Dengue
Phylogenetic
analysis of dengue viruses available
sequences
Strain selection
and production of
missing genotypes
by ISA
Antiviral
compounds study
✓ Caractérisation du « lead compound » contre le panel de Dengue✓ Dépôt d’un dossier à la « FDA » par l’industriel pour poursuivre le développement du
composé
Workflow
Validation in vivo
Validation in vivo
• Le BLS3+ ou est localisé la plate forme est équipé d’une animalerie.
• Stabulation des animaux en iso-cage (dépression et système de ventilation individuel+ filtres HEPA).
• 2 modèles virus/animaux avec flavivirus ( neurotrope et viscerotrope)
• Possibilité de mise en place d’autres modèles (différents critères).
• Possibilités d’exploration de la charge virale moléculaire dans différents organes (cerveau, foie, rate, sang etc…)
Activité In Vivo de composés
• Modèle fièvre hémorragique/ viscérotropique YFV ap7 avec Hamster syrien doré
YFV AP7YFV AP7+ Compound X (précoce)YFV AP7+ Compound X (tardif)
Activité In Vivo de composés
• Modèle virus neurotrope avec souris C57/b6 (TBEV)
2 4 6 8 100
50
100
2E4
Days
Perc
en
t su
rviv
al
2E4Traités
2E4
• Possibilité utilisation modèle C57/b6 + immunodépression avec anti-IFNAR ( autres critéres)
Activité In Vivo de composés
Merci de votre attention
Contact : [email protected]@[email protected]
UMR IRD 190, Inserm 1207 "Unité des Virus Émergents"Aix-Marseille Université – Institut de Recherche pour le Développement – Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Unité des Virus Émergents téléphone: +33 (0)4 91 32 44 20Faculté de Médecine de Marseille fax: +33 (0)4 91 32 44 2127, Bd Jean Moulin 13005 Marseille cedex 05
