TTHHÈÈSSEE

En vue de l'obtention du

DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE

Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spécialité : Physiopathologie

JURY

Dr Jacques BERTOGLIO, rapporteur Pr Alain VERLOES, rapporteur

Dr Béatrice PARFAIT, examinatrice Dr Armelle YART, invitée

Pr Maithé TAUBER, invitée Dr Patrick RAYNAL, directeur de thèse

Pr Jean-Pierre SALLES, directeur de thèse

Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies de Toulouse

Unité de recherche : unité INSERM U563 Directeur(s) de Thèse : Patrick RAYNAL et Jean-Pierre SALLES

Rapporteurs : Jacques BERTOGLIO et Alain VERLOES

Présentée et soutenue par EDOUARD Thomas Le 11 décembre 2009

Titre : Impact sur la signalisation cellulaire des mutations de la tyrosine phosphatase

Shp2 associées aux syndromes de Noonan et LEOPARD

Remerciements

Les travaux présentés dans ce mémoire de doctorat ont été menés dans l’unité INSERM U563 du centre de Physiopathologie Toulouse-Purpan, dans l’équipe médiateurs et signaux lipidiques, prolifération et différenciation cellulaire dirigée par Jean-Pierre Salles et Patrick Raynal. Tout d’abord, je tiens à remercier mes deux directeurs de Thèse, Patrick Raynal et Jean-Pierre Salles, pour m’avoir accueilli au sein de leur équipe et avoir dirigé ce travail. Mes remerciements vont également à Monsieur Alain Verloes, professeur de Génétique et directeur de recherche (unité INSERM U676) à l’hôpital Robert Debré, et Monsieur Jacques Bertoglio, directeur de recherche (unité INSERM U461) à la faculté Paris XI, pour m'avoir fait l'honneur d'être rapporteur de ce travail. Je remercie aussi Madame Béatrice Parfait, généticienne à l’hôpital Beaujon, Madame Maithé Tauber, professeur de Pédiatrie à Toulouse, et Armelle Yart, chargée de recherche à l’unité INSERM U563, qui ont bien voulu participer au jury. J’exprime toute ma reconnaissance à Madame Maithé Tauber qui m’a soutenu tout au long de ma formation médicale et scientifique sur Toulouse et m’a encouragé à réaliser une thèse de Sciences. Je remercie chaleureusement toute l’équipe du Centre de Recherche sur la Croissance (CRC), Françoise Conte-Auriol, Marianne Mus, Arnaud Bros et Sarah Laurencin, pour m’avoir initié à la recherche. Ils auront grandement participé à l’augmentation de ma culture scientifique et générale. Je tiens également à remercier Armelle Yart pour sa grande disponibilité, ses conseils et son aide précieuse pour la rédaction de l’article et la correction du manuscrit de thèse. J’ai beaucoup apprécié ses qualités pédagogiques et ses connaissances musicales. Je remercie Jean-Philippe Combier pour son aide majeure dans la réalisation de ce projet. Il m’aura ouvert les yeux aux beautés de la biologie moléculaire. Un grand merci à Alexandra Montagner, Marie Dance et Carla Sampaio qui ont initié ce travail et Audrey Nédélec qui va le continuer. Enfin, que l'ensemble des techniciens, ingénieurs, étudiants ainsi que le personnel du secrétariat, soient aussi remerciés pour l'atmosphère agréable qu'ils contribuent à maintenir au sein du département.

Impact sur la signalisation cellulaire des mutations de la tyrosine phosphatase Shp2 associées aux syndromes de Noonan et LEOPARD

Résumé Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique autosomique dominante relativement fréquente (≈1/2000), caractérisée par l’association d’une dysmorphie faciale, d’un retard statural et d’une cardiopathie. Le syndrome LEOPARD (SL) est une maladie génétique plus rare, phénotypiquement très proche du SN, s’en distinguant essentiellement par l’existence d’une surdité et d’anomalies cutanées. Ces deux syndromes appartiennent à la famille des syndromes « Neuro-Cardio-Facio-Cutanés », un groupe de maladies du développement en rapport avec des mutations germinales de gènes codant pour des molécules impliquées dans la voie Ras/Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK). Au moins 50% des patients SN et plus de 80% des patients SL ont des mutations germinales du gène PTPN11, codant pour la tyrosine phosphatase Shp2. De manière intéressante, les études biochimiques ont montré que les mutations de PTPN11 ont des effets opposés sur l’activité de la phosphatase, gain de fonction dans le SN et perte de fonction dans le SL. Comment des mutations aux effets opposés peuvent être à l’origine de phénotypes similaires est à ce jour incompris. Un point important dans la compréhension de la physiopathologie des SN et SL est l’identification des voies de signalisation altérées par les mutants de Shp2. Jusqu’ici, la plupart des études se sont focalisées sur la voie Ras/MAPK. Ainsi, les mutants SN de Shp2 seraient responsables d’une activation de cette voie suivant des mécanismes moléculaires peu connus. En ce qui concerne le SL, nos connaissances sont plus limitées car même l’effet des mutants SL de Shp2 sur la voie Ras/MAPK est toujours débattu. Pour aller plus loin dans la physiopathologie de ces syndromes, il nous a semblé important d’étudier l’impact des mutants de Shp2 sur d’autres voies de signalisation, notamment la voie de signalisation PI3K/Akt. Pour cette étude, nous avons travailler à partir de cultures de fibroblastes cutanés immortalisés de patient NS et SL ce qui constituait un outil original et unique à ce jour. Ce travail nous a permis d’observer, qu’en réponse à l’EGF, la voie PI3K/Akt est hyperactivée dans les cellules de patients SL comparées à celles des patients SN ou des contrôles. Cet effet dominant positif des mutants SL de Shp2 est du à une diminution de la déphosphorylation des sites de liaison de PI3K sur Gab1, augmentant ainsi l’association PI3K/Gab1 et l’activation de la voie PI3K/Akt. Nous avons également observés dans les cellules de patients SL que cette hyperactivation de PI3K/Akt entraîne une augmentation de l’inactivation de GSK3-β et par conséquent une régulation positive des marqueurs d’hypertrophie cardiaque. Enfin, les inhibiteurs de PI3K annulent la croissance hypertrophique induite par les mutants SL dans des cardiomyocytes en culture et des explants cardiaques d’embryons de poulet, suggérant que l’hyperactivation de PI3K/Akt pourrait participer à l’hypertrophie cardiaque souvent observée dans le SL. Ces données expérimentales sont concordantes avec les données cliniques qui ont montré que, dans le cadre des mutations de PTPN11, la fréquence des HCM est élevée (≈50%) chez les patients SL, et basse (<10%) dans le SN. Il s’agit donc de la première étude suggérant l’implication de la voie PI3K/Akt dans la physiopathologie des SN et SL. Ces données obtenues in vitro restent bien sur à valider, notamment dans des modèles animaux, mais ouvrent de nouvelles perspectives de recherche.

Abréviations CFC Cardio-Facio-Cutané CIA Communication inter-auriculaire CIV Communication inter-ventriculaire EGF Epidermal Growth Factor Erk Extracellular-regulated kinase FAK Focal Adhesion Kinase FGF Fibroblast Growth Factor Gab1 Grb2-associated Binder 1 GAP GTPase Activating Protein GEF Guanosine Exchange Factor GDP Guanosine Diphosphate GH Growth hormone GTP Guanosine Triphosphate HCM Hypertrophic cardiomyopathy IGF-I Insulin-like Growth Factor-I JAK Janus Kinase JNK c-Jun Terminal Kinase LMMJ Leucémie myélomonocytaire juvénile MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase Mek MAPK Erk Kinase NCFC Neuro-Cardio-Facio-Cutané NF1 Neurofibromatose de type 1 PDGF Platelet-Derived Growth Factor PH Pleckstrin Homology PI3K Phosphoinositide 3-Kinase PTEN Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on chromosome 10 PTK Protein Tyrosine Kinase PTP Protein Tyrosine Phosphatase RTK Récepteur à activité Tyrosine Kinase SC Syndrome de Costello SH2 Src Homology 2 Shp2 SH2 domain -containing tyrosine phosphatase SFK Src Family Kinase SL Syndrome de Noonan SN Syndrome de LEOPARD Sos Son of Sevenless STAT Signal Transducer and Activator of Transcription

