Cours Module L5-BH-05

Régulation de l’expression des génomes

Mercredi de 13h30 à 15h30 & Jeudi de 8h00 à 10h00(sem. 0 à 5/6)

Université d’Orléans – UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301S. Bourgerie

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Extrait du livret de l’étudiant

Code - Libellé SC-L5BH-05 – Régulation de l’Expression du GénomeNombre de crédits 6 ECTSCoefficient 2Nom du Responsable Alain LEGRANDProgramme Cours : 26h - TD : 14h -TP : 15hMécanismes généraux de la régulation de la transcription et de la traduction chez les procaryotes. Notions de signaux exogènes et endogènes de la régulation. Etude détaillée de quelques systèmes de régulation chez les procaryotes : approches biologiques, physiologiques, génétiques et moléculaires.Mécanismes de régulation chez les eucaryotes : régulation transcriptionnelle : séquences régulatrices et facteurs de transcription. Complexes d'initiation de la transcription. Structure de la chromatine et expression génique. Régulation post-transcriptionnelle : modifications des ARNm (coiffe, épissage, polyadénylation), durée de vie des ARNm, régulation par les petits ARN. Régulation de l'initiation de la traduction. Régulation post-traductionnelle : modifications et durée de vie des protéines.

Contrôle des connaissances 1è session : Cours : Contrôle terminal écrit (2h) + TP : CC2è session : Cours : Contrôle terminal écrit (2h) + TP : Contrôle Terminal

Coefficients de la note finale 1è session : a = 3 ; b = 0 ; c = 1 ; d = 02è session : a = 3 ; b = 0 ; c = 1 ; d = 0

Pré-requis Bases fondamentales de la biologie moléculaire

Cours magistraux

TD TP

intervenants Legrand Bourgerie

MolletNormand

Bourgerie

Cours magistraux

TD TP

Nombres d’heures

Part. 1 : 6 x 2hde S0 à S2Part. 2 : 6,5 x 2hde S3 à S6

Part. 1 : 3 x 2hS3-S4-S5Part. 2 : 4 x 2hS6-S7-S8-S9

3 x 5hde S9 à S12(13h30 à 18h30)

Ouvrage recommandé

1- Lewin « Gènes VI »

PLAN GENERAL

1- les stratégies de régulation2- l’opéron lactose3- l’opéron ara4- l’opéron tryptophane5- les facteurs σ alternatifs6- les gènes des aminoacyl-ARNt synthétases7- la réponse stringente8- les gènes codant les protéines ribosomiques – l’opéron ermC9- la réponse SOS10- les riborégulateurs11- la dégradation des ARNm12- récapitulatif

PLAN des COURS n°1 & n°2

1- Introduction1.1 pourquoi y-a-t-il régulation?1.2 niveaux de régulation1.3 quelques définitions1.4 notion d’opéron

2- Régulation de la transcription2.1 stratégies de contrôle de l’initiation de la transcription2.2 contrôles positif-négatif2.3 rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes

3- Opéron lactose3.1 organisation générale3.2 phénomène d’induction - inducteur3.3 lacZ - lacY - lacA3.4 mutants de l’opéron3.5 régulations

3.5.1 négative (répresseur)3.5.1.1 expérience Pajamo3.5.1.2 rôle du répresseur3.5.1.3 structure du répresseur3.5.1.4 opérateur

3.5.2 positive : répression catabolique3.5.2.1 diauxie3.5.2.2 AMPc3.5.2.3 scénarios3.5.2.4 structure-fonction CRP3.5.2.5 opérateurs

3.6 récapitulatif*

Introduction Pourquoi y-a-t-il régulation de l’expression des gènes ?

Pour répondre aux conditions changeantesde l’environnement immédiat

Sept mécanismes susceptibles de modifier la concentration à l’équilibre d’une protéine ;

Sites possibles de régulation :

1- synthèse du transcrit primaire2- maturation post-transcriptionnelle de l’ARNm3- dégradation de l’ARNm4- synthèse protéique5- modifications post-traductionnelles6- ciblage et transport des protéines7- dégradation des protéines

*

1

2 3

4

5

6

7

*

Principalement, 3 niveaux de régulation de l’expression des gènes chez les procaryotes :

1- transcription : phase d’initiation (le plus souvent) ; phase de terminaison

2- maturation : stabilité du transcrit;

3- traduction : en général aux étapes d’initiation et de terminaison

Quelques définitions

Les séquences codant des produits agissant en transLes séquences agissant en cis

Un locus agit en cis sur un autre locus s’il est sur la même molécule d’ADN ;

L’opérateur est un élément d’activation en cis car il fonctionne uniquements’il est fixé sur le gène dont il contrôle l’expression.

