Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

Cours

d'Hémato-cytologie

DUT ABB3- Frottis sanguins

LE FROTTIS SANGUIN

obtenir sur une lame de verre une couche unicellulaire d'éléments figurés du sang répartis sur tout le frottis et fixés dans l'aspect le plus proche de leur état physiologique

Positionner la lame de façon à prendre la totalité de la goutte.La laisser se répartir de façon homogène le long du biseau.

Appliquer un mouvement de translation horizontale rapide en maintenant la spatule d’un angle de 45° environ sans appuyer tout au long de la lame. Sécher par agitation pour fixer temporairement les cellules

Bon frottis:   de bonne taille (½ à ¾ de la lame)de bonne densité, goutte étalée en entier, distant des bords de la lame donc accessible en tout point à l’observation microscopique

Ce qu’il ne faut pas faire

Coloration Frottis sanguin: May Grünwald Giemsa

L'action des ions acides et basiques obtenus après dissociation par de l'eau neutre de deux colorants alcooliques (méthanoliques)

-le May Grünwald (éosine – bleu de méthylène)

-le Giemsa (éosine – azur de méthylène) sur les éléments cellulaires complémentaires permet d'obtenir quatre affinités :

- trois orthochromatiques

Acidophile: du gris au légèrement rosé

Basophile: violet foncé au noir

Neutrophile: rose-violet

- une métachromatique

Azurophile: rose-rouge

Technique:

Eau neutre :eau dé ionisée (acide) neutralisée par quelques gouttes d’eau du robinet (basique) en présence d’un indicateur coloré virant aux alentours de 7,4 (par exemple : le Bleu de Bromothymol).

Plus rapide et suffit parfois eau du robinet ou comprimés eau neutre

•Fixer le frottis par le méthanol en l’immergeant dans le May Grünwald pur pendant 3 minutes.

•Plonger la lame dans un bain de May Grünwald dilué au ½ en eau neutre durant une minute.

•Plonger la lame dans un bain de Giemsa dilué au 1/10ième durant 20 minutes (Giemsa lent).

•Rincer doucement la lame à l’eau neutre ou du robinet.

•Essuyer le dessous de la lame. La laisser sécher verticalement.

L’examen du frottis sanguin

• faible grossissement (obj.x40) permet d’apprécier la qualité du frottis

•Études Cytologiques: obj.x100 à l’immersion.

- observer les éventuelles anomalies morphologiques des GR: anomalies de forme, de taille, de coloration, la présence d’inclusions intra-érythrocytaires.

-observer les éventuelles anomalies morphologiques des plaquettes (taille, forme), la présence éventuelle d’amas plaquettaire, et confirmer la densité de la numération plaquettaire.

-Effectuer la Formule Leucocytaire

-penser aussi aux Parasites sanguins intra éryhthrocytaires (Plasmodium, Babésia) ou extra-érythrocytaires (Trypanosomes, Microfilaires)

Parcours du frottis sanguin en vue de la réalisation d’une formule leucocytaire

La formule leucocytaire correspond à la distribution des différentes variétés leucocytaires identifiées le long d’un parcours qui tient compte de la distribution des globules blancs lors de l’étalement (les granulocytes et les monocytes sont plus fréquemment rencontrés sur les bords et en bout de frottis). Cette distribution doit être représentative de la répartition physiologique des leucocytes.

Identifier ainsi 100 (ou 200) leucocytes minimum et calculer le pourcentage des différentes variétés

Calculer à l’aide de la numération des leucocytes les valeurs absolues indispensables à l’interprétation de la formule leucocytaire

Remarques :

•Des leucocytes immatures (ou anormaux) peuvent être identifiés lors du parcours. Exemple: myéloblastes, promyélocytes, myélocytes,….

ils sont à inclure dans le pourcentage et à introduire dans le % de la formule leucocytaire.

•Des érythroblastes  (souvent Erythroblastes acidophiles ou polychromatophiles) peuvent être également rencontrés ; Ils sont à compter au cours de la formule leucocytaire, mais ne sont pas inclure dans le % de la formule leucocytaire.

Exemple de FL avec éléments immatures: Polynucléaires Neutrophiles 75%,Lymphocytes 15%,Monocytes 5 %,Promyélocytes 2%, Myélocytes 5%, et Erythroblastes 5 pour cent GB rencontrés.

Cependant les éryhthroblastes ont été dénombrés lors de la numération automatisée des GB, comme des cellules nuclées, et il est nécessaire d'effectuer une correction de cette numération, si %age d’Erythroblaste est très élevé, et nombre GB faible, afin qu’elle ne corresponde uniquement qu’à celle des leucocytes.

GB réels =(Num GB automate x100) / (100 + % Erythroblaste)

Atlas d’images cytologiques en Hématologie

http://bioimage.free.fr/

http://www.med.univ-tours.fr/fmc/Pages/hemato.html

http://www.med.univ-angers.fr/discipline/lab_hema/

Formule automatisée:

Les automates réalisent une analyse en flux d'une quantité beaucoup plus grande de cellules selon différents critères physiques (diffraction lumineuse avec mesure à différents angles, conductance de signaux électriques...). L'étude informatique des éléments obtenus permet dans de nombreux cas de rendre la formule leucocytaire.

