Adaptation des Alvinellidés aux conditions de stress

Adaptation des Alvinellidés aux conditions de stress oxydatif de l’environnement hydrothermal profond.

Approche protéomique

Jean MaryMaître de conférences Univ. Paris 7 – Denis Diderot

Délégation CNRS

UMR 7144- CNRS - UPMCUMR 7144- CNRS - UPMC Equipe Equipe

EcophysiologieEcophysiologie

Journée Stress oxydant, 28 juin 2007

Les sources hydrothermales profondes: un milieu extrême

Journée Stress oxydant, 28 juin 2007Jean MARY

TempératurePression

Métaux lourdspH acide

[H2S]….


Les sources hydrothermales profondes: un milieu extrême

Houdez & Lallier (2007)

Réactions d’oxydation d’H2S par O2 HS- + O2 → HS● + O2●-

HS● + O2 → S + HO2-

HO2- + H+ → H2O2

Réaction de Fenton H2O2 + Fe2+ → ●OH + Fe3+ + -OH

Stress oxydatif exogène intense, principalement (?) au niveau des branchies (tissu d’échange)

D’après Chen et al. 1972

Alvinella pompejana, l’eucaryote le plus thermotolérant de la planète (?)

Les organismes se distribuent

sur les flancs des cheminées

en fonction de leur tolérance

au fluide hydrothermal.

D’après http//amex.snv.jussieu.fr/fichiers/htm Journée Stress oxydant, 28 juin 2007Jean MARY

Ifremer

Alvinella pompejana (Desbruyères & Laubier 1980)

O. Dugornay, Ifremer Ifremer

Alvinella pompejanaoccupe le pôle le pluschaud et résisterait à des températures de

80°C (?)

Quelles sont les, les cibles du stress oxydatif, les protéines mises en œuvre par A. pompejana en réponse

au stress oxydatif?

Approche protéomique différentielleElectrophorèse 2D et identification des protéines par spectrométrie

de masse (SM).

Définition de la distribution tissulaire des protéines cibles.

Echantillons: Campagne BIOSPEEDO(dorsale sud EPR, entre 7°S et 23°S, 2004, D. Jollivet)

Individus collectés soumisà expérimentation enenceinte pressurisée Desearesavec régulation chimique (DEep-SEA RESpirometer)

Alvinella pompejana conditionnés 7 et 14h à différentes concentrations d’O2

(normoxie 2.3 mg d’O2/l soit ~130µM, Hypoxie 0.35 mg/l soit ~20µM, Hyperoxie 6.5 mg/l soit ~360µM)Différentes concentrations de Peroxyde d’hydrogène.


Banque de cDNA d’Alvinella pompejana

3 banques « complètes »: - Animal entier 25 000 seq. 19 700 seq. (73% redondance)

- Branchies 26 500 seq. 18 100 seq. (79% redondance)

- Tissu ventral 16 400 seq. 12 800 seq. (78% redondance)

1 banque en cours: - Pygidium

8 800 seq. 5 800 seq. (53% redondance)

Séquençage: Génoscope – Evry

Annotation : IGBMC – Strasbourg (O. Poch, O. Lecompte)

http://www-alvinella.u-strasbg.fr/Alvinella/





2O2 2 O2

●- 2 H2O2 2 ●OH (+2

-OH) 2 H2O

H2O2 + O2

SOD (Mn ou Cu/Zn)

Catalase

O2 + 2 H2O

2 GSH

GSSG

2H2O + O2

Glutathion peroxydases

2R’SH

R’SSR’

2 H2O

PeroxyredoxinesThioredoxineGlutathion réductaseProtéasome 20S

Méthionine sulfoxyde réductase A et B

2e- 2e- (+4H+) 2e- 2e- (+ 2H+)

2H+

Enzymes rédox présentes chez Alvinella pompejana


Traitement informatique des données

(banque de cDNA)

Protéomique « Canal

historique »

1- Lavage2- Digestion

3- Extraction

Analyse par SM

(MALDI-TOFLC-MS/MS)Quelle(s) est (sont)

la (les) protéine(s) dans ce spot?

Identification de la protéine1- Hsp702- Kératine...3- Trypsine...

pH

PM

Electrophorèse 2D


Branchies réduites en poudre dans N2 liquide, précipitation des protéines au

TCA / Acétone 10% (v/v) / mercaptoéthanol 0.07% (v/v)Reprise des protéines dans tampon d’extraction

500µg déposés, coloration bleu colloïdal132

78

45.7

32.5

18.4

kDa

pH 3 pH 10 pH 4 pH 7

Analyse par E2D des protéines solubles de branchies



Conditions normoxie vs. hypoxie

Branchies, échantillon 1581-1 (normoxie) et 1584-140 (hypoxie)Site Garrett-17S.

Normoxie 2.30 mg O2/l Hypoxie 0.35 mg O2/l

78

45.7

32.5

18.4

kDa

pH 4 pH 4pH7 pH7

Journée Stress oxydant, 28 juin 2007Jean MARY Journée Stress oxydant, 28 juin 2007Jean MARY

Conditions normoxie vs. hypoxie

Branchies, échantillon 1581-1 (normoxie) et 1584-140 (hypoxie)Site Garrett-17S.

