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Régulation de l’expression des génomes Sylvain Bourgerie Semestre 5

Régulation de l’expression des génomesTable des matièresI. Introduction....................................................................................................................................3

A. Pourquoi y a-t-il régulation de l’expression des gènes ?............................................................3

B. Niveaux de régulation.................................................................................................................3

C. Quelques définitions...................................................................................................................3

D. Notion d’Opéron.........................................................................................................................4

II. Régulation de la transcription........................................................................................................4

A. Stratégie de contrôle de l’initiation de la transcription..............................................................4

I. Analyse génétique de l’opéron.......................................................................................................8

II. Utilisation de diploïdes partiels......................................................................................................9

III. Les contrôles exercés par le répresseur....................................................................................11

A. Comment fonctionne le répresseur ?.......................................................................................11

B. Comment l’inducteur provoque-t-il la libération du répresseur de son opérateur ?................12

IV. L’opérateur lac..........................................................................................................................12

V. Exemple d’utilisation en génie génétique de l’opéron lac............................................................17

I. En absence d’Arabinose...............................................................................................................18

I. Modulation de la terminaison de la transcription........................................................................20

A. Atténuation transcriptionnelle.................................................................................................20

1. Mécanisme 1 : Interaction répresseur-opérateur.................................................................21

2. Mécanisme 2 : terminaison de la transcription....................................................................21

B. Atténuation générale : exemple chez le phage λ et cas de l’opéron des ARN ribosomiques....22

C. Antiterminaison dans les opérons ribosomaux........................................................................23

D. Autre exemple de la régulation par antiterminaison transcriptionnelle...................................24

1. Les aminoacyl ARNt synthétases :........................................................................................24

2. Contrôle de l’initiation de la transcriprion par substitution des facteurs σ :........................25

3. Un exemple de contrôle de l’expression génique par l’intervention d’une succession de facteurs σ, la sporulation chez B. subtilis......................................................................................26

4. Que se passe-t-il au niveau des gènes lors de la sporulation ?.............................................26

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5. Infection de B. subtilis par le phage SPO1 : contrôle de la transcription par l’intermédiaire de la production de nouveaux facteurs σ.....................................................................................27

6. Le régulon σ32 (ou σH), la réponse au choc thermique..........................................................27

7. Système de régulation de l’expression génique basé sur l’utilisation de facteurs anti-σ......27

II. Régulation de l’expression de l’opéron α d’E. coli........................................................................42

III. Synthèse des protéines ribosomiques......................................................................................42

A. Modalités du rétrocontrôle négatif..........................................................................................43

IV. L’atténuation traductionnelle...................................................................................................45

1. Cas de la résistance au chloramphénicol chez les bactéries.................................................45

2. Un autre exemple de régulation par atténuation traductionnelle (en plus d’une régulation par atténuation transcriptionnelle)..............................................................................................47

1. Contrôle de l’activité d’une protéine par un riborégulateur.................................................49

2. contrôles de l’expression génique au niveau post-transcriptionnelpar des ARN antisens....49

I. Un exemple de REGULATION de la TRADUCTION par une petite molécule d’ARN :.....................49

II. Les riborégulateurs modulant l’activité de facteurs protéiques...................................................53

1. gène csrA..............................................................................................................................53

2. Protéine CsrA........................................................................................................................54

III. Mécanisme de contrôle de la ségrégation plasmidique par un ARN antisens..........................55

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Chapitre 1 : Les procaryotesPrésentation de la diversité des mécanismes par lesquels les bactéries contrôlent la régulation de leur génome, en fonction des conditions environnementales. On ne s’intéresse qu’aux bases moléculaires.

I. Introduction

A. Pourquoi y a-t-il régulation de l’expression des gènes ?On parle d’adaptation phénotypique, ou d’acclimatation. Les bactéries ont la faculté de s’adapter à des conditions, des environnements changeants. Cette capacité est connue depuis très longtemps par rapport à l’existence transitoire de certaines enzymes, on la connaissait bien avant la bio mol actuelle. Depuis que l’on dispose d’outils et des travaux, on sait que cette adaptation s’exprime en termes de régulations de l’expression des gènes. Il y a régulation pour répondre aux conditions changeantes de l’environnement. Un « sensor » est une molécule relais qui transmet l’information d’un signal capté à un composé appelé régulateur. Ce composé effectue alors son action positive ou négative. Ca se traduit par une réponse, des protéines exprimées ou réprimées.

B. Niveaux de régulationIl existe 7 mécanismes principaux susceptibles de modifier la concentration à l’équilibre d’une protéine :

Synthèse de transcrit primaire Maturation post transcriptionnelle de l’ARNm Dégradation de l’ARNm Synthèse protéique Modifications post-traductionnelles Ciblage et transport des protéines Dégradation des protéines.

Toutes les étapes constituent des sites possibles de régulation.

// Voir Biologie moléculaire de la cellule, 4ème édition, Médecine-Sciences, Flammarion, 79.

On se recentre sur 3 niveaux principaux de régulation :

Transcription : phase d’initiation (le plus souvent), c’est Le site de régulation ; phase de terminaison (1)

Maturation : stabilité du transcrit (2) Traduction : en général aux étapes d’initiation et de terminaison (4)

C. Quelques définitionsLes séquences codant des produits agissant en trans, les séquences agissant en cis :

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- On va parler de cis régulateur, ça correspond à un motif présent sur l’ADN qui exerce un effet régulateur, sa présence a un effet sur la régulation du motif. Par exemple, un Opérateur. Un locus agit en cis s’il est sur la même molécule d’ADN que sa cible . Le plus souvent, il est en amont du gène régulé.

- Action en trans : un trans régulateur peut-être par exemple un facteur de transcription, ce n’est pas un élément de séquence, mais ça peut être une protéine qui agit en se fixant sur un élément cible, qui peut être de type opérateur. Il peut contrôler un autre locus même à partir d’une autre molécule d’ADN. Par exemple, lac I, en émettant une protéine, peut agir sur un opérateur. C’est la protéine elle-même qui est la molécule trans, et pas le locus.

Gène structural / gène régulateur : un gène structural code une protéine, un gène régulateur code une protéine impliquée dans la régulation d’un autre gène.

D. Notion d’OpéronOpéron : c’est un ensemble de gènes structuraux organisés en groupes, contenant des gènes codant des protéines dont les fonctions sont apparentées (gènes co-transcrits pour former une molécule d’ARN polycistronique = ARN unique, renferme plusieurs séquences potentielles).

A coté de ces gènes on retrouve des séquences adjacentes requises pour la transcription des promoteurs et des opérateurs et des séquences impliquées dans la régulation.

Un régulon est un réseau d’opérons fonctionnant avec un régulateur commun. Par exemple, les opérons codant pour les enzymes du métabolisme glucidique ; le système des gènes de choc thermique qui répondent au changement de température ; Les gènes qui sont induits (chez E. coli) en réponse à des agents endommageant l’ADN (appartenant à la réponse SOS).

II. Régulation de la transcription

A. Stratégie de contrôle de l’initiation de la transcriptionRégulation : moyen pour la cellule de développer un mécanisme qui lui permet de réprimer les gènes qui codent pour des protéines inutiles et de les activer au moment où ils deviennent nécessaires. Pour répondre aux changements du milieu, la cellule a développé une grande variété de mécanismes.

On définit 2 classes de mécanismes de régulation :

- Mécanismes opportunistes : quand la cellule a mis à profit la fonction particulière de la molécule régulée pour intervenir directement sur son expression.

- Mécanismes généraux : la protéine dont la fonction est régulée n’est pas directement impliquée, il intervient le plus souvent une protéine oxydée.

Il existe 2 modes de régulation :

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- D’une façon positive, c'est-à-dire que l’interaction déclenche la transcription du gène- D’une façon négative quand l’interaction empêche la transcription du gène.

Quelques rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes : idées fortes : voir diapos.

Quelques observations :

- Un organisme unicellulaire, avec un temps de génération très court, doit pouvoir répondre rapidement à des changements de son environnement

- Les demi-vies de la plupart des ARNm sont courtes (de l’ordre de quelques minutes)- La transcription et la traduction sont couplées et se réalisent dans le même compartiment

cellulaire.

Ces constatations impliquent que la régulation génique doit prendre effet tôt, et il est effectivement constaté que le point de contrôle majeur est l’initiation de la transcription.

Il existe 2 modes distincts de contrôle de l’initiation de la transcription :

- Un contrôle constitutif qui dépend uniquement de la structure du promoteur, de sa séquence. Le niveau de base de l’initiation de la transcription déterminé par la structure du promoteur. Il y a une variabilité dans la séquence consensus du promoteur : modification de l’efficacité du promoteur, définit promoteur fort ou faible. L’écartement des boites fait varier aussi l’efficacité.

- Un contrôle de régulation qui est sous la dépendance de protéines régulatrices. Le principe de base de la régulation de la transcription : la liaison d’une protéine spécifique à un site donné de l’ADN influence l’ensemble des évènements composant l’assemblage du complexe d’initiation et/ou l’initiation d’une synthèse productive d’ARN par l’ARN polymérase.

Quand on s’intéresse au processus d’évolution, on constate qu’il existe de nombreuses façons de moduler l’expression des gènes. Maintenant, on a énormément de façons différentes de moduler l’expression. On peut parler aussi d’astuce pour bloquer ou au contraire faciliter les modalités de la transcription. Il y a de multiples façons d’être actives pour une protéine. Une même voie métabolique peut être soumise à des contrôles de nature différente chez les espèces bactériennes différentes.

Lorsque le contrôle de la transcription est négatif, il faut :

- Un répresseur : protéine qui empêche l’expression d’un gène = régulateur négatif- Un opérateur : site cible de la protéine répresseur.

Lorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polymérase ne peut plus initier la transcription, ce qui empêche l’expression du gène.

Schéma de l’induction et de la répression cours diapos.

Corépresseur : petite molécule qui permet de convertir un répresseur inactif en un répresseur actif.

On dit qu’il y a modulation de l’activité du répresseur, on dit que les protéines sont allostériques. Une forme inactive peut être obtenue par protéolyse.

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Le contrôle positif de la transcription a besoin d’un élément auxiliaire qui va assister l’ARN polymérase pour l’initiation au niveau du promoteur.

Schémas diapos induction et répression.

Le site cible de la protéine auxiliaire est juste en contact.

En résumé :

- Un contrôle négatif : le répresseur inactive la transcription- Un contrôle positif : l’activateur active la transcription- Opéron inductible : avec inducteur : activateur de la transcription- Opéron répressible : avec corépresseur : inhibition de la transcription

Pourquoi tant de diversité ? Hasard ? But ? On n’a pas encore de réponse.

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Chapitre 2 : L’opéron lactose chez E. coli, un exemple d’opéron inductible négativement et positivement régulé

Lactose : disaccharide pouvant être utilisé comme source de carbone unique pour la croissance d’E. coli.

