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Cours Module L5-BH-05 Régulation de l’expression des génomes Cours n°3 & 4 S. Bourgerie Université d’Orléans – UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301 1

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Cours Module L5-BH-05

Régulation de l’expression des génomes

Cours n°3 & 4

S. Bourgerie Université d’Orléans – UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301

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Plan des cours n°3 & 4Opéron arabinose

1- introduction – comparaison2- organisation3- régulateur AraC : fonctions4- répression catabolique5- fonctionnement : + - inducteur

Rappels sur terminaison de la transcription1- terminaison rho-indépendante2- terminaison rho-dépendante : structure-fonction de rho

Stratégies de modulation de la terminaison1- définition : antiterminaison-atténuation2- quelques exemples

Opéron tryptophane1- organisation2- régulation

mécanisme 1 : interaction répresseur-opérateurmécanisme 2 : atténuation transcriptionnelle

Antiterminaison généraleexemple 1 : opérons des ARN ribosomiquesexemple 2 : gènes codant les aminoacylARNt synthétases

Facteurs σ alternatifssporulation chez B. subtilisSPO1régulon σ32 : réponse au choc thermiqueσ54 : régulation du métabolisme azoté* 2

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The genes required for the uptake and catabolism of L-arabinose in Escherichia coli, the operon structures, their approximate locations on the 100-minute circulargenetic map, and the initial steps of arabinose catabolism showing the structures of the intermediatesand the steps catalyzed by the products of the araoperon geneproducts. AraC acts positively and negatively at pBAD, and negatively at pC.

*

opéron arabinose

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Le régulateur AraC opéron arabinose

• Structure– homodimère– avec un domaine de fixation à l’ADN (côté C-ter.)– avec un site de fixation pour l’arabinose (activateur) (côté N-ter.)

• Fonction- régulateur négatif

• se fixe à araO2 & araI1- régulateur positif

• se fixe à la fois aux demi-sites araO1 & araI1 & I2

- régule sa propre synthèse (autorégulation)• se fixe à araO1

- provoque la formation de boucles dans l’ADN

* 4

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opéron arabinose

CRP

P t

Pt

araC araB araA araD

O2

I1 I2

O1

1. Absence de L-arabinose

AraC dimère flexible

O2

I1 I2

O1

répriméactivé

P araBADP araC

AraC se fixe à O2 & I1 réprimant P araBAD5

O2

I1 I2

O1

répriméréprimé

P araBADP araC

AraC en excès se fixe à O1 ce qui régulele taux cellulaire en la protéine AraC

*

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opéron arabinose

P t

Pt

araC araB araA araD

O2

I1 I2

O1 CRP

I1 I2

induit(activé)

P t O2 O1

P araBAD

2. + Inducteur L-arabinose+ CRP-AMPc

AraC se fixe à I2 & I1 activant P araBAD

* 6

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1. L’arabinose est un régulateur positif de la transcription.

2. En l’absence d’arabinose, AraC se fixe aux sites régulateurs I1 & O2 ce qui réprime la transcription de l’opéron AraBAD.

3. Le taux d’AraC est autorégulé, lorsqu’un excès d’AraC se fixe en O1

4. Quand l’arabinose est abondant, il se fixe à AraC, AraC se fixe à I1 & I2. : la transcription estACTIVEE

5. Quand le Glucose est absent, le taux d’AMPc s’élève et le complexe cAMP-CRP se fixe sur uneséquence adjacente à I1.

Il y a expression de l’opéron AraBAD.

En résumé opéron arabinose

* 7

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Rho dés-engage la chaîne d’ARN naissantedu complexe de transcription

*

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Modulation de la terminaison de la transcription

L’ensemble des mécanismes par lesquels la terminaison de la transcription est abolieou fortement diminuée est appelé antiterminaison

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Deux types de stratégies utilisées chez les bactéries pour obtenir l’antiterminaison :

1- effet sur l’ARN polymérase, la rendant « résistante » aux signaux de terminaison

ANTITERMINAISON GENERALE

Exemple : système d’antiterminaison par la protéine N du bactériophage λ

2- action localisée en masquant les signaux de terminaison eux-mêmes

ATTENUATION TRANSCRIPTIONNELLE

Mise en jeu d’interactions entre l’ARN polymérase et des effecteurs qui favorisent ou empêchent la formation des structures terminatrices.

