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Coloration et Examen des

frottis sanguin

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But• La coloration des frottis sanguins

permet d’identification des leucocytes grâce à leurs caractéristiques propres mises en évidence par un colorant approprié, ainsi que l’observation de la morphologie des érythrocytes et des plaquettes.

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• Plusieurs colorations sont utilisées, telles les colorations dérivées de la méthode de Romanowsky (Wright, Leishman, Giemsa) et les colorations panoptiques (Jenner-Giemsa et May-Grunwald-Giemsa) .

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• le colorant de Wright est surtout utilisé sur le contient américain ;

• en Grande-Bretagne, on emploie le colorant le Leishman

• et en France, le colorant de May-grunwald-Giemsa

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• Ici, la coloration de May-grunwald-Giemsa et la coloration de Wright sont les plus répandues. Cette variété de colorations, selon le pays, explique les différences de coloration des planches des livres d’hématologie.

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Coloration de May-Grunwald-Giemsa

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1. Principe • Cette méthode panoptique est basée

sur l’emploi successif de deux colorants : Le May-Grunwald-Giemsa. Le premier fixe les frottis par son alcool méthylique et colore les éléments acidophiles et les granulations spécifiques des leucocytes. Le second colore surtout les noyaux et les parties azurophiles.

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2. Matériel et réactifs • Plateau à coloration• Chronomètre• Colorant de May-Grunwald : poudre de

May-Grunwald (disponible dans la commerce) et méthanol.

• Des solutions de colorants prêtes à l’emploi sont vendues dans le commerce. On peut aussi se procurer simplement la poudre de colorant et la préparer dans les proportions recommandées par le fabricant.

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• Colorant de Giemsa : poudre de Giemsa (du commerce), méthanol et glycérine.

• Tampon : tampon phosphate préparé généralement à partir des solutions tampons de Sörensen.

• Les colorants sont sensibles à la concentration en ions hydrogène ; un pH alcalin accentue le bleu de méthylène aux dépens de l’éosine et vis versa.

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• Nous recommandons un pH de 7.0. Cependant, le pH varie selon les utilsateurs. Nous donnerons donc ici les quantités requises pour des solutions à pH différents :

• Solution A:• KH2PO4 0,066 mol/l9,1g/l• Solution B:• Na2HPO4 0,066 mol/l 9,5g/l ou Na2HPO42H2O 11,9g/l

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Pour obtenir une solution du pH requis, mélanger les solutions A et B dans des proportions suivantes :pH Solution A Solution B6.46.66.87.07.2

73.0ml63.0ml50.8ml38.9ml28.0ml

27.0ml37.0ml49.2ml61.1ml72.0ml

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3. Technique • 1) Verser sur le frottis 10 à 15

gouttes de liquide de May-Grunwald de manière à bien le recouvrir. Laisser agir pendant 3 minutes. Il est essentiel que le liquide ne sèche pas.

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• 2) Ajouter autant de gouttes de tampon phosphate que l’on a mis de gouttes de May-Grunwald. Mélanger en inclinant la lame en tous sens ou en soufflant dessus délicatement. Laisser agir pendant 2 minutes.

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• 3) Rejeter le May-Grunwald et, sans laver, verser du Giemsa dilué dans la proportion de 3 gouttes pour 2 cm3 d’eau distillée. Laisser agir pendant 20 minutes environ.

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• 4) Laver rapidement sous le jet d’eau. Il ne faut pas se contenter de rejeter le colorant, sinon la pellicule irisée du précipité qui se forme toujours à sa surface risque d’adhérer au frottis.

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• 5) Faire sécher le frottis par égouttage ou par ventilation. Ne jamais chauffer le frottis.

• N.B : Les temps de coloration peuvent être différents à cause de la concentration, et de la qualité des colorants utilisés.

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Coloration de Wright

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1. Principe • Très utilisé, cette méthode permet

une bonne différenciation des cellules grâce au colorant de Wright.