L’opéron lac : organisation

Il occupe environ 6000 paires de base. Il est composé de 3 gènes structuraux : z, y et a. z code pour une β-galactosidase, y pour une perméase, et a pour une acétylase. En amont des 3 gènes, on a une séquence régulatrice lac I (dont le produit est un répresseur), un promoteur et un opérateur.

Codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du lactose. Sont exprimés continuellement à faible taux. Sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent. Sont modulés par le taux de glucose du milieu.

Lac I est individuel, il a son propre promoteur, il est transcrit indépendamment des 3 gènes structuraux.

Expériences de Jacob et Monod : ils ont pu déduire l’organisation et le fonctionnement de l’opéron lactose en étudiant une série de mutations affectant la synthèse de la β-galactosidase et de la lactose-perméase. Les mutations étaient introduites soit dans le chromosome bactérien, soit sur un facteur F plasmidien reproduisant l’opéron.

Les gènes de structure lac sont contigus sur le chromosome d’E. coli. Ces gènes sont associés à des éléments de contrôle.

Il existe un transporteur dédié au lactose, situé au niveau de la membrane. Il permet au lactose de rentrer dans la cellule. La molécule transporteur est la β-galactoside perméase. (Voir schéma pas 32).

Lactose et glucose sont utilisés comme source de carbone. Il existe un transporteur pour le lactose, et un pour le glucose. Ce ne sont pas les mêmes. Ils rejoignent la même voie métabolique.

Notion importante : les enzymes nécessaires au métabolisme du lactose sont inductibles.

Expérience de 1957 page 33. Si on s’intéresse à l’activité d β-gal au cours du temps, à partir du moment où on ajoute un inducteur, on a une augmentation forte du taux de β-gal. L’induction se traduit par une augmentation du taux de messagers, et du taux de protéines β-gal. L’induction provoque une augmentation de la transcription d’une catégorie de gènes. Il y a un léger décalage entre l’apparition du messager et celle de la protéine.

Les inducteurs de l’opéron lac :

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- Lactose : substrat de l’opéron. Il n’est pas l’inducteur, il est converti en un isomère, l’allolactose par transglycosylation. L’enzyme qui réalise cette conversion est la β-galactosidase. Elle le fait par une activité parasite. Cet allolactose amplifie l’induction. Au final, cette réaction augmente.

- L’allolactose est l’inducteur naturel, c’est lui qui agit.- Inducteur gratuit : induit l’opéron mais pas métabolisé. Par exemple :

isopropylthiogalactoside (IPTG).

L’induction provoque la production des différents partenaires, et les gènes s’expriment à l’unisson, car les régulations se coordonnent.

Lac z code pour la β-galactosidase dont la forme active est un tétramère d’environ 500 kDa. Elle hydrolyse le galactose en lactose et ?

Lac y code la β-galactoside perméase, une protéine de 30 kDa liée à la membrane (protéine transmembranaire). Elle transporte les β-galactosides dans la cellule. La lactose perméase utilise le gradient de protons à travers la membrane de la cellule bactérienne pour co-transporter H + et le lactose.

Manque histoire E1 et E2.

Elle utilise le gradient de protons. L’entrée de lactose s’accompagne d’entrée de protons. Coté extérieur, le transporteur est sous forme E2. Possible fixation proton et lactose. Changement de conformation en entrant, et E2 devient E1. Il n’y a plus d’affinité, et donc libération du lactose et du proton. Dans le sens inverse, E1 devient E2, qui est de nouveau apte à recevoir proton et lactose. Perméase pas spécifique au lactose.

Lac a code la β-galactosidetransacétylase, une enzyme qui transfère un groupement acétyle de l’acétyle coenzyme A aux β-galactosides (comme l’IPTG). Le métabolisme du lactose ne nécessitant pas de ?...

I. Analyse génétique de l’opéronLa génétique a joué un rôle décisif dans la compréhension de l’opéron lac. L’objectif était d’évaluer les changements qui se produisent dans la spécificité de l’un ou de l’autre des intervenants du système en réalisant des mutations. On a pu déterminer 2 catégories principales de mutations :

- Mutation qui supprime l’expression de l’opéron : non-inductible. Il n’y a pas de réponse.- Mutation qui exprime de façon permanente l’opéron : constitutifs. Réponse constante.

3 éléments essentiels ont été identifiés : le répresseur, l’opérateur et l’inducteur. Pour que le système soit fonctionnel, il faut un répresseur fonctionnel, un opérateur qui peut être reconnu, et un inducteur qui doit pouvoir se fixer sur le répresseur.

Etude des mutants lac :

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En absence d’inducteur, niveaux faibles, en présence, niveaux forts.

En absence de lactose, β-galactosidase, lactose perméase et galactosidase transacétylase sont en quantités faibles, en présence de lactose, elles sont en fortes quantités.

L’effet de l’inducteur dans le i- est nul, et dans le oC, cette séquence n’est plus une cible efficace, et donc on a des effets sur l’expression qui sont faibles, l’ajout d’inducteur permet une expression rehaussée, mais l’effet inducteur est moins marqué, il n’y a qu’un facteur 10.

Donc il y a une régulation commune des 3 gènes sous contrôle de 2 loci (locus au pluriel).

Dans le cas ou le répresseur actif ne peut pas se fixer à l’opérateur mutant O C, il y a une fixation lâche (il peut quand même se fixer), et l’opéron est transcrit puis traduit.

Dans le cas d’un lac I-, ce gène commande la synthèse d’un répresseur défectueux que ne se fixe pas à l’ADN. L’opéron est transcrit et traduit.

II. Utilisation de diploïdes partielsLa souche sauvage à laquelle on ajoute un élément (plasmide). On a donc 2 copies de l’opéron lac. On dit alors que c’est un diploïde partiel, basé sur le phénomène de conjugaison bactérienne. On obtient alors la différenciation mâle/femelle.

On met en présence dans une culture des males et des femelles. Les males insèrent alors leurs informations dans les femelles, et on se sépare des males (on les tue ***par magie***).

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La fonction du répresseur ne s’exerce pas uniquement sur des séquences adjacentes, mais aussi sur des séquences distantes. On dit que ce produit agit en trans.

Dans le cas du OC, l’effet inducteur est moindre.

Les mutations de l’opérateur sont dites constitutives, car le promoteur est incapable de fixer les protéines répresseur. Ceci permet à l’ARN polymérase d’avoir libre accès au promoteur. Les mutations OC agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes structuraux qui leurs sont contigus.

Les mutations du type lac I- inactivent le gène lac I et entrainent l’expression constitutive de l’opéron, car la protéine du répresseur mutant ne peut plus se fixer sur l’opérateur.

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III. Les contrôles exercés par le répresseurOn met en contact 2 populations cellulaires : Hfr I+Z+ x F I-Z-. On ne s’intéresse qu’aux cellules receveuses, les cellules donneuses sont tuées. En l’absence d’inducteur, la synthèse de β-gal fonctionne, en présence d’inducteur, la synthèse fonctionne, puis diminue et s’arrête.

On a donc la preuve d’un transfert. Il s’est exprimé au cours du temps, et l’inducteur est une molécule qui va exercer son induction sur le répresseur.

Conclusion de l’expérience : en absence d’inducteur, les gènes structuraux ne peuvent être transcrits, la liaison à l’opérateur de la protéine répresseur dans sa forme active empêche la transcription. En présence d’inducteur, transformation du répresseur en une forme inactive qui quitte l’opérateur. La transcription débute alors au niveau du promoteur et se poursuit le long des gènes jusqu’à un terminateur situé quelque part au-delà de lac A.

A. Comment fonctionne le répresseur ?Le répresseur lac est un tétramère. Chaque sous-unité est capable de se lier à une molécule d’IPTG (l’inducteur).

En absence d’inducteur, liaison non spécifique du répresseur, sous forme tétramérique de l’ADN double brin. En présence d’inducteur, la liaison est spécifique.

Il y a 3 domaines fonctionnels pour chaque sous-unité.

Le répresseur se fixe à un ADN double brin contenant la séquence de l’opérateur lac de type sauvage. Le répresseur ne se fixe pas à un ADN de mutant OC. L’addition d’IPTG in vitro libère le répresseur de l’ADN opérateur.

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3 domaines :

- Pièce maitresse : fixation à l’opérateur- Cœur : fixation de l’inducteur- Domaine C-terminal : oligomérisation

B. Comment l’inducteur provoque-t-il la libération du répresseur de son opérateur ?

Lorsque l’inducteur est fixé au répresseur, la protéine répresseur change légèrement de structure.

Le répresseur ne reconnaît pas une seule séquence, il existe 3 séquence opératrices, le répresseur va si fixer sur 2 d’entre elles, provoquant différents cas. Il y a alors formation d’une boucle d’ADN, qui devient inopérante.

IV. L’opérateur lacC’est une séquence qui fait environ 35 paires de bases, l’opérateur principal (O1) est situé en aval du promoteur, et il couvre celui-ci. Il présente 2 séquences quasi symétriques (séquence palindromique imparfaite).

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Pour connaître cela, on a fait des expériences d’empruntes. La partie du bout d’ADN protégée par la protéine sera résistante, et si elle n’est pas attaquée, elle est protégée, ce qui permet de déterminer la place occupée par les différents éléments de l’ADN.

Il déborde sur le premier gène de lac Z.

Le promoteur est l’élément de séquence sur laquelle vient se fixer le matériel de transcription.

S’il y a recouvrement partiel, c’est parce que comme ça, si le répresseur est fixé sur la séquence opératrice, le matériel de transcription ne peut pas s’y fixer.

O1 est l’opérateur original, il se trouve sur l’extrémité 3’ du promoteur et déborde sur les premiers gènes de lac Z. O2 se situe 410 paires de bases en aval de Lac Z, et O 3 83 paires de bases en amont de lac I.

Si l’on a mutation qui touche O2 ou O3, la transcription est augmentée d’un facteur 4. Si les 2 sont mutées, le facteur de transcription augmente d’un facteur 100.

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L’opéron lac est également soumis à une régulation positive. Dans ce cas, un autre mécanisme régulateur est mis en œuvre, on parle de répression catabolique, qui correspond à une activation.

La répression catabolique a été mise en évidence par des expériences de Moneau en 1950, correspondant à un phénomène de diauxie. Si l’on met E. coli à croitre en milieu de glucose et xylose, on obtient une croissance en 2 phases. Le glucose est d’abord utilisé (1ère partie), puis, il y a une pause, et enfin, le xylose est consommé (2ème partie), c’est ce qu’on appelle le phénomène de diauxie, qui témoigne de la consommation d’un sucre favorisée par rapport à un autre. La cellule bactérienne préfère donc utiliser le glucose qu’un autre sucre. Cette préférence est due à la facilité d’utilisation du glucose.