*

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Organisation de l’opéron Trp d’E. coli

*L-tryptophan

opéron tryptophane

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Mécanisme n°1

Interaction répresseur – opérateur

Quand le tryptophane est présent, celui-ci se fixe au produit du gène trpRLa protéine TrpR se fixe à l’opérateur trp ce qui empêche la transcription de se faire.(la répression observée réduit le taux de transcription d’environ 70 fois)

opéron tryptophane

La séquence des bases de l’opérateur trpla séquence presque palindromique est encadrée et sa région -10 est surlignée

CGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGGCTTGATCAATTGATCATGCGTTC

-20 -10 +1

* 11

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opéron tryptophane

Un monomère comprend 107 acides aminés.Il est replié en 6 hélices α.Il forme un dimère stable en solution ;Les deux hélices reconnaissant l’ADN sont séparées de 3,4nm.

* 12

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opéron tryptophane

Mécanisme n°2

Terminaison de la transcription

La transcription est également contrôlée par atténuation, processus qui aboutit à la traductiond’un petit polypeptide.

Quand les cellules sont privées de tryptophane, les gènes de l’opéron sont exprimés au taux le plus fort;Quand la privation en tryptophane est moins sévère, les gènes de l’opéron s’expriment à un niveau plus faibleque le maximum.

L’atténuation régule le niveau de transcription par un facteur de 8 à 10 et combiné avec le mécanisme 1(interaction répresseur-opérateur) il y a diminution de la transcription d’un facteur 560 à 700.

* 13

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opéron tryptophane

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Organisation de la région leader/atténuateur de l’opéron trp

*

Structures ARN alternatives

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Modèle moléculaire de l’atténuation

La région leader (trpL) se situe entre l’opérateur et la séquence du locus trpE.Dans cette région leader se trouve la séquence att (= atténuateur).

Cette séquence att comprend un codon start, deux codons Trp et un codon stop, ainsi que 4 régions formées de séquence pouvant s’apparier selon 3 structures secondaires alternatives

S’il y a appariement des régions 1-2, le signal formé correspond à une PAUSE.S’il y a appariement des régions 2-3, le signal formé correspond à une ANTITERMINAISONS’il y a appariement des régions 3-4, le signal formé correspond à une TERMINAISON.

opéron tryptophane

Transcription et traduction sont étroitement couplées chez les procaryotes; ces deux processus se produisent simultanément.

L’appariement des régions 1 avec 2 de l’ARNm produit provoque la pause de l’ARN polymérase juste après queces régions aient été synthétisées.Cette pause est suffisamment longue pour que le ribosome se fixe à l’ARNm et démarre la traduction du messagerjuste derrière l’ARN polymérase.

* 15

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opéron tryptophane

Phénomène d’atténuation pour des cellules privées de trp

* 16

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opéron tryptophane

Phénomène d’atténuation pour des cellules non-privées de trp

* 17

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situation 1 :

le tryptophane est absent (ou en quantité insuffisante)1- les trp-ARNt sont indisponibles, le ribosome s’arrête aux codons trp ce qui couvre la région 1.2- la région 1 ne peut s’apparier avec la région 2, à la place la région 2 s’apparie à la région 3.3- la région 3 ne peut donc s’apparier à la région 4.4- l’ARN polymérase continue à transcrire l’ensemble de la séquence codantece qui permet la synthèse complète de l’ARNm.

situation 2 :

le tryptophane est abondant1- le ribosome ne s’arrête pas au niveau des codons trp; il continue à traduire la séquence leader, s’arrêtant au niveau de la région 22- la région 2 ne peut s’apparier avec la région 3; cette dernière s’apparie alors avec la région 4.3- cet appariement 3-4 constitue la séquence « atténuateur » et fonctionne comme signal determinaison4- la transcription s’achève avant que l’ARN polymérase atteigne les gènes permettant la synthèse du tryptophane

La position du ribosome joue un rôle important dans le phénomène d’atténuation

*

opéron tryptophane

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Cas de l’opéron trp de B. subtilis : régulation par l’intermédiaire d’une protéine se fixant à l’ARN (trpRNA-binding attenuation protein (TRAP) )

En présence de tryptophane : TRAP se fixe à l’ARNmce qui provoque la formation d’un signal de terminaison : ARRET de la transcription

