Stress oxydant
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Stress oxydantI. Réactivité de l’oxygèneII. Oxygène en biologie et stress
oxydatifIII. Superoxyde DismutaseIV. CatalaseV. Peroxydase
I.1 Diagramme d’OM de O2 et de ses formes réduites
x
y
z
x
y
z
px, py
pz
Où placer les 2 autres électrons?
Liaison O=O selon cet axe
I. Réactivité de l’oxygène
O2 = diradical
Forme stable de OForme stable de O22
OO22 stable est un stable est un diradicaldiradical
Autres formes de O2
3O2 triplet 1O2 singulet (réactif)
Formes les plus courantes
O2 triplet
O2 singulet23 kcal/mol
E
Notation: 2S+1O2 où 2S+1 est la multiplicité de spin, et S le nombre de spinTriplet: 2 spins parallèles S = ½ + ½ = 1Singulet: 2 spins antiparallèles S = ½ - ½ = 0
Formes réduites de O2
O2 O2•- O2
2-+ 1 e- + 1 e-
E° (NHE) à pH 7, pO2 = 1:O2 / O2
•- = -0.33 VO2
•- / H2O2 = 0.89 VO2 / H2O2 = 0.28 VO2 / H2O = 1.23 VH2O2 / H2O = 1.82 V
OH• (+ OH-)+ 1 e-
Radicaux
I.2 Réactivité de l’oxygène triplet (diradical)
O2 triplet, or la plupart des réactifs sont singulets (non radicalaires): Réaction concertée généralement lente (Restriction de spin, non détaillé)
3O2 (↑↑) + 2R• (↓) → 2RO2• (↑)
Exemple en bio: Peroxydation de lipides
Rapide (substrat radicalaire)radical radical radical
Pour plus de commodité on ne représente plus que le doublet le plus haut en énergie ou l’électron célibataire dans les produits
O
OH
O
OHOO
O2
Pour une réaction rapide: triplet réagissant avec radicaux.
3O2 (↑↑) + 1R (↑↓) 1RO2 (↑↓)triplet singulet
Coût énergétique pour le retournement du spin: 25 kcal/mol; De plus collisions intermoléculaire beaucoup plus rapides que spin-flip. NON
3O2 (↑↑) + 1R (↑↓) 3RO2 (↑↑)triplet singulet
Etat triplet 3RO2 = état excitétypiquement 40-70 kcal/mol au dessus de l’état fondamental 1RO2. Energie d’activation nécessaire bien trop importante. NON
3RO2 (↑↑) 1RO2 (↑↓) + énergie
3O2 (↑↑) + 3R (↓↓) 1RO2 (↑↑)triplet triplet
1R (↑↓) 3R (↑↑) Energie d’activation nécessaire bien trop importante (Cf cas précédent).
Produit non radicalaire
Produit radicalaire
Possibilités de réaction de 3O2 avec 1R: directe
3O2 (↑↑) + 1R (↑↓) 2O2•- (↑) + 2R•+ (↑)
2O2•- (↑) + 2R•+ (↑) 2O2
•- (↑) + 2R•+ (↓) (diffusion)
2O2•- (↑) + 2R•+ (↓) 1RO2 (↑↓) (recombinaison)
N
N
NH
HN
RO
OH
+ O2N
N
NH
NR
O
OHH
+ O2
N
N
NH
HN
RO
OHOOH
N
N
NH
NR
O
O
+ H2O2
Exemple avec des flavines, mais très rare (nécessite un réducteur fort pour O2)
Réduction de l’oxygène
Rem: Autoxydation radicalaire
Initiation:1X2 (↑↓) → 2X• (↓)2X• (↓) + 1RH (↑↓) → 1RH (↑↓) + 2R• (↓)
Propagation:2R• (↓) + O2 (↑↑) → 2ROO• (↑)2ROO• (↑) + 1RH (↑↓) → 1ROOH (↑↓) + 2R •(↓)
Terminaison:2R• (↓) + 2ROO• (↑) → 1ROOR (↑↓)
2O2•- (↑) + 1X (↑↓) → 1O2
2- (↑↓) + 2X•+ (↑)
2O2 •- (↑) + 2X•+ (↓) → 1XO2 (↑↓)
2HO• (↑) + 1H-X (↑↓) → H2O + 2X•+ (↑)
Formes trFormes trèès s rrééactivesactives
OH
OH
+ O2-
O
OH
+ HO2- k = 1.7 x 107 M-1 s-1
(facilitée par transfert de proton couplé au transfert d’électron)
I.3 Réactivité des formes réduites de l’oxygène triplet
1X (↑↓) + 2O2•- (↑): Exemple de l’oxydation d’hydroquinones
2HO• (↑) + R-H (↑↓) → H2O + R• (↑)
a) Radical OH•
O
OH H
R ou OH
O
OH
O
OH
O
OHOO
O
OHOHO
O2
H
1ere étape de la peroxydation de lipides
Mais aussi oxydation de l’extrémité N-terminale des protéines
Attaque de l’ADN
b) Peroxyde d’hydrogène H2O2 (↑↓)
Cinétique lenteEn présence de traces de métal rédox-actif (Cu, Fe) les réactions de H2O2 sonttrès rapides:
Fe2+ + H2O2 + H+ → Fe3+ + H2O + HO•
Fe3+ + 1/2 H2O2 → Fe2+ + 1/2 O2 + H+
______________________________________3/2 H2O2 → H2O + 1/2 O2 + HO•
EspEspèèce activece active
I.4 Réactivité de O2 singulet
Durée de vie < 1 μsec en solution aqueuse. Peu spécifique. Obtenu par irradiation ou chimiquement:
Supposé être le principal agent responsable de l'effet néfaste du rayonnement UVA:
R
R
OO
1O2
R
R
1O2
3O2
hν
NH
NN
N
O
NH2
NH
NN
HN
O
NH2
O
1O2
ADN ADN
Exemple de réaction de O2 singuletgénéré par photoxydation
Utilisation en biologie: Photo-décontamination des produits sanguins, traitement photothérapique de cancers. En chimie:
• Air = 21% de dioxygène.
• Dioxygène nécessaire aux animaux, plantes et bactériesaérobes pour la production d’énergie, métabolisme, détoxification ...
II. Oxygène en biologie et stress oxydatif
Glycolyse en conditions anaérobies:Glucose + 2ADP + 2Pi Lactate + 2ATP + 2H2O
Glycolyse aérobie: O2 est l’accepteur final d’électron:Glucose + 6O2 + 36ADP + 36Pi 6CO2 + 36ATP + 6H2ORemarquez la différence d’efficacité (potentiel O2 grand)
Energie
Energie
• Air = 21% de dioxygène.
• Dioxygène nécessaire aux animaux, plantes et bactériesaérobes pour la production d’énergie, métabolisme, détoxification ...
• Paradoxe: Dioxygène est aussitrès toxique à toutes les formes de vie.
• La vie existe car les organismesdisposent de systèmes de défense(anti-oxydants) ou de réparationdes dégâts oxydatifs.
II. Oxygène en biologie et stress oxydatif
Dommages
Défences
Radicaux libres produits naturellement en faible quantité et utiles aux organismes à dose raisonnable.Dans des conditions normales la production est maîtrisée et adaptive
II.1 Radicaux primaires et secondaires
Primaires: Espèces à proprement parler radicalaires (issues de la réduction du dioxygène triplet ou de l’oxygène singulet)Secondaires: Radicaux formés par réaction des radicaux primaires avec des molécules biologiques.Précurseurs: Espèces non radicalaires issues de la réduction du dioxygène (type H2O2)Toutes ces espèces sont appelées Espèces Réactives de l’Oxygène (ROS en anglais)
Radicaux primaires et précurseurs
Espèces réactives de l’oxygène
Espèces très réactives
ROO•
NO•
O2•-
1O2RO•
OH•
H2O2RO2H
ONO2•
Radicaux primaires et précurseurs
II.2 Production naturelle de radicaux
O2
H2OPyruvate
O2•-
Electrons circulants sont très réducteurs2-5% sont perdus de la chaîne et vont
réduire O2 en O2•- très toxique
+ énergie
O2 Fonctionnement normal
Fonctionnement anormal
Lutte anti-infectieuse
Phagocytose de 2 globules rouges par un macrophage
Macrophage activé: Production d’un mélange très toxique de superoxyde O2
•-, OH•, H2O2 …Implique une réduction de O2 par la NADPH oxydase pour produire O2
•-, puis action d’une superoxyde dimutase pour produire H2O2.Résultat: Lyse des cellules phagocytées.
OH• peut résulter d’une mauvaise régulation de la concentration en métaux cellulaires
Mn+ = Cu+, Fe2+ (milieu cellulaire est plutôt réducteur)
Autres sources (non naturelles)
Rayonnement ionisant
Rayonnement UV
Pollution
Cigarette1015 radicaux (NO• et NO2
•) inhalés à chaque aspiration
Protection DommagesROSdefence
A l’état de santé : Equilibre entre les radicaux libres et/ou espèces réactives de l’oxygène (toxiques) et nos défences. Tout
déséquilibre entraîne un état de stress oxydatif (agression).