Dans le cas où on lance une culture dans un milieu sans glucose, mais avec du glycérol, et induction par l’IPTG. En ajoutant du glucose, on constate une chute du taux d’ARNm lac.

La disposition dans un milieu de culture de glucose empêche l’expression de gènes régulateurs, au profit de l’utilisation du glucose. Il a un effet négatif sur d’autres gènes.

L’absence de glucose active l’opéron lac, la présence la désactive.

L’effet du glucose s’exerce dans le cas de l’effet répressif, par l’AMPc et une protéine appelée activateur des gènes cataboliques (CAP ou CRP). Cet effet s’explique en relatant la façon dont le glucose entre dans la cellule.

Chez E. coli, la plupart des sucres sont transportés par le système PTS. Son principe est simple, l’entrée du glucose dans la cellule s’accompagne de sa phosphorylation. Une fois dans la cellule, le glucose devient du glucose-6-phosphate. Ce groupement phosphate provient du PEP.

EIII est phosphorylée, et transmet le phosphate au glucose. Le PEP est transformé en pyruvate pour transférer le phosphate à EIII. L’adénylate cyclase

Quand le glucose est abondant il n’y a pas production d’AMPc. Cet AMPc, quand il est présent, s’associe à une protéine qui constitue en l’état un activateur de transcription. Donc en présence de glucose il n’y a pas d’activation des gènes.

Si le glucose est moins abondant, voir absent, la situation est inverse, l’adénylate cyclase est active, l’AMP s’associe aux CRP, et les gènes s’expriment.

L’AMPc s’accumule quand le glucose est absent. Quand le glucose est présent, l’adénylate cyclase est inhibée. L’AMPc phosphodiestérase est activée.

L’AMPc représente un système de coordination générale de régulation. C’est un système que marque sa préférence pour l’utilisation du glucose en inhibant l’expression des opérons qui codent les

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enzymes de voies métaboliques alternatives. Elle est déclenchée dans la cellule par la réduction de la concentration de l’AMP cyclique.

Tout repose sur la quantité intracellulaire d’AMPc :

AMPc glucose Concentration réduite en AMPc

CAP active CAP inactive

Transcription Pas de transcription

3 scénarii :

1) Pas de lactose présent : l’opéron est éteint, pas d’ARN synthétisé2) Lactose présent ; glucose également présent : la présence du lactose inactive le répresseur (il

y a transcription. Parce que le glucose est présent, l’AMPc est faible, CRP ne peut pas aider la transcription

3) Lactose présent ; pas de glucose : la présence de lactose inactive le répresseur, il y a transcription. Il n’y a pas de glucose, le taux d’AMPc est élevé, l’AMPc se fixe à la CRP (activation), CRP se fixe et aide la transcription, il y a un niveau élevé de transcription.

4) En absence de glucose et de lactose : dans ces conditions, il y a une forte concentration en AMPc dans la cellule, et la CRP se fixe à son site en amont du promoteur lac. La CRP assiste l’ARN pol dans sa fixation au promoteur. Cependant, il n’y a pas activation de la transcription parce que le répresseur lac demeure …

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CAP : ce qu’il faut retenir

- Active la transcription de plus de 100 promoteurs (facteur de transcription global).- Protéine d’environ 45 kDa qui se fixe à l’ADN sous la forme d’un dimère (2 sous-unités

identiques).- Le premier activateurs transcriptionnels à avoir été isolé(1970) et le 1er pour lequel la

structure 3D a été déterminée.- En présence d’AMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe à une séquence cible de

22pb, située près ou au sein du promoteur qu’il contrôle- Active la transcription du fait de contacts protéine-protéine avec l’ARN polymérase

Le

site de fixation CRP se situe à différents endroits, pour lac c’est en -61, pour gal c’est en -41, et pour ara, c’est en amont du promoteur.

CRP est un activateur transcriptionnel au spectre assez large. Il existe 3 classes de CRP

Dans la classe 1, elle active la transcription est fait des contacts avec l’αCTD de l’ARN polymérase.

Voir pages 90, 91, 92 et 93.

Dans le cas d’une transcription, il n’y a pas de répresseur, la protéine CRP, lorsqu’elle se fixe à son site courbe l’ADN.

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Dans le modèle 1, le répresseur se fixe en O1 et O3. Le promoteur est libre, mais le site CAP est occupé, donc l’ARN polymérase ne peut se fixer. Dans le modèle 2, la fixation du répresseur lac se fait en O1 et O2, le site CAP est toujours occupé, l’ARN polymérase fixée au promoteur mais pas de synthèse car blocage de l’ARN polymérase par le répresseur.

V. Exemple d’utilisation en génie génétique de l’opéron lacOn va utiliser, lorsqu’il s’agit de produire de l’ARN mutant, une souche bactérienne lac Z. Ces souches produisent un β-galactosidase incomplète, et inactive. La séquence codant le peptide α peut être apportée en trans par un plasmide. Seul, le peptide α n’a aucune activité enzymatique. Mais associée avec la protéine codée par lac Z, il restaure l’activité β-galactosidase de la protéine mutante.

L’intérêt de cette manipulation est que dans un souci de clonage, on a un problème d’efficacité. Il faut donc pouvoir sélectionner les clones présentant le caractère désiré. Ce crible peut reposer sur le phénomène d’α-complémentation.

X-gal : Sucre dont le produit après hydrolyse est bleu.

Voir page 102.

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Chapitre 3 : L’opéron arabinoseUn exemple de mécanisme de régulation transcriptionnelle positive et négative de l’activité des gènes.

L’arabinose est un sucre à 5 carbones, organisé en 3 gènes structuraux : ara BAD, contrôlé par le régulatuer général CRP et par une protéine spécifique AraC. Les gènes structuraux codent pour les enzymes qui permettent la transformation du L-arabinose en D-xylulose-5-phosphate. Ce dernier rejoint la voie des pentoses phosphate, productrice d’énergie pour la cellule.

Illustration page 5

Il y a aussi 4 autres gènes qui codent pour des transports. AraE code pour une protéine qui sert au transport de l’arabinose, par faible affinité. araF, G et H servent au transport de forte affinité, mais de faible capacité. Il y a aussi araJ, mais on ne connaît pas son fonctionnement.

AraC constitue le régulateur positif et négatif de cet opéron.

Cette région régulatrice est constituée :

- Un site régulateur I, constitué de 2 portions I1 et I2, ce sont des sites de liaison pour la protéine AraC.

- De l’autre coté, on a 2 sites O1 et O2, qui sont également des sites de fixation de la protéine AraC.

AraC est une protéine en 2 partie, appelée dimère. On dit donc que c’est un homodimère, elle a un domaine de fixation à l’ADN (coté C-ter), et un site de fixation de l’arabinose (activateur, coté N-ter). Cette molécule agit comme un activateur et un répresseur. Quand c’est un régulateur négatif, il se fixe sur araO2 et araI1. Quand c’est un régulateur positif, elle se fixe à la fois aux demi-sites araO1 et araI1 et I2. Elle régule en plus sa propre synthèse (autorégulation), en se fixant à araO 1. Elle provoque la formation de boucles sur l’ADN.

Effets de la source de carbone sur la transcription d’araBAD :

Glucose Arabinose araBADFort Faible RépriméFaible Fort ActivéFort Fort RépriméAbsent Absent Réprimé

La courbe de croissance est typiquement diauxique.

I. En absence d’ArabinosePage 10

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AraC se fixe en O2 et I1, cette situation constitue à une répression de la transcription des gènes structuraux, le promoteur ne fonctionne pas. C’est possible grâce à la forme dimérique et à la flexibilité d’AraC. Elle gène alors la fixation sur le promoteur. Donc état de répression.

Quand AraC est en excès, une transcription est toujours possible, elle se fixe à O 1, ce qui rgule le taux cellulaire en la protéine AraC.

L’induction se fait en présence de L-arabinose, qui est l’inducteur, la conformation de la protéine AraC voit sa conformation changer. Plutôt que d’être flexible, elle se rétracte, et elle ne pourra que se fixer à I1 et I2, activant ainsi ParaBAD. En se fixant en ces sites, elle va activer la transcription au niveau de ce promoteur. L’accès de l’ADN pol est favorisé, et on a une action suplémentaire.

Page 11.

Il y a 3 différences importantes entre les opérons lac et ara :

- La protéine AraC peut fonctionner à la fois comme répresseur et activateur pour l’expression des gènes AraBAD

- La protéine AraC régule également sa propre synthèse, réprimant sa propre transcription- L’opéron ara constitue un exemple de régulation « menée » à distance du fait de la

formation d’une boucle dans l’ADN.

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Terminaison de la transcription : quelques rappelsC’est la dernière phase de la transcription, qui va aboutir au relargage du trans sceen. L’arrêt se fait quand l’ARN polymérase rencontre un terminateur. Le terminateur est formé d’un boucle dans l’ARN. Il y a 2 mécanismes principaux : terminaison facteur-indépendant, terminaison facteur-dépendant. Quand l’ARN polymérase passe par une région d’arrêt formé de 2 séquences spécifiques, la seconde est une répétition inversée de la première. L’ARN polymérase franchit cette région, une boucle se forme, la course de l’ARN polymérase est ralentie. La série de A ensuite est transcrite en une série de U, les liaisons entre A et U sont moins fortes, et l’ARN est enfin détaché puis libéré.

A coté de ceci on a une terminaison facteur dépendant : elle requiert des protéines accessoires qui interagissent avec la polymérase ou le transcript provoquant l’arrêt de la transcription. E. coli possède 3 facteurs de terminaison : Rho, Tau, NusA. Rho est mieux comprise.

La terminaison Rho-dépendante est un mode de terminaison qui ne fonctionne que si l’ARN produit n’est pas en cours de traduction (ribosomes absents). Rho est une ATPase ARN-dépendante ; elle réalise l’hydrolyse de l’ATP… ? page 23

Roh se fixe à l’ARN synthétisée qui va être reconnu par la protéine rut. Rho glisse le long de l’ARN polymérase à condition que l’ARN polymérase soit freiné. Il faut donc l’intervention d’une boucle.

I. Modulation de la terminaison de la transcriptionL’ensemble des mécanismes par lesquels la terminaison de la transcription est abolie ou fortement diminuée est appelé antiterminaison.

Il y a 2 types de stratégies utilisées chez les bactéries pour obtenir l’antiterminaison :

1) Effet sur l’ARN polymérase, la rendant « résistante » aux signaux de terminaison : c’est l’antiterminaison générale. Par exemple, le système d’antiterminaison par la protéine N du bactériophage λ.

2) Action localisée en masquant les signaux de terminaison eux-mêmes : c’est l’atténuation transcriptionnelle. Il y a alors mise en jeu d’interactions entre l’ARN polymérase et des effecteurs qui favorisent ou empêchent la formation des structures terminatrices.