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Regulation of the tryptophan operon of Bacillus subtilis. (A) Regulation centers on the protein called TRAP, whichattaches to the leader region of the transcript when tryptophan levels are adequate. When attached, TRAP prevents formation of the large hairpinloop and so allows formation of the termination signal. (B) Structure of the TRAP-RNA complex. TRAP comprises 11 identical subunits, eachone made up mainly of β-sheets, which associate together to form a circular structure with a diameter of 8 nm. The 11 TRAP subunits are shownin different colors, each one with an attached tryptophan molecule indicated by the red-green-blue spherical structures. The RNA molecule isshown as a ball-and-stick structure wound around the TRAP complex. (Antson et al., Nature, 401, 235–242)

*

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Carte génétique partielle du bactériophage λ, indiquant les effets transcriptionels des protéines N et Q.

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Antiterminaison : une alternative…

Utilisée comme un mécanisme de contrôle à la fois dans les systèmes de régulation des phageset des opérons bactériens.

L’antiterminaison comme élément de contrôle de la transcriptionTERMINAISON : seule la région 1 est transcrite

é é

arrêt de la transcription

+

ANTI-TERMINAISON : les régions 1 et 2 sont transcrites

Le facteur antiterminateur permet à l’ARN pol. de poursuivre sa lecture au-delà du site de terminaison

é é

* 21

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Antiterminaison des opérons rrn (ARNr) d’E. coli

Nécessite les produits des loci nus : 1- codent des protéines appartenant à l’appareil de transcription mais non associées à l’ARN

polymérase lors de son isolement2- correspondent à 4 protéines

- nusA, nusB & nusG intervenant dans la terminaison de la transcription- nusE, codant la protéine ribosomale S10.

Protéine NusA : facteur de transcription généraleaugmente l’efficacité de la terminaison en accentuant la tendance de l’ARN polymérase

à marquer des pauses sur les terminateurs

Protéines NusB & S10 forment un dimère qui se fixe spécifiquement à l’ARN contenant une séquence particulière, boxA.

Protéine NusGimpliquée dans la formation du complexe entre les facteurs Nus et l’ARN polymérase.

* 22

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Forme compétente pour la transcription & forme compétente pour la terminaison de l’ARN polymérase

L’ARN polymérase fonctionne selon un cycle : (il existe des formes alternatives de l’ARN pol.)1- forme enzymatique prête pour l’initiation : α2ββ’σ2- forme enzymatique prête pour la terminaison : α2ββ’NusA

La protéine NusA se fixe au noyau de la polymérase mais pas à l’holoenzyme; lorsqu’on ajoute un facteur s au complexe α2ββ’NusA, il déplace la protéine NusA, reconstituant ainsi l’holoenzyme α2ββ’σ.

forme enzymatique prête pour l’initiation : α2ββ’σ

forme enzymatique prête pour la terminaison : α2ββ’NusA

* 23

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Le noyau de l’ARN polymérase alterne entre l’association avec σ pour l’initiation et l’association avec les facteur Nus pour la terminaison

24

initiation

libération de σ

+

réunion NusA + noyau enz. σ et Nus : partenaires

du noyaude l’ARN pol. mutuellementincompatibles

terminaison

déplacement de NusA par σ

*

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antiterminaison transcriptionnelle (2)

Autre exemple de régulation par antiterminaison transcriptionnelle

gènes codant les aminoacyl-ARNt synthétases

Antiterminaison : formation potentielle d’un structure secondaire alternative au promoteur

Preuves expérimentales: 1- quand délétion de la structure terminatrice

en amont des gènes structuraux : expression élevée et constitutive2- dans des conditions non carence : mise en évidence uniquement de cours transcrits

générés par une terminaison transcriptionnelle au niveau de chacun des 3 terminateursdans des conditions de carence : efficacité de terminaison réduite; accumulation de

transcrits entiers

Donc il y a modulation du taux de terminaison au niveau de la structure terminatrice

* 25

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Caractéristiques communes aux gènes des amino-acyl ARNt synthétases chez B. subtilis antiterminaison transcriptionnelle (2)

Région 5’- non codante hautement structurée d’environ 300 nucléotides comprend :

- un terminateur de la transcription facteur indépendant, situé en amont du codon de démarrage

- une séquence de 14 à 18 nucléotides (appelée T-box)

- une séquence complémentaire à une partie de la T-box trouvée en aval dans la moitié 5’ de la tige du terminateur(cette complémentarité suggère la formation d’une structure alternative aux dépens des tige et boucle du terminateur)