Normoxie 2.30 mg O2/l Hypoxie 0.35 mg O2/l

18.4 kDa 18.4 kDaSpot acide(oxydation cystéine?)

Perspectives

- Comparer quantitativement les états normoxie, hypoxie et hyperoxie (2D DIGE),

- Doser les activités des principales enzymes rédox (SOD, Gpx et Prdx) dans les branchies,

- Effets de H2S sur l’activité enzymatique de ces enzymes,

-Quid des Msr?


Protéines(méthionine, cystéine)

ROSProduction des ROS

(O2•-,OH•,H2O2…)

e-ROS

Dégradation Protéasome Lon protéase

ADNLipides

RéparationTrx, GSH, Srx1 Msr

Systèmes antioxydants (SOD, catalase, GPx, Prx)

ROS

MsrBTrx/TrxR/NADPH

MsrATrx/TrxR/NADPH

Oxydation et réduction des résidus méthionines

CH3

S

CH2

CH2

3 HN C H

-OCO

L-Méthionine

+

+ H2O

+ H2O

+ +

----------

CH3

S = O

CH2

CH2

3HN C H

-OCO

L-Méthionine, S-sulfoxyde

CH3

O = S

CH2

CH2

3HN C H

-OCO

----------

L-Méthionine, R-sulfoxyde

H2O2 H2O2

++ H2O

L-Méthionine sulfone

CH3

O = S = O

CH2

CH2

3HN C H

-OCO

H2O2H2O2

Enzymes Code Identification dans banque Alvinella

Mn SOD (mitochondriale)

ALEN1054 [contig] ALVE1214 [singlet] ALVE1224 [singlet]PYGI0208 [contig]

Mn-containing superoxide dismutase precursor

Cu/Zn SOD cytosolique ALEN4552 [singlet] ALVE0035 [contig]ALGI0457 [contig]

Superoxide dismutase

Cu/Zn SOD ALEN3232 [singlet]ALGI1034 [contig]

Cu-Zn superoxide dismutase

Superoxide dismutase [EC 1.15.1.1]2 O2

•- + 2 H+ → O2 + H2O2

Enzymes de la réponse au stress oxydatif

Enzymes Code Identification dans banque Alvinella

Peroxyrédoxine I ALEN0725 [contig]ALVE0228 [contig]ALGI0703 [contig]ALGI3708 [singlet]PYGI0264 [contig]

Thioredoxin peroxidase

Peroxyrédoxine II

Peroxyrédoxine III ALEN1329 [contig]ALGI0445 [contig]ALGI2973 [singlet]

Thioredoxin dependent reductase

Peroxyrédoxine IV ALEN2723 [singlet] Thioredoxin peroxidase

Peroxyrédoxine V ALEN0110 [contig]ALGI1103 [contig]

Peroxiredoxin

Peroxyrédoxine VI (A) ALEN1123 [contig]ALVE0327 [contig]ALGI0587 [contig]ALGI1303 [singlet] PYGI0545 [contig]

Peroxiredoxin

Glutathione peroxidase

Peroxyrédoxine VI (B) ALEN4007 [singlet] Peroxiredoxin

Peroxyrédoxines [EC 1.11.1.15]2 R'-SH + ROOH → R'-S-S-R' + H2O + ROH

Enzymes (meilleur Blast) Code Identification dans banque

Alvinella

GPx-2 (salivaire –Ixodes scapularis Gastrointestinale –souris)

PYGI2403 [singlet]

GPx-3 (A) (extracellulaire, plasma homme)

ALEN0206 (contig]ALVE0643 [contig]ALGI1093 [contig]

PYGI1755 [Singlet]PYGI0466

GPx-3 (B) (extracellulaire, plasma homme)

ALEN0988 [contig]ALVE0935 [singlet]ALVE0867 [contig]ALGI0850 [contig]ALGI0154 [contig]PYGI1341 [singlet]PYGI1247 [singlet]

Glutathione peroxidase

GPx-3 (C) (extracellulaire, plasma homme)

ALEN0898 [contig]ALVE0868 [contig]ALGI0471 [contig]PYGI0822 [singlet]

GPx-6 (Odorant-metabolizing protein RY2D1, rat)

ALEN5263 [singlet]PYGI1323 [singlet]

Phospholipide hydroperoxyde glutathion peroxydase

ALEN0693 [contig]ALVE1377 [singlet]ALGI0865 [contig]PYGI0260 [contig]

Glutathion réductase ALEN0597 [contig]ALGI0817 [contig]

Glutathione reductase

Glutathion peroxydase séléno-dépendante [EC 1.11.1.9]2 glutathione + H2O2 → glutathione disulfide + 2 H2O

Enzyme Code Identification dans banque Alvinella

Thioredoxine

ALEN0098 [contog]ALVE0371 [contig]ALGI3144 [singlet]ALGI3032 [singlet]ALGI1035 [contig]PYGI0398 [contig]

Thioredoxin

Thioredoxine

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