Un locus agit en trans s’il peut contrôler un autre locus, même à partir d’une molécule d’ADN différente.

Le gène du répresseur du lactose (lacI) agit en trans car il peut réguler l’expression de l’opéron lactose même s’il est enlevé du génome d’E. coli et placé sur un plasmide.

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élément régulateur en cis : site pour une protéine de liaison à l’ADN, situé en amont du gène régulé.

élément agissant en trans : protéine elle-même, qui diffuse dans la cellule depuis son site de synthèse jusqu’à son site de liaison sur l’ADN.

*

Quelques définitions (2)

Gène structural

gène qui code une protéine (ou un ARN)

Gène régulateur

gène structural qui code une protéine impliquée dans la régulation de l’expression d’autres gènes.

*

OPERONGènes structuraux organisés en groupes contenant des gènes codant des protéines dont les fonctions sont apparentées(gènes co-transcrits pour former une molécule d’ARN polycistronique)

À côté de ces gènes, on retrouve :- des séquences adjacentes requises pour la transcription (promoteurs, opérateurs)- des séquences impliquées dans la régulation.

Quelques définitions (3)

Exemple : Les gènes des enzymes successives d’une voie métabolique

*

REGULON

réseau d’opérons fonctionnant avec un régulateur commun

Quelques définitions (4)

Exemples de régulons : opérons codant pour les enzymes du métabolisme glucidique;le système des gènes de choc thermique qui répondent au changement de température;les gènes qui sont induits (chez E. coli) en réponse à des agents

endommageant l’ADN (appartenant à la réponse SOS).

Qu’est-ce-que la REGULATION ?

Deux classes de mécanismes de régulation :

1- mécanismes opportunistes :

2- mécanismes généraux :

Deux modes de régulation de l’expression d’un gène cible par une molécule régulatrice :

1- d’une façon positive c’est à dire que l’interaction déclenche la transcription du gène

2- d’une façon négative : l’interaction empêche la transcription du gène

Quelques rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes

l’ARN polymérase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester qui résulte d’une attaque du groupement 3’-OHdu dernier nucléotide de la chaîne sur le groupement 5-triphosphate du nucléotide entrant, ce qui s’accompagne d’une libération de pyrophosphate

la transcription comprend 4 étapes qui impliquent différents types d’interactions entre l’ARN polymérase et l’ADN :1- reconnaissance de la matrice2- initiation3- élongation4- terminaison

l’ARN polymérase copie en ARN un brin du duplex d’ADNune unité de transcription est une séquence d’ADN transcrite en un ARN unique,

qui débute au niveau du promoteur et se termine au terminateurla transcription a lieu dans une « bulle », à l’intérieur de laquelle l’ARN est synthétisé par appariement des bases

avec un brin d’ADN de la région transitoirement dérouléeau fur et à mesure de la progression de la bulle, le duplex d’ADN se reforme après son passage.

« Idées fortes »

le facteur σ contrôle la liaison à l’ADN de l’ARN polymérase.

la reconnaissance du promoteur dépend de séquences consensus.

il existe deux modes principaux de terminaison.

*

Promoteurs bactériens : organisation

ARN polymérase

Schematic representation of the major form of E. coli RNA polymerase bound to DNA.

β’ 155613

β 150618

σ 70263

α 36512

ω 10105

*

ARN polymérase : organisation - structure

*

Transcription chez les procaryotes

Initiation Elongation Terminaison*

fixation de σau cœur de l’enzyme

reconnaissance du promoteur

(de Mooney et al. 1998)

1. Un organisme unicellulaire, avec un temps de génération très court, doit pouvoirrépondre rapidement à des changements de son environnement.

2. Les demi-vies de la plupart des ARNm sont courtes (de l’ordre de quelquesminutes).

3. La transcription et la traduction sont couplées et se réalisent dans le mêmecompartiment cellulaire.

Ces constatations impliquent que la régulation génique doit prendre effet tôt, et il est effectivement constaté que le point de contrôle majeurest l’initiation de la transcription.

Stratégies de contrôle de l’initiation de la transcription (chez les bactéries)

2 modes distincts de contrôle de l’initiation de la transcription

1- un contrôle constitutif qui dépend de la structure du promoteur

2- un contrôle de régulation qui est sous la dépendance de protéines régulatrices

CONTRÔLE CONSTITUTIF

niveau de base de l’initiation de la transcription déterminé par la structure du promoteur.

variabilité dans la séquence consensus du promoteur : modification de l’efficacité du promoteur

Comment la séquence du promoteur affecte l’initiation?