• Celui-ci est composé de bleu de méthylène, d’éosine et d’azur de méthylène en solution dans le méthanol.

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2. Matériel et réactifs • Colorant de Wright : il se présente en

solution prête à l’emploi ou en poudre que l’on dissout dans du méthanol dans les proportions recommandées par le fabricant.

• Tampon à pH voisin de 6.8 (voir tampon préparé pour la coloration de May-Grunwald-Giemsa).

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3. Technique• 1) Verser sur le frottis 10 à 15 gouttes de

liquide de Wright de manière à bien le recouvrir. Laisser agir pendant 3 minutes.

• 2) Ajouter autant de gouttes de tampon phosphate que l’on a mis de gouttes de Wright. Laisser agir pendant 6 minutes.

• 3) Laver rapidement sous le jet d’eau et sécher par égouttage ou ventilation.

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Résultats d’une bonne coloration Avec la coloration de May-Grunwald-Giemsa :• Les noyaux sont rouge-violet

(basichromatine) et roses (oxychromatine),• Les cytoplasmes acidophiles (granulocytes)

sont roses,• Les cytoplasmes basophiles (lymphocytes et

monocytes) sont bleus,• Les cytoplasmes polychromatophiles sont

grisâtres avec des zones roses et des zones bleues,

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• Les granulations neutrophiles sont marron,

• Les granulations éosinophiles sont orangées,

• Les granulations basophiles sont violet foncé,

• Les granulations azurophiles sont violet-pourpre,

• Les thrombocytes sont visibles et de teinte rose violacé (lilas)

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Avec la coloration de Wright :• Le frottis est de couleur rosée

uniforme à l’examen macroscopique,• Au microscope, les globules rouges

sont roses,• Les noyaux des leucocytes sont bleu

foncé,• Les granulations des neutrophiles

sont violet-rose ou lilas,

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• Les granulations des éosinophiles sont rouge orangé,

• La basichromatine ainsi que l’oxychromatine du noyau sont clairement différenciées,

• Les autres éléments sont de la même couleur que celle qu’on obtient à la coloration de May-Grunwald-Giemsa.

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Causes d’erreurs• Si le frottis est excessivement bleu,

c’est peut-être qu’il est trop épais ou que le lavage a été insuffisant ou le temps de coloration trop prolongé, ou qu’on a utilisé un colorant ou un tampon excessivement basique.

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• Dans ce cas, les érythrocytes sont bleus ou verts, le cytoplasmes de lymphocytes devient gris ou bleu lavande, les granulations des éosinophiles deviennent grises ou bleues et les granulations des neutrophiles sont très foncées et apparaissent plus grosses que normalement.

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• Si le frottis est trop rouge, cela peut être causé par un colorant ou un tampon trop acide. Dans ces préparations, la chromatine du noyau est bleu pale au lieu d’être bleu foncé, les érythrocytes sont rouges ou oranges au lieu d’être roses, et les granulations des éosinophiles sont rouges brillant alors que les granulations azurophiles et neutrophiles sont à peine visibles.

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• Si les noyaux, les érythrocytes et les granulations éosinophiles sont pales, cela est probablement du à un lavage trop prononcé ou à un temps de coloration trop court.

• Parfois des précipités apparaissent sur le frottis ; ce défaut est dû à des lames malpropres, à un mauvais lavage, à du colorant séché sur les lames ou à une filtration inadéquate du colorant.

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Examen des frottis sanguins 

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• On contrôle tout d’abord le frottis à faible grossissement, de manière à déterminer la distribution des cellules ainsi que la qualité de l’étalement et de la coloration. Si la préparation est jugée satisfaisante, on dépose une petite goutte d’huile à immersion sur l’étalement, puis on met en place l’objectif à immersion.

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• Il est important de choisir un endroit ou les érythrocytes sont voisins sans cependant se toucher.

