Stress oxydant

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Stress oxydant I. Réactivité de l’oxygène II. Oxygène en biologie et stress oxydatif III. Superoxyde Dismutase IV. Catalase V. Peroxydase

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Page 1: Stress oxydant

Stress oxydantI. Réactivité de l’oxygèneII. Oxygène en biologie et stress

oxydatifIII. Superoxyde DismutaseIV. CatalaseV. Peroxydase

Page 2: Stress oxydant

I.1 Diagramme d’OM de O2 et de ses formes réduites

x

y

z

x

y

z

px, py

pz

Où placer les 2 autres électrons?

Liaison O=O selon cet axe

I. Réactivité de l’oxygène

Page 3: Stress oxydant

O2 = diradical

Forme stable de OForme stable de O22

OO22 stable est un stable est un diradicaldiradical

Page 4: Stress oxydant

Autres formes de O2

3O2 triplet 1O2 singulet (réactif)

Formes les plus courantes

O2 triplet

O2 singulet23 kcal/mol

E

Notation: 2S+1O2 où 2S+1 est la multiplicité de spin, et S le nombre de spinTriplet: 2 spins parallèles S = ½ + ½ = 1Singulet: 2 spins antiparallèles S = ½ - ½ = 0

Page 5: Stress oxydant

Formes réduites de O2

O2 O2•- O2

2-+ 1 e- + 1 e-

E° (NHE) à pH 7, pO2 = 1:O2 / O2

•- = -0.33 VO2

•- / H2O2 = 0.89 VO2 / H2O2 = 0.28 VO2 / H2O = 1.23 VH2O2 / H2O = 1.82 V

OH• (+ OH-)+ 1 e-

Radicaux

Page 6: Stress oxydant

I.2 Réactivité de l’oxygène triplet (diradical)

O2 triplet, or la plupart des réactifs sont singulets (non radicalaires): Réaction concertée généralement lente (Restriction de spin, non détaillé)

3O2 (↑↑) + 2R• (↓) → 2RO2• (↑)

Exemple en bio: Peroxydation de lipides

Rapide (substrat radicalaire)radical radical radical

Pour plus de commodité on ne représente plus que le doublet le plus haut en énergie ou l’électron célibataire dans les produits

O

OH

O

OHOO

O2

Pour une réaction rapide: triplet réagissant avec radicaux.

Page 7: Stress oxydant

3O2 (↑↑) + 1R (↑↓) 1RO2 (↑↓)triplet singulet

Coût énergétique pour le retournement du spin: 25 kcal/mol; De plus collisions intermoléculaire beaucoup plus rapides que spin-flip. NON

3O2 (↑↑) + 1R (↑↓) 3RO2 (↑↑)triplet singulet

Etat triplet 3RO2 = état excitétypiquement 40-70 kcal/mol au dessus de l’état fondamental 1RO2. Energie d’activation nécessaire bien trop importante. NON

3RO2 (↑↑) 1RO2 (↑↓) + énergie

3O2 (↑↑) + 3R (↓↓) 1RO2 (↑↑)triplet triplet

1R (↑↓) 3R (↑↑) Energie d’activation nécessaire bien trop importante (Cf cas précédent).

Produit non radicalaire

Produit radicalaire

Possibilités de réaction de 3O2 avec 1R: directe

Page 8: Stress oxydant

3O2 (↑↑) + 1R (↑↓) 2O2•- (↑) + 2R•+ (↑)

2O2•- (↑) + 2R•+ (↑) 2O2

•- (↑) + 2R•+ (↓) (diffusion)

2O2•- (↑) + 2R•+ (↓) 1RO2 (↑↓) (recombinaison)

N

N

NH

HN

RO

OH

+ O2N

N

NH

NR

O

OHH

+ O2

N

N

NH

HN

RO

OHOOH

N

N

NH

NR

O

O

+ H2O2

Exemple avec des flavines, mais très rare (nécessite un réducteur fort pour O2)

Réduction de l’oxygène

Page 9: Stress oxydant

Rem: Autoxydation radicalaire

Initiation:1X2 (↑↓) → 2X• (↓)2X• (↓) + 1RH (↑↓) → 1RH (↑↓) + 2R• (↓)

Propagation:2R• (↓) + O2 (↑↑) → 2ROO• (↑)2ROO• (↑) + 1RH (↑↓) → 1ROOH (↑↓) + 2R •(↓)

Terminaison:2R• (↓) + 2ROO• (↑) → 1ROOR (↑↓)

Page 10: Stress oxydant

2O2•- (↑) + 1X (↑↓) → 1O2

2- (↑↓) + 2X•+ (↑)

2O2 •- (↑) + 2X•+ (↓) → 1XO2 (↑↓)

2HO• (↑) + 1H-X (↑↓) → H2O + 2X•+ (↑)

Formes trFormes trèès s rrééactivesactives

OH

OH

+ O2-

O

OH

+ HO2- k = 1.7 x 107 M-1 s-1

(facilitée par transfert de proton couplé au transfert d’électron)