A. Atténuation transcriptionnelleIl y a de nombreux exemples d’opérons régulés par atténuation transcriptionnelle. Il y a 2 sous-classes d’atténuation transcriptionnelle selon la nature de l’effecteur mis en jeu dans le mécanisme :

1- Un composant général de la machinerie cellulaire, le ribosome, ou2- Une protéine régulatrice spécifique.

Exemple : L’opéron tryptophane (Trp) d’E. coli

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Un exemple de modulation de la terminaison de la transcription par atténuation. La régulation du taux intracellulaire dans la cellule repose sur l’inhibition du produit final, et sur l’atténuation de la transcription.

Voir schéma cours.

On a une série de gènes structuraux : E, D, C, B et A. Il y a une région régulatrice complexe. Il y a synthèse d’un messager unique polycistronique. 5 protéines sont synthétisées à partir de ce messager.

Il y a un promoteur unique, et un site opérateur au sein de ce promoteur. Il existe une protéine répresseur qui peut se fixer sur le promoteur pour faire une régulation négative.

Si les acides aminés dont elle a besoin sont présents dans le milieu de culture, la bactérie E. coli « importera » ceux-ci avant d’en faire la synthèse. Dans ce cas, les gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés sont réprimés, on parle d’opéron réprimé. Quand les acides aminés sont absents du milieu de culture, certains gènes sont exprimés et la synthèse des acides aminés se produit.

Il y a 2 mécanisme principaux qui peuvent être mis en œuvre : interaction répresseur-opérateur, et terminaison de la transcription.

1. Mécanisme 1 : Interaction répresseur-opérateurQuand le tryptophane est présent, celui-ci se fixe au produit du gène TrR. La protéine TrpR se fixe à l’opérateur trp, ce qui empêche la transcription de se faire (la régression observée réduit le taux de transcription d’environ 70 fois). La séquence des bases de l’opérateur trp est presque palindromique, et elle est encadrée et sa région -10 est surlignée.

La fixation du tryptophane au répresseur trp altère sa structure, un déplacement de 0,8nm des hélices impliquées dans la reconnaissance permet au répresseur d’interagir avec de l’ADN.

Ce mécanisme relatif à la fixation de la protéine répresseur est un mécanisme déjà évoqué dans d’autres cas.

2. Mécanisme 2 : terminaison de la transcriptionLa transcription est également contrôlée par atténuation, le processus qui aboutit à la traduction d’un petit polypeptide. Quand les cellules sont privées de tryptophane, les gènes de l’opéron sont exprimés au taux le plus fort. Quand la privation en tryptophane est moins sévère, les gènes de l’opéron s’expriment à un niveau plus faible que le maximum. L’atténuation régule le niveau de transcription par un facteur 8 à 10 et combiné avec le mécanisme 1 (interaction répresseur-opérateur) il y a diminution de la transcription d’un facteur 560 à 700.

Organisation de la région leader/atténuateur de l’opéron trp : voir schéma.

La région leader/atténuateur est une séquence codante. Il y a donc possibilité de synthèse d’un co-peptide qui fait 14 acides aminés. Il renferme 2 triplets qui correspondent à la synthèse de tryptophane. Elle comprend 4 segments dont les séquences sont des duplications en tandem. Ces

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séquences sont susceptibles de s’apparier et de former des tiges-boucles. Il y a 2 possibilités de structure : 1-2 + 3-4 ou 2-3.

La région leader se situe entre l’opérateur et la séquence du locus trpE. Dans cette région leader se trouve la séquence att (=atténuateur). Cette séquence att comprend un codon start, deux codons Trp, et un codon stop, ainsi que 4 régions formées de séquences pouvant s’apparier selon 3 structures secondaires alternatives.

S’il y a appariement des régions 1-2, le signal formé correspond à une Pause. Si c’est ans les régions 2-3, le signal formé correspond à une antiterminaison. Si ce sont les régions 3-4 qui s’apparient, le signal formé correspond à une terminaison.

Transcription et traduction sont étroitement couplées chez les procaryotes : ces deux processus se produisent simultanément. (Voir page 45).

Dans le cas d’une cellule privée en tryptophane, on a une transcription qui démarre, la synthèse du messager prend effet au +1, le transcrit est formé, de par sa séquence il peut faire une tige boucle, du fait de l’appariement d’un élément 1 avec une région 2. Si le tryptophane est peu abondant, on aura peu d’ARNt chargé en tryptophane, et on aura un blocage de la traduction au niveau de ces codons tryptophane. En effet, les ribosomes qui parcourent l’ARN vont marquer une pose. A la faveur de cette pose, il va se former un appariement entre la région 2 et la région 3 (voir page 46). Cette formation est une structure antiterminatrice. En effet, si le tryptophane est abondant, on aura 1-2 + 3-4, c'est-à-dire pause et terminaison. Cependant, dans notre cas 2-3, le terminateur disparaît, la pause n’a pas lieu, d’où l’antiterminaison.

Dans la situation inverse, le tryptophane est abondant, la traduction de la région leader aura lieu, le ribosome couvre la portion 1 et 2, et donc 3 et 4 s’apparient, forment une boucle de terminaison.

La position du ribosome joue un rôle important dans le phénomène d’atténuation (voir page 48).

Ce mécanisme est retrouvé chez plusieurs opérons de biosynthèse des acides aminés, c’est un mécanisme commun à ces opérons. Chez l’opéron thréonine, par exemple, le mécanisme est similaire. C’est l’atténuation de la transcription.

Contrôle enzymatique du taux de tryptophane et par le transport, aident contrôle génique.

Cas de l’opéron trp de B. subtilis : régulation par l’intermédiaire d’une protéine se fixant à l’ARN. En présence de tryptophane, TRAP se fixe à l’ARNm, ce qui provoque la formation d’un signal de terminaison : arrêt de la transcription. TRAP a 11 sous unités, et au niveau de la région de contrôle, il y a 11 sites de fixations, on dit que l’ARN s’enroule autours de cette protéine. Ceci provoque alors un appariement C-D, qui est un terminateur transcriptionnel.

B. Atténuation générale : exemple chez le phage et cas deλ l’opéron des ARN ribosomiques

Rappel : au niveau de certains terminateurs, la réaction de terminaison peut être empêchée par des facteurs auxiliaires spécifiques, qui interagissent avec l’ARN polymérase.

Il y a un signal de l’environnement qui va faire basculer la situation pour la cellule infectée d’un état intact à un état où elle sera lysée. Le phage λ est maintenu en phase lysogénique (non transcrit) du

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fait de la présence d’un répresseur transcriptionnel c1. Il y a une situation (stress environnemental), dans lequel cette répression sera annulée. c1 reconnaît 2 séquences opératrices OL et OR.

Si la répression est levée, il y aura un début de transcription, de 2 gènes précoces qui s’appellent N et cro. La transcription des gènes fini par des terminateurs tL1 et tR1. Ce sont des transcrits précoces. La partie cro entre alors en compétition avec C1, pour occuper les opérateurs OL et OR. Donc c’est un cycle d’activation, on amplifie le signal, on favorise l’expression de N et de cro. Quand N atteint un certain seuil, elle va rendre l’ARN polymérase résistante aux terminateurs présents peu après. L’important ici est le rôle de N, capable de permettre à l’ARN d’ignorer les terminateurs.

C. Antiterminaison dans les opérons ribosomauxQuand modification des besoins cellulaires en protéines : augmentation du nombre de ribosomes ; pas de changement de leur activité individuelle. Le nombre de ribosomes augmente en même temps que la vitesse de croissance des cellules.

Il faut que la synthèse des 2 composants soit coordonnée.

Nécessite les produits des loci nus :

1- Codent des protéines appartenant à l’appareil de transcription mais non associées à l’ARN polymérase lors de son isolement

2- Correspondent à 4 protéines :a. nusA, nusB et nusG intervenant dans la terminaison de la transcriptionb. nusE, codant la protéine ribosomale S10

Protéine nusA :

- facteur de transcription générale- augmente l’efficacité de la terminaison en accentuant la tendansce de l’ARN polymérase à

marquer des pauses sur les terminateurs

Protéines nusB et S10 :

- forment un dimère qui se fixe spécifiquement à l’ARN contenant une séquence particulière : boxA

Protéine nusG :

- impliquée dans la formation du complexe entre les facteurs… (voir diapos)

Les régions de tête des opérons rrn contiennent des séquences boxA : ces éléments de séquence sont indispensables à la fixation des protéines nécessaires à l’antiterminaison. Les dimères nusB-S10 reconnaissent ces séquences et se fixent à l’ARN polymérase en cors d’élongation au-delà de boxA. Cela modifie les propriétés de l’ARN polymérase en lui permettant alors de poursuivre sa lecture au-delà des terminateurs rho-dépendants, présents dans l’unité de transcription.

L’ARN polymérase fonctionne selon un cycle : (il existe des formes alternatives de l’ARN polymérase.)

1- forme enzymatique prete pur l’initiation : α2ββ’σ

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2- forme enzymatique prete pour la terminaison : α2ββ’NusA

La protéine nusA se fixe au noyau de la polymérase mais pas à l’holoenzyme … (voir diapos)

Le noyau de l’ARN polymérase alterne entre l’association avec σ pour l’initiation et l’association avec les facteurs Nus pour la terminaison.

Schéma diapo.

D. Autre exemple de la régulation par antiterminaison transcriptionnelle

Gènes codant les aminoacyl-ARNt synthétases.

Antiterminaison : formation potentielle d’une structure secondaire alternative au promoteur.

Preuves expérimentales :

1- Quand délétion de la structure terminatrice en amont des gènes structuraux : expression élevée et constitutive

2- Dans les conditions de non carence : mise en évidence uniquement de cours transcrits générés par une terminaison transcriptionnelle au niveau de chacun des 3 terminateurs. Dans les conditions de carence : efficacité de terminaison réduite, accumulation de transcrits entiers.

Donc il y a modulation du taux de terminaison au niveau de la structure terminatrice.

1. Les aminoacyl ARNt synthétases :- Groupes d’enzymes catalysant la charge des ARNt avec des acides aminés- Réaction en 2 étapes :

o Consommation d’une molécule d’ATP pour activer l’acide aminé sous la forme d’un complexe enzyme-aminoacyl-adénylate

o Attachement de l’acide aminé « activé » à l’adénosine présente à l’extréminté 3’ de l’ARNt spécifique, avec libération d’AMP

Induction spécifique de l’expression des gènes amino-acyl ARNt synthétases par une carence en l’acide aminé correspondant (et pas par une carence générale en acides aminés).

Quels sont les mécanismes d’induction des gènes des aminoacyl ARNt synthétases ?

