IHC, FISH, CISH, NGS dans les...

IHC,FISH,CISH,NGSdanslesCBNPC:quellesévolu*onsdansl’èredesbio-

marqueurs

MarieWislezServicedePneumologieetdeRéanima8on

GRC«Theranoscan»UPMC,ParisVIHôpitalTenonParis

maisjesuis

Pneumologue!!!

ceritinib

osimertinib

L'èredelamédecinedeprécisiondèsla1èreligne

CBNPC IIIB IV

Addiction oncogénique Non épidermoïde Epidermoïde

Doublet CDDP Beva

Doublet CDDP sans Pem sans Beva

Gefitinib vvvvvvvvvvvvvvvvvv

Gefitinib Erlotinib Afatinib

Crizotinib

Immunothérapie

ProgrammeBiomarqueurEmergentleréseaudesplateformesenFrance

28plateformes(2006) 7biomarqueurspourlesCBNPCnonépidermoïdes

Cancer Molecular Target Lung Non-sq NSCLC

EGFR mutations EML4-ALK transloc. KRAS mutations HER2 ex20 mutations BRAF mutations PI3K mutations

ProgrammeACSECohortesetnouveauxbiomarqueursémergents

20Cohortespré-définies:• Lymphomeanaplasiqueàgrandescellules–enfantsetadultes–Transloca8onALK• Cancercolorectal–adultes–Transloca8onALK• Cancercolorectal–adultes–Amplifica8onMET• Cancercolorectal–adultes–Muta8onMET• Cancerdupoumonnonàpe8tescellules–adultes–Amplifica8onMET• Cancerdupoumonnonàpe8tescellules–adultes–Transloca8onROS1• Cancerdusein–adultes–Transloca8onALK• Cancergastrique–adultes–Amplifica8onMET• Carcinomedesvoiesbiliaires–adultes–Transloca8onROS1• Cancerdel’ovaire–adultes–Amplifica8onMET• Carcinomerénalàcellulesclaires–adultes–Transloca8onALK• Carcinomerénalàcellulesclaires–adultes–Amplifica8onALK• Carcinomerénalpapillaire–adultes–Muta8onMETouAmplifica8onMET• Carcinomehépa8que–adultes–Amplifica8onMET• Neuroblastome–enfantsetadultes–Amplifica8onALKouMuta8onALK• Tumeurinflammatoiremyofibroblas8que–enfantsetadultes–Transloca8onALK• Rhabdomyosarcome(alvéolaireetembryonnaire)–enfantsetadultes–Amplifica8onALK• Glioblastome–adultes–Amplifica8onMET=>ouverteaprèsamendement• Canceranaplasiquedelathyroïde–adultes–Muta8onALK• Cancerdelathyroïde(folliculaire+médullaire+papillaire)–adultes–Muta8onMET3Cohortessupplémentaires:• Maladiespédiatriquesdiversesrares(donthépatocarcinome)associéesàunealtéra8ond’unedesciblesducrizonib• 2cohortesconcernant2autrespathologiesporteusesd’unealtéra8onquelconqued’unedesciblesducrizonib,(gèneAXLcompris)iden8fiéesgrâceauxprogrammespangénomiques(CGHarray,ouSNParrayouNGS.Ex:le1ercasiden8fédecancerduseinavecamplifica8ondeMETcréeraunecohorte).

Sarcomatoides poumon mutation épissage de l’ exon 14 MET

IHC

NGS

Hybrida8oninsitu

Commentciblerlesanomaliesmoléculaires

Immunohistochimie

WHOClassifica8onofTumorsLung,Pleura,ThymusandHeart,WHO–IARC,4thEdi8onIARC,Lyon,2015

TTF-1 P40 Bleu alcian Alk

P63 CK5/6

Marqueurs neuroendocrines

ATCD autre primitf

crizo&nib en 1ière ligne : essai profil 1014

Solomon BJ, N Engl J Med, 2014

10,9 mois

6,0 mois

crizo&nib en 2ième ligne essai profil 1007

ShawAT,NEnglJMed,2013

7,7 mois

3,0 mois

Immunohistochimietechnique

calcification

Ac 5A4 1/50

mucus

Techniquesautoma8sées

VENTANA anti-ALK (D5F3) Rabbit Monoclonal Primary Antibody VENTANA PD-L1 (SP142) Assay FDA approved test predictive for TECENTRIQ™ in urothelial carcinoma (UC) patients.

AutostainerLink48-DakoAgilent

BOND-IIIFullyAutomatedIHCandISHLeicaBiosystems Bond™Ready-to-UsePrimaryAn8body

AnaplasNcLymphomaKinase(5A4)

DAKOPD-L1IHC28-8pharmDxTheonlyFDA-approvedandCE-IVDmarkedtestforPD-L1expressionassociatedwithenhancedsurvivalwithOPDIVO®(nivolumab)fornon-squamousNSCLCDAKOPD-L1IHC22C3pharmDxACE-IVD-markedtesttoaidiniden8fica8onofNSCLCpa8entsforKEYTRUDA®(pembrolizumab).