I.3 Réactivité des formes réduites de l’oxygène triplet

1X (↑↓) + 2O2•- (↑): Exemple de l’oxydation d’hydroquinones

Page 11: Stress oxydant

2HO• (↑) + R-H (↑↓) → H2O + R• (↑)

a) Radical OH•

O

OH H

R ou OH

O

OH

O

OH

O

OHOO

O

OHOHO

O2

H

1ere étape de la peroxydation de lipides

Page 12: Stress oxydant

Mais aussi oxydation de l’extrémité N-terminale des protéines

Attaque de l’ADN

Page 13: Stress oxydant

b) Peroxyde d’hydrogène H2O2 (↑↓)

Cinétique lenteEn présence de traces de métal rédox-actif (Cu, Fe) les réactions de H2O2 sonttrès rapides:

Fe2+ + H2O2 + H+ → Fe3+ + H2O + HO•

Fe3+ + 1/2 H2O2 → Fe2+ + 1/2 O2 + H+

______________________________________3/2 H2O2 → H2O + 1/2 O2 + HO•

EspEspèèce activece active

Page 14: Stress oxydant

I.4 Réactivité de O2 singulet

Durée de vie < 1 μsec en solution aqueuse. Peu spécifique. Obtenu par irradiation ou chimiquement:

Supposé être le principal agent responsable de l'effet néfaste du rayonnement UVA:

R

R

OO

1O2

R

R

1O2

3O2

NH

NN

N

O

NH2

NH

NN

HN

O

NH2

O

1O2

ADN ADN

Page 15: Stress oxydant

Exemple de réaction de O2 singuletgénéré par photoxydation

Utilisation en biologie: Photo-décontamination des produits sanguins, traitement photothérapique de cancers. En chimie:

Page 16: Stress oxydant

• Air = 21% de dioxygène.

• Dioxygène nécessaire aux animaux, plantes et bactériesaérobes pour la production d’énergie, métabolisme, détoxification ...

II. Oxygène en biologie et stress oxydatif

Glycolyse en conditions anaérobies:Glucose + 2ADP + 2Pi Lactate + 2ATP + 2H2O

Glycolyse aérobie: O2 est l’accepteur final d’électron:Glucose + 6O2 + 36ADP + 36Pi 6CO2 + 36ATP + 6H2ORemarquez la différence d’efficacité (potentiel O2 grand)

Energie

Energie

Page 17: Stress oxydant

• Air = 21% de dioxygène.

• Dioxygène nécessaire aux animaux, plantes et bactériesaérobes pour la production d’énergie, métabolisme, détoxification ...

• Paradoxe: Dioxygène est aussitrès toxique à toutes les formes de vie.

• La vie existe car les organismesdisposent de systèmes de défense(anti-oxydants) ou de réparationdes dégâts oxydatifs.

II. Oxygène en biologie et stress oxydatif

Dommages

Défences

Page 18: Stress oxydant

Radicaux libres produits naturellement en faible quantité et utiles aux organismes à dose raisonnable.Dans des conditions normales la production est maîtrisée et adaptive

Page 19: Stress oxydant

II.1 Radicaux primaires et secondaires

Primaires: Espèces à proprement parler radicalaires (issues de la réduction du dioxygène triplet ou de l’oxygène singulet)Secondaires: Radicaux formés par réaction des radicaux primaires avec des molécules biologiques.Précurseurs: Espèces non radicalaires issues de la réduction du dioxygène (type H2O2)Toutes ces espèces sont appelées Espèces Réactives de l’Oxygène (ROS en anglais)

Page 20: Stress oxydant

Radicaux primaires et précurseurs

Page 21: Stress oxydant

Espèces réactives de l’oxygène

Espèces très réactives

ROO•

NO•

O2•-

1O2RO•

OH•

H2O2RO2H

ONO2•

Page 22: Stress oxydant

Radicaux primaires et précurseurs

Page 23: Stress oxydant

II.2 Production naturelle de radicaux

O2

H2OPyruvate

O2•-

Electrons circulants sont très réducteurs2-5% sont perdus de la chaîne et vont

réduire O2 en O2•- très toxique

+ énergie

O2 Fonctionnement normal

Fonctionnement anormal

Page 24: Stress oxydant

Lutte anti-infectieuse

Phagocytose de 2 globules rouges par un macrophage

Macrophage activé: Production d’un mélange très toxique de superoxyde O2

•-, OH•, H2O2 …Implique une réduction de O2 par la NADPH oxydase pour produire O2

•-, puis action d’une superoxyde dimutase pour produire H2O2.Résultat: Lyse des cellules phagocytées.

Page 25: Stress oxydant

OH• peut résulter d’une mauvaise régulation de la concentration en métaux cellulaires

Mn+ = Cu+, Fe2+ (milieu cellulaire est plutôt réducteur)

Page 26: Stress oxydant

Autres sources (non naturelles)

Rayonnement ionisant

Rayonnement UV

Pollution

Cigarette1015 radicaux (NO• et NO2

•) inhalés à chaque aspiration

Page 27: Stress oxydant

Protection DommagesROSdefence

A l’état de santé : Equilibre entre les radicaux libres et/ou espèces réactives de l’oxygène (toxiques) et nos défences. Tout

déséquilibre entraîne un état de stress oxydatif (agression).