- une séquence AG-box et le motif GCUG faisant partie de boucles présentes au sein du « domaine régulateur »

- une séquence CGUUA (appelée F-box) située à environ 40-50 nt en amont de la T-box

Cas particulier de la thréonyl-ARNt synthétaseplus de 800 ntcorrespond à une triple répétition de la région type observée pour tous les autres gènes présence de 3 terminateurs forts

* 26

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27Schéma de la région 5’ non-codant du gène thrSLes séquences conservées ainsi que le codon régulateur Thr (ACC) sont indiqués.

antiterminaison transcriptionnelle (2)

*

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Régulation par antiterminaison antiterminaison transcriptionnelle (2)

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““ ””

AAAAAAAAAAAAGGGGGG

AACCGG

GGUU

CCCCCCUUUUUU

CCAA UU

CAUACAUA

UUGGGGAAAACCCC

UUUUCCCCGGUUUU UU AA UUUU

CCAAAA

CCCC

AAAGGGUGGAACCACGAUUCCGUUUAUUCAAAAAGGGUGGAACCACGAUUCCGUUUAUUCAACCCCUUCCGGUUCCCCCCUUUU

UUCC AA

UUAA

GGGGGGGGCCGGGGGGGG

GG

UUUUUUUUUUTT--boxbox

thrSthrS

TerminateurTerminateur AntiterminateurAntiterminateur

*

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29

’’

ARNmARNm

AntiterminateurAntiterminateur

+ 1+ 1

Domaine Domaine de spde spéécificitcificitéé

AAAAGGGG

AACCAA

GGAAAAGG

CC UU GGCC

CC

UUUU AA

CCCC

CCCCUUUU

UU

AA

GG AAAA

GGAAAAUUGG

UUAACC

CCGGGG CC

GGGG

AACC

CCAAUUUUCC

UU

CC

GG

AA

GG

CC GGUU AACCAA

AAGG

GGGG

GGAAAAGGCC

CCCCCCUUUUCCGG

CCCCUU GG

GG

AAAAAAGGGGGG

AACCGG

GGUU

CCCCCCUUUUUU

CCGG UU

UUGGGGAA

AA CC CC

UUUU

CCCCGGUU

UU UU AA UUUUCCAAAA

CCCC

AAAA

thrS

ARNtARNt

UUCCCCAAUUGGGG

Modèle d’antiterminaison transcriptionnelleet du clivage de la région 5’ non codante de la thréonyl ARNt synthétaseLe site du clivage endonucléolytique est indiquépar une flèche.

*

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Substitution des facteurs σ

30ISHIHAMA (2000), Annu. Rev. Microbiol. 54, 499-518

THE SEVEN TYPES OF SIGMA SUBUNITS IN E. coli, EACH OF WHICHRECOGNIZES AND STIMULATES THE TRANSCRIPTION OF A SPECIFIC

SET OF GENES VIA PROMOTERS WITH DIFFERENT SEQUENCES

Les 7 types de facteurs σ chez E. coliChacun des facteurs σ reconnaît et stimule la transcription d’un groupe de gènes spécifiques via des promoteurs présentant des séquences différentes.

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Phases de la sporulation

Sporulation : différenciation d’une bactérie végétative en une cellule mère (qui sera lysée) et une spore (qui sera libérée)

é é é

é ’

31

é é

è

*

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Que se passe-t-il au niveau des gènes lors de la sporulation?

2 constats : 1- changements importants des activités de biosynthèse chez la bactérie en sporulation2- changements dans l’expression de nombreux gènes :

arrêt de la transcription pour certainsexpression spécifique pour d’autres

Mise en place de nouvelles formes d’ARN polymérases : même noyau enzymatique mais différents facteurs σ

Changements dans la spécificité de transcription

La sporulation est pilotée par 5 facteurs σ (en plus de la cellule végétative)1- un facteur actif avant la séparation de la cellule2- deux facteurs actifs successivement dans la préspore3- deux facteurs actifs successivement dans la cellule mère

Il y a une régulation croisée des facteurs σ compartimentés ce qui permet à la préspore et à la cellule mèrede coordonner étroitement ce processus de différenciation.

*

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Changements successifs des facteurs σ qui contrôlent la spécificité de l’initiation de l’ARN pol.