Chez E. coli, différents mécanismes sont en œuvre :

- Autorégulation au niveau traductionnel : thréonyl-ARNt synthétase- Atténuation transcriptionnelle classique : phénylalanine ARNt synthétase- Autorégulation de l’intitiation de la transcription : alanyl-ARNt synthétase

Chez Bacillus subtilis, mécanisme commun : régulation par antiterminaison. Organisation des gènes aminoacyl ARNt synthétase chez B. subtilis :

- Présence d’une séquence signature (formée de 14 nucléotides) appelée T-box

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- Présence d’une région leader non traduite, hautement structurée, d’environ 300 nucléotides située en amont de AUG = Terminateur transcriptionnel facteur-indépendant.

Voir schéma page 72 de la région 5’ non codante du gène thrS.

La T-box est une séquence de 14 nucléotides capable de s’apparier avec le début du terminateur.

La structure leader est susceptible de former 2 structures alternatives, qui sont la conséquence d’appariement de base entre la t-box et une séquence complémentaire située en aval.

En présence de thréonine, ce sont essentiellement de courts transcrits qui sont formés, alors qu’en situation de carence, une structure alternative se forme, l’ARN polymérase poursuit son travail au-delà du terminateur, grâce à l’antiterminateur.

Interaction entre l’ARNt non chargé avec l’ARNm (région 5’ non cofante de la synthétase correspondante) : stabilisation de la structure antiterminatrice.

Interaction en 2 endroits :

1- Codon-anticodon2- Appariement entre extrémité CCA libre du bras accepteur de l’ARNt non chargé et une

séquence UGG complémentaire présente au niveau de la T-box

Cette interaction va stabiliser la structure antiterminatrice, et l’ARNt pourra continuer sa transcription et transcrire cette séquence thrS.

2. Contrôle de l’initiation de la transcriprion par substitution des facteurs σ :

Quelques rappels sur le rôle du facteur σ, autres facteurs σ

Ce facteur est nécessaire au démarrage de la transcription, il est libéré quand la chaine d’ARN atteint une 10aine de nucléotides.

Il y a plusieurs facteurs σ. On connaît le σ70, utilisé pour l’initiation de la transcription.

Problématique

Constat :

- Une seule ARN polymérase chez E. coli- De nombreux gènes à transcrire, donc de nombreux promoteurs différents- Transcription faite à des taux variables et en des occasions différentes

Conséquence :

- Nécessité pour la cellule d’être capable d’initier la transcription au niveau de promoteurs spécifiques.

Contrôle par des facteurs σ auxiliaires. Partage des taches entre le noyau de l’ARN polymérase et le facteur σ.

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Les 7 types de facteurs σ chez E. coli. Chacun de ces facteurs σ reconnaît et stimule la transcription d’un groupe de gènes spécifiques via des promoteurs présentant des séquences différentes (page 83).

Un facteur σ c’est une protéine avec plusieurs régions : voir page 85.

3. Un exemple de contrôle de l’expression génique par l’intervention d’une succession de facteurs , la sporulation chez B. subtilisσ

Sporulation : processus par lequel la cellule bactérienne est répartie asymétriquement en 2 compartiments, la préspore (qui donnera les spores) et la cellule mère (qui synthétise la paroi cellulaire protectrice de la spore et qui est finalement abandonnée).

B. subtilis a plus de 10 facteurs σ différents, et il n’y en a pas de dominants, ils interviennent conjointement. Certains ont une expression dans le temps à un moment donné pour une situation précise.

Certains de ces facteurs sont présents dans les cellules végétatives. D’autres produits dans des circonstances particulières : p.e lors d’une infection phagique ou lors de la sporulation.

Voir page 88.

4. Que se passe-t-il au niveau des gènes lors de la sporulation ?2 constats :

1- Changements importants des activités de biosynthèse chez la bactérie en sporulation2- Changements dans l’expression de nombreux gènes :

a. Arrêt de la transcription pour certainsb. Expression spécifique pour d’autres

Mise en place de nouvelles formes d’ARN polymérase : même noyau enzymatique mais différents facteurs σ. Changement dans la spécificité de transcription.

La sporulation est pilotée par 5 facteurs σ (en plus de la cellule végétative)

1- Un facteur actif avant la séparation de la cellule2- Deux facteurs actifs successivement dans la préspore3- Deux facteurs actifs successivement dans la cellule mère

Il y a une régulation croisée des facteurs σ compartimentés ce qui permet à la préspore et à la cellule mère…

La sporulation commence quand le facteur σ43 est remplacé par σF, activé. Cette nouvelle forme est apte à transcrire un premier groupe de gènes spécifiques à la place des gènes végétatifs (nécessaires à la vie végétative). Ensuite, σG va déplacer σF, et déclenche ainsi la transcription des gènes tardifs par σG activant le déclenchement de la transcription des gènes tardifs par σG activé.

Il existe une étroite relation entre ces cascades d’évènements, en relation avec les échanges, imposé par l’incorporation des facteurs σ.

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5. Infection de B. subtilis par le phage SPO1 : contrôle de la transcription par l’intermédiaire de la production de nouveaux facteurs σ

Cycle infectieux de SPO1 , en 3 étapes :

1- Imméiatement après l’infection : transcription des gènes précoces2- Après 4 ou 5 minutes, transcription des gènes intermédiaires3- 8 à 12 minutes après le début de l’infection, transcription des gènes tardifs

Gènes précoces : transcription par l’holoenzyme de la bactérie hôte.

Gènes du phage intermédiaire et tardif : expression contrôlée par 3 gènes régulateurs appelés 28,33 et 34 : régulation en cascade.

L’ARN polymérase de l’hôte transcrit un gène précoce, dont le produit est nécessaire à la transcription des gènes intermédiaires ; puis deux des gènes intermédiaires codent des produits indispensables à la transcription des gènes tardifs.

Voir page 92.

6. Le régulon σ32 (ou σH), la réponse au choc thermiqueUn autre, et dernier, exemple de la substitution des facteurs σ.

Quand E. coli exposée à des températures supérieures à sa température normale de croissance : 24 protéines sont induites par le saut de température (dont 20 sous le contrôle d’un seul gène rpoH (codant σ32).

Niveau intracellelaire de σ32 : variable, déterminant l’expression de la vingtaine de gènes constituant le réseau (=régulon σ32).

σ32 permet la transcription des gènes codant les HSP, elles comprennent des protéases et des protéines chaperons.

Le régulon σ32 d’E. coli : caractéristiques principales

- Joue un rôle central dans la réponse au choc thermique chez E. coli- Est spécifiquement induit en réponse à un stress environnemental- Transcrit de façon préférentielle les gènes de la réponse aux chocs thermiques, gènes dont

les produits codent pour une série de protéines chaperons, de protéases et quelques autres HSP

- Intervient de concert avec le régulon σE (l’ARN polymérase σE active la transcription du gène rpoH (codant σ32))

- Signal de base qui induit la production de σ32 : accumulation de protéines dépliées

Schéma page 96.

7. Système de régulation de l’expression génique basé sur l’utilisation de facteurs anti-σ

Facteurs anti-σ : facteur capable de former un complexe avec son facteur σ cible entrainant l’inhibition du fonctionnement du facteur σ.

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1ère démonstration : lors de l’infection d’E. coli par le phage T4 :

Mise en évidence d’un facteur anti-σ (AsiA)

- Synthétisé par le phage- S’associe avec σ70

- Inhibe ainsi la transcription des promoteurs de l’hôte et promoteurs phagiques précoces

Voir page 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104.

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Le Quorum sensingQuand il y a modification de leur environnement, les bactéries répondent. Il y a coordination de leurs réponses au niveau de l’ensemble de la population bactérienne soumise à la modification.

Comment peut-il y avoir coordination de la réponse ? Par une modification intercellulaire. Les bactéries produisent des molécules de signalisation, diffusible.

Conséquence : au sein de la population se déclenche l’expression des gènes spécifiques.

La molécule diffusible est parfois appelée phéromone, c’est une molécule de faible poids moléculaire, et qui permet à la cellule individuelle de percevoir quand l’unité de population minimale (le quorum) est atteint. Ceci pour initier une réponse concertée.

Schéma page 5

Quand un seuil critique de phéromones est atteint, à partir d’une certaine quantité de population, une réponse est émise.

Ex : facteurs de virulence de Pneumobactéria granulosa

Le quorum sensing est décrit parmi de nombreuses espèces bactériennes. C’est un procédé de régulation des processus impliqués dans l’adaptation métabolique, et la virulence.

Modèle de régulation via le QS : 3 acteurs principaux

- Un signal (appelé autoinducteur)- Voir diapos- …

Le type de signal diffusible dans l’environnement peut être des oligopeptides modifiés.

Voir émission, réception schéma page 7.

Le senseur provoque une réponse transcriptionnelle. C’est une kinase qui suite à la fixation de la phéromone va être auto-phosphorylée, au dépend de l’ATP. La molécule phosphorylée est un régulateur transcriptionnel, elle va activer la transcription de gène cible.

Chez Staphilococcus aurus, la bactérie va émettre sa virulence, en liaison avec ce type de mécanisme.

La molécule diffusible est un dérivé des acides gras (page 8).

AHL = acyl homosérine lactones

Les molécules sont reconnues par un régulateur, qui va permettre la régulation d’un certain nombre de gènes. La réponse déclenchée par ce couple, ne l’est qu’à partir d’un certain seuil, d’un niveau de concentration.

Pseudomonas est à l’origine d’un certain nombre de maladies nosocomiales, cette virulence, émission de toxines, est due aux messages émis par la bactérie.

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Le complexe LasR constitue un activateur transcriptionnel d’un facteur de virulence.

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La réponse stringenteDéfinition :

« Mécanisme de survie » mis en œuvre quand les bactéries se retrouvent dans des conditions de croissance moins favorables ; p.e. conditions dans lesquelles l’apport d’acides aminés est insuffisant pour assurer une synthèse protéique normale.

Court-circuitage de nombreuses voies métaboliques : la bactérie économise ses ressources en s’engageant dans un minimum d’activités (jusqu’à ce que l’apport nutritif augmente).

Effets :

- Réduction massive de la synthèse d’ARNr- Synthèse des ARNm diminuée- Augmentation de la dégradation des protéines- Nombreux ajustements métaboliques

Qu’est-ce qui déclenche la réponse stringente ?

- L’absence de n’importe quel acide aminé- Une mutation qui inactive n’omporte quel aminoacyl-ARNt synthétase

Plus précisément : la présence d’un ARNt non chargé dans le site A du ribosome.

- Conditions normale : seuls les aminoacyl-ARNt peuvent ête placés dans le site A du ribosome- Quand il n’y a pas d’aminoacyl-ARNt disponible : l’ARNt correspondant non chargé peut

pénétrer.

Conséquence : blocage de la progression du ribosome ce qui déclenche une réaction stérile.

Accumulation de 2 nucléotides inhabituels :

1- ppGpp : guanosine tétraphosphate : nucléoside possédant un groupement diphosphate à chacune de ses extrémités

2- pppGpp : guanosine pentaphosphate : nucléoside possédans un groupement triphosphate en 5’ et un groupement diphosphate en 3’

ppGpp et pppGpp : petites molécules effectrices qui se fixent aux protéines cibles pour modifier leurs activités.