II.3 stress oxydatif
Le stress oxydatif est reconnu aujourd'hui comme l'explication essentielle des phénomènes du vieillissement
Le stress oxydatif est un indicateur du réel état de santé.
Définit un état intermédiaire, où la personne ne présentant pourtant pas encore de maladie avérée, n'est plus tout à fait en bonne santé, en quelque sorte un 'état de rupture plus ou moins passager de l'état de santé'.Cette période liée à un stress, à des contraintes nouvelles ou anormales, à un déséquilibre momentané entre agressions et défenses, expose l'individu à une agression oxydative importante, synonyme à terme de maladies, et quoiqu'il en soit d'un vieillissement accéléré.
II.4 Dégâts aux cellules
Attaque par les espèces réactive de l’oxygène de tous les constituants cellulaires
a) Lipides
b) ADN
N
N NH
N
NH2
HN
N NH
N
O
H2N
HN
NH
O
O
HN
N NH
NO
H2N
HN
N NH
NO
H2N
c) Acides aminés
Viellissement
Athéroscléroses
CHD
Cancer
Diabètes
Maladies Respiratoires
Pb rénaux
Cataracte
Maladies de la peau
Obesité
Maladies inflammatoires
Infections
Dysfonctions hormonales
Conséquences à long terme (maladies)
Gluthation
Flavonoides,Carotenoides
Ubiquinol
Vitamines (C, E)
Induction de la synthèsede protéines de
stockage de métaux
Enzymes du stress oxydant
Coopération entre différents systèmes
II.5 Défenses contre le stress oxydatif
OH
OHO
O
UbiquinolO
HO
Vitamine E
Antioxydants
Spécificités des systèmes
a) Antioxydants
E300, E301
α-Tocophérol (haut)Acide ascorbique (bas)
Vitamine C
Même molécule !!!
E307
=
=
Vitamine E
Propriétés communes aux antioxydants
-O2C NH
HN
CO2-
O
SHO
NH3+ -O2C N
H
HN
CO2-
O
SO
NH3+
CO2-H
NNH
-O2C
O
SO
NH3+
O O
OHHO
HO
HO O O
OHHO
HO
HO
Formes oxydées à 1 électrons stables
Dimère non radicalaire (donc stable)
Radical stabilisé (délocalisé)
Glutathion
Acide ascorbique
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Vit E oxydée
-e-
-e-
LH: Lipid molecule, LOOH: Lipid peroxide, LOO+: Lipid Peroxide radical, a-Toc-OH: α-Tocopherol, a-Toc-O+: α-Tocopherol radical, GSH: Glutathione, Vitamin C+: Vitamin C radical, GS+: Glutathione radical, GSSG: Oxidized glutathione, NADPH: Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+: Oxidizednicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
Vitamine E, appelée aussi α-Tocopherol, -bloque la peroxydation des lipides.
Utilisée pour empêcher le rancissement du beurre (E 307)
Vit E Vit C
Ici Vit C régénère la Vit E, mais peut aussi régénérer
le glutathion ou réagir directement avec le
radical
Ex de cascade de réactions:
O
HO
O
O
+ R-RH
b) Induction de la synthèse de protéines de stockage de métaux
Induction de la synthèse de:Ferritine, transferrine pour le ferCerruloplasmine, albumine pour le cuivre
Mn+ = Cu+, Fe2+ (milieu cellulaire est plutôt réducteur)
OH• peut résulter d’une mauvaise régulation de la concentration en métaux cellulaires:
c) Systèmes enzymatiques : Catalase, peroxydase et Superoxyde Dismutase
III. Superoxyde Dismutase
2O+ 2O2H++ 2 H-•2O2
O2•- + 1 e- + 2 H+ H2O2
O2•- O2 + 1 e-
En fait cette équation est une équation bilan dont les demi-réactions rédox sont:
-0.33 V
+0.89 V
E à pH physiologique
La réaction de dismutation est donc thermodynamiquement favorable !