Sommaire Introduction bibliographique…………………………………………………………….... 1 Chapitre I: Description clinique du syndrome de Noonan et des syndromes apparentés 1. Le syndrome de Noonan........................................................................................................................ 2 1.1. Généralités…………………………………………………..……………………………..... 2 1.2. Anomalies de la croissance et de la puberté………………………………………………… 4 1.2.1. Données cliniques………………………………………………………………... 4 1.2.2. Données hormonales…………………………………………………………….. 5 1.2.3. Réponse au traitement par GH recombinante…………………………………….. 6 1.2.4. Hypothèses physiopathologiques du retard statural……………………………… 8 1.3. Cardiopathie………………………………………………………………………………….. 8 1.4. Anomalies hématologiques et de l’hémostase………………………………………………... 9 1.5. Anomalies du développement psychomoteur............................................................................ 10 1.6. Autres signes.............................................................................................................................. 10 2. Le syndrome LEOPARD…………………………………………………………………… ………… 12 2.1. Anomalies de la croissance et de la puberté………………………………………………….. 12 2.2. Cardiopathies………………………………………………………………………………….. 13 2.3. Autres anomalies……………………………………………………………………………… 13 3. Les autres syndromes apparentés……………………………………………………………………… 14 3.3. Le syndrome Cardio-Facio-Cutané………………………………………………………… 14 3.4. Le syndrome de Costello…………………………………………………………………… 15 3.5. La neurofibromatose de type 1 et le syndrome de Legius…………………………………. 16 Chapitre II : Génétique du syndrome de Noonan et des syndromes apparentés : les anomalies de la voie de signalisation Ras/MAPK 1. La voie Ras/MAPK……………...…………………………………………………………………….... 18 1.1. Généralités…………………………………………………………………………………….. 18 1.2. Description des molécules impliquées dans la voie Ras/MAPK……………………………… 20 1.2.1. Ras et ses régulateurs……………………………………………………………… 20 1.2.1.1. Structure et fonction de Ras……………………………………………. 20 1.2.1.2. Activation de Ras par la GEF Sos1…………………………………… 22 1.2.1.3. Régulation négative de Ras par les GAPs RasGAP et Neurofibromine.. 23 1.2.2. La cascade de signalisation Raf/Mek/Erk………………………………………… 23 1.2.2.1. Raf........................................................................................................... 23 1.2.2.2. Mek et Erk 1 et 2……………………………………………………… 25 1.3. Régulation de l’activation de la voie Ras/MAPK…………………………………………….. 26 1.3.1. La tyrosine phosphatase Shp2…………………………………………………….. 26 1.3.2. Les protéines Sprouty et Spred…………………………………………………….. 26 2. Les anomalies génétiques de la voie Ras/MAPK……………………………………………………… 28 2.1. Gènes impliqués dans les syndromes Neuro-Cardio-Facio-Cutanés…………………………. 29 2.1.1. Le gène PTPN11…………………………………………………………………… 29 2.1.2. Le gène SOS1……………………………………………………………………… 31 2.1.3. Le gène RAF……………………………………………………………………... 32 2.1.4. Les gènes MEK 1 et 2............................................................................................... 32 2.1.5. Le gène RAS………………………………………………………………………. 33 2.1.6. Le gène NF1……………………………………………………………………….. 35 2.1.7. Le gène SPRED1………………………………………………………………….. 36 2.2. Les autres anomalies constitutives de la voie Ras/MAPK…………………………………… 36 2.2.1. RASA1 et le syndrome malformation artérioveineuse/malformation capillaire…… 36 2.2.2. NRAS et le syndrome lymphoprolifératif autoimmun…………………………….. 37 2.2.3. SOS1 et la fibromatose gingivale héréditaire……………………………………… 37

Chapitre III : Corrélations phénotype/génotype dans les syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés 1. Syndrome de Noonan……………………………………...…………………………………………… 38 1.1. Retard statural…………………………………….…………….……………………………. 39 1.2. Cardiopathie………………………………………….………………………………………. 41 1.3. Anomalies hématologiques…………………………….…………………………………….. 42 1.4. Autres atteintes…………………………………………….………………………………….. 42 2. Syndrome LEOPARD…….…………………………………………………………………………….. 43 2.1. Retard statural…………………………………………………………………………………. 43 2.2. Cardiopathie………………………………………………………………………………….. 43 2.3. Autres atteintes………………………………………………………………………………. 43 3. Syndrome Cardio-facio-cutané………………………………………………………………………… 44 4. Syndrome de Costello…………………………………………………………………………………… 46 Chapitre IV : Conséquences fonctionnelles des mutants de Shp2 1. Structure et fonctions biologiques de Shp2…………………………………………………………… 48 1.1. Tyrosines kinases et tyrosines phosphatases…………………………………………………. 48 1.2. Structure et régulation de l’activité de Shp2………………………………………………….. 49 1.3. Gab1, une protéine adaptatrice essentielle à la fonction de Shp2……………………………... 50 1.4. Rôle dans les différentes voies de signalisation……………………………………………….. 53 1.4.1. Régulation de Ras et PI3K en aval des RTKs…………………………………….. 53 1.4.1.1. Régulation de Ras………………………………………………………. 53 1.4.1.2. Régulation de PI3K…………………………………………………….. 55 1.4.2. Régulation de Rho en aval des intégrines………………………………………….. 55 1.4.3. Régulation de JAK/STAT en aval des récepteurs aux cytokines………………….. 56 1.5. Rôle de Shp2 dans le développement…………………………………………………………. 57 1.5.1. Chez les invertébrés……………………………………………………………….. 57 1.5.2. Chez les vertébrés…………………………………………………………………. 58 2. Conséquences fonctionnelles des mutants de Shp2……………………………………………………. 60 2.1. Mutants SN de Shp2…………………………………………………………………………. 60 2.1.1. Conséquences sur l’activité de la phosphatase……………………………………. 60 2.1.2. Conséquences sur les voies de signalisation………………………………………. 62 2.1.3. Conséquences sur le développement : les modèles animaux……………………… 62 2.1.3.1. La Drosophile………………………………………………………….. 63 2.1.3.1. Les modèles murins……………………………………………………. 64 2.2. Mutants SL de Shp2………………………………………………………………………..... 65

Résultats expérimentaux et perspectives……………………………………………… 67

Résultats expérimentaux…………………………………………………………………………… 68

1. Introduction……………………………………………………………………………………………… 68

2. Résultats et discussion………………………………………………………………………………….. 69

3. Conclusion……………………………………………………………………………………………….. 109

Perspectives……………………………………………………………………………………………… 110

1. Validation du modèle de développement de l’HCM chez les patients SL

dans des tissus cardiaques humains et/ou des modèles animaux…………………………………….. 110

2. Implication physiopathologique des mutants de Shp2 dans le retard statural.................................. 112

2.1. Hyperactivation de la voie Ras/MAPK sous GH et déficit en IGF-I……………………….... 112

2.2. Atténuation du retard statural chez les SL par hyperactivation de la voie PI3K/Akt……….... 114

3. Effet des mutants de Shp2 sur différentes voies de signalisation…………………………………..... 115

4. Conclusion………………………………………………………………………………………………... 117

Références bibliographiques……………………………………………………………...…. 118

Annexes………………………………………………………………………………………………..... 134

Annexe 1 : The Shp2 paradox in Noonan and LEOPARD syndromes:

How mutations oppositely influencing its biochemical activity result in similar phenotypes?.. 135

Annexe 2 : Identification des mécanismes moléculaires d’insensibilité partielle à GH dans le SN………... 141

- Introduction bibliographique -

1

Chapitre I

Description clinique du syndrome de Noonan et des syndromes apparentés

Le syndrome de Noonan (SN, OMIM 163950), décrit par Jacqueline Noonan en 1968

(Noonan 1968), est caractérisé par l’association d’une dysmorphie faciale caractéristique,

d’un retard statural et d’une cardiopathie (essentiellement une sténose des valves

pulmonaires) (Allanson 1987). Ces caractéristiques cliniques sont partagées à des degrés

variables par d’autres syndromes phénotypiquement très proches que sont le syndrome

LEOPARD (SL, OMIM 151100), le syndrome Cardio-Facio-Cutané (CFC, OMIM 115150),

le syndrome de Costello (SC, OMIM 218040), et la neurofibromatose de type 1 (NF1, OMIM

162200). Nous décrirons dans ce premier chapitre la présentation clinique de ces différents

syndromes.

1. Le syndrome de Noonan

1.1. Généralités

Le SN est une maladie génétique relativement fréquente dont la prévalence est estimée

entre 1/1000 à 1/2500 naissances vivantes (Nora, Nora et al. 1974; Mendez and Opitz 1985;

Opitz 1985; Allanson 1987). Cependant, ces données ne reposent pas sur des études de

population précises. De plus, l’incidence est sans doute plus importante du fait d’interruptions

spontanées de grossesse.

Le SN peut-être familial avec une transmission le plus souvent autosomique

dominante (Jongmans, Otten et al. 2004); cependant, une possible transmission récessive a été

suggérée dans certains cas (van Der Burgt and Brunner 2000). Dans ces formes transmises, il

existe une prédominance de transmission maternelle (70%) possiblement expliquée par une

diminution de la fertilité masculine (Collins and Turner 1973; Nora, Nora et al. 1974;

Sharland, Burch et al. 1992). Au moins la moitié des cas sont sporadiques (Nora, Nora et al.

1974; Mendez and Opitz 1985; Allanson 1987; Ranke, Heidemann et al. 1988; Sharland,

Burch et al. 1992).

2

Le phénotype du SN est très hétérogène entre les personnes atteintes, même à

l’intérieur d’une même famille. De plus, le phénotype varie au cours des différents âges et

peut être discret à l’âge adulte notamment au niveau des signes faciaux (figure 1) (Allanson,

Hall et al. 1985; Allanson 1987).