II.3 stress oxydatif

Le stress oxydatif est reconnu aujourd'hui comme l'explication essentielle des phénomènes du vieillissement

Page 28: Stress oxydant

Le stress oxydatif est un indicateur du réel état de santé.

Définit un état intermédiaire, où la personne ne présentant pourtant pas encore de maladie avérée, n'est plus tout à fait en bonne santé, en quelque sorte un 'état de rupture plus ou moins passager de l'état de santé'.Cette période liée à un stress, à des contraintes nouvelles ou anormales, à un déséquilibre momentané entre agressions et défenses, expose l'individu à une agression oxydative importante, synonyme à terme de maladies, et quoiqu'il en soit d'un vieillissement accéléré.

Page 29: Stress oxydant

II.4 Dégâts aux cellules

Attaque par les espèces réactive de l’oxygène de tous les constituants cellulaires

Page 30: Stress oxydant

a) Lipides

Page 31: Stress oxydant

b) ADN

N

N NH

N

NH2

HN

N NH

N

O

H2N

HN

NH

O

O

HN

N NH

NO

H2N

HN

N NH

NO

H2N

Page 32: Stress oxydant

c) Acides aminés

Page 33: Stress oxydant

Viellissement

Athéroscléroses

CHD

Cancer

Diabètes

Maladies Respiratoires

Pb rénaux

Cataracte

Maladies de la peau

Obesité

Maladies inflammatoires

Infections

Dysfonctions hormonales

Conséquences à long terme (maladies)

Page 34: Stress oxydant

Gluthation

Flavonoides,Carotenoides

Ubiquinol

Vitamines (C, E)

Induction de la synthèsede protéines de

stockage de métaux

Enzymes du stress oxydant

Coopération entre différents systèmes

II.5 Défenses contre le stress oxydatif

OH

OHO

O

UbiquinolO

HO

Vitamine E

Antioxydants

Page 35: Stress oxydant

Spécificités des systèmes

Page 36: Stress oxydant

a) Antioxydants

E300, E301

α-Tocophérol (haut)Acide ascorbique (bas)

Vitamine C

Même molécule !!!

E307

=

=

Vitamine E

Page 37: Stress oxydant

Propriétés communes aux antioxydants

-O2C NH

HN

CO2-

O

SHO

NH3+ -O2C N

H

HN

CO2-

O

SO

NH3+

CO2-H

NNH

-O2C

O

SO

NH3+

O O

OHHO

HO

HO O O

OHHO

HO

HO

Formes oxydées à 1 électrons stables

Dimère non radicalaire (donc stable)

Radical stabilisé (délocalisé)

Glutathion

Acide ascorbique

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Vit E oxydée

-e-

-e-

Page 38: Stress oxydant

LH: Lipid molecule, LOOH: Lipid peroxide, LOO+: Lipid Peroxide radical, a-Toc-OH: α-Tocopherol, a-Toc-O+: α-Tocopherol radical, GSH: Glutathione, Vitamin C+: Vitamin C radical, GS+: Glutathione radical, GSSG: Oxidized glutathione, NADPH: Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+: Oxidizednicotinamide adenine dinucleotide phosphate.

Vitamine E, appelée aussi α-Tocopherol, -bloque la peroxydation des lipides.

Utilisée pour empêcher le rancissement du beurre (E 307)

Vit E Vit C

Ici Vit C régénère la Vit E, mais peut aussi régénérer

le glutathion ou réagir directement avec le

radical

Ex de cascade de réactions:

O

HO

O

O

+ R-RH

Page 39: Stress oxydant

b) Induction de la synthèse de protéines de stockage de métaux

Induction de la synthèse de:Ferritine, transferrine pour le ferCerruloplasmine, albumine pour le cuivre

Mn+ = Cu+, Fe2+ (milieu cellulaire est plutôt réducteur)

OH• peut résulter d’une mauvaise régulation de la concentration en métaux cellulaires:

Page 40: Stress oxydant

c) Systèmes enzymatiques : Catalase, peroxydase et Superoxyde Dismutase

Page 41: Stress oxydant

III. Superoxyde Dismutase

2O+ 2O2H++ 2 H-•2O2

O2•- + 1 e- + 2 H+ H2O2

O2•- O2 + 1 e-

En fait cette équation est une équation bilan dont les demi-réactions rédox sont:

-0.33 V

+0.89 V

E à pH physiologique

La réaction de dismutation est donc thermodynamiquement favorable !