Conditions requises pour la catalyse: Avoir une espèce (catalyseur) dont le potentiel rédox est compris entre +0.89 et -0.33 V (baisse du ΔG° des réactions élémentaires)
Dismutation du superoxyde
Rem: E°(Cu2+/Cu+) aqueux = 0.34 V et E°(Fe3+/Fe2+) = 0.77 V Ces deux métaux libres catalysent également la dismutation du superoxyde (moins bien que la SOD)
Différentes classes de SOD:
CuZn-SOD (SOD1) dans le cytoplasme, noyauMn-SOD (SOD2) dans les mitochondriesCuZn-SOD (SOD3) extracellulaire (capte le superoxyde libéré par les cellules)
Chez les bactéries: Mn-SOD et/ou Fe-SOD (structures assez similaires)
Les CuZn-SOD sont les plus abondantes chez l’être humain
La structure des SOD varie selon leur classe
pH
Cal
cula
ted
rate
con
stan
t, M
-1se
c-1
CuZnSOD
MnSOD
Sans enzyme
kcat pour CuZn-SOD = 109 M-1.s-1!! La plus grande constante de vitesse du monde vivant. La réaction n’est limitée que par la diffusion du superoxyde
III.1 CuZn-SOD
Dimere de MW = 2 x 16 kDa151 aa/monomère (bovin), 153 aa/monomère (humain)Chaque monomère contient 1 Cu + 1 Zn
Cu et Zn
CuZn-SOD
Hétérobimétallique: Rôle de chacun des métaux ? Réaction catalysée de type rédox or seul Cu peut exister à 2 états rédox dans la fenêtre de potentiel accessible aux systèmes biologiques: Le cuivre est impliqué dans la réaction.Forme active: Cu2+ ou Cu+ ?
O2•- / H2O2
O2•- / O2 -0.33 V
+0.89 V
E°CuII/CuI = 0.065 vs AgCl/Ag dans SOD
En fait les 2 formes Cu2+ et Cu+ sont actives:
O2•- / H2O2
O2•- / O2 -0.33 V
+0.89 VCuII-SOD
CuI-SOD
O2•-
O2O2•-
H2O2
E°CuII/CuI = 0.065 vs AgCl/Ag dans SOD
H+
Cu+ + O2- + 2 H+ Cu2+ + H2O2
Cu2+ + O2- Cu+ + O2
2 O2- + 2H+ O2 + H2O2
Mécanisme catalytique « ping pong »:
Un seul métal, le cuivre, est impliqué dans la catalyse
Arg 141
Thr 56Glu 131
Thr 135
CuCu
10 Å
24 Å
4 Å
5Å
O2-
O2-
O2-
O2-O2
-
O2-
+
+
-
Monomère:IV: Zn-binding loopVII: Electrostatic loop (contient des résidus chargés dont l’Argessentielle à l’activité)IV et VII définissent un canal entre la surface et le site actif
Attraction électrostatique du substrat !!!
Zn
Pas accessible au solvant
Comment expliquer la constante de vitesse gigantesque?...
… Conséquences de l’attraction électrostatique…
Spécificité du substrat (anion de taille convenable)Forte accélération de l’accès au site actif: O2
•-
circule plus rapidement dans le canal qu’en solution (barrière de la diffusion). L’accès au site n’est pas le facteur limitant.Preuve indirecte: Diminution de la constante de vitesse lorsque la force ionique augmente
Mécanisme
CuII-SOD
CuI-SOD
O2•-
O2O2•-
H2O2H+
1ere étape
2eme étape
1ere étape: Réduction de la SOD
Réaction: Transfert d’électron sphère interne très rapide
Rem: Noter que l’histidine est complètement déprotonée
Coordination sur Cu2+
avant réaction
Rappel sur l’hémocyanine et la Galactose Oxydase qui fixent O2:Le cuivre catalytique est Cu(I), mais il est obligatoirement oxydé en Cu(II) pour pouvoir coordiner O2
2- ou O2•-
Espèce neutre donc non retenue
N N ZnCu
H2O
NH
H2N NH2O
O
N N ZnCu
NH
H2N NH2
OO
H2O2+ 2+
HN N ZnCu
NH
H2N NH2
OO
+
H+
Forme oxydée
Forme réduite
L’enzyme n’est jamais saturée en conditions standardsO2
•- + SOD = SOD-O2•- SOD réduite + O2
SOD-O2•- ne s’accumule jamais
Reduced (Cu+) yeast CuZnSOD Oxidized (Cu2+) human CuZnSOD
Conséquence de la réduction du cuivre: Structure des formes oxydées/réduites
6.2 ǺLe cuivre se déplace de 1 Ǻ suite àla protonation de l’His
Changement de géométrie:Cu(II) initial adopte sa géométrie préférentielle (pentacoordiné en bipy trigonale)Le Cu(I) adopte sa géométrie préférentielle qui est tricoordiné trigonale
Rem: Le Cu(I) est dans la même géométrie que dans l’hémocyanine (3 Hiscoordinées)
2eme étape: Oxydation de la SOD
Réaction: Transfert d’électron très rapide
Rappel sur l’hémocyanine et la Galactose Oxydase qui fixent O2:Le cuivre catalytique est Cu(I), mais il est obligatoirement oxydé en Cu(II) pour pouvoir coordiner O2
2- ou O2•-
Espèce neutre donc non retenue
Forme oxydée
Forme réduite
HN N ZnCu
NH
H2N NH2
OO
+
OO
N N ZnCu
NH
H2N NH2
+
OO
H
NH
H2N NH2
H+H2O
N N ZnCu
H2O2+
H
H
O2•- n’est pas fixé par Cu+, il est simplement maintenu près du Cu+ par
liaisons H avec l’Arg et l’His (pour qu’il y ait transfert d’électron)
Rôle du zinc ?