Mais la présence d'anomalies cytologiques érythrocytaires, leucocytaires et/ou thrombocytaires nécessitera l'analyse microscopique d'un frottis sanguin coloré

Présence d’éléments médullaires dans le sang périphérique

Erythroblastes : souvent E. acidophile et E. polychromatophile

A compter au cours de la FL, mais ne pas inclure dans le %

Ex: PN 80%, L 15%, M 5 %, et Erythroblastes 5%

Si % Erythroblaste très élevé, et nombre GB faible: correction de la numération automatisée des GB:

N GB =(Num GB automate x100) / (100 + % Erythroblaste)

Aspect général :taille 7,3 µmen moyenne, forme ronde

Noyau :absent

Cytoplasme :affinité acidophile, gris rosé à centre décoloré, sans granulations

Globules rouges

Aspect général :taille 1 à 3 µm plus grosses sur anticoagulantforme irrégulière

Noyau :absent

Cytoplasme :affinité basophile clair, granulations fines indiscernables nombreuses azurophiles

Plaquettes

Aspect général :taille 12 à 14 µmforme arrondie

Noyau :taille N/P = 1deux à six (le plus souvent deux ou trois lobes)chromatine dense à mottes allongées

Cytoplasme :affinité acidophile clairgranulations très nombreuses, fines, irrégulières dispersées et neutrophiles

Granulocyte ou polynucléaire neutrophile (PN)

Aspect général :taille 12 à 14 µmforme arrondie

Noyau :taille N/P = 1le plus souvent deux ou trois lobeschromatine dense à mottes allongées

Cytoplasme :affinité acidophile clairgranulations moyennes, rondes, nombreuses, parsemant le cytoplasme

Granulocyte ou polynucléaire eosinophile (PE)

Aspect général :taille 11 à 13 µmforme arrondie

Noyau :taille N/P > 1deux ou quatre lobesronds se recouvrant chromatine dense à mottes allongées

Cytoplasme :affinité acidophile clairgranulations peu nombreuses, recouvrant partiellement le noyau, parsemant le cytoplasme, violet-noir

Granulocyte ou polynucléaire basophile (PB)

Aspect général :taille 9 à 11 µmforme arrondie

Noyau :taille N/P >> 1rond, chromatine dense

Cytoplasme :mince couronne périnucléaire, affinité basophile clair, sans granulations

Petit Lymphocyte

Aspect général :taille 10 à 15 µmforme arrondie mais déformable, souvent des côtés plats

Noyau :taille N/P >= 1rond, chromatine légère, mais d’aspect lisse

Cytoplasme :affinité basophile clair, presque transparent, renforcement basophilie périphérique sans granulations ou avec quelques granulations azurophiles

Grand Lymphocyte

Aspect général :taille 18 à 21 µmforme arrondie mais très déformable,

Noyau :taille N/P < 1forme très variable, souvent encoché, chromatine légère et filamenteuse

Cytoplasme :affinité basophile clair, avec granulations indiscernables azurophiles mais très nombreuses donnant un aspect de cytoplasme gris sale, vacuolé parfois

Monocyte

ANOMALIES MORPHOLOGIQUES DES GR

•Anomalies de Taille

Microcytose

Macrocytose

Anisocytose

•Anomalies de forme

Ovalocytes

Dacryocytes, poires

Schizocytes

Sphérocytes Drépanocytes

•Anomalies de coloration

Hypochromie Hématies cibles

Polychromatophilie

•Inclusions

Ponctuations basophiles Corps de Jolly

Anneau de Cabot

Faux-ami: Trophozoïte de Plasmodium

ANOMALIES MORPHOLOGIQUES DES PLAQUETTES

Plaquette géante Agrégat plaquettaire

Éléments cellulaires médullaires de la lignée granulocytaire

A compter lors de la formule leucocytaire et à inclure dans le %

Métamyélocytes N

Myélocytes N

Promyélocyte NMyéloblaste

Aspect général :taille  20 à 25 µmforme arrondie ou ovalaire

Noyau :taille : N/P >>1 forme : arrondie (un peu aplati)aspect de la chromatine: légère et uniforme avec présence de nucléoles

Cytoplasme :affinité basophileavec parfois, quelques granulations moyennes et azurophiles

Myéloblaste

Aspect général :taille 18 à 22 µmforme ovalaire

Noyau :taille : N/P > 1forme : ovalaire (voire aplatie même encochée)aspect de la chromatine : légère et nucléolée avec possibilité de quelques masses de condensation Cytoplasme :affinité basophile soutenueprésence de nombreuses granulations moyennes et azurophiles (quelques granulations spécifiques possibles)

Promyélocyte neutrophile

Aspect général :taille 15 à 18 µmforme ronde à ovalaire

Noyau :taille : N/P = 1forme : ronde, ovalaire aplatie, même encochéeaspect de la chromatine : assez dense avec masses de condensation

Cytoplasme :affinité acidophile ou basophile très clairprésence de nombreuses granulations spécifiques neutrophiles de taille irrégulière, et encore quelques granulations azurophiles

Myélocyte neutrophile

Aspect général :taille 13 à 15 µmforme arrondie à ovalaire

Noyau :taille : N/P = 1forme : incurvé ou droit, sans rétrécissement, pas de lobulationaspect de la chromatine : dense avec masses de condensation

Cytoplasme :affinité acidophile avec présence de nombreuses granulations spécifiques neutrophiles de taille irrégulières

Métamyélocyte neutrophile

PlasmocyteLymphocyte hyperbasophile

Lymphocyte hyperbasophile

A inclure dans le % de la FL

Lymphocytes hyperbasophiles apparaissent dans des infections virales ou parasitaires : syndromes mononucléosiques, souvent l’hyperlymphocytose est polymorphe