Figure 1. Evolution du phénotype du syndrome de Noonan avec l’âge : « The changing phenotype »

Chez le nouveau-né, les principaux signes sont un hypertélorisme avec des fentes palpébrales tombantes (95%),

des oreilles basses en rotation postérieure avec un hélix épais (90%), un philtrum marqué (95%), un palais haut

et arché (45%), une micrognathie (25%) et un excès de peau nuccal avec une implantation basse des cheveux

(55%). Chez le nourrisson, la tête apparaît relativement large avec turicéphalie, les yeux sont proéminents avec

un hypertélorisme et des paupières épaisses « en capuchon ». Le nez a une racine déprimée, une base large et une

extrémité bulbeuse. Chez l’enfant plus âgé, le visage apparaît grossier et myopathique, le contour du visage

devient plus triangulaire avec l’âge avec la croissance du menton. Il peut exister un ptosis (uni ou bilatéral) et un

comblement supraorbitaire latéral. Chez l’adolescent, et l’adulte jeune, les yeux sont moins proéminents et le nez

a une racine pincée, un pont haut et fin et une base large. Le cou s’allonge accentuant la palmure et la

proéminence du trapèze (90%). Chez l’adulte plus âgé, les plus nasolabiaux sont marqués, l’implantation

antérieure des cheveux est haute, la peau transparent et ridée. Les cheveux peuvent être minces chez le

nourrisson alors qu’ils sont souvent laineux et bouclés chez l’enfant plus âgé et l’adolescent. Les oreilles basses

en rotation postérieure avec un hélix épais sont présentes à tous les âges (Allanson, Hall et al. 1985; Allanson

1987).

Ainsi, établir le diagnostic de SN peut être difficile, spécialement dans les phénotypes

modérés et chez les patients adultes. Plusieurs systèmes de scores basés sur les

caractéristiques phénotypiques ont été développés pour aider le diagnostic. En 1981, Duncan

et al. proposèrent un score diagnostique avec 26 items, difficilement utilisable en pratique

3

clinique (Duncan, Fowler et al. 1981). En 1993, Sharland et al. définirent comme certain le

diagnostic de SN si des caractéristiques faciales typiques (définies dans l’article d’Allanson et

al.) étaient associées à au moins une anomalie cardiaque, une petite taille (<10ème percentile)

ou une ectopie testiculaire chez le garçon (Sharland, Morgan et al. 1993). Cependant ce score

ne permettait pas de diagnostiquer les patients avec une dysmorphie modérée. En 1994, Van

Der Burgt et al. développèrent un score plus simple prenant en compte l’importance des

modifications faciales (typiques ou évocatrices) (tableau 1) (van der Burgt, Berends et al.

1994). Lorsque ce score clinique est utilisé, le pourcentage de mutations positives est plus

important (Jongmans, Sistermans et al. 2005).

retard mental ou cryptorchidie ou dysplasie lymphatique

retard mental et cryptorchidie et dysplasie lymphatique6. Autres

1er degré dc évocateur1er degré dc certain5. Histoire familiale

thorax largepectus carinatus/excavatus4. Anomalie thorax

<10ème percentile<3ème percentile (-2 DS)3. Retard statural

autressténose pulmonaire, HCM, anlie ECG2. Cardiopathie

évocatricetypique1. Dysmorphie

B. mineursA. majeursSignes

retard mental ou cryptorchidie ou dysplasie lymphatique

retard mental et cryptorchidie et dysplasie lymphatique6. Autres

1er degré dc évocateur1er degré dc certain5. Histoire familiale

thorax largepectus carinatus/excavatus4. Anomalie thorax

<10ème percentile<3ème percentile (-2 DS)3. Retard statural

autressténose pulmonaire, HCM, anlie ECG2. Cardiopathie

évocatricetypique1. Dysmorphie

B. mineursA. majeursSignes

Tableau 1. Critères diagnostiques du syndrome de Noonan (van der Burgt, Berends et al. 1994) Le diagnostic de syndrome de Noonan est porté si le patient présente : Soit une dysmorphie typique (1A) + un signe de 2A à 6A ou 2 signes de 2B à 6B Soit une dysmorphie évocatrice (1B) + deux signes de 2A à 6A ou 3 signes de 2B à 6B

1.2. Anomalies de la croissance et de la puberté

1.2.1. Données cliniques

Le retard statural est présent chez environ 80% des enfants SN et plusieurs auteurs

ont pu établir des courbes de croissance spécifiques à partir de larges séries (Witt, Keena et al.

1986; Ranke, Heidemann et al. 1988).

Chez les enfants SN, les mensurations à la naissance sont normales avec un poids et une taille

moyennes respectivement de 3219 g et 51.1 cm chez les filles et 3182 g et 51.0 cm chez les

garçons soulignant une croissance prénatale normale (Ranke, Heidemann et al. 1988).

Cependant, 10% des enfants naissent avec une petite taille de naissance (Small for

gestationnal age, SGA) (Ranke, Heidemann et al. 1988). Les oedèmes, parfois présents à la

4

naissance, pourraient masquer des anomalies du poids de naissance (Allanson 1987; Sharland,

Burch et al. 1992).

Des difficultés alimentaires associées à une mauvaise prise pondérale sont présentes chez

75% des nourrissons ; ces difficultés peuvent être légères (15%), modérées (40%) ou sévères

justifiant une nutrition entérale (20%) et peuvent persister jusqu’à l’âge de 18 mois.

L’évolution postnatale de la croissance staturale est identique dans les deux sexes avec une

taille moyenne qui suit le troisième percentile jusqu’à 10 ans chez les filles et 12 ans chez les

garçons. L’âge osseux est souvent retardé par rapport à l’âge chronologique d’environ deux

ans et s’accompagne d’un retard pubertaire responsable d’un ralentissement de la vitesse de

croissance dans les 2 sexes. Le pic de croissance pubertaire apparaît avec un retard de deux

ans et est souvent réduit, la taille finale est atteinte à la fin de la deuxième décade.

La taille adulte spontanée est proche des -2 déviations standards (DS) (soit le 3ème percentile)

de la population normale : 152.7 cm chez les femmes (n=55) et 162.5 cm chez les hommes

(n=89) dans l’étude de Ranke et al. (Ranke, Heidemann et al. 1988) et 152.7 cm chez les

femmes (n=25) et 167.4 cm chez les hommes (n=18) dans une étude plus récente (Shaw,

Kalidas et al. 2007). A l’âge adulte, 30% des hommes et femmes ont une taille supérieure au

10ème percentile alors qu’environ 40% des hommes et 50% des femmes ont une taille en

dessous du 3ème percentile (Noonan, Raaijmakers et al. 2003). L’existence ou la sévérité d’une

cardiopathie associée ne semble pas avoir un impact majeur sur les caractéristiques de la

croissance (Ranke, Heidemann et al. 1988).

Concernant la fonction génitale, l’âge moyen de la ménarche est de 14.6 ans,

cependant la fertilité ne semble pas atteinte chez les femmes présentant un SN (Sharland,

Burch et al. 1992). Chez le garçon, des anomalies de migration testiculaire sont fréquentes

(75%) (Sharland, Burch et al. 1992) et des taux élevés de LH et FSH sont parfois présents en

période prépubertaire (Theintz and Savage 1982). Chez l’adulte, des taux de FSL élevés et

une faible qualité du liquide séminal ont été retrouvés, suggérant une anomalie de la

spermatogenèse chez les garçons avec des testicules non descendus (Elsawi, Pryor et al.

1994).

1.2.2. Données hormonales

L’hormone de croissance (Growth Hormone, GH), sécrétée par l’antéhypophyse dans

la circulation générale, se lie à des récepteurs membranaires au niveau des tissus cibles pour

5

stimuler la croissance somatique; la plupart de ses effets sont médiés par l’Insulin-Like

Growth Factor (IGF) -I. L’IGF-I est transportée et stockée au niveau sanguin par des

protéines porteuses dont l’IGF binding protein 3 (IGFBP-3) et l’acid labil subunit (ALS).

Dans le SN, il n’existe habituellement pas de déficit en hormone de croissance (Growth

hormone deficiency, GHD) mais des anomalies de l’axe somatotrope GH/IGF-I ont été

observées.

Après stimulation pharmacologique, la sécrétion de GH est le plus souvent normale (Elders

and Char 1976; Ahmed, Foot et al. 1991; Thomas and Stanhope 1993; Romano, Blethen et al.

1996; Kirk, Betts et al. 2001; Noordam, van der Burgt et al. 2001) ; certaines études

retrouvent cependant des tests déficitaires chez environ un tiers des enfants (Otten BJ. ;

Cotterill, McKenna et al. 1996; Romano, Blethen et al. 1996). L’étude du profil sécrétoire

nocturne de la GH est également le plus souvent normale, cependant, certains enfants

présentent des anomalies de la pulsatilité avec des pics irréguliers de GH et des dépressions

moins profondes entre les pics (Ahmed, Foot et al. 1991; Tanaka, Sato et al. 1992; Noordam,

van der Burgt et al. 2002).

Les taux d’IGF-I sont le plus souvent bas ou dans la normale basse (Ahmed, Foot et al. 1991;

Tanaka, Sato et al. 1992; Noordam, van der Burgt et al. 2002), l’IGFBP-3 est

normale (Cotterill, McKenna et al. 1996; Noordam, van der Burgt et al. 2001; Binder, Neuer

et al. 2005; Limal, Parfait et al. 2006) et l’ALS est basse (Limal, Parfait et al. 2006).