3 hypothèses :

1- de la séquence de la boîte -35 dépend la reconnaissance par la sous-unité

σ et donc le taux de fixation de l’ARN polymérase

2- la transition du promoteur fermé au promoteur ouvert dépend de la boîte à -10

3- la fréquence des initiations avortées (c’est à dire celles qui se terminent de manière prématurée) pourrait dépendre de la séquence au niveau du nucléotide +1 ou immédiatement en aval.

Conséquences de ces variations de séquences

Promoteurs FORTS – FAIBLES : les plus efficaces induisent 1000 fois plus d’initiation productives que les plus faibles

TAUX de BASE : pour un gène donné niveau de transcription pré-programmé par la séquence de son promoteur

Autres types de régulation de l’initiation de la transcription

CONTRÔLE de REGULATION

Principe de base de la régulation de la transcription : (déduit de l’étude de l’opéron lactose)La liaison d’une protéine spécifique à un site donné de l’ADN influence l’ensemble des évènements composant l’assemblage du complexe d’initiationet\ou l’initiation d’une synthèse productive d’ARN par l’ARN polymérase.

LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF :

Répresseur : protéine qui empêche l’expression d’un gène.

Opérateur : site cible de la protéine répresseur.

Lorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polyLorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polymérasemérasene peut plus initier la transcription ce qui empêche l’expressione peut plus initier la transcription ce qui empêche l’expression du gène.n du gène.

répresseurinducteur

répresseur inactif

REPRIME INDUIT

INDUCTION

En vert : gène régulateurEn bleu : gène structural

Cas du répresseur lac avec l’IPTG p.e.

*

CONTRÔLE NEGATIF DE LA TRANSCRIPTION

Répresseur inactifcorépresseur

répresseur actif

REPRIMEINDUIT

REPRESSION

*

LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF :

Un facteur de transcription doit assister l’ARN polymérase pour l’initiation au niveau du promoteur.

activateur inactifinducteur

activateur actif

REPRIME INDUIT

INDUCTION

Cas de la CRP associée au l’AMPc

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CONTRÔLE POSITIF DE LA TRANSCRIPTION

activateur actifcorépresseur

activateur inactif

REPRIMEINDUIT

REPRESSION

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En résumé

Contrôle négatif : le répresseur inactive la transcriptionContrôle positif : l'activateur active la transcription

Opéron inductible : avec inducteur : activation de la transcriptionOpéron répressible : avec corépresseur : inhibition de la transcription

Exemples de régulateurs positifs :métabolisme de l’arabinose – AraCmétabolisme du maltose – MalTmétabolismes carbonés (opérons gal, lac… ) – CRP

Exemples de régulateurs négatifs :AraCGalR

L’opéron lactose (chez E. coli)un exemple d’opéron inductible négativement régulé

lactose : disaccharide pouvant être utilisé comme source de carbone unique pour la croissance d’E. coli.

L’opéron lac : organisationL’opéron lac : organisation

3510 pb 780 pb 825 pb1040 pb

3 gènes structuraux: z, y & a- codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du lactose- sont exprimés continuellement à faible taux- sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent- sont modulés par le taux de glucose du milieu

laci : un gène adjacent n’appartenant pas à l’opéron, codant pour le répresseur lac

*

Opéron lactose : quelques détails d’organisation

fonction répresseur β-galactosidase perméase transacétylase

polypeptide

36038000

1021116000

26030000

27530000

aaDa

protéine Tétramère152000

Tétramère500000

Protéine membranaire30000

Dimère 60000 D

a

Expériences de Jacob et Monod : élucidation du fonctionnement de l’opéron lac(1er article : 1960)

François Jacob et Jacques Monod ont pu déduire l’organisation et le fonctionnement de l’opéron lactose en étudiant une série de mutations affectant la synthèse de la β-galactosidase et de la lactose perméase. Les mutations étaient introduites soit dans le chromosome bactérien, soit sur un facteur F plasmidien reproduisant l’opéron.

Les gènes de structure lac sont contigus sur le chromosome d’E. coli.Ces gènes sont associés à des éléments de contrôle.