Important dans la 2eme étape i.e. réoxydationdu Cu(I), c’est-à-dire la réduction du superoxyde.Structural:1. Orienterait l’imidazole, qui coordine alors le Cu(II)2. Imidazole orienterait l’hydroperoxyde et l’empêcherait
de coordiner fortement (départ facilité de H2O2)
OO
NH
H2N NH2
N N ZnCu
H2O2+
H
H
III.2 Autres SOD: FeSOD et MnSOD
Fe: bactéries, chloroplastes, et peut être chez les eucaryotesMn: bactéries, mitochondriesRôle: Mn: protection de l’ADN spécifiquement, Fe plutôt protection du stress environnemental.Fe-SOD: moins sensible à l’inactivation par le peroxyde que les Mn-SODDimères (pro-) ou tétramères (eucaryotes)Monomère = 22 kDa pour Fe-SODQuelques organismes peuvent utiliser indifféremment le fer ou le manganèse dans une SOD: cambialistiques (cas particuliers)
Fe-SOD et Mn-SOD très proches d’un point de vue structuralChez E. Coli 40 % d’homologies de séquence, et structure tridimensionnelle similaire
(A) Dimer structure of FeSOD T.elongatus.(B) Monomeric subunit of FeSOD(C)Dimer structure of MnSOD Anabaena sp. (D)Monomeric MnSOD.
Structure du site actif des Fe-SOD et Mn-SOD
Coordination par 3 His et un Asp. 3eme ligand: OH- (dur) pour M3+, H2O (un peu moins dur) pour M2+
Sites actifs identiques (1ere sphère de coordination) que le métal soit Mn ou Fe
Site actif de laMn(III)SOD d’E.coli
Un métal par sous-unité, par opposition aux CuZnSOD
Une sous unité du dimère de FeSOD
Métal inaccessible directement au solvant (doit emprunter un tunnel)Site actif des Fe-SOD entouré d’une couche de résidus aromatiques: Protection de la protéine vis-à-vis des O2
•-
Réaction: Ar + O2•- Ar•+ + O2
2- (protons omis)Ar•+ par son caractère aromatique aura une durée de vie suffisante pour que sa réduction soit possible par un second équivalent de substrat : Ar•+ + O2
•- Ar + O2
Catalyse par les Fe ou Mn-SODForme oxydée
Forme réduite
Mécanisme de type« ping-pong »
Etape 1: Réduction à un électron du métal de la SODoxEtape 2: Oxydation à un électron du métal de la SODred
Catalyse par les Fe-SOD et Mn-SODTransfert de proton couplé au transfert d’électron, eau = base Liaisons H en vert
O
NH
N
NHN
MO
NHN
O
O
O
CON
HH
H H H
His
His MII
O
His
H H O
O
His
His MIII
O
His
H
His
His MII
O
His
H H O
OO O
O
O2-
H2O2
OH+
Catalyse par les Fe-SOD et Mn-SOD
NH
N
NHN
MO
NHN
O
O
O
CON
HH
H H H
- Fe-SOD inactivée à pH 9, soit pH ≈pKa(Tyr) et pKa(hydroxyde lié) par rupture des réseaux de liaison H et l’impossibilité de transférer des protons au site actif.
- Libération de H2O2 est limitante comme la protonation
Comment expliquer que Fe-SOD et Mn-SOD travaillent au même potentiel?
Couple M(III)/M(II) : Fe(H2O)6 = 0.77 VMn(H2O)6 = 1.51 V
Potentiel des SOD ≈ 0 – 0.3 V (Mn ou Fe!)Comment expliquer cette similitude ?
Site actif de laMn(III)SOD d’E.coli
Une sous unité du dimère de FeSOD
Sites actifs identiques
Comment expliquer que Fe-SOD et Mn-SOD travaillent au même potentiel?