1.2.3. Réponse au traitement par GH recombinante

Comme dans le syndrome de Turner et le retard statural secondaire à un SGA (Kamp,

Kuilboer et al. 1993; Boguszewski, Rosberg et al. 1995), une diminution de la sensibilité à

GH a été évoquée, c’est pourquoi, lors des protocoles thérapeutiques, des doses de GH

humaine recombinante (human recombinant, rh) plus élevées que dans les déficits ont été

proposées (0,05 à 0,066 versus 0,033 mg/kg/j dans les GHD).

Les premières études concernant le traitement par rhGH des enfants présentant un SN

concernaient un petit nombre de patients (Cianfarani, Spadoni et al. 1987; Ahmed, Foot et al.

1991; Thomas and Stanhope 1993; Municchi, Pasquino et al. 1995) ou un traitement de courte

durée (Cotterill, McKenna et al. 1996; De Schepper, Otten et al. 1997). Par la suite, plusieurs

études concernant un nombre de patients plus important et un traitement prolongé d’au moins

3 ans ont été réalisées avec des résultats encourageants (Otten BJ. ; Romano, Blethen et al.

6

1996; Kirk, Betts et al. 2001; MacFarlane, Brown et al. 2001; Noordam, Van der Burgt et al.

2001; Limal, Parfait et al. 2006). Ainsi, le gain de taille moyen après 3 années de traitement

est de presque 1 DS (0.8 à 0.9 DS). Il existe comme dans d’autres indications un épuisement

du rattrapage initial avec une stabilisation (Cho, Thorvaldsen et al. 2001; Um, Frigerio et al.

2004) de la vitesse de croissance après la troisième année.

Sous traitement par rhGH, il existe une augmentation significative des taux d’IGF1 (de –1,6 à

0,3 DS après un an traitement dans l’étude de Limal et al.) (Ahmed, Foot et al. 1991; Limal,

Parfait et al. 2006). La réponse au traitement est dose dépendante et ne semble pas liée aux

données de la sécrétion GH avant traitement (Noordam, van der Burgt et al. 2001).

Deux études ont permis de préciser les tailles adultes après traitement par rhGH (Osio,

Dahlgren et al. 2005; Noordam, Peer et al. 2008). Dans l’étude d’Osio et al. (n=18), la taille

adulte est de –1.6 DS chez les filles et -0.9 DS chez les garçons soit un gain de taille

respectivement de 1.8 et 1.5 DS ; 60% des enfants atteignent leur taille cible. Cet

accroissement de taille est important au cours des premières années de traitement, sans effet

de la dose de GH (0.033 vs 0.066 mg/kg/j). Après 3 ans de traitement, il n’existe plus de

rattrapage mais le gain de taille obtenu est maintenu jusqu’au démarrage pubertaire. Du début

de la puberté à la taille finale, une augmentation de la taille est obtenue chez les garçons du

fait d’un pic de croissance pubertaire prolongé. Dans l’étude de Noordam et al. (n=28), la

taille adulte moyenne est de -1.5 DS soit un gain de taille de 1.3 DS (9.5 cm chez les garçons

et 9 cm chez les filles) ; 76% des patients ont une taille adulte supérieure à -2DS.

L’accroissement de taille obtenu lors des 4 premières années de traitement est maintenu

jusqu’à la taille adulte. La réponse au traitement est très variable, les facteurs prédictifs de

bonne réponse sont l’âge de démarrage de la puberté et le nombre d’années de traitement

avant le démarrage pubertaire.

Ces résultats sont semblables à l’accroissement de taille sous traitement par rhGH chez les

filles avec un syndrome de Turner et les enfants petits nés SGA (Van Pareren, Mulder et al.

2003; van Pareren, de Muinck Keizer-Schrama et al. 2003).

La tolérance du traitement au niveau métabolique, hématologique et cardiaque à court

et long terme est globalement bonne (Cotterill, McKenna et al. 1996; MacFarlane, Brown et

al. 2001; Osio, Dahlgren et al. 2005; Noordam, Peer et al. 2008). Une augmentation modérée

et transitoire de l’insulinémie à jeun sans modification des autres paramètres du métabolisme

glucidique a été notée, de plus un enfant a développé un lymphome après 3 ans de traitement

7

(Osio, Dahlgren et al. 2005). Les inquiétudes concernant l’avance de maturation osseuse

observée chez les patients traités plus importante que chez les contrôles n’ont pas été

confirmées (Noordam, Van der Burgt et al. 2001; Noordam, Peer et al. 2008).

1.2.4. Hypothèses physiopathologiques du retard statural

Les anomalies de l’axe somatotrope observées et la réponse au traitement par rhGH

ont fait évoquer plusieurs hypothèses :

a) Résistance partielle à GH par anomalie de signalisation post récepteur

L’association de taux normaux de GH, spontanés ou après stimulation, à des taux d’IGF-I bas

suggère une insensibilité à GH (Growth hormone insentivity, GHI). Cette résistance est

partielle comme le prouve la réponse au traitement par rhGH et pourrait être spécifique de

l’IGF-I et l’ALS sans affecter l’IGFBP-3. Comme nous le verrons dans le chapitre suivant,

l’identification dans le SN de mutations du gène PTPN11, codant pour une tyrosine

phosphatase Shp2 impliquée dans la régulation du signal en aval du récepteur à GH (GH

receptor, GHR), est en faveur de cette hypothèse.

b) Une anomalie hypothalamo-hypophysaire à type de dysfonction neurosécrétoire ne peut

être exclue. En effet, les taux normaux d’IGFBP-3 (comme chez 70% des patients présentant

un hypopituitarisme) et l’élévation des taux l’IGF-I sous traitement par rhGH sont

compatibles avec cette hypothèse.

c) Enfin, une anomalie localisée au niveau de la plaque de croissance est également possible.

1.3. Cardiopathie

La cardiopathie congénitale est présente chez environ 80% des patients SN (Sharland,

Burch et al. 1992; Marino, Digilio et al. 1999; Bertola, Kim et al. 2000). Le plus souvent, il

s’agit d’une sténose des valves pulmonaires avec feuillets dysplasiques (60%) qui peut être

isolée ou associée à d’autres anomalies cardiaques (Pernot, Marcon et al. 1987; Lin 1988).

Une cardiomyopathie hypertrophique (hypertophic cardiomyopathy, HCM) peut également

se développer (20%) tout au long de l’enfance. Plus rarement, sont retrouvées une

communication inter auriculaire (CIA) (6 à 10%), une communication inter ventriculaire

8

(CIV) (5%), ou la persistance d’un canal artériel (3%) (Allanson 1987; Sharland, Burch et al.

1992). Enfin, certains patients présentent des anomalies du canal atrio-ventriculaire associées

à une obstruction subaortique et des anomalies structurales de la valve mitrale (Marino,

Digilio et al. 1999). L’électrocardiogramme (ECG) des patients SN retrouve des complexes

QRS larges avec une négativation dans les dérivations précordiales gauches (60%), une

déviation gauche de l’axe et des ondes Q géantes (Sanchez-Cascos 1983; Pernot, Marcon et

al. 1987).

1.4. Anomalies hématologiques et de l’hémostase

A la naissance, une hépatomégalie et/ou une splénomégalie, non expliquées par une

atteinte cardiaque, sont retrouvées chez 20 à 30% des enfants SN (Sharland, Burch et al.

1992) ; la fréquence de ces anomalies est de 50% lorsqu’une échographie abdominale est

réalisée de manière systématique (George, Patton et al. 1993). Cette hépatosplénomégalie

diminue souvent avec l’âge et pourrait être la manifestation d’un syndrome myéloprolifératif

à minima.

Chez approximativement 1% des patients SN, un réel syndrome myéloprolifératif

(leucémie myélomonocytaire chronique) est diagnostiqué devant des anomalies

hématologiques modérées (thrombocytopénie et splénomégalie dans les premiers mois de vie)

(Bader-Meunier, Tchernia et al. 1997; Fukuda, Horibe et al. 1997; Side and Shannon 1997;

Choong, Freedman et al. 1999; Silvio, Carlo et al. 2002). Le plus souvent, ce syndrome

myéloprolifératif régresse spontanément sans traitement, cependant, il peut parfois évoluer en

leucémie myélomonocytaire juvénile (LMMJ).

La LMMJ est une hémopathie rare (2% des hémopathies de l’enfant) mais agressive

(6% de survie à 10 ans en l’absence de traitement) qui apparaît dans la petite enfance, avec

une médiane au moment du diagnostic de 2 ans (Emanuel 2004). La LMMJ a une prévalence

augmentée dans le SN bien qu’elle soit présente dans un faible pourcentage de cas (<1%)

(Bader-Meunier, Tchernia et al. 1997; Fukuda, Horibe et al. 1997; Choong, Freedman et al.

1999). De plus, lorsqu’elle survient, l’évolution est souvent plus bénigne comparée aux

LMMJ non associées au SN. Le rôle prédisposant du SN dans la survenue d’autres

hémopathies, notamment les leucémies aigues lymphoblastiques (LAL), a également été

9

évoqué mais reste plus difficile à prouver compte tenu de la relative fréquence de ces tumeurs

chez l’enfant (Piombo, Rosanda et al. 1993; Attard-Montalto, Kingston et al. 1994).