Conditions requises pour la catalyse: Avoir une espèce (catalyseur) dont le potentiel rédox est compris entre +0.89 et -0.33 V (baisse du ΔG° des réactions élémentaires)

Dismutation du superoxyde

Rem: E°(Cu2+/Cu+) aqueux = 0.34 V et E°(Fe3+/Fe2+) = 0.77 V Ces deux métaux libres catalysent également la dismutation du superoxyde (moins bien que la SOD)

Page 42: Stress oxydant

Différentes classes de SOD:

CuZn-SOD (SOD1) dans le cytoplasme, noyauMn-SOD (SOD2) dans les mitochondriesCuZn-SOD (SOD3) extracellulaire (capte le superoxyde libéré par les cellules)

Chez les bactéries: Mn-SOD et/ou Fe-SOD (structures assez similaires)

Les CuZn-SOD sont les plus abondantes chez l’être humain

La structure des SOD varie selon leur classe

Page 43: Stress oxydant

pH

Cal

cula

ted

rate

con

stan

t, M

-1se

c-1

CuZnSOD

MnSOD

Sans enzyme

kcat pour CuZn-SOD = 109 M-1.s-1!! La plus grande constante de vitesse du monde vivant. La réaction n’est limitée que par la diffusion du superoxyde

Page 44: Stress oxydant

III.1 CuZn-SOD

Dimere de MW = 2 x 16 kDa151 aa/monomère (bovin), 153 aa/monomère (humain)Chaque monomère contient 1 Cu + 1 Zn

Cu et Zn

Page 45: Stress oxydant

CuZn-SOD

Hétérobimétallique: Rôle de chacun des métaux ? Réaction catalysée de type rédox or seul Cu peut exister à 2 états rédox dans la fenêtre de potentiel accessible aux systèmes biologiques: Le cuivre est impliqué dans la réaction.Forme active: Cu2+ ou Cu+ ?

O2•- / H2O2

O2•- / O2 -0.33 V

+0.89 V

E°CuII/CuI = 0.065 vs AgCl/Ag dans SOD

Page 46: Stress oxydant

En fait les 2 formes Cu2+ et Cu+ sont actives:

O2•- / H2O2

O2•- / O2 -0.33 V

+0.89 VCuII-SOD

CuI-SOD

O2•-

O2O2•-

H2O2

E°CuII/CuI = 0.065 vs AgCl/Ag dans SOD

H+

Cu+ + O2- + 2 H+ Cu2+ + H2O2

Cu2+ + O2- Cu+ + O2

2 O2- + 2H+ O2 + H2O2

Mécanisme catalytique « ping pong »:

Un seul métal, le cuivre, est impliqué dans la catalyse

Page 47: Stress oxydant

Arg 141

Thr 56Glu 131

Thr 135

CuCu

10 Å

24 Å

4 Å

O2-

O2-

O2-

O2-O2

-

O2-

+

+

-

Monomère:IV: Zn-binding loopVII: Electrostatic loop (contient des résidus chargés dont l’Argessentielle à l’activité)IV et VII définissent un canal entre la surface et le site actif

Attraction électrostatique du substrat !!!

Zn

Pas accessible au solvant

Comment expliquer la constante de vitesse gigantesque?...

Page 48: Stress oxydant

… Conséquences de l’attraction électrostatique…

Spécificité du substrat (anion de taille convenable)Forte accélération de l’accès au site actif: O2

•-

circule plus rapidement dans le canal qu’en solution (barrière de la diffusion). L’accès au site n’est pas le facteur limitant.Preuve indirecte: Diminution de la constante de vitesse lorsque la force ionique augmente

Page 49: Stress oxydant

Mécanisme

CuII-SOD

CuI-SOD

O2•-

O2O2•-

H2O2H+

1ere étape

2eme étape

Page 50: Stress oxydant

1ere étape: Réduction de la SOD

Réaction: Transfert d’électron sphère interne très rapide

Rem: Noter que l’histidine est complètement déprotonée

Coordination sur Cu2+

avant réaction

Rappel sur l’hémocyanine et la Galactose Oxydase qui fixent O2:Le cuivre catalytique est Cu(I), mais il est obligatoirement oxydé en Cu(II) pour pouvoir coordiner O2

2- ou O2•-

Espèce neutre donc non retenue

N N ZnCu

H2O

NH

H2N NH2O

O

N N ZnCu

NH

H2N NH2

OO

H2O2+ 2+

HN N ZnCu

NH

H2N NH2

OO

+

H+

Forme oxydée

Forme réduite

L’enzyme n’est jamais saturée en conditions standardsO2

•- + SOD = SOD-O2•- SOD réduite + O2

SOD-O2•- ne s’accumule jamais

Page 51: Stress oxydant

Reduced (Cu+) yeast CuZnSOD Oxidized (Cu2+) human CuZnSOD

Conséquence de la réduction du cuivre: Structure des formes oxydées/réduites

6.2 ǺLe cuivre se déplace de 1 Ǻ suite àla protonation de l’His

Changement de géométrie:Cu(II) initial adopte sa géométrie préférentielle (pentacoordiné en bipy trigonale)Le Cu(I) adopte sa géométrie préférentielle qui est tricoordiné trigonale

Rem: Le Cu(I) est dans la même géométrie que dans l’hémocyanine (3 Hiscoordinées)