Similitude liée à l’énergie associée à la réaction : M3+--OH- + e- + H+ M2+--OH2 et donc au transfert de proton couplé au transfert d’électron (réseau de liaisons H)
La mutation de ce résidu conservé dans la Fe-SOD augmente le potentiel (+600 mV pour le mutant Glu)
FeSOD (blanc),Fe(Mn)SOD (gris)[+ mutants Q69H-FeSOD (vert) et Q69E-FeSOD (jaune)]
Différence entre Fe et Mn? Conséquence du remplacement de Fe par Mn:
Malgré que l’environnement soit identique, Fe(Mn)SOD* est inactive. Idem lorsque Mnest remplacé par Fe dans les Mn-SOD
*Fe(Mn)SOD: Fe-SOD ou Fe est remplacé par Mn
Explication: Potentiels de travail
Potentiel idéal
FerManganese
Fe-SOD
Mn-SOD
Fe(Mn)-SOD
Mn(Fe)-SOD
Fe remplacé par Mn et vice-versa
Mn-SOD
Fe-SOD
Sauf pour les SOD cambialistiques
IV. Peroxydases et catalases
Protéines à fer héminiqueSite actif proche de l’hémoglobine ou des cytochromesRéaction primaire avec H2O2 dans les 2 casRéaction globale différente:
Peroxydase: AH2 + H2O2 A + 2 H2OCatalase: 2 H2O2 2 H2O + O2
Il existe des catalases-peroxydases chez les procaryotes et les eucaryotes inférieurs.
IV. 1 CatalaseRéaction: 2 H2O2 → O2 + 2H2O(dismutation de H2O2) kcat jusqu’à 40 000 000 M-1.s-1
Chez tous les pro- et eucaryotes aérobes, et aussi certains anaérobes facultatifs.Cette enzyme est utilisée pour l'identification des bactéries par mise en contact d’une colonie avec H2O2. L’effervescence (dégagement de O2) signale la présence d'une catalase.
catalase empoisonnée catalase active
Localisation chez l’humain:
Dans le cytosol, mitochondries, mais surtout dans des peroxysomes≈ taille lysosomes, entourés d’une membrane, contiennent une multitude d’enzymes impliquées dans l’oxydation d’acides gras (foie)
Thermodynamique de la réaction
Demi-réactions rédox:H2O2 H2O: Réduction à 2 électronsH2O2 O2: Oxydation à 2 électrons
E° (NHE) :O2 / O2
•- = -0.33 VO2
•- / H2O2 = 0.89 VO2 / H2O2 = 0.28 VH2O2 / H2O = 1.82 V
0.28 V
+1.82 VLa réaction bilan est
favorable, mais lente
O2 / H2O2
H2O2 / H2O
Réaction catalysée: H2O2 2 H2O + O2
Suffisamment stable pour être stocké
Structure généraleTétramères dont chaque monomère est α/βChaque monomère : ≈ 500 amino-acides et un hème (site actif)La plupart des catalases ont un hème b comme groupement prosthétique; Quelques catalases bactériennes et fongiques contiennent un hème dExistence d’un domaine de fixation de NAD(P)H à 20 Ǻde l’hème
b d
Accessibilité au site actif
hème
Canal de 20 Ǻ de long
Protéine en coupe
Structure du site actif (conservé)Globalement structure proche de celle de l’hémoglobine/myoglobine SAUF le résidu proximal
Micrococcus lysodeikticus catalase Hème dans l’hémoglobine/myoglobine
Poche hydrophobe pour gaz
Arg339
Ser99
Trop loin pour coordination
Distal
Proximal
Hydrophobe
Mécanisme catalytique
Ces 3 résidus sont essentiels (quand mutés perte totale d’activité): Impliqués dans la catalyse
Type « Ping Pong »:Ox-O
2 H2O2 2 H2O + O2
Alcools aliphatiques peuvent réagir aussi
Red
Mécanisme catalytique: Rappels sur la fixation du dioxygène par la myoglobine
Fe(II)(hs)
Fe(II) Fe(II) Fe(II)
Fe(III)-O2•-
(bs)
N
NH
N NFe
N
NHO
O
N
NH
N NFe
OO
N
HN
N NFe
N
HN
N
HN
N
HN
N NFe
O
O
N
HN
H2O
H2OO2
N
HN
N NFe
O
O
N
HN
H2OO2
δ ≈ 0.5 mm/s
Différences entre hémoglobine et catalase
Ox-O
Composé I
Forme active = Fe(III) hs
N Fe N
O
Catalase
N Fe N
N
N
H
O NHGlobine
Pas de δ- sur l’His: Stabilisation du Fer(III) moins importante: E(FeIII/II) ↑
Stabilisation du fer(III) par compensation de charge Domaine d’existence de Fe(III) augmente E(FeIII/II) ↓
Donc:
Etat d’oxydation du fer avant réaction:+II dans l’hémoglobine+III dans les peroxydases
Substrat:Dioxygène dans l’hémoglobineForme réduite du dioxygène (H2O2) dans les peroxydases
Degré d’oxydation spécificité pour O2 ou H2O2Pourquoi ? O2 doit être « activé » pour être utilisé (fixé). Cette activation est une réduction par le métal (qui est donc à bas degré d’oxydation). Une simple déprotonation (par l’Hisdistale) suffit à fixer H2O2 (sous forme HO2
-, O dur comme Fe(III)).