Enfin, des anomalies de l’hémostase sont souvent observées (20%). Ainsi, des

ecchymoses spontanées ou des saignements sont fréquents, notamment dans l’enfance ;

cependant, des hémorragies sévères sont rares (3%). L’exploration de la coagulation peut

retrouver un temps de saignement prolongé, des déficits des facteurs VIII, XI et XII, une

thrombocytopénie et des anomalies fonctionnelles des plaquettes. Ces anomalies peuvent

apparaître isolément ou en association (Sharland, Burch et al. 1992; Massarano, Wood et al.

1996). Chez les patients SN, il n’existe pas de corrélation entre les ecchymoses spontanées et

les tests de coagulation. Ces tests ne peuvent donc être utilisés pour prédire le risque de

saignement.

1.5. Anomalies du développement psychomoteur

Les nourrissons SN présentent souvent une hypotonie musculaire et une hyperlaxité

articulaire responsables d’un retard moteur modéré : la tenue assise est acquise en moyenne

à 10 mois, la marche à 21 mois et la parole à 31 mois (Sharland, Burch et al. 1992). La plupart

des enfants (90%) suivent une scolarité normale mais certains présentent des retards des

apprentissages (25%) et/ou nécessitent une pris en charge éducative spécialisée (10-15%). Un

retard mental modéré est présent chez 15 à 35% des patients: le quotient intellectuel est en

moyenne de 85 avec des variations importantes entre les patients (van der Burgt, Thoonen et

al. 1999; Chan, Leedy et al. 2005). Ces enfants présentent des troubles visio-constructifs et

une diminution des performances verbales. Des anomalies du comportement (déficit de

l’attention, irritabilité, opposition) sont fréquemment observées.

1.6. Autres signes

Les autres signes observés chez les patients SN sont précisés dans le tableau 2. Les

fréquences des différentes atteintes évaluées dans des cohortes anciennes, seront reprécisées

dans le chapitre 3 à la lumière de la découverte des gènes impliqués dans cette pathologie.

10

Retard psychomoteur (25%), retard de langage (20%) et des apprentissages (25%), retard mental modéré (15-35%), troubles du comportement (hyperactivité, déficit de l’attention)

Neurologique

naevi (25%), taches café au lait (10%), lentigines (3%), ulérythème ophryogenes(14%), cheveux fins (30%)et épars (10%), foetal pads (67%)

Phanères

Mauvaise prise pondérale dans la petite enfance (75%)Retard statural (80%)

Croissance

Anomalies lymphatiques (lymphoedème, lymphangiectasie) (20%)Lymphatique

Malformations tractus urinaire (sténose pyélo-urétérale et/ou hydronéphrose) (10%), cryptorchidie (70%)

Urogénitale

Pectus excavatus et/ou carinatus (70%), cubitus valgus (50%), hypermobilitéarticulaire (50%), clinobrachydactylie (30%), scoliose (15%), pieds varus equin(12%), synostose radioulnaire (2%)

Squelettique

Strabisme (60%), myopie et hypermétropie (60-70%), amblyopie (30%), nystagmus (10%), anomalies du segment antérieur (63%) et du fond d’œil (20%)Surdité (15-40%) de perception (otites) ou de transmission

Neurosensorielle

Hépatosplénomégalie (20-30%), syndrome myéloprolifératif (1%), LMMJ (<1%)Anomalies de la coagulation (20%)

Hématologique

Cardiopathie congénitale (80%): sténose pulmonaire (60%), HCM (20%), CIA (6-10%), CIV (5%), canal artériel persistant (3%), anomalie du canal atrioventriculaire, tétralogie de Fallot, anomalie mitraleAnomalies ECG (60%)

Cardiaque

Retard psychomoteur (25%), retard de langage (20%) et des apprentissages (25%), retard mental modéré (15-35%), troubles du comportement (hyperactivité, déficit de l’attention)

Neurologique

naevi (25%), taches café au lait (10%), lentigines (3%), ulérythème ophryogenes(14%), cheveux fins (30%)et épars (10%), foetal pads (67%)

Phanères

Mauvaise prise pondérale dans la petite enfance (75%)Retard statural (80%)

Croissance

Anomalies lymphatiques (lymphoedème, lymphangiectasie) (20%)Lymphatique

Malformations tractus urinaire (sténose pyélo-urétérale et/ou hydronéphrose) (10%), cryptorchidie (70%)

Urogénitale

Pectus excavatus et/ou carinatus (70%), cubitus valgus (50%), hypermobilitéarticulaire (50%), clinobrachydactylie (30%), scoliose (15%), pieds varus equin(12%), synostose radioulnaire (2%)

Squelettique

Strabisme (60%), myopie et hypermétropie (60-70%), amblyopie (30%), nystagmus (10%), anomalies du segment antérieur (63%) et du fond d’œil (20%)Surdité (15-40%) de perception (otites) ou de transmission

Neurosensorielle

Hépatosplénomégalie (20-30%), syndrome myéloprolifératif (1%), LMMJ (<1%)Anomalies de la coagulation (20%)

Hématologique

Cardiopathie congénitale (80%): sténose pulmonaire (60%), HCM (20%), CIA (6-10%), CIV (5%), canal artériel persistant (3%), anomalie du canal atrioventriculaire, tétralogie de Fallot, anomalie mitraleAnomalies ECG (60%)

Cardiaque

Tableau 2. Principales atteintes dans le syndrome de Noonan (Allanson 1987; Sharland, Burch et al. 1992)

11

2. Le syndrome LEOPARD

Le SL est une maladie autosomique dominante dont le nom acronymique se réfère aux

caractéristiques cliniques les plus fréquentes : multiple Lentigines, Electrocardiographic-

conduction abnormalities, Ocular hypertelorism, Pulmonary stenosis, Abnormal genitalia,

Retardation of growth, sensorineural Deafness (Gorlin, Anderson et al. 1971). Ce syndrome

est phénotypiquement très proche du SN et s’en différencie principalement par l’existence

d’une atteinte cutanée (lentigines multiples) (figure 2) et d’une surdité. La prévalence de ce

syndrome n’est pas connue, plus de 200 cas ont été rapportés à travers le monde.

Figure 2. Caractéristiques cliniques du syndrome LEOPARD

Noter l’hypertélorisme et les lentigines multiples au niveau du thorax (Sarkozy, Conti et al. 2004).

2.1. Anomalies de la croissance et de la puberté

Les mensurations à la naissance des patients SL sont le plus souvent normales,

cependant environ un tiers d’entre eux présentent une macrosomie (définie par un poids de

naissance au-dessus du 97ème percentile) (Digilio, Sarkozy et al. 2006). Par la suite, ces

patients présentent un retard de croissance postnatal avec un retard statural (taille en dessous

du 3ème percentile) chez environ 25% d’entre eux (Gorlin, Anderson et al. 1971; Voron,

Hatfield et al. 1976). A l’âge adulte, 85% des patients auraient une taille en dessous du 25ème

percentile (Sarkozy, Digilio et al. 2008).

Il n’existe actuellement pas de données sur le statut hormonal de ces patients.

Concernant la fonction génitale, une cryptorchidie bilatérale est présente chez 50% des

garçons, mais des hypospadias et des hypoplasies génitales sont également retrouvés. Des

12

retards pubertaires et des ovaires hypoplasiques ont été rapportés chez la fille. La plupart des

cas familiaux sont d’origine maternelle suggérant une réduction de la fertilité masculine

(Voron, Hatfield et al. 1976; Digilio, Sarkozy et al. 2006).

2.2. Cardiopathie

Des malformations cardiaques sont retrouvées chez environ 80% des patients

(Sarkozy, Conti et al. 2004; Limongelli, Pacileo et al. 2007; Limongelli, Sarkozy et al. 2008).

Contrairement au SN, l’HCM est l’anomalie la plus fréquente (80%) alors que la sténose des

valves pulmonaires n’est présente que chez 20% des patients. Cette HCM, qui est en général

asymétrique et implique le ventricule gauche, est souvent associée à une obstruction

d’éjection du ventricule gauche (40%) ; elle peut être congénitale mais le plus souvent se

manifeste au cours de la seconde enfance. Des arrêts cardiaques et des morts subites ont été

rapportés chez certains patients SL porteurs de HCM (Somerville and Bonham-Carter 1972;

Woywodt, Welzel et al. 1998; Limongelli, Sarkozy et al. 2008).

Parmi les autres anomalies cardiaques, sont retrouvés des prolapsus de la valve mitrale (40%)

et, moins fréquemment, des anomalies septales (CIA, CIV, canal atrioventriculaire), un

élargissement du ventricule gauche isolé, une fibroélastose endocardique, des anomalies des

artères coronaires, un anévrysme apical et non compaction du ventricule gauche (Coppin and

Temple 1997; Limongelli, Pacileo et al. 2007).

Des anomalies de l’ECG sont observées chez 75% des patients. Ces anomalies sont en

rapport avec l’HCM mais il existe également des troubles de la conduction (20%)(Limongelli,

Pacileo et al. 2007).