PRESPORE CELLULE MERE

ARN pol avec σ43 ARN pol avec σ43 ou σH

33(Lewin fig. 11-24 p316)

Activation de la synthèse de σF et de σpro-E

σpro-EσF

Remplacement de σ43 par σF septum

Transcription des gènes précoces de sporulation par le complexe σF-noyau

Synthèse de σG

Activation de σG

et déplacement de σF

Déclenchement de la transcription des gènes tardifspar σG activé

Activation de σE

et déplacement de σ43

Synthèse de σK

Activation de σK

et déplacement de σE

* Déclenchement de la transcription des gènes tardifspar σK activé

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Substitution des facteurs σCas de la transcription des gènes du phage SPO1 : contrôle par 2 substitutions successives du facteur σ CHANGEMENT de la SPECIFICITE de l’initiation

Période Changements dans l’ARN polymérase Réactions

précoce Les promoteurs des gènes précocesdu phage sont reconnus par l’holoenzymede la bactérie

intermédiaire

Le gène précoce 28 code un nouveau facteur σ qui déplacele facteur σ bactérien

Le complexe gp28-noyau de l’enzymetranscrit les gènes intermédiairesdu phage

34

Early : σ70Middle : σ28Late : σ33,34

tardive

Les gènes intermédiaires 33 & 34 codent des protéines qui remplacent gp28

Le complexe noyau de l’enzymegp33-gp34 transcrit les gènes tardifsdu phage

*

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cascade σ : cas de l’infection de B. subtilis par le phage SPO1

Substitution des facteurs σ

Des facteurs σ alternatifs contrôlent l’ordre de l’expression des gènes du virus bactérien SPO1

La substitution de facteurs σ permet la reconnaissance de nouveaux promoteurs.Il y a expression de nouvelles séries de gènes du fait de la substitution des facteurs σ.

Cette substitution est requise en cas de changements de l’environnement (nutriments, température…).

* 35

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σ32

3 processus aboutissent à une élévationrapide du niveau intracellulaire de σ32

1- diminution de la dégradation de σ32

2- augmentation de la synthèse du messager de σ32

3- élévation du niveau de traduction du messager de σ32

La stabilisation de σ32 se produit par la séquestration des chaperones DnaKJ

(Réf. : Yura & Nakahigashi (1999) Cur. Op. Microbiol. 2 : 153-8)*

Substitution des facteurs σ

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Substitution des facteurs σ

Système de régulation de l’expression génique basé sur l’utilisation de facteurs anti-sigma

Facteur anti-sigmafacteur capable de former un complexe avec son facteur σ cible

entraînant l’inhibition du fonctionnement du facteur σ

1ère démonstration : lors de l’infection d’E. coli par le phage T4 :

mise en évidence d’un facteur anti-σ (AsiA)synthétisé par le phage s’associe avec σ70, inhibe ainsi la transcription des promoteurs de l’hôte

et promoteurs phagiques précoces

Chez E. colimise en évidence de la protéine Rsd (pour « regulation of sigma D »)

Rsd se lie à la région 4 de σ70

empêche l’association de σ70 avec l’enzyme-cœursynthèse de Rsd induite lors de l’entrée en phase stationnaire des bactériesRsd séquestre σ70 sous une forme inactive

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Page 38: Cours Module L5-BH-05 Régulation de l’expression des génomesaurelien.chateigner.free.fr/Semestre 5/SC-L5BH-05 Régulation de l... · The genes required for the uptake and catabolism

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Activation par NtrC de l’ARN polymérase - σ54 au niveau du promoteur du gène glnA.

• le gène glnA code pour la glutamine synthétase, enzyme qui synthétise la glutamine à partir d’acideglutamique et d’ammoniaque.

• l’ARN polymérase avec σ54 se fixe au promoteurglnA formant un complexe fermé avant d’être activé.

• en réponse à un faible taux de glutamine, une protéine kinase, appelée NtrB phosphorylela protéine dimérique NtrC, laquelle se fixe alors à 2 éléments de séquence(appelés enhancer) localisée à -108 & -140.

• les dimères phosphorylés de NtrC fixés à l’ADNinteragissent avec la σ54-polymerase, ce qui provoque la formation d’une boucle dans l’ADN.

• l’activité ATPase de NtrC stimule par la suite la polymérase entraînant la formation d’un complexe ouvert; la transcription du gène glnA peut alors commencer.

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