Prix Nobel de Physiologie & Médecine, 1965 (avec André Lwoff)

Jacques Monod

Lactose Glucose

Lactose Glucose-6P glycolyse

Galactose

Galactose-1P Glucose-1P

Glucose

Croissance d’E. coli sur un mélange de glucose et lactose

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Les enzymes du métabolisme du lactose sont inductibles

Cinétique d’induction de l’activité β-galactosidase chez E. coli

(d’après Cohn, M. J. Bacteriol. (1957) 21, 156)

*

Les inducteurs de l’opéron lac

• Lactose, (substrate de l’opéron), converti en son isomère (par transglycosylation), l’allolactose.

• Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomère du lactose).• inducteur gratuit : induit l’opéron mais pas métabolisé.

Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG)

O

OH

HOOH

OH

OO

HOOH

OH

OH

O

OH

HOOH

O

OH

OHO

HOOH

OHlactose

O

OH

HOOH

SCH

CH3

CH3

OH allolactose

IPTG ou isopropylthiogalactoside

*

lacZ

code l’enzyme β-galactosidase dont la forme active est un tétramère d’environ 500kDa

Réaction catalysée : coupe les β-galactosides et libère les sucres qui les constituent

Exemple : le lactose est hydrolysé en glucose et galactose

Equation de la réaction catalysée par la β-galactosidase

*

organisation de l’opéron lac

lacY

code la β-galactoside perméase, une protéine de 30kDa liée à la membrane (protéine transmembranaire); elle transporte les β-galactosides dans la cellule

La lactose perméase :

- utilise le gradient de protons à travers la membrane de la cellule bactérienne pour co-transporter H+ et le lactose (le gradient de protons résulte du métabolisme oxydatif)

- présente 2 états conformationnels principaux : E-1 : caractérisé par un site de liaison de faible affinité pour le lactose,

orienté vers l’intérieur de la celluleE-2 : caractérisé par un site de liaison à haute affinité pour le lactose,

orienté vers l’extérieur de la cellule.

Structure de la β-galactoside perméase

organisation de l’opéron lac

Abramson J, Smirnova I, Kasho V, Verner G, Kaback HR, Iwata S. Science. 2003 301(5633):610-5 Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli.

protéine monomérique enchassée dans la membrane(12 hélices α transmembranaires)

lactose

Ext. Int.

Membrane

H+ + lactoseE2 E1

H+

E2-H+-lactose E1-H+-lactose

CYCLE de TRANSPORT

*

organisation de l’opéron lac

lacA

code la β-galactoside transacétylase, une enzyme qui transfère un groupement acétylede l’acétyl-CoA aux β-galactosides (comme l’IPTG).

Le métabolisme du lactose ne nécessitant pas de thiogalactoside transacétylase, le rôle physiologique de cette enzyme demeure inconnu.

Les mutants de l’opéron lac

Analyse génétique de l’opéron

Quels sont les éléments essentiels du système de régulation ?

*

Le répresseur ACTIF ne peut se fixerà l’opérateur mutant Oc

lacI promoteur/opérateur lacZ lacY lacA

Opérateur MUTANT Oc

L’opéron est transcrit puis traduit

lacI- promoteur/opérateur lacZ lacY lacA

Le gène lacI- commande la synthèse d’un répresseur défectueuxqui ne se fixe pas à l’ADN.

L’opéron est transcrit puis traduit

Utilisation de diploïdes partiels

Conjugaison : transfert de matérielgénétique

F-pilus

(1)

(2)

(3)

*

lacI-

promoteur/opérateur

Le gène lacI- conduit à la synthèse d’un répresseur qui ne se fixe pas à l’ADN.

lacZ lacY lacA

lacI+

Le gène lacI+ conduit à la synthèse d’un répresseur de type sauvage qui se fixe à l’opérateur

L’inducteur déplace le répresseur de type sauvage de l’opérateur

Le gène lacIs conduit à la synthèse d’un répresseur qui ne peut fixer l’inducteur; il est donc fixer en permanence à l’opérateur

lacIs lacZ lacY lacApromoteur/opérateur

lacI+

Le répresseur de type sauvage n’influence pas la liaison à l’ADN du répresseur lacIs

Les mutations non inductibles lacIs sont dominantes

Les mutations de l’opérateur sont constitutives, car le promoteur est incapable de fixer la protéine répresseur;Ceci permet à l’ARN polymérase d’avoir libre accès au promoteur.Les mutations Oc agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes structuraux qui leur sont contigus.

mutations Oc

Les mutations qui inactivent le gène lacI entraînent l’expression constitutive de l’opéron, car la protéine du répresseur mutant ne peut plus se fixer sur l’opérateur.

Les mutations constitutives du gène lacI sont récessives.

Les mutations non inductibles lacIS sont dominantes.

mutations du type lacI-

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