2.3. Autres anomalies

Chez quelques patients SL, quelques cas de complications hématologiques (LAL,

LAM, neuroblastome) ont été rapportés (Voron, Hatfield et al. 1976; Merks, Caron et al.

2005; Ucar, Calyskan et al. 2006; Laux, Kratz et al. 2008). Un mélanome malin (Seishima,

Mizutani et al. 2007) et un choristome (tumeur de la cornée) bilatéral ont également été

décrits (Choi, Yoo et al. 2003).

Le développement psychomoteur de ces enfants est souvent normal, cependant, 30% d’entre

eux présentent un retard mental très modéré. La surdité est présente chez 20% des patients.

13

Chez ces patients sont également décrites des anomalies thoraciques (75%) et des

malformations des voies urinaires (Digilio, Sarkozy et al. 2006).

3. Les autres syndromes apparentés au syndrome de Noonan

3.1. Le syndrome Cardio-Facio-Cutané

Le syndrome CFC décrit en 1986 est une maladie sporadique phénotypiquement très

proche du SN (Reynolds, Neri et al. 1986; Wieczorek, Majewski et al. 1997). Les

caractéristiques cliniques associent une dysmorphie faciale caractéristique (avec front haut,

rétraction bitemporale, hypoplasie supraorbitaire), des anomalies ectodermiques (avec

eczéma, ichtyose, hyperkératose, cheveux et sourcils fins, épars et fragiles) (figure 3), une

cardiopathie et un retard mental (Roberts, Allanson et al. 2006). Les anomalies neurologiques

sont constantes à des degré divers incluant hypotonie, retard psycho-moteur, retard de langage

et difficultés d’apprentissage (Yoon, Rosenberg et al. 2007). Des critères diagnostiques ont

été proposés par certains auteurs (Kavamura, Peres et al. 2002).

Figure 3. Caractéristiques cliniques du syndrome Cardio-Facio-Cutané

Noter les cheveux fins et épars et les sourcils absents (Roberts, Allanson et al. 2006)

14

3.2. Le syndrome de Costello

Le SC décrit en 1971 est une maladie sporadique avec un phénotype beaucoup plus

sévère que le SN (Costello 1977; Hennekam 2003).

La dysmorphie faciale se distingue par des traits grossiers, des joues pleines, des lèvres et une

langue épaisses, une hypertrophie gingivale et une voix rauque (figure 4) (Delrue, Arveiler et

al. 2002). La peau est douce et plissée au niveau du dos des mains, par contre les plis

palmoplantaires sont particulièrement profonds et marqués. L’apparition de papillomes (péri-

oraux, péri-nasaux ou péri-anaux), qui peut survenir entre l’âge de 2 ans et la fin de

l’adolescence, est un signe clinique distinctif.

Figure 4. Caracéristiques cliniques du syndrome de Costello

Noter les traits grossiers du visage, les plis palmoplantaires épais et profonds (Delrue, Arveiler et al. 2002)

Les cardiopathies, retrouvées dans 60% des cas, sont essentiellement des HCM. Des troubles

du rythme sont également fréquents.

Le retard psychomoteur est constant, avec une marche acquise vers 4 ans, et le retard mental

moyen à léger (QI de 47 à 85) prédominant sur le langage. La plupart des enfants ont un

comportement chaleureux, sociable et gai. Il existe souvent une macrocrânie.

Enfin, ce syndrome est associé à un risque de tumeur solide élevé (10 à 15%). La tumeur la

plus fréquente est le rhabdomyosarcome, le plus souvent avec une histologie embryonnaire.

Des neuroblastomes, des ganglioneuroblastomes et des carcinomes cellulaires de la vessie

sont retrouvés moins fréquemment. Certains protocoles de dépistage systématique de ces

tumeurs ont été proposés (DeBaun 2002; Gripp, Lin et al. 2006).

15

3.3. La neurofibromatose de type 1 et le syndrome de Legius

La NF1, ou maladie de Von Recklinghausen, est une maladie autosomique dominante

dont la prévalence est de 1 pour 3000. Elle est caractérisée par l’association d’anomalies de la

pigmentation (taches café au lait, lentigines axillaires), de neurofibromes cutanés et

plexiformes, de nodules de Lisch au niveau de l’iris, d’une dysplasie osseuse et de gliomes

des voies optiques (Williams, Lucas et al. 2009). Les autres signes fréquemment observés

sont le retard statural, la macrocéphalie et des difficultés d’apprentissage et de comportement.

La gravité de cette maladie est liée au risque d’apparition de tumeurs, comme les

neuroblastomes et les rhabdomyosarcomes chez l’enfant. Plus rarement des leucémies de type

LMMJ peuvent apparaître.

Certains patients présentant une NF1 présentent une dysmorphie faciale évocatrice de SN ;

cette association a été parfois appelée syndrome Noonan-NF1 (figure 5) (Carey 1998).

Figure 5. Caractéristiques cliniques du syndrome Noonan-NF1

Noter chez le même patient l’existence d’une dysmorphie évocatrice de SN et de taches café au lait.

Le syndrome de Legius, ou « NF1-like », est une maladie autosomique dominante

qui partage de nombreuses caractéristiques avec la NF1. Ce syndrome associe des taches café

au lait, des lentigines axillaires et une macrocéphalie mais, contrairement à la NF1, il n’existe

pas de neurofibromes, de nodules de Lisch ou de tumeur du système nerveux central (Brems,

Chmara et al. 2007; Pasmant, Sabbagh et al. 2009).

16

Conclusion

Le SN et les syndromes apparentés représentent un groupe de syndromes génétiques

phénotypiquement très proches, parfois difficiles à différencier sur le plan clinique. Pendant

longtemps, s’est posée la question de l’expression variable d’une même maladie génétique ou

de maladies impliquant des gènes différents. Récemment, la découverte des différents gènes

impliqués dans ces syndromes a permis de répondre à cette question.

17

Chapitre II

Génétique du syndrome de Noonan et des syndromes apparentés :

les anomalies de la voie de signalisation Ras/MAPK

Dans tous ces syndromes, des mutations germinales constitutives de gènes codant pour

des molécules impliquées dans la voie Ras/Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) ont été

décrites ces dernières années. Dans ce chapitre, nous décrirons dans un premier temps les

différentes molécules impliquées dans la voie de signalisation Ras/MAPK. Puis, nous

préciserons les anomalies génétiques retrouvées dans le syndrome de Noonan et les

syndromes apparentés.

1. La voie Ras/MAPK

La voie de signalisation Ras/MAPK joue un rôle majeur dans la régulation du cycle

cellulaire, la prolifération, la différenciation, la survie et la mort cellulaires (Malumbres and

Barbacid 2003; Giehl 2005); toutes ces étapes sont critiques pour permettre un développement

normal. Cette voie transduit les signaux extracellulaires, véhiculés sous la forme de facteurs

de croissance, d’hormones ou de petites molécules, à l’environnement intracellulaire. Elle a

été particulièrement étudiée dans le contexte de l’oncogenèse puisque sa dérégulation est une

des premières causes de cancers.

1.1. Généralités

Dans les cellules de mammifères, il existe 4 principales voies de signalisation MAPK

qui ont été bien caractérisées (Johnson and Lapadat 2002). Ces cascades de signalisation sont

constituées de 3 protéines kinases qui sont activées séquentiellement, en partie par des

phosphorylations : une MAPK kinase kinase (MAPKKK), une MAPK kinase (MAPKK) et

une MAPK (figure 6). La voie de signalisation extracellular signal-regulated kinase

(Erk)/MAPK est activée par des facteurs de croissance et est particulièrement importante dans

l’oncogenèse humaine (figure 7) alors que les voies de signalisation c-Jun N-terminal kinase

(JNK), p38 et Erk5 sont activées en réponse à des signaux de stress provenant de

l’environnement, notamment le choc osmotique ou les radiations ionisantes.

18

Figure 6. Les principales voies de signalisation MAPK (Roberts and Der 2007)

Figure 7. Activation de la voie Ras/MAPK

La liaison d’un ligand (facteur de croissance) à son récepteur (récepteur tyrosine kinase par exemple) entraîne la

dimérisation et l’autophosphorylation du récepteur au niveau des résidus tyrosines du domaine cytoplasmique.

Ces tyrosines phosphorylées servent alors de site d’ancrage pour des protéines possédant des domaines

phosphotyrosine binding (PTB) ou Src homology-2 (SH2) telle que la molécule adaptatrice Grb2. Sos1, qui est

associée de façon constitutive à Grb2, est alors recrutée au niveau de la membrane plasmatique à proximité de

son substrat Ras. En facilitant le remplacement du GDP par le GTP, Sos1 stimule la formation de la forme active

de Ras liée au GTP. Ras activé active alors Raf qui active à son tour la protéine kinase MAPK/Erk kinase (Mek)

1/2 qui active alors Erk 1/2. La protéine Erk 1/2 activée transloque au niveau du noyau où elle phosphoryle et

régule divers facteurs de transcription, conduisant à des changements de l’expression des gènes cibles.