Quelles sont les voies de biosynthèse de (p)ppGpp ?

Identification des composants impliqués dans la production de (p)ppGpp : par l’utilisation de mutants (relâchés).

Mise en évidence d’une protéine appelée facteur stringent (facteur associé à certains ribosomes).

Facteur stringent

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Manque une partie

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Le système SOSUn exemple de répression transcriptionnelle aux conséquences multiples.

Ou comment les cellules survivent aux lésions SOS.

Les dimères de thymine :

- lésions provoquées par les UV- réaction entre bases pyrimidiques adjacentes sur un même brin d’ADN- structure rigide déformant la double hélice, pouvant bloquer la réplication

Le système SOSo sollicité en réponse à un «appel à l'aide» de la cellule devant les dommages

causés à son ADN.- met en jeu des mécanismes de réparation de l'ADN : principale cause des mutations

induites par les mutagènes qui produisent des lésions non codantes (rayons UV, aflatoxine B1, benzo-pyrèneet la plupart des carcinogènes).

- effectue des réparations imparfaites des lésions provoquées par ces agents physiques et techniques.

- apparaît comme un dernier recours par lequel la cellule négociesa survie au prix d'un certain niveau de mutagénèse.

- implique un ensemble de gènes qui sont activés par des lésions au niveau de l’ADN.

Répression de l'expression des gènes SOS par LexA

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Le déclenchement du système SOS :Quand erreurs graves entraînant l’arrêt de la synthèse de l'ADN : induction de l'expression d'un groupe de gènes importants appelés gènes SOS. Quand arrêt de la réplication : apparition d'ADN monocaténaire, reconnu par l'enzyme de réparation RecA.RecA agit :

- en assurant des recombinaisons- en détruisant, par son activité protéolytique, la protéine LexA, le répresseur des gènes

SOS.

La vingtaine de gènes qui gouvernent les fonctions SOS sont tousréprimés par la même protéine, LexA.

Qu’est ce qui lève la répression?

Protéolyse de LexA :

protéine RecA

- est toujours présente en petite quantité,- est attirée par l'ADN simple brin formé par la discontinuité dela double hélice.- forme un filament hélicoïdal autour du brin d'ADN.

répresseur LexA

- s'attache au complexe ADN simple brin-RecA- est clivé par une activité protéase (ainsi activée)- est ainsi inactivé =signal SOS.

Conséquence : EXPRESSION de la vingtaine de gènes SOS, impliqués dans les divers processus de réparation

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On observe :

1-l'activation du gène uvrA, dont le produit est impliqué dans la réparation par excision,

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2-la synthèse de la protéine RecAqui induit sa propre activation,

3-la synthèse des protéines mutagènes UmuDet UmuC, qui jouent un rôle important dans la mutagenèse SOS.

Mutagenèse SOSAvec le déclenchement du système SOS, la réplication de l'ADN porteur de lésion, qui présente une discontinuité dans sa double hélice, reprend. Dans ces conditions "d'urgence", le complexe de réplication ignore la lésion qui se trouve sur le brin parental et synthétise unbrin fils en face de la lésion.

Réplication fautiveinduite par le complexe umuD'2C

La réparation par le système SOS introduit donc des erreurs

En résumé

La réplication fidèle est temporairement suspendue au profit de la viabilité, même si c'est au prix d'une altération de l'information génétique. Elle est remplacée par une réplication que l'on peut qualifier de fautive

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Contrôle de la traductionStratégies de régulation de l’initiation de la traduction

2 types de régulation peuvent s’exercer :

1-régulation globale : altération générale du taux de synthèse encours

2-régulation spécifique d’un transcrit : intervient un mécanisme particulier

Formation du complexe ternaire :

L’initiation de la traduction requiert l’association réversible de la sous-unité ribosomale 30S, du ARNtfMet et de l’ARNm, formant le complexe ternaire de préinitiation où l’ARNt est associé de manière lâche au complexe.

Un complexe stable, actif se forme ensuite par une lente isomérisation irréversible permettant à l’ARNt d’interagir avec le codon d’initiation sur l’ARNm.

Exemples de mode de contrôle traductionnel de l’expression des gènes :

1- la fonction de répresseur est assurée par une protéine qui se fixe à une région cible de l’ARNm pour empêcher les ribosomes de reconnaître la région d’initiation

2- la traduction d’un cistron nécessite des changements de structure secondaire qui dépendent de la traduction d’un cistron précédent

L’ARNm ne peut être efficacement traduit lorsque le site de fixation du ribosome se trouve séquestré. Il s’est produit sur l’ARN m un changement conformationel à l’endroit où vient se fixer le ribosome, ce qui activera ou réprimera.

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Différents mécanismes de régulation de la traduction : Activation (+) Répression (-)

(a) Activation de la traduction impliquant un changement de conformation de l’ARNm, changement induit par la fixation soit d’un ARN régulateur, soit d’une protéine, soit parla température (RBS : en bleu).

(b) Inhibition de la traduction par des facteurs agissant en trans; ARN régulateur ou protéine. La répression peut également être obtenue par un changement de conformation de l’ARNm induit par la température ou par divers métabolites.

A. La répression de la traduction peut être le résultat de l’interaction d’une séquence d’ARNm (agissant en cis) avec le RBS (Ribosome Binding Site) de l’ARNm formant un complexe inactif. Quand il y a compétition, la structure inactive de l’ARNm qui se forme ne peut se fixer à la sous-unité 30S du ribosome. Quand il y a séquestration, l’ARNm empêche la sous-unité 30S fixée de s’isomériser pour former un complexe actif.

Schéma général de l’initiation de la traduction et de sa répression

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B. Un répresseur (agissant en trans) se fixe à l’ARNm ce qui réduit l’efficacité de la traduction. Dans un mécanisme de compétition, le répresseur empêche la sous-unité 30S du ribosome de se fixer à l’ARNm. Dans un mécanisme de séquestration, le répresseur empêche les changements structuraux requis pour qu’il y ait interactions entre tRNAfMet et l’ARNm.

Mécanisme de régulation de l’expression de la thréonyl-ARNt synthétase (ThrRS) :

ThrRS d’Escherichiacoli :

- Enzyme catalysant la «charge» de la thréonine à l’ARNt qui lui correspond;- Enzyme homodimérique, chacune des sous-unités étant formée de 3 domaines différents;- Régule négativement l’expression de son propre gène (thrS) au niveau traductionnel;- Se fixe à un site, l’opérateur, situé dans la région de tête (leader) de son propre ARN.

Conséquence : inhibition de l’initiation de la traduction du fait de la compétition pour la fixation de la sous-unité ribosomale 30S.

Opérateur : constitué de 4 domaines structuraux :

Domaine 1 : sous la forme d’un simple brin, porte la séquence de Shine-Dalgarno & le codon d’initiation

Domaine 3 : en simple brin, fait le lien entre deux structures en tige-boucle (les domaines 2 & 4) ; présente une analogie de séquence avec la boucle de l’anticodon du Thr-ARNt.

ThrRS : régulation

2 situations :

Lors de la réaction d’aminoacylation, ThrRS se fixe à 2 ARNt, chacun interagissant avec l’une des sous-unités de l’enzyme.

La boucle de l’anticodon du tRNAThr est reconnue par le domaine C-ter. de la protéine enzymatique et le bras accepteur est séquestré entre le domaine catalytique et le N-ter.

Lorsqu’il y a régulation, la protéine ThrRS se fixe à l’opérateur de telle façon que les domaines 2 & 4 occupent une position équivalente à celle du bras de l’anticodon du tRNAThr, avec les boucles apicales interagissant avec le domaine C-ter. de la ThrRS.

Exemple d’un répression de la traduction par compétition : régulation de l’expression de la thréonyl-ARNtsynthétase

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Protéine enzymatique

ARNm leader 1 2 3 4

La synthèse de l’enzyme, thréonyl-ARNt synthétase, est autorégulée par compétition entre l’ARNtThr

et l’ARNm thrS pour leur fixation à la protéine enzymatique. Deux domaines structuraux (n°2 & n°4) de l’ARNm miment le bras accepteur de l’ARNtThr ce qui permet à la protéine enzymatique, la thréonyl-ARNt synthétase de se fixer spécifiquement à sa propre séquence d’ARNm leader ; la formation de ce complexe binaire, thréonyl-ARNt synthétase-ARNm entraîne la dégradation rapide du messager.

Base moléculaire de la reconnaissance de la ThrRS: par des interactions bases spécifiques entre le domaine C-ter de la protéine et la boucle anticodon de l’ARNt ou la boucledu domaine opérateur.

Mécanisme exercé par la ThrRSpour inhiber la fixation du ribosome à l’ARNm

La protéine ThrRSet le ribosome entrent en compétitionpour la fixation à l’ARNm thrS.

Le ribosome interagit à la fois avec le domaine 1 et l’extrémité3’ du domaine 3, tandis que la protéine ThrRSse fixe aux domaines 2 & 4.

Par conséquent la synthetaseet le ribosome se fixent en des domaines différents mais mélangés au niveau de l’opérateur.

2 modèlespermettent d’expliquer l’inhibition de la fixation du ribosome par la ThrRS.

1-un domaine de la protéine ThrRSséquestre et/ou change la conformation des domaines 1 & 3; où le ribosome se fixe pour initier la traduction;

2-un domaine de la synthétase d’un point de vue stérique gêne la fixation du ribosome.

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La régulation de l’expression de thrSimplique deux mécanismes de compétition.

(a) Aminoacylation ou répression. Il y a compétition entre l’ARNt-Thr et l’opérateur pour la fixation de ThrRS. Lorsque la cellule est en division active, la concentration cellulaire en Thr-ARNt augmente, la ThrRS fonctionne principalement en tant qu’enzyme; quand la concentration en Thr-ARNt diminue, la protéine ThrRS se fixe à son ARNm, ce qui provoque la répression de la traduction du messager et la dégradation de celui-ci.

(b) Traduction ou répression. Il y a compétition entre le ribosome et ThrRS pour la fixation de l’ARNm. Lorsque la cellule est en division active, la concentration cellulaire en 30S augmente et l’ARNm thrRS est traduit efficacement; à l’inverse lorsque la concentration en 30S diminue, l’ARNm est peu traduit et dégradé.

II. Régulation de l’expression de l’opéron d’E. coliαRépression de la traduction par occlusion (capture du ribosome) implication d’un «switch» conformationel de l’ARNm2

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Cette structuration particulière en pseudo-nœud mime la structure de l’ARNr 16S. Il existe probablement une homologie entre le pseudo-nœud et le répresseur S4. Le pseudo-nœud existe sous 2 formes distinctes : 2 formes différentes de l’ARNm sont impliquées dans la régulation de la traduction. L’une, active, participe rapidement au processus normal d’initiation de la traduction. L’autre, inactive, est reconnu spécifiquement par le répresseur S4 et la sous-unité 30S ce qui forme un complexe ternaire d’occlusion. Une seule est donc reconnue par le répresseur S4.