Page 52: Stress oxydant

2eme étape: Oxydation de la SOD

Réaction: Transfert d’électron très rapide

Rappel sur l’hémocyanine et la Galactose Oxydase qui fixent O2:Le cuivre catalytique est Cu(I), mais il est obligatoirement oxydé en Cu(II) pour pouvoir coordiner O2

2- ou O2•-

Espèce neutre donc non retenue

Forme oxydée

Forme réduite

HN N ZnCu

NH

H2N NH2

OO

+

OO

N N ZnCu

NH

H2N NH2

+

OO

H

NH

H2N NH2

H+H2O

N N ZnCu

H2O2+

H

H

O2•- n’est pas fixé par Cu+, il est simplement maintenu près du Cu+ par

liaisons H avec l’Arg et l’His (pour qu’il y ait transfert d’électron)

Page 53: Stress oxydant

Rôle du zinc ?

Important dans la 2eme étape i.e. réoxydationdu Cu(I), c’est-à-dire la réduction du superoxyde.Structural:1. Orienterait l’imidazole, qui coordine alors le Cu(II)2. Imidazole orienterait l’hydroperoxyde et l’empêcherait

de coordiner fortement (départ facilité de H2O2)

OO

NH

H2N NH2

N N ZnCu

H2O2+

H

H

Page 54: Stress oxydant

III.2 Autres SOD: FeSOD et MnSOD

Fe: bactéries, chloroplastes, et peut être chez les eucaryotesMn: bactéries, mitochondriesRôle: Mn: protection de l’ADN spécifiquement, Fe plutôt protection du stress environnemental.Fe-SOD: moins sensible à l’inactivation par le peroxyde que les Mn-SODDimères (pro-) ou tétramères (eucaryotes)Monomère = 22 kDa pour Fe-SODQuelques organismes peuvent utiliser indifféremment le fer ou le manganèse dans une SOD: cambialistiques (cas particuliers)

Fe-SOD et Mn-SOD très proches d’un point de vue structuralChez E. Coli 40 % d’homologies de séquence, et structure tridimensionnelle similaire

Page 55: Stress oxydant

(A) Dimer structure of FeSOD T.elongatus.(B) Monomeric subunit of FeSOD(C)Dimer structure of MnSOD Anabaena sp. (D)Monomeric MnSOD.

Page 56: Stress oxydant

Structure du site actif des Fe-SOD et Mn-SOD

Coordination par 3 His et un Asp. 3eme ligand: OH- (dur) pour M3+, H2O (un peu moins dur) pour M2+

Sites actifs identiques (1ere sphère de coordination) que le métal soit Mn ou Fe

Site actif de laMn(III)SOD d’E.coli

Un métal par sous-unité, par opposition aux CuZnSOD

Une sous unité du dimère de FeSOD

Page 57: Stress oxydant

Métal inaccessible directement au solvant (doit emprunter un tunnel)Site actif des Fe-SOD entouré d’une couche de résidus aromatiques: Protection de la protéine vis-à-vis des O2

•-

Réaction: Ar + O2•- Ar•+ + O2

2- (protons omis)Ar•+ par son caractère aromatique aura une durée de vie suffisante pour que sa réduction soit possible par un second équivalent de substrat : Ar•+ + O2

•- Ar + O2

Page 58: Stress oxydant

Catalyse par les Fe ou Mn-SODForme oxydée

Forme réduite

Mécanisme de type« ping-pong »

Etape 1: Réduction à un électron du métal de la SODoxEtape 2: Oxydation à un électron du métal de la SODred

Page 59: Stress oxydant

Catalyse par les Fe-SOD et Mn-SODTransfert de proton couplé au transfert d’électron, eau = base Liaisons H en vert

O

NH

N

NHN

MO

NHN

O

O

O

CON

HH

H H H

His

His MII

O

His

H H O

O

His

His MIII

O

His

H

His

His MII

O

His

H H O

OO O

O

O2-

H2O2

OH+

Page 60: Stress oxydant

Catalyse par les Fe-SOD et Mn-SOD

NH

N

NHN

MO

NHN

O

O

O

CON

HH

H H H

- Fe-SOD inactivée à pH 9, soit pH ≈pKa(Tyr) et pKa(hydroxyde lié) par rupture des réseaux de liaison H et l’impossibilité de transférer des protons au site actif.

- Libération de H2O2 est limitante comme la protonation

Page 61: Stress oxydant

Comment expliquer que Fe-SOD et Mn-SOD travaillent au même potentiel?

Couple M(III)/M(II) : Fe(H2O)6 = 0.77 VMn(H2O)6 = 1.51 V

Potentiel des SOD ≈ 0 – 0.3 V (Mn ou Fe!)Comment expliquer cette similitude ?

Site actif de laMn(III)SOD d’E.coli

Une sous unité du dimère de FeSOD

Sites actifs identiques

Page 62: Stress oxydant

Comment expliquer que Fe-SOD et Mn-SOD travaillent au même potentiel?