19

1.2. Description des molécules impliquées dans la voie Ras/MAPK

1.2.1. Ras et ses régulateurs

Les protéines Ras sont les membres fondateurs de la superfamille Ras des petites

protéines G monomériques à activité guanosine triphosphate hydrolase (GTPase). Cette

superfamille est constituée de 150 membres chez l’homme répartis dans 5 branches

principales en fonction de leur similarité de séquence et de fonction : Ras, Rho, Rab, Ran et

Arf (Wennerberg, Rossman et al. 2005). Les protéines Ras sont des modulateurs sophistiqués

de processus cellulaires divers et complexes. Des mutations de RAS (Rat sarcoma) sont

retrouvées dans de nombreuses tumeurs chez l’homme (Malumbres and Barbacid 2003). Un

autre aspect important de ces protéines est leur implication dans les processus neuronaux

comme les apprentissages, la mémoire et la plasticité synaptique (Atkins, Selcher et al. 1998;

Selcher, Atkins et al. 1999).

1.2.1.1. Structure et fonction de Ras

Il existe 3 principales isoformes de Ras qui partagent 85% de leur séquence d’acides

aminés : Harvey-Ras (HRas), Kirsten-Ras (KRas) et Neuroblastoma-Ras (NRas). Ces 3

isoformes sont exprimées de manière ubiquitaire, KRas étant exprimé pratiquement dans tous

les tissus. Des modèles murins ont montré que HRas et NRas n’interviennent pas dans le

développement alors que KRas est essentiel (Johnson, Greenbaum et al. 1997).

Ces différentes isoformes présentent 2 régions différentes : une région conservée en N-

terminal (résidus 5-166) qui constitue le domaine catalytique, et une région hypervariable en

C-terminal (résidus 167-188/189) qui constitue la séquence d’adressage membranaire (figure

8) (Wennerberg, Rossman et al. 2005).

Le domaine catalytique contient différentes régions fonctionnellement importantes permettant

la liaison aux groupements phosphates des nucléotides, la liaison à la guanine des nucléotides,

la liaison avec les effecteurs (boucle « switch I ») et la liaison aux activateurs de Ras (boucle

« switch II »). La séquence de cette région est partagée par les membres de la superfamille

Ras mais aussi les protéines Gsα et d’autres GTPases.

La région hypervariable contient un motif CAAX (C correspondant à une cystéine et A à une

alanine) qui va permettre la modification post transcriptionnelle des protéines Ras et leur

20

adressage membranaire. En effet, le motif CAAX est la séquence de reconnaissance

d’enzymes (farnesyltransferase et geranylgeranyltransferase I) qui catalysent l’addition

covalente de lipides (farnesyl et d’isoprenoid geranylgeranyl respectivement) au niveau du

résidu cystéine de ce motif.

Figure 8. Structure de la petite protéine G Ras.

Les domaines fonctionnels de la GTPase sont figurés sur le shéma (Wennerberg, Rossman et al. 2005)

Les protéines Ras fonctionnent comme des « switchs » moléculaires régulés par leur

liaison à la guanosine diphosphate (GDP) ou à la guanosine triphosphate (GTP) (Mitin,

Rossman et al. 2005). Ainsi, elles alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme

active lié au GTP, cette dernière permettant la transduction du signal en interagissant avec des

protéines situées en aval.

Les petites GTPases présentent une haute affinité de liaison pour le GDP et le GTP, mais

possèdent de faibles activités intrinsèques pour l’échange GDP/GTP et l’hydrolyse du GTP.

Le cycle GDP/GTP est donc contrôlé par 2 types de protéines régulatrices : les facteurs

d’échange de nucléotides à guanine (Guanosine nucleotide exchange factors, GEFs), qui

facilitent le remplacement du GDP par le GTP et stimulent la formation de la forme active de

Ras liée au GTP, alors que les protéines activatrices de GTPases (GTPase activating proteins,

GAPs) stimulent la formation de la forme inactive liée au GDP. Les 2 états de liaison aux

nucléotides (Ras-GDP ou Ras-GTP) entraînent des changements conformationnels au niveau

des régions switch I et II. C’est principalement à travers ces changements conformationnels

de Ras que les protéines régulatrices et les effecteurs « reconnaissent » le statut nucléotidique

de la GTPase (Mitin, Rossman et al. 2005).

21

1.2.1.2. Activation de Ras par la GEF Sos1

Les protéines Ras sont situées en aval de nombreux récepteurs transmembranaires:

récepteurs à activité tyrosine kinase (receptor tyrosine kinase, RTKs), récepteurs aux

cytokines, intégrines, récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPG) et canaux

calciques. L’activation de Ras par les RTKs, notamment le récepteur à l’EGF (EGF receptor,

EGFR), est une des plus importante. Cette activation fait intervenir le module Grb2/Sos.

L’activation en aval du RTK survient lors de la liaison d’un ligand (facteur de croissance)

entraînant la dimérisation et l’autophosphorylation du récepteur au niveau des résidus

tyrosines du domaine cytoplasmique. Ces tyrosines phosphorylées servent alors de site

d’ancrage pour des protéines possédant des domaines phosphotyrosine binding (PTB) ou Src

homology-2 (SH2) telle que la molécule adaptatrice Grb2. Grb2 est associée de façon

constitutive à la GEF son of sevenless-1 (Sos1) qui est alors recrutée au niveau de la

membrane plasmatique à proximité de son substrat Ras (Buday and Downward 1993).

Sos1 est une protéine complexe dans laquelle le domaine catalytique Cdc25 est précédé par

les domaines histone folds (HF), Dbl homology-pleckstrin homology (DP-HP) et Ras exhange

motif (REM), et suivis par la région polyproline (PxxP) qui lie des domaines SH3 (figure 9).

Figure 9. Structure et activation de Sos1 (Tartaglia, Pennacchio et al. 2007)

De manière basale, Sos1 est dans une conformation auto-inhibée faisant intervenir des

interactions intra- et inter-moléculaires complexes impliquant notamment l’unité DH-PH

(Sondermann, Soisson et al. 2004). Le mécanisme précis de l’activation de Sos1 est

incomplètement compris. Sos se lie à la fois à Ras-GTP et Ras-GDP et son domaine Cdc25

déplace les nucléotides à guanine par un mécanisme biochimique complexe qui implique la

formation de complexes binaires et ternaires avec Ras (Margarit, Sondermann et al. 2003). Le

remplacement du GDP par le GTP, stimule la formation de la forme active de Ras liée au

GTP.

22

1.2.1.3 Régulation négative de Ras par les GAPs p120RasGAP et Neurofibromine

Les deux GAPs de Ras les mieux caractérisées sont la p120RasGAP et la

Neurofibromine (Nf) (Bernards and Settleman 2004). Ces deux molécules, co-exprimées de

manière ubiquitaire, semblent jouer des rôles différents dans l’inactivation de Ras. La

p120RasGAP possède deux domaines SH2 qui lui permette d’être recrutée au niveau de

récepteurs activés ou de protéines adaptatrices. Au contraire, la Nf, qui ne possède pas de

domaine SH2, présente une haute affinité pour de faibles niveaux de Ras lié au GTP. Ainsi, la

Nf serait responsable du maintien de Ras sous sa forme inactive en l’absence de stimulation

cellulaire alors que p120RasGAP régulerait de manière négative Ras en réponse à des facteurs

de croissance.

1.2.2. La cascade de signalisation Raf/Mek/Erk

La forme active de Ras interagit avec de nombreuses molécules cibles (effecteurs),

incluant notamment Raf, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), RAL-guanine nucleotide

dissociation stimulator (RAL-GDS) et la phospholipase Cε (PLCε). La voie de signalisation

classique est la voie Ras/Raf/Mek/Erk impliquée dans la prolifération et la différenciation

médiées par les facteurs de croissance.

1.2.2.1. Raf

Les sérine/thréonine kinases Raf sont les effecteurs directs de Ras et sont situées au

sommet du module Raf/Mek/Erk. Il existe 3 isoformes de Raf (ARaf, BRaf et Raf-1 (ou

CRaf)) qui présentent une structure semblable avec 3 régions conservées (conserved regions,

CR) : CR1, CR2 et CR3 (figure 10).

Figure 10. Structure des isoformes de Raf (Wellbrock, Karasarides et al. 2004)

23

CR1 contient un domaine de liaison à Ras (Ras binding domain, RBD) et un domaine

riche en cystéine (cysteine-rich domaine, CRD) tous les deux impliqués dans le recrutement

membranaire. CR2 est un domaine de régulation de phosphorylation, il contient un site de

liaison (comprenant la sérine 259) pour la protéine 14-3-3 qui stabilise Raf dans sa forme

inactive. Il a été montré que CR1 et CR2 constituent un domaine régulateur négatif ; ainsi, la

suppression de ces 2 domaines conduit à l’activité oncogénique de Raf-1 (Heidecker, Huleihel

et al. 1990). Le domaine CR3 contient le domaine catalytique avec le segment d’activation.

Malgré ces caractéristiques structurales communes, les 3 isoformes de Raf diffèrent

considérablement dans leur distribution tissulaire, leur mode d’activation et de régulation

(Wellbrock, Karasarides et al. 2004). Ainsi, par exemple, alors que Raf-1 est exprimé de

manière ubiquitaire, BRaf, qui possède l’activité kinase la plus forte, est surtout exprimé dans

le cerveau. Les études d’invalidation des différentes isoformes de Raf chez la souris suggèrent

des fonctions non redondantes au niveau du développement (Galabova-Kovacs, Kolbus et al.