Parmi les produits de la protéine α il y a les S4. C’est une forme d’équilibre, qui est déplacé suivant les besoins de la cellule.

III. Synthèse des protéines ribosomiquesSynthèse des protéines ribosomiques: un Défi !!!

- 52 protéines différentes (chacune étant codée par un seul gène appartenant à l’un des 20 opérons distincts)

- Synthèse en quantité stœchiométrique, correspondant à la composition du ribosome (c’est-à-dire une copie de chaque protéine par ribosome)

- Vitesse de synthèse variant d’un facteur 500 en fonction du taux de croissance- Coordination entre la vitesse de synthèse des protéines ribosomiques et celle de la synthèse

des ARNr

Élucidation du mode de régulation de la synthèse des protéines ribosomiques: travaux de Nomura et coll.

C’est un rétrocontrôle négatif.

A. Modalités du rétrocontrôle négatifAccumulation de la protéine inhibe sa propre synthèse (et celle d’autres produits). Effet s’exerçant au niveau de la traduction de l’ARNm polycistronique.

Le régulateur :

- Une protéine ribosomale qui se fixe directement à l’ARNr

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- Reconnaît un site : séquence chevauchant le motif nucléotidique où la traduction est initiée, ce qui influence l’accessibilité du site d’initiation

- Bloque l’accès du ribosome ou empêche une étape ultérieure de la traduction- Stabilise une structure secondaire particulière de l’ARNm

2 situations :

- Tant qu’il y a des ARNr libres, les protéines ribosomales néosynthétisées s’associent à ces ARNr pour démarrer la construction d’un ribosome ; Il n’y a pas de protéines ribosomales disponibles pour se fixer à l’ARNm ; sa traduction va donc continuer.

- Dès que la synthèse d’ARNr ralentit ou s’arrête, les protéines ribosomiques libres commencent à s’accumuler ; Elles sont alors disponibles pour se fixer à leurs ARNm, réprimant ainsi la poursuite de leur traduction.

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Ici, sur α, c’est S4 qui effectue son contrôle.

En résumé : L’extrémité 5’ des ARNm (région leader) transcrite pour chaque opéron, contient une séquence qui sert de site de liaison à l’une des protéines codées par l’opéron.

Quand la protéine est synthétisée, elle peut :

1- Soit se fixer sur sa position sur l’ARNr,2- Soit se lier à ce site dans la région leader de l’ARNm.

La liaison à l’ARNr est favorisée s’il existe des ARNr libres dans la cellule.

Quand tous les ARNr ont été assemblés en ribosomes, la protéine ribosomique se lie à son ARNm bloquant la synthèse des protéines ribosomiques codées par cet ARN particulier.

La traduction des autres ARNm est régulée par des mécanismes similaires assurant une bonne coordination de la biosynthèse des protéines ribosomiques en fonction de la quantité d’ARNr libre dans la cellule.

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IV. L’atténuation traductionnelle

1. Cas de la résistance au chloramphénicol chez les bactéries

Cet antibiotique bloque l’activité peptidyl-transférase du ribosome.

Régulation par atténuation traductionnelle : exemple de la résistance au chloramphénicol chez les bactéries

2 gènes dont l’expression confère la résistance au chloramphénicol sont régulés selon le même principe :

1- Gène cat: spécifie la chloramphénicol acétyltransférase chez les bactéries à G(+)2- Gène cmlA: spécifie une protéine membranaire chez les bactéries à G(-)

Principe de la régulation par atténuation traductionnelle

- Le site de fixation du ribosome (RBS) du gène soumis à régulation est séquestré au sein d’une structure secondaire de l’ARNm (de type tige-boucle)

- En amont de cette structure, se trouve un court ORF traduit en un peptide nommé leader- Le ribosome se «cale» au niveau de la séquence leader, ce qui provoque la déstabilisation de

la structure secondaire en aval, «dévoilant» le RBS, permettant ainsi l’initiation de la traduction des gènes cat ou cmlA

Domaines régulateurs situés en 5’ des transcrits de (a) catA86 et de (b) cmlA.

P & A se réfèrent aux codons occupés par les sites peptidyl & aminoacyl du ribosome La région crb correspond aux codons du leader essentiels pour l’induction.

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La séquence codante de cat et la région régulatrice en amont sont co-transcrites en une molécule d’ARN unique.

En l’absence de chloramphénicol, le transcrit entier n’est pas efficacement traduit parce que le RBS-C est séquestré dans une structure en tige-boucle.

Après addition de chloramphénicol, l’antibiotique provoque la pause du ribosome en train de traduire la séquence leader (son site A se situant au niveau du codon 6).

La pause du ribosome masque des séquences ce qui déstabilise la structure en tige-boucle de l’ARNm, dégageant ainsi le RBS-C.

Le chloramphénicol antibiotique à large spectre inhibe l’activité peptidyl-transférase de la grande sous-unité du ribosome.

Model for alterations in the conformation of 23S rRNA domains IV and V upon translation of the first five codons of thecatA86 leader. Concomitant with translation of the first five codons, theproduct5-mer peptide MVKTD binds to domains IV and V of the rRNA, altering its conformation and blocking PT. Peptide binding to the rRNA is reversible and dissociation restores PT activity. Resulting translation drives the inhibitor peptide away from its rRNA target (Harrodand Lovett, 1995).

Résultat d’une levée d’inhibition de fait de cette pause causée par la synthèse d’un petit peptide.

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2. Un autre exemple de régulation par atténuation traductionnelle (en plus d’une régulation par atténuation transcriptionnelle)

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Les riborégulateursCe sont de petites molécules qui vont moduler la transcription et la traduction. Ces petits ARN sont soir issus d’éléments génétiques parasites, codés par des plasmides, transposons, bactériophages, ou alors ils sont d’origine chromosomique, codée par le génome de la bactérie considérée.

2 grandes classes de riborégulateurs :

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1. Contrôle de l’activité d’une protéine par un riborégulateur- répression d’une protéine de liaison à l’ADN ou à l’ARN par un riborégulateur. La

transcription ou la traduction d’un gène cible est inhibée par la fixation de l’ARN régulateur à la protéine régulatrice

- répression d’une enzyme par un riborégulateur

2. contrôles de l’expression génique au niveau post-transcriptionnelpar des ARN antisens

- Inhibition de la traduction d’un ARNm. Le duplex ARN antisens-ARNm empêche la fixation du ribosome et donc la traduction

- activation traductionnelle. Le RBS séquestré dans une structure en tige-boucle est rendu accessible par la fixation d’un ARN antisens ce qui permet la fixation du ribosome

- dégradation favorisée par un ARN antisens. La fixation de l’antisens à l’ARNm crée un site de clivage par une Rnase spécifique des régions bicaténaires

I. Un exemple de REGULATION de la TRADUCTION par une petite molécule d’ARN :Contrôle de la traduction du gène ompF d’E. coli : phénomène d’osmorégulation et expression des porines

Quand bactéries confrontées à un changement de l’osmolarité du milieu :

- ajustement des propriétés de perméabilité de la membrane externe

Organisation de la membrane externe d’E. coli

- traversée de canaux formés de protéines appelées porines- 2 porines majeures chez E. coli: OmpF & OmpC, synthétisées de manière alternative selon les

conditions du milieu- Porines dont l’expression est contrôlée par deux protéines régulatrices EnvZ& OmpR

EnvZ:

- protéine de la membrane cytoplasmique, fonctionnant comme un osmocapteur- interagit avec OmpR- modifie l’activité de OmpR en la phosphorylant

OmpR:

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- Se fixe spécifiquement à l’ADN en amont des promoteurs qu’elle contrôle- Réprime la transcription de ompF- Active la transcription de ompC

Lorsque la pression osmotique est élevée :

- phosphorylation de EnvZ- phosphorylation de OmpR- répression de ompF- activation de ompC

Lorsque la pression osmotique est basse :

- pas de phosphorylation de EnvZ- pas de phosphorylation de OmpR- répression de ompC- activation de ompF

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Lorsque la concentration en OmpR phosphorylés est basse, cette molécule devient activateur transcriptionnel de OmpF, et inhibe OmpC, mais quand la situation chute, c’est l’inverse.

En plus de la régulation exercée par OmpR-(P) (inhibant ou stimulant la transcription de 2 gènes),il intervient un autre élément régulateur, le produit du gène micF.

MicF

- ARN de 174 nucléotides- complémentaire du début de l’ARNm de ompF- inhibe la traduction de l’ARNm OmpF- favorise sa dégradation- nécessaire mais pas suffisant

Facteur protéique fixe MicFet intervient dans le contrôle de l’expression d’ompF (mécanisme inconnu).

Le complexe MicF-OmpF séquestre la séquence de Shine-Dalgarno et le codon initiateur de l’ARNm, réprimant ainsi la traduction d’OmpF.

OmpR et MicF concourent toutes les 2 à réprimer OmpF.

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Implication d’ARN régulateurs dans le contrôle de l’expression du facteur de transcription alternatif σS

Le facteur de transcription alternatif σS

o induit l’expression de plus d’une cinquantaine de gènes lors del’entrée des cellules en phase stationnaire de croissance.

Séquences et structures de la région 5’-UTR d’OmpF, de l’ARN antisens MicFet du complexe

ARN-ARN formé. Les régions complémentaires entre les deux ARN sont dessinées en rouge. La séquence Shineet Dalgarnoest hachurée dans la région 5’-UTR de l’ARN OmpF. Le codon AUG initiateur de la traduction est indiqué par une boîte noire. Dans le complexe formé, ces mêmes séquences sont représentées en caractères blancs sur fond noir et encadrées, respectivement.

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o codé par le gène rpoS,o impliqué également dans la réponse des cellules au stress oxydatif, aux basses

températures, à une déplétion du milieu en nutriments et à un choc acideo intervient au centre de cascades d’intégration de signaux extracellulaires

- en réponse à ces stimuli, l’expression de rpoS est modulée au niveau transcriptionnel par différents signaux (dont le ppGpp, l’homosérine lactone, l’AMPc et l’UDP-glucose)

- des régulateurs ont également été caractérisés comme modulant l’expression de rpoS au niveau traductionnel ou au niveau de la stabilité de la protéine.

Différentes voix de régulation du gène rpoS.

La région 5’ non traduite du gène rpoS est représentée. Les différents contrôles sont indiqués par des flèches pour les régulations positives et par des lignes terminées par une barre pour les régulations négatives. Les flèches en pointillés indiquent les gènes qui répondent à des signaux environnementaux. Les niveaux de l’expression de rpoS auxquels les différents contrôles se font sont indiqués. Les autres cibles potentielles ou caractérisées de DsrA et OxyS sont indiquées. Les facteurs globaux de régulation sont indiqués en vert. Les riborégulateurs sont indiqués en rouge.