Exemples de coûts à l’Hôpital Tenon AP-HP(Paris) prix anticorps nus et kits de révélation

AnNcorps

CondiNonnementNombredetests

Fournisseur KituNlisé

PrixAP-HPHTeuros

ConfirmC-MET Prêtàl’emploi50tests

RocheDiagnos8cs UltraviewDAB 3697,81

ALK,D5F3 Prêtàl’emploi50tests

RocheDiagnos8cs Op8view+ampli 3697,81

ROS-1 100µl50tests Cellsignaling UltraviewDAB 479,18

PDL1 100µl100tests Cellsignaling UltraviewDAB 494,00

KitultraviewDAB Prêtàl’emploi250tests

RocheDiagnos8cs 1025,00

Kitop8viewDAB Prêtàl’emploi250tests


Ampliop8view Prêtàl’emploi50tests


Immunohistochimie sur Ventana BenchMark ULTRA


. « XALKORI est indiqué dans le traitement des patients adultes ayant reçu au moins un traitement antérieur pour un cancer du poumon non à petites cellules anaplastic lymphoma kinase (ALK) positif et avancé»

Europe

USA

Ciblerlestransloca8onsdeALK

Hybrida8oninsitu

Fluorescenceinsituhybridiza8ontechnique

•  Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier •  Détection de délétions, identification de translocations ou autres réarrangements

chromosomiques

Chromosome 2 ALK

EML4

Sonde T

Sonde C

ALK/EML4

Sonde T

Sonde C

FISH “break apart“ Soda M, Nature 2007, 448:561; Horn L, J Clin Oncol 2009, 27:4232; Shaw AT, J Clin Oncol 2009, 27:4247

Fluorescenceinsituhybridiza8onFISH:lestandardpourALK

FISH ALK Sonde vysis

Antoine M, anatomopathologie, Hôpital Tenon

Saito M, Cancer Science 2016

Fluorescenceinsituhybridiza8onautresréarrangements

Ciblerlestransloca8onsdeROS

24

A 2 cyclesRO= 54 % (19/36) [38 ; 70] Taux de contrôle= 86 % (31/36) [71; 95]

Meilleure réponseORR = 69 % (25/36) [52 ; 84]DCR = 89 % (32/36) [74 ; 97]

ACSEcrizo8nibcohorteCBNPCréarrangéROS

Diagnostic aout 2012

Sonde clinisciences

IHCFISHRos

clone d4d6

Aspiration bronchique homme de 35 ans non fumeur opacité alvéolaire


30 octobre 2014 Quatrième ligne par crizotinib

Fluorescenceinsituhybridiza8onamplificaIon


MET Sonde clinisciences

ACSEcrizo8nibcohorteCBNPCamplifiéMET

A 2 cyclesRO% = 32 % (8/25) [15;54]Taux de contrôle= 60 % (15/25) [41;79]

Meilleure réponseRO = 32 % (8/25) [15;54]Taux de contrôle = 60 % (15/25) [41;79]

FISHrouIne

Avantages Inconvénients

Paraffine Techniquelourdeimpactdupréanaly8quelecturedifficileexpériencedupathologiste

Pe8tprélèvement Pe8tprélèvementmais100noyaux

Sensibleetspécifique Microscopeàfluorescence

Grandchoixdesondes Analyseciblée

Couteux

Exemples de coûts à l’Hôpital Tenon AP-HP(Paris): prix sondes et kits de révélation

FISH technique semi-manuelle sur DAKO Hybridizer

Sondes

CondiNonnementNombredetests

Fournisseur KituNlisé

PrixAP-HPHTeuros

ROS-1 Prêtàl’emploi20tests ZYTOVISION HistologyFISH

AccessoryKit 1041,20

MET/CEN7 Prêtàl’emploi20tests ZYTOVISION HistologyFISH


ALK Prêtàl’emploi20tests ABBOTT HistologyFISH

AccessoryKit 2702,10(HM)

RET Prêtàl’emploi20tests ZYTOVISION HistologyFISH


HistologyFISHAccessoryKitDako

20tests DAKO 392,46

Techniquessemi-automa8sées

7biomarqueurspourlesCBNPCnonépidermoïdes

Cancer Molecular Target Lung Non-sq NSCLC

EGFR mutations

EML4-ALK transloc.