• Si le frottis est trop épais, les leucocytes et les érythrocytes sont petits, et on ne distingue que très peu les détails morphologiques.

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• Si le frottis est trop mince, les érythrocytes sont plus grands, et la distribution de l’hémoglobine semble plus uniforme que normalement.

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• La répartition des cellules n’est pas parfaitement égale. Les éléments les plus petits (lymphocytes) se regroupent surtout au centre du frottis, les granulocytes sur les bords et les cellules plus volumineuses (monocytes) sont entrainées dans les franges du frottis.

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• Pendant qu’on exécute la formule leucocytaire, on doit aussi vérifier les éléments suivants :

• Les érythrocytes : il faut observer et apprécier la taille, la forme et la couleur des érythrocytes, ce qui fournit des renseignements utiles pour le diagnostic.

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• Avec l’éxpérience, l’observateur peut déterminer si les globules rouges sont macrocytaire, normocytaire ou microcytaire. Le degré de variation de la taille (anisocytose)est rendu par la notation 0,+,++,+++ ou ++++.

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• La présence de forme anormales (codocytes, drépanocytes, elliptocytes, sphérocytes, etc.) doit être notée. Le degré de variation de la forme (poikilocytose) est rendu par les notations 0 à ++++. Les variations de la couleur (anisochromie, hypochromie,polychromatophilie) doivent aussi être notées et graduées.

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• La présence de corps d’inclusions (corps de Jolly, ponctuations basophiles, anneau de Cabot, etc.), de globules rouges nucléés, de rouleaux d’hématies doit être indiquée. Tous ces éléments ont une importance considérable pour le diagnostic.

• Les thrombocytes : la distribution et la morphologie des thrombocytes doivent être observées.

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• L’évaluation du nombre de thrombocytes est approximative (augmentation marquée, augmentation modéré, nombre légèrement augmenté, normal ou légèrement diminué, diminution modérée et diminution marquée) et sera confirmé par la numération dans un hématimètre si nécessaire.

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• Pour la morphologie, il est important de regarder la forme et la taille des thrombocytes. Sont notées principalement : l’anisocytose plaquettaire et les mégaplaquettes.

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• Les leucocytes : en plus d’établir la formule leucocytaire, on doit noter la présence de corps d’inclusion (granulations toxique, corps de Döhle, corps d’Auer, etc.), de neutophiles hypersegmentés, de lymphocytes atypiques, etc.

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Formule leucocytaire

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• But : La formule leucocytaire permet d’établir le pourcentage (relatif) de chacun des types de leucocytes présents.• Principe : Il s’agit d’établir le pourcentage en comptant 100 ou 200 leucocytes et en distinguant les lignées granulocytaire, lymphocytaire et monocytaire, les formes adultes ou jeunes. Chaque leucocyte est identifié puis compté à l’aide d’un hémoleucomètre (compteur mécanique).

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Technique : 1) Avec l’objectif à immersion, parcourir l’ensemble du frottis, sur les bords et au centre, en évitant les parties trop épaisses ou trop minces. Comme on l’a vu précédemment, il est important de parcourir le frottis en tous sens, à cause de la répartition des diverses cellules. 2) Chaque leucocyte rencontré est identifié et compté. Établir ensuite le pourcentage de chacun des types cellulaires.

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tête queue

film trop épais épaisseur Idéale film trop mince

Corps

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3) A partir du pourcentage, calculer le nombre absolu de chacun des types si désiré. NB : ce calcul est utile lorsque le

nombre de leucocytes ou le pourcentage de chacun des types de leucocytes est anormal.

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Causes d’erreurs :• On peut diminuer l’erreur due au

hasard de la répartition des cellules en comptant un plus grand nombre de cellules.

• L’erreur est de l’ordre de +/- 10% si 100 cellules sont comptées et de +/- 7% si 200 cellules sont comptées.

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