II. Les riborégulateurs modulant l’activité de facteurs protéiquesExemple du contrôle de la biosynthèse du glycogène chez E. coli

Réajustement du statut physiologique des bactéries lors de la transition entre la phase exponentielle de croissance et la phase stationnaire

Activation de la cascade de réactions régulant la biosynthèse du glycogène

Inactivation du gène csrA : augmentation (x20) du niveau de glycogène intracellulaire du fait de la dé-répression de plusieurs gènes impliqués dans la biosynthèse du glycogène

1. gène csrACode pour une protéine de 61 acides aminés contenant un motif de liaison à l’ARN :

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- Dans une souche csrA+, les transcrits des gènes cibles impliqués dans la biosynthèse du glycogène ont une demi-vie de l’ordre d’une minute

- Dans une souche csrA-, ces mêmes transcrits sont significativement stabilisés

2. Protéine CsrA- régule l’expression des gènes cibles au niveau post-transcriptionnel- essentielle pour promouvoir une dégradation rapide des ARN messagers correspondants.

Purification d’un complexe constitué d’une molécule d’ARN de 360 nucléotides et de 18 molécules CsrA.

Modèle de repliement secondaire de l’ARN csrB d’E. coli.

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Les 18 séquences répétées sont numérotées sur la structure. Les séquences présentes dans des boucles sont indiquées en rouge tandis que les séquences présentes dans des régions non structurées ou appariées sont indiquées. Un alignement des 18 séquences est représenté.

Ces séquences miment partiellement la séquence de Shine Dalgarno.

PRINCIPE de la REGULATION EXERCEE

Caractéristiques de l’ARN CsrB d’E. coli :

- présence de 18 séquences imparfaitement répétées de type 5’-CAGGA (U,C,A)G-3’. (constituent le site de fixation de CsrA sur l’ARN)

- miment partiellement la séquence de Shine-Dalgarno, postulée comme étant le site de fixation de CsrA sur ses ARNm cibles.

1- fixation de la protéine CsrAsur l’ARN cible2- séquestration de la protéine CsrApar l’ARN csrB, ce qui réprime ses fonctions régulatrices

INACTIVATION de CsrA

L’ARN csrB agit comme inhibiteur compétitif de la fixation de CsrA sur ses substrats naturels.

Quand la protéine CsrA est présente : régulation négative de nombreux gènes impliqués dans la biosynthèse du glycogène

Quand la protéine CsrA est absente : situation inversée

III. Mécanisme de contrôle de la ségrégation plasmidique par un ARN antisensExemple du système Hok-Sok du plasmide R1

Principe :

2 acteurs clés :

- protéine Hok = toxine (porine déstabilisant la membrane cellulaire)- ARN antisens Sok = antidote

Fonctionnement :

2 situations :

1- Le plasmide est présent dans la cellule :a. Traduction du messager Hok est bloquée. Il se replie de manière à ne pas permettre

l’accès des ribosomes. Sa traduction est couplée à celle de mok, or l’ARN antisens Sok bloque la séquence mok

b. Le complexe Sok-hok est finalement rapidement clivé (par la RNase III)2- Le plasmide est absent de la cellule

a. Complexe messager et régulateur traduction cellule meurt

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Pourquoi la cellule utilise-t-elle des riborégulateurs?

1- économie d’énergie et de temps de synthèse des riborégulateurs2- dégradation du régulateur3- versatilité des structures du régulateur4- rapidité d’action

Applications :

1- développement de riborégulateurs artificiels2- ARN interférents

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Contrôle de la durée de vie des ARNm – Dégradation par des ARNases

ARNm

Durée de vie variable (de quelques secondes à20 min env.)

Stabilité: point de contrôle de l’expression des gènes

ARN messagers: grande instabilité

Durée de vie d'un ARNm donné : fortement modulée en réponse à des changements de l'environnement cellulaire

Séquence et structuration de l’ARNm déterminent sa stabilité.

Les ribonucléasesidentifiées chez E. coli

- 20 identifiées- 5 impliquées dans la dégradation des ARNm

2 exonucléases3’-5’:

- RnaseII- polynucléotidephosphorylase (PNPase)

3 endonucléases:

- RnaseIII- RnaseE- RnaseP

RnaseII : dégradation de l’extrémité 3’ des ARNm et ARNt (hydrolyse)PNPase : dégradation de l’extrémité 3’ des ARNm et ARNt (phosphorolyse)RnaseIII : maturation & dégradation des ARNm et ARNrRnaseE : dégradation des ARNm, maturation de l’ARN 9SRnaseP : maturation de l’extrémité 5’ des ARNt, maturation des ARNm

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Modèle de dégradation des ARNm chez E. coli

La RNaseE initie la dégradation en se fixant à l’extrémité 5′ du transcrit. Parfois, elle attaque l’ARN à partir d’une position internePar la suite les RNaseE et/ou RNaseG poursuivent la dégradation en se déplaçant dans le sens 5′ → 3′. Les produits obtenus sont ensuite dégradés dans le sens 3 ′ → 5′ soit par une polynucleotidephosphorylase, RNaseII ou RNaseR. Pour les ARNm avec des structures secondaires à leurs extrémités3’, une poly(A) polymérase ajoute des A afin d’augmenter la fixation des exonucléases3′ → 5′.

De quelle manière la séquence et la structure de l’ARNm jouent sur la stabilité du messager?

- Ce sont les éléments de séquence situés en 5’-et 3’-de l’ARNm (séquences non traduites) qui influencent la stabilité du messager.

- La présence de sites reconnus par les ribonucléases module également la durée de vie du messager.

Facteurs modulant les interactions ARNm –ARNases

TraductionProtéines se fixant à l’ARNARN antisens

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Un exemple : la dégradation de l’ARNm rpsO

rpsO

- code la protéine ribosomale S15- peut être transcrit sous la forme d’un ARN monocistronique ou dicistronique (avec le gène

pnp, en aval)- maturation des transcrits rpsO-pnp par action, dans la région intercistronique, de la RNAse III

et RNAse E.- séparation des messagers et traduction indépendante

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Autre mode de régulation de la traductionLe recodage traductionnelExemple du décalage du cadre de lecture (ou «frameshifting»)

Le décalage du cadre de lecture : changement de phase de lecture du ribosome d’un nucléotide en 3’

Exemple du décalage en +1 chez E. coli; cas du gène prfB

Protéine RF2:

- facteur de terminaison de la traduction spécifique des codons UGA et UAA- ORF interrompu au 26èmecodon par un UGA

ARNm5’GGG UAU CUU UGAC UAC GAC GCC 3’ 23 24 25 26 27

La lecture de la suite du message nécessite un décalage de phase en +1.

Régulation de la synthèse de la protéine RF2(boucle d’auto-régulation)

- Quand la concentration en RF2 est élevée, le codon UGA est reconnu efficacement: il y a donc DIFFICULTE à avoir un décalage en +1 de l’ARNt; la synthèse de RF2 est par conséquent moindre.

- Inversement, quand la concentration en RF2 est faible, le codon UGA est peu reconnu (l’absence de RF2 «affame» l’UGA) ce qui permet à l’ARNtLeu de passer d’un codon à l‘autre (décalage +1): il y a donc synthèse accrue de RF2.

Le ribosome fait une pause au niveau du codon STOP en condition limitante en RF2. La séquence AGGGGG est située à une distance plus petite du codon STOP que ne l’est la séquence SD du codon AUG. Il n’y a donc pas interaction optimale avec l’ARNr 16S; cela force le ribosome à se recaler sur cette séquence et le fait donc glisser d’un nucléotide.

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ConclusionsUne cellule comme E. coli représente 3 à 4000 gènes. Elle peut donc potentiellement produire 3 à 4000 bactéries. Une cellule normale de ce type n’utilise pas plus de la moitié de ce répertoire. Les reste est en attente d’être utilisé si nécessaire. La bactérie s’adapte en faisant appel à différents jeux de gènes. L’adaptabilité des bactéries repose sur l’usage sélectif de ces gènes.

Réseaux de régulation multigéniques

Modèle de l’opéron lac: établi en 1961, mode de régulation décortiqué au niveau moléculaire

Résolution du mode de régulation d’autres opérons : diversité des mécanismes

De nombreuses activités bactériennes nécessitent une coordination des gènes à un niveau d’organisation supérieur à celui de l’unité de transcription : réseaux de régulation

Le mode d’organisation - l’opéron - offre une solution simple au problème de la co-régulation de gènes ayant des fonctions apparentées.

Pourquoi est-il nécessaire pour la cellule de disposer de systèmes de régulation de réseaux d’opérons ?

1- Certains processus bactériens impliquent un trop grand nombre de gènes pour qu’ils puissent être rassemblés en un opéron viable (cas de la machinerie de traduction mettant en jeu les produits d’au moins 150 gènes)

2- certains processus bactériens mettent en œuvre des gènes qui doivent être à la fois régulés indépendamment et soumis à un contrôle principal de coordination (cas de l’ensemble des gènes codant des enzymes du catabolisme)

Chez E. coli

Estimation : plusieurs centaines de systèmes multigéniques

Tentative de classement en réseaux :

1- ceux participant à la réponse à la carence en l’un des nutriments –sources de carbone & d’énergie, ammoniac, phosphate inorganique ;

2- ceux impliqués dans des réactions d’oxydo-réductionet de transport d’électrons ;3- ceux concernés par la réponse aux dommages créés par l’oxydation, les radiations, les basses

& hautes températures, les pressions osmotiques extrêmes ;4- tous les autres…

Quels sont les liens établis entre les opérons indépendants formant des réseaux ?

1- par un mécanisme commun faisant appel à une protéine régulatrice allostérique : une protéine, répresseur ou activateur, reconnaît une séquence particulière commune aux régions de contrôle des opérons membres du réseau;

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2- sur la base d’un facteur σalternatif qui «reprogramme» l’ARN polymérase afin qu’elle reconnaisse les promoteurs des opérons des membres du réseau;

3- sur la combinaison de protéines régulatrices et de facteurs σ4- par des mécanismes à part…

Réseaux de régulation

Identifiés, à l’origine, comme apportant une réponse cellulaire à des changements du milieu : gènes organisés comme un système stimulus-réponse

Un stimulus, en provenance du milieu, agit sur une cible cellulaire, un capteur («sensor» en anglais) qui à son tour engendre un signal.

Ce système affecte directement ou indirectement (lorsque le signal chemine à travers un ou plusieurs transducteurs) l’activité ou la synthèse d’un régulateur qui contrôle la réponse finale, généralement une adaptation au changement du milieu.

Ce genre de système inclut souvent un mécanisme de rétrocontrôle qui permet un retour aux conditions qui précédaient le stimulus, ou un nouvel équilibre en accord avec le nouvel environnement.

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