Similitude liée à l’énergie associée à la réaction : M3+--OH- + e- + H+ M2+--OH2 et donc au transfert de proton couplé au transfert d’électron (réseau de liaisons H)

La mutation de ce résidu conservé dans la Fe-SOD augmente le potentiel (+600 mV pour le mutant Glu)

Page 63: Stress oxydant

FeSOD (blanc),Fe(Mn)SOD (gris)[+ mutants Q69H-FeSOD (vert) et Q69E-FeSOD (jaune)]

Différence entre Fe et Mn? Conséquence du remplacement de Fe par Mn:

Malgré que l’environnement soit identique, Fe(Mn)SOD* est inactive. Idem lorsque Mnest remplacé par Fe dans les Mn-SOD

*Fe(Mn)SOD: Fe-SOD ou Fe est remplacé par Mn

Page 64: Stress oxydant

Explication: Potentiels de travail

Potentiel idéal

FerManganese

Fe-SOD

Mn-SOD

Fe(Mn)-SOD

Mn(Fe)-SOD

Fe remplacé par Mn et vice-versa

Mn-SOD

Fe-SOD

Sauf pour les SOD cambialistiques

Page 65: Stress oxydant

IV. Peroxydases et catalases

Protéines à fer héminiqueSite actif proche de l’hémoglobine ou des cytochromesRéaction primaire avec H2O2 dans les 2 casRéaction globale différente:

Peroxydase: AH2 + H2O2 A + 2 H2OCatalase: 2 H2O2 2 H2O + O2

Il existe des catalases-peroxydases chez les procaryotes et les eucaryotes inférieurs.

Page 66: Stress oxydant

IV. 1 CatalaseRéaction: 2 H2O2 → O2 + 2H2O(dismutation de H2O2) kcat jusqu’à 40 000 000 M-1.s-1

Chez tous les pro- et eucaryotes aérobes, et aussi certains anaérobes facultatifs.Cette enzyme est utilisée pour l'identification des bactéries par mise en contact d’une colonie avec H2O2. L’effervescence (dégagement de O2) signale la présence d'une catalase.

catalase empoisonnée catalase active

Page 67: Stress oxydant

Localisation chez l’humain:

Dans le cytosol, mitochondries, mais surtout dans des peroxysomes≈ taille lysosomes, entourés d’une membrane, contiennent une multitude d’enzymes impliquées dans l’oxydation d’acides gras (foie)

Page 68: Stress oxydant

Thermodynamique de la réaction

Demi-réactions rédox:H2O2 H2O: Réduction à 2 électronsH2O2 O2: Oxydation à 2 électrons

E° (NHE) :O2 / O2

•- = -0.33 VO2

•- / H2O2 = 0.89 VO2 / H2O2 = 0.28 VH2O2 / H2O = 1.82 V

0.28 V

+1.82 VLa réaction bilan est

favorable, mais lente

O2 / H2O2

H2O2 / H2O

Réaction catalysée: H2O2 2 H2O + O2

Suffisamment stable pour être stocké

Page 69: Stress oxydant

Structure généraleTétramères dont chaque monomère est α/βChaque monomère : ≈ 500 amino-acides et un hème (site actif)La plupart des catalases ont un hème b comme groupement prosthétique; Quelques catalases bactériennes et fongiques contiennent un hème dExistence d’un domaine de fixation de NAD(P)H à 20 Ǻde l’hème

b d

Page 70: Stress oxydant

Accessibilité au site actif

hème

Canal de 20 Ǻ de long

Protéine en coupe

Page 71: Stress oxydant

Structure du site actif (conservé)Globalement structure proche de celle de l’hémoglobine/myoglobine SAUF le résidu proximal

Micrococcus lysodeikticus catalase Hème dans l’hémoglobine/myoglobine

Poche hydrophobe pour gaz

Arg339

Ser99

Trop loin pour coordination

Distal

Proximal

Hydrophobe

Page 72: Stress oxydant

Mécanisme catalytique

Ces 3 résidus sont essentiels (quand mutés perte totale d’activité): Impliqués dans la catalyse

Type « Ping Pong »:Ox-O

2 H2O2 2 H2O + O2

Alcools aliphatiques peuvent réagir aussi

Red

Page 73: Stress oxydant

Mécanisme catalytique: Rappels sur la fixation du dioxygène par la myoglobine

Fe(II)(hs)

Fe(II) Fe(II) Fe(II)

Fe(III)-O2•-

(bs)

N

NH

N NFe

N

NHO

O

N

NH

N NFe

OO

N

HN

N NFe

N

HN

N

HN

N

HN

N NFe

O

O

N

HN

H2O

H2OO2

N

HN

N NFe

O

O

N

HN

H2OO2

δ ≈ 0.5 mm/s

Page 74: Stress oxydant

Différences entre hémoglobine et catalase

Ox-O

Composé I

Forme active = Fe(III) hs

N Fe N

O

Catalase

N Fe N

N

N

H

O NHGlobine

Pas de δ- sur l’His: Stabilisation du Fer(III) moins importante: E(FeIII/II) ↑

Stabilisation du fer(III) par compensation de charge Domaine d’existence de Fe(III) augmente E(FeIII/II) ↓

Page 75: Stress oxydant

Donc:

Etat d’oxydation du fer avant réaction:+II dans l’hémoglobine+III dans les peroxydases

Substrat:Dioxygène dans l’hémoglobineForme réduite du dioxygène (H2O2) dans les peroxydases

Degré d’oxydation spécificité pour O2 ou H2O2Pourquoi ? O2 doit être « activé » pour être utilisé (fixé). Cette activation est une réduction par le métal (qui est donc à bas degré d’oxydation). Une simple déprotonation (par l’Hisdistale) suffit à fixer H2O2 (sous forme HO2

-, O dur comme Fe(III)).