Réaction de type hémoglobine dans la Catalase ?
δ = 0.07 mm/s ΔEQ = 1.47 mm/sδ= 0.03 mm/s ΔEQ = 2.29 mm/s δ≈ 0.5 mm/s pour hémoglobine
Après addition de peracide
RCO3H + catalase RCO2H + Composé
?
Catalase
Composé I
Composé I
FeIV-OHFeIV=O diamagnétique
≈ Cyt P450 (rappel: thiolate proximal)
1ere étape: Mécanisme de formation du composé I
Composé I
Réduction de H2O2
Asn133 participe aussi à la fixation du substrat (non montré)
Modèle de la fixation du substrat
Structure RX d’un complexe cyt c peroxydase oxydé avec H2O2 (attention H2O2 ne peut pas réduire le composé I de la cyt c peroxydase ≠ catalase)
Réseau de liaisons H pour maintenir le substrat en place
Rôle = maintenir le substrat
2eme étape: Régénération de l’état initial
Oxydation de H2O2 par le composé I (FeIV-porph•)Conduit à du fer(III): Réduction directe à 2 électrons de l’hème
Composé I
Il semblerait que le NADPH empêche cet intermédiaire de se former. De plus la poche hydrophobe stabiliserait la porph• et limiterait l’accès au site (effet stérique)
Existence d’un domaine de fixation de NAD(P)H à 20 Ǻ de l’hèmeDans certaines conditions (substrat précurseur de radical de petite taille), absence de NADPH un composé II (FeIV-porph) peut être vu. En présence de NADPH il est non observé
IV.2 PeroxydasesNombreuses et fonctions pas très bien comprises, se trouvent dans pro- et eucaryotes (30 isoenzymes dans le radis noir)AH2 + H2O2 A + 2 H2ORéaction en 2 temps:
Réduction de H2O2 (comme la catalase)Oxydation d’un substrat AH2 (≠ catalase)
OHO
AH2 = gaïacol(incolore sous forme réduite)
Jaunissement des légumes en présence de H2O2 et gaïacol (coloré sous forme oxydée)
-O2C NH
HN
CO2-
O
SHO
NH3+
O O
OHHO
HO
HO
AH2 = glutathion
AH2 = acide ascorbique
Structure de la peroxydase de radis noir(la plus connue)
Hème protégé, accès solvant uniquement par un côté de l’hème
Structure du site actifL'hème et le substrat se trouvent dans une poche hydrophobe (sauf His distale/proximale).FeIII établit 6 liaisons de coordinence:
4 N d’une protoporphyrine IX (idem hémoglobine)1 N de l’His proximale1 OH2 (champ faible) Fer haut spin
Trp dans la poche autour de l’hèmeHis 42 (distale) située est trop loin pour établir la sixième coordinence.
Fortes homologies
Horseradish peroxydase HémoglobineAscorbate peroxydase
N Fe N
N
N
H
O O
Peroxydaseδ-Stabilisation du fer(III) par compensation de charge
N Fe N
N
N
H
O NH
Globine
Pas de δ- sur l’His: Stabilisation du Fer(III) moins importante: E(FeIII/II) ↑
Effet de seconde sphère de coordination = Comme pour les catalases E(FeIII/II) ↓ et la forme active est Fe(III)E(FeIII/II) = 0.170 V (hémoglobine)E(FeIII/II) = 0.046 V (myoglobine)E(FeIII/II) = -0.220 V (HRP)
Forme active: Fe(III) ou Fe(II)?
Mécanisme catalytique
H2O2 est attiré dans la zone polaire de la crevasse au voisinage de His 42, Arg 38 et du FeIII
His 42, Arg 38 et His 170 sont conservés dans les différentes peroxydasesLa mutation de His 42 diminue toujours l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction.La mutation de Arg 38 (polaire) par Leu (apolaire) diminue également l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et surtout pour le 2ème substrat.
Accès H2O2
Hème protégé, accès solvant uniquement par un côté de l’hème
Déplacement des molécules d'eau distalesFixation du peroxyde sur le centre métallique et déprotonation par H42La mutation de Asn 70 en Val diminue Vmax de 90%: Une liaison hydrogène ne peut s'établir entre Val 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivitéde His 42 et changerait sa position dans l'espace.