KRAS mutations

HER2 ex20 mutations

BRAF mutations

PI3K mutations

Testsmoléculairesenrou8ne

Mais aussi mutations de MET

AnalysedugénomeméthodeenzymaIqueSanger

Testsmoléculairesenrou8neversdestechniquesàhautdébit

Rivzi N, Science 2015

Testsmoléculairesenrou8neversdestechniquesàhautdébit

•  Wholegenomesequencing(WGS)•  Wholeexomesequencing(WES)•  Amplicon-basedNGS

NGSnext-genera8onsequencing

•Rapidité : plus de patients, plus de gènes étudiés en simultané •Coût : inférieur au séquençage de Sanger •Sensibilité : supérieure au Sanger, détection de sous-clones, suivi de MRD •Exhaustivité : plus d’exons, gènes entiers •Économie du matériel biologique : qq ng d’ADN pour un grand nombre de gènes


Perspec8vespourlarou8ne?RCPmoléculaire

Deuxsites

•  Tenon/HEGP

Deuxorganes

•  Poumon/côlonrectum

RéunionsélecNondedossier

•  2fois/mois

But

•  SélecNonnerdespaNentsayantuneaddicNononcogéniqueàunbiomarqueurnonrecherchéenrouNne

Sujet

•  «plutôt»jeune,nonfumeur,stadeIV,sansbiomarqueuridenNfié

Deuxprélèvementstumorauxdebonnetaille

•  chirurgical?

Congelésetparaffine

Sang

•  consultaNond’oncogénéNque

Perspec8vesanalysedel’exome«enrouIne»

Compterenduprovisoirele20Février2015

Résultatsexomedu14TH10341-ADN-N-14TH10341-ADN-TAucuneanomalieconstitutionnellemiseenévidencesurlesgènessuivants:BRCA1;BRCA2;TP53;STK11;MLH1;MLH2;MSH6;PMS2;APC;MUTYH;VHL;MEN1;RET;PTEN; RB1; SDHD; SDHAF2; SDHC; SDHB; TSC1; TSC2; WT1;NF2; COL3A1; FBN1;TGFRBR1; TGFBR3; SMAD3; ACTA2; MYLK; MYH11; MYBPC3; MYH7; TNNT2; TTNI3;TPM1; MYL3; ACTC1; PRKAG2; GLA; MYL2; LMNA; RYR2; PKP2; DSP; DSC2; TMEM43;DSG2;KCNQ1;KCNH2;SCN5A;LDLR;APOB;PCSK9;RYR1;CACNA1S


AnalyseSomatique Anomaliedunombredecopie

Aucungènepouvantêtreimpliquédansunepathologiecancéreusen’aétéidentifiécommeayantunnombredecopiesupérieureà6(amplifié)LesgènesCDKN2AetCDKN2Bprésententunedélétionhomozygoteprobable


AnalyseSomatique

Recherchedemutationssomatiques

587mutationsponctuellesontétéidentifiées

Lafréquencedesmutationsenfonctiondeleurtypeestindiquéedansletableausuivant.Cetterépartitionestévocatriced’uneintoxicationtabagique:

ATtoGC ATtoCG ATtoTA GCtoCG GCtoTA GCtoAT total nb_de_mutation0,08 0,13 0,11 0,09 0,40 0,19 1,00 587


AnalyseSomatique


Whole exome sequencing (WES) and RNA sequencing (RNA-seq) in routine clinical practice for colorectal cancer (CRC) and non-small cell lung cancer (NSCLC) patients (pts). Authors: Geraldine Perkins1,2, Elizabeth Fabre3, Vincent Fallet4, Helene Blons5, Nicolas Pecuchet3, Valerie Gounant6, Laure Gibault7, Martine Antoine8, Marie Wislez4, Delphine Le Corre9, Karen Leroy10, Robert Lacave11, Julien Taieb1, Jacques Cadranel4, Pierre Laurent-Puig2,5 Between 09/2014 and 4/2016, 35 pts were selected ..The median analysis turnaround was 21.5 days (8-92). Potential driver alterations were found in 27 pts, most frequently in HER/RAS/MAPK (n=14), PTEN/PI3K/AKT (n=6), STK11 (n=4) pathways. Gene alterations were identified in chromatin organization (ARID1A/ARID2/EZH2, n=8), cell cycle checkpoint signaling (ATR/ATRX/ATM, n=4), and DNA repair (BRCA1/BRCA2, n=4) pathways. Therapy could be personalized in 13 pts, of whom 7 were included in a clinical trial. These results are encouraging on the feasibility of WES and RNA-seq analysis in routine clinical basis, in order to select dedicated TT in pretreated pts.

Geraldine Perkins et al; Esmo 2016

Evolu8on

•  Biopsiesliquides– Sangcirculant/Urines…

•  Contrôlesdequalité;normes•  Consulta8ond’oncogene8que

ConclusionévoluIondesméIers

chirurgien

anapath

radiothérapeute

oncologue pneumologue

radiologue

biologistemoléculaire

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