Page 76: Stress oxydant

Réaction de type hémoglobine dans la Catalase ?

δ = 0.07 mm/s ΔEQ = 1.47 mm/sδ= 0.03 mm/s ΔEQ = 2.29 mm/s δ≈ 0.5 mm/s pour hémoglobine

Après addition de peracide

RCO3H + catalase RCO2H + Composé

?

Catalase

Composé I

Composé I

FeIV-OHFeIV=O diamagnétique

≈ Cyt P450 (rappel: thiolate proximal)

Page 77: Stress oxydant

1ere étape: Mécanisme de formation du composé I

Composé I

Réduction de H2O2

Asn133 participe aussi à la fixation du substrat (non montré)

Page 78: Stress oxydant

Modèle de la fixation du substrat

Structure RX d’un complexe cyt c peroxydase oxydé avec H2O2 (attention H2O2 ne peut pas réduire le composé I de la cyt c peroxydase ≠ catalase)

Réseau de liaisons H pour maintenir le substrat en place

Rôle = maintenir le substrat

Page 79: Stress oxydant

2eme étape: Régénération de l’état initial

Oxydation de H2O2 par le composé I (FeIV-porph•)Conduit à du fer(III): Réduction directe à 2 électrons de l’hème

Composé I

Page 80: Stress oxydant

Il semblerait que le NADPH empêche cet intermédiaire de se former. De plus la poche hydrophobe stabiliserait la porph• et limiterait l’accès au site (effet stérique)

Existence d’un domaine de fixation de NAD(P)H à 20 Ǻ de l’hèmeDans certaines conditions (substrat précurseur de radical de petite taille), absence de NADPH un composé II (FeIV-porph) peut être vu. En présence de NADPH il est non observé

Page 81: Stress oxydant

IV.2 PeroxydasesNombreuses et fonctions pas très bien comprises, se trouvent dans pro- et eucaryotes (30 isoenzymes dans le radis noir)AH2 + H2O2 A + 2 H2ORéaction en 2 temps:

Réduction de H2O2 (comme la catalase)Oxydation d’un substrat AH2 (≠ catalase)

OHO

AH2 = gaïacol(incolore sous forme réduite)

Jaunissement des légumes en présence de H2O2 et gaïacol (coloré sous forme oxydée)

-O2C NH

HN

CO2-

O

SHO

NH3+

O O

OHHO

HO

HO

AH2 = glutathion

AH2 = acide ascorbique

Page 82: Stress oxydant

Structure de la peroxydase de radis noir(la plus connue)

Hème protégé, accès solvant uniquement par un côté de l’hème

Page 83: Stress oxydant

Structure du site actifL'hème et le substrat se trouvent dans une poche hydrophobe (sauf His distale/proximale).FeIII établit 6 liaisons de coordinence:

4 N d’une protoporphyrine IX (idem hémoglobine)1 N de l’His proximale1 OH2 (champ faible) Fer haut spin

Trp dans la poche autour de l’hèmeHis 42 (distale) située est trop loin pour établir la sixième coordinence.

Fortes homologies

Horseradish peroxydase HémoglobineAscorbate peroxydase

Page 84: Stress oxydant

N Fe N

N

N

H

O O

Peroxydaseδ-Stabilisation du fer(III) par compensation de charge

N Fe N

N

N

H

O NH

Globine

Pas de δ- sur l’His: Stabilisation du Fer(III) moins importante: E(FeIII/II) ↑

Effet de seconde sphère de coordination = Comme pour les catalases E(FeIII/II) ↓ et la forme active est Fe(III)E(FeIII/II) = 0.170 V (hémoglobine)E(FeIII/II) = 0.046 V (myoglobine)E(FeIII/II) = -0.220 V (HRP)

Forme active: Fe(III) ou Fe(II)?

Page 85: Stress oxydant

Mécanisme catalytique

H2O2 est attiré dans la zone polaire de la crevasse au voisinage de His 42, Arg 38 et du FeIII

His 42, Arg 38 et His 170 sont conservés dans les différentes peroxydasesLa mutation de His 42 diminue toujours l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction.La mutation de Arg 38 (polaire) par Leu (apolaire) diminue également l'affinité de l'enzyme pour H2O2 et surtout pour le 2ème substrat.