2 molécules d’eau
N
N
H
H OOH
Fe3+
O
NH2
His42
Asn70
NH
N
H
OOH
Fe3+
O
NH2
His42
Asn70
H
1ere étape commune aux catalases et peroxydases
Réaction: formation d'eau et d'un hème radical FeIV=O (métal bas-spin)FeIV=O très oxydant: E(composéI/composéII) = 0.90 V, E(composéII/composéIII) = 0.87 VRem: Peroxydase à Fer: Coupure hétérolytiqueFe2+ en solution (Fenton): Coupure homolytique de la liaison O-O. Génération de radicaux OH• très toxiques
The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution, G. I. Berglund et al., Nature 417, pp. 463-468 (2002)
N
N
H
OFe
O
NH2
His42
Asn70
4+
HOH
HNNH2
N HArg38
NH
N
H
O
Fe3+
O
NH2
His42
Asn70
H OH
Le 2ème substrat intervient. Chez la Glutathion peroxydase il s’agit du glutathion, chez l’ascorbateperoxydase l’ascorbate, la peroxydase de radis noir une multitude de substrats … etc …H2O2 peut aller jusqu’au site actif, mais pas les substrats organiquesCes substrats restent à l’extérieur (oxydation sphère externe)
N
N
H
OFe
O
NH2
His42
Asn70
4+
HOH
HNNH2
N HArg38
OHO
Produit de réaction avec le 2eme substrat:
-O2C NH
HN
CO2-
O
SHO
NH3+
GSH (glutathion)
Substrat Produit
-O2C NH
HN
CO2-
O
SO
NH3+
CO2-H
NNH
-O2C
O
SO
NH3+
GSSG (glutathion oxydé)La Glutathion Réductase permet de repasser à GSH
Glutathion Peroxydase:2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O2 GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O
O O
OHHO
HO
HO
Acide ascorbique
Ascorbate Peroxydase:2Asc + H2O2 → 2Asc• + 2 H2O
O O
OHHO
HO
HO
Asc•
Mécanisme de réduction: 2 électrons transférés simultanément (catalase) ou par étapes?
-O2C NH
HN
CO2-
O
SHO
NH3+
FeIVO
-O2C NH
HN
CO2-
O
SO
NH3+
FeIVO
-O2C NH
HN
CO2-
O
SHO
NH3+
FeIVO
-O2C NH
HN
CO2-
O
SO
NH3+
FeIIIO
+ H2O
-O2C NH
HN
CO2-
O
SO
NH3+
CO2-H
NNH
-O2C
O
SO
NH3+
Ex: Glutathion peroxydase
Ex: Asc peroxydase
Intermédiaire porphyrine FeIV=O non radicalaire
Mécanisme de réduction (HRP)
N
N
H
OFe
O
NH2
His42
Asn70
4+
HOH2N
H2N
N HArg38
O
OO
OH
H
O
OO
O
HO
OO
O
H
O
OO
O
+ H2O
Etat initial
N
N
H
OFe
O
NH2
His42
Asn70
4+
HOH
H2NNH2
N HArg38
HO
OO
O
N
N
H
OFe
O
NH2
His42
Asn70
4+
HOH2N
H2N
N HArg38
O
OO
OH
H
Rôle de l’Arg: Ascorbate peroxydase
O O
OHHO
HO
HO
Modélisation du site de fixation du substrat (ascorbateperoxydase) et mécanisme catalytique proposé (horseradishperoxydase): Remarquer le rôle primordial de l’arginine dans les 2 cas malgré que le substrat soit différent
N
N
H
OFe
O
NH2
His42
Asn70
4+
HOH2N
H2N
N HArg38
O
OO
OH
H
Un tryptophane (W191) est près du centre héminique
Cyt c peroxydaseUn cas particulier
Réaction:2 Cyt c red + H2O2 → 2 Cyt c ox + 2 H2OTransfert d’électrons à l’hème ferreux du Cyt c. Dans la chaîne respiratoire, mais transfert aussi des électrons au Cyt b5, sulfite oxydase (animaux), cyt c peroxydase (levures)…
e-
Ascorbate peroxydaseCyt c peroxydase
Le radical est généré non pas sur la porphyrine mais sur ce Tryptophane (W191) !!!
Cyt c peroxydase
H2O2
2 H2O
Raison ? Il semblerait que l’équivalent radical Trp• soit plus près de la surface en contact avec le Cyt c = Transfert d’électron plus rapide au cytochrome soluble.
Cyt c peroxydase
Respiration