Accès H2O2

Hème protégé, accès solvant uniquement par un côté de l’hème

Page 86: Stress oxydant

Déplacement des molécules d'eau distalesFixation du peroxyde sur le centre métallique et déprotonation par H42La mutation de Asn 70 en Val diminue Vmax de 90%: Une liaison hydrogène ne peut s'établir entre Val 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivitéde His 42 et changerait sa position dans l'espace.

2 molécules d’eau

N

N

H

H OOH

Fe3+

O

NH2

His42

Asn70

NH

N

H

OOH

Fe3+

O

NH2

His42

Asn70

H

Page 87: Stress oxydant

1ere étape commune aux catalases et peroxydases

Réaction: formation d'eau et d'un hème radical FeIV=O (métal bas-spin)FeIV=O très oxydant: E(composéI/composéII) = 0.90 V, E(composéII/composéIII) = 0.87 VRem: Peroxydase à Fer: Coupure hétérolytiqueFe2+ en solution (Fenton): Coupure homolytique de la liaison O-O. Génération de radicaux OH• très toxiques

The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution, G. I. Berglund et al., Nature 417, pp. 463-468 (2002)

N

N

H

OFe

O

NH2

His42

Asn70

4+

HOH

HNNH2

N HArg38

NH

N

H

O

Fe3+

O

NH2

His42

Asn70

H OH

Page 88: Stress oxydant

Le 2ème substrat intervient. Chez la Glutathion peroxydase il s’agit du glutathion, chez l’ascorbateperoxydase l’ascorbate, la peroxydase de radis noir une multitude de substrats … etc …H2O2 peut aller jusqu’au site actif, mais pas les substrats organiquesCes substrats restent à l’extérieur (oxydation sphère externe)

N

N

H

OFe

O

NH2

His42

Asn70

4+

HOH

HNNH2

N HArg38

OHO

Page 89: Stress oxydant

Produit de réaction avec le 2eme substrat:

-O2C NH

HN

CO2-

O

SHO

NH3+

GSH (glutathion)

Substrat Produit

-O2C NH

HN

CO2-

O

SO

NH3+

CO2-H

NNH

-O2C

O

SO

NH3+

GSSG (glutathion oxydé)La Glutathion Réductase permet de repasser à GSH

Glutathion Peroxydase:2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O2 GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O

O O

OHHO

HO

HO

Acide ascorbique

Ascorbate Peroxydase:2Asc + H2O2 → 2Asc• + 2 H2O

O O

OHHO

HO

HO

Asc•

Page 90: Stress oxydant

Mécanisme de réduction: 2 électrons transférés simultanément (catalase) ou par étapes?

-O2C NH

HN

CO2-

O

SHO

NH3+

FeIVO

-O2C NH

HN

CO2-

O

SO

NH3+

FeIVO

-O2C NH

HN

CO2-

O

SHO

NH3+

FeIVO

-O2C NH

HN

CO2-

O

SO

NH3+

FeIIIO

+ H2O

-O2C NH

HN

CO2-

O

SO

NH3+

CO2-H

NNH

-O2C

O

SO

NH3+

Ex: Glutathion peroxydase

Ex: Asc peroxydase

Intermédiaire porphyrine FeIV=O non radicalaire

Page 91: Stress oxydant

Mécanisme de réduction (HRP)

N

N

H

OFe

O

NH2

His42

Asn70

4+

HOH2N

H2N

N HArg38

O

OO

OH

H

O

OO

O

HO

OO

O

H

O

OO

O

+ H2O

Etat initial

N

N

H

OFe

O

NH2

His42

Asn70

4+

HOH

H2NNH2

N HArg38

HO

OO

O

N

N

H

OFe

O

NH2

His42

Asn70

4+

HOH2N

H2N

N HArg38

O

OO

OH

H

Page 92: Stress oxydant

Rôle de l’Arg: Ascorbate peroxydase

O O

OHHO

HO

HO

Modélisation du site de fixation du substrat (ascorbateperoxydase) et mécanisme catalytique proposé (horseradishperoxydase): Remarquer le rôle primordial de l’arginine dans les 2 cas malgré que le substrat soit différent

N

N

H

OFe

O

NH2

His42

Asn70

4+

HOH2N

H2N

N HArg38

O

OO

OH

H

Page 93: Stress oxydant

Un tryptophane (W191) est près du centre héminique

Cyt c peroxydaseUn cas particulier

Réaction:2 Cyt c red + H2O2 → 2 Cyt c ox + 2 H2OTransfert d’électrons à l’hème ferreux du Cyt c. Dans la chaîne respiratoire, mais transfert aussi des électrons au Cyt b5, sulfite oxydase (animaux), cyt c peroxydase (levures)…

e-

Ascorbate peroxydaseCyt c peroxydase

Page 94: Stress oxydant

Le radical est généré non pas sur la porphyrine mais sur ce Tryptophane (W191) !!!

Cyt c peroxydase

H2O2

2 H2O

Page 95: Stress oxydant

Raison ? Il semblerait que l’équivalent radical Trp• soit plus près de la surface en contact avec le Cyt c = Transfert d’électron plus rapide au cytochrome soluble.

Cyt c peroxydase

Respiration