2006).

A l’état basal, la portion N-terminale interagit et inactive le domaine kinase CR3 en C-

terminal maintenant Raf dans une conformation auto-inhibée. Les dimères protéiques 14-3-3,

qui lient les sérines 259 (au niveau du CR2) et 621 (en C-terminal) phosphorylées, stabilisent

l’état auto-inhibé de Raf (Muslin, Tanner et al. 1996). L’activation de Raf par Ras induit la

libération des dimères 14-3-3 et stimule dans le même temps la phosphorylation des sites

d’activation du domaine kinase. L’effet cumulatif de ces phosphorylations, de la liaison à Ras

et des interactions avec les lipides membranaires est de rompre l’auto-inhibition de Raf et de

stabiliser la conformation active du domaine kinase (Dhillon, Meikle et al. 2002; Wellbrock,

Karasarides et al. 2004). Des protéines phosphatases (PP) sont également impliquées dans

l’activation de Raf. Ainsi, il a été montré que PP1 et PP2A régulent positivement l’activation

de Raf en déphosphorylant le site de liaison de 14-3-3 au niveau de la sérine 259 permettant

ainsi l’interaction avec Ras et le recrutement membranaire.

De manière intéressante, certaines études ont montré que l’hétérodimérisation avec BRaf

contribue à l’activation de Raf-1 (Garnett, Rana et al. 2005). Cette hétérodimérisation avec

BRaf induirait la conformation active de la kinase de Raf-1 en permettant la phosphorylation

du segment d’activation de Raf-1. On ne sait pas actuellement si cette phosphorylation est

causée par BRaf, une autre kinase ou une auto-phosphorylation de Raf-1. On ne sait

également pas si Raf-1 peut moduler l’activité de BRaf et si l’hétérodimérisation concerne

également ARaf.

24

1.2.2.2. Mek et Erk 1 et 2

Une fois activée, les protéines Raf sont capables de phosphoryler Mek 1/2 qui à son

tour phosphoryle Erk 1/2. Contrairement, à la complexité de l’activation de Raf, Mek et Erk

deviennent complètement actifs simplement par la phosphorylation du segment d’activation

de leurs domaines kinases respectifs.

Mek 1 et 2 sont des kinases qui activent toutes les deux Erk 1 et 2 mais semblent ne pas avoir

de fonction redondante. Les données génétiques de modèles murins indiquent que Mek 1 est

essentiel pour le développement embryonnaire (Giroux, Tremblay et al. 1999) alors que Mek

2 ne l’est pas (Belanger, Roy et al. 2003). Les protéines Mek sont constituées d’un domaine

régulateur en N-terminal et d’un domaine kinase (figure 11).

Figure 11. Structure de Mek 1 et 2 (Rodriguez-Viciana and Rauen 2008)

Erk 1 et 2 sont les derniers éléments de la cascade et exercent leur fonction sur de nombreuses

molécules nucléaires et cytosoliques situées en aval. Les substrats de Erk 1 et 2 incluent des

composants nucléaires, des facteurs de transcription, des protéines membranaires et des

protéines kinases qui contrôlent la progression du cycle cellulaire, la différenciation et la

prolifération (Yoon and Seger 2006).

25

1.3. Régulation de l’activation de la voie Ras/MAPK :

L’activation de la voie Ras/MAPK joue un rôle majeur dans des processus clés comme

la différenciation et la prolifération, elle doit donc être précisément régulée pour permettre

une réponse physiologique appropriée. Il existe divers mécanismes de contrôle permettant de

moduler cette activation.

1.3.1. La tyrosine phosphatase Shp2

Shp2, codée par le gène PTPN11, est une protéine tyrosine phosphatase non

récepteur exprimée de manière ubiquitaire et qui joue un rôle fondamental dans la régulation

de voies de signalisation majeures (en particulier la voie Ras/MAPK) activées en réponse à de

nombreux facteurs de croissance, cytokines et hormones. Le rôle de Shp2 dans la régulation

positive de l’activation de la voie Ras/MAPK sera développé dans le chapitre 4.

1.3.2. Les protéines Sprouty et Spred

Chez l’homme, il existe 4 isoformes des protéines Sprouty (Spry 1 à 4) qui présentent

deux domaines conservés : un domaine riche en cystéine en C-terminal permettant la

localisation membranaire, et un domaine contenant un résidu tyrosine en N-terminal

permettant, lorsqu’il est phosphorylé, l’interaction avec des molécules possédant un domaine

SH2 (Kim and Bar-Sagi 2004). La divergence de séquence au niveau du domaine N-terminal

entre les protéines Spry pourrait être à l’origine de leurs fonctions différentes en médiant des

interactions protéines-protéines différentes. L’expression de ces protéines est induite par les

mêmes voies de signalisation qu’elles contrôlent, constituant ainsi un rétrocontrôle négatif.

Des modèles d’invalidation génique ont montré que Spry exercerait une activité

inhibitrice en aval des RTKs et en amont de Erk ; cependant, les mécanismes moléculaires

précis sont incomplètement connus. Les protéines Spry pourraient interagir, par leur résidu

tyrosine phosphorylé, avec la molécule adaptatrice Grb2. Ainsi, dans la signalisation induite

par le fibroblast growth factor (FGF), l’association Spry/Grb2 entraîne une séquestration de

Grb2 empêchant la transmission du signal (Hanafusa, Torii et al. 2002). Un autre mode

d’action serait l’interaction des protéines Spry, par leur domaine riche en cystéine, avec le

domaine catalytique de Raf. Cette interaction bloquerait l’activation de Raf par la protéine

26

kinase Cδ (PKCδ) mais pas l’activation de Raf dépendante de Ras (Sasaki, Taketomi et al.

2003).

Cependant, le rôle de régulateur négatif de Spry dans l’activation des RTKs reste controversé

car leurs effets dépendent de l’isoforme de Spry, du récepteur activé, du type et du contexte

cellulaire (Mason, Morrison et al. 2006). Ainsi, bien qu’étant considérés comme des

régulateurs négatifs de l’activation de la voie Ras/MAPK en aval du FGFR, ces protéines

réguleraient positivement cette voie en aval de l’EGFR (Waterman, Katz et al. 2002). Ce rôle

positif pourrait s’expliquer par une inhibition de l’ubiquitination de l’EGFR (Wong, Fong et

al. 2002).

Un domaine riche en cystéine partageant des similarités de séquence avec celui des

protéines Spry (cysteine-rich domaine related to sprouty, SPR) a été identifié dans les

protéines SPRY-related proteins with an EVH1 domain (Spred) dont il existe 2 isoformes

(Spred 1 et 2). En plus du domaine SPR en C-terminal, ces protéines contiennent un domaine

central de liaison à KIT (KIT-binding domain, KBD) et un domaine ENA/Vasodilatator-

stimulated phosphoprotein (VASP) homology-1 (EVH1) en N-terminal (figure 12).

Figure 12. Structure des protéines Spred et Sprouty (Kim and Bar-Sagi 2004)

Le domaine SPR intervient dans la localisation membranaire des protéines Spred et dans

l’interaction avec Raf. Le domaine EVH1 reconnaît et lie des séquences riches en proline,

cependant les ligands spécifiques des protéines Spred ne sont pas encore identifiés. Enfin, la

fonction physiologique du domaine KBD est encore inconnue.

Les protéines Spred semblent agir principalement en aval de Ras en inhibant la

phosphorylation et l’activation de Raf (Wakioka, Sasaki et al. 2001). Ainsi, Spred s’associe à

Ras ce qui n’empêche pas l’activation de Ras ni le recrutement membranaire de Raf. Par

contre, Spred prolonge l’association de Raf à Ras ce qui pourrait diminuer son activation en

altérant sa distribution cellulaire.

27

2. Les anomalies génétiques de la voie Ras/MAPK

Des mutations germinales constitutives de gènes codant pour des molécules

impliquées dans la voie Ras/MAPK sont retrouvées dans le syndrome SN et les syndromes

apparentés (figure 13).

Figure 13. Les anomalies constitutives des molécules impliquées dans la voie Ras/MAPK à l’origine des

syndromes Neuro-Cardio-Facio-Cutanés

Ainsi, il a été proposé de regrouper l’ensemble de ces syndromes sous le nom de « syndromes

Neuro-Cardio-Facio-Cutanés » (NCFC) (Bentires-Alj, Kontaridis et al. 2006). Cependant, la

classification nosologique de ces syndromes continue à être discutée. Actuellement, il semble

admis que le SN est causé par des mutations de 3 gènes (PTPN11, SOS1 et RAF1), le SL par

des mutations de 2 gènes (PTPN11 et RAF1), le syndrome CFC par des mutations de 3 autres

gènes (BRAF, MEK 1 et 2), et le syndrome de Costello par des mutations de HRAS. Les

patients présentant des mutations de KRAS sont plus difficiles à classer du fait de phénotypes

à la frontière entre les SN, CFC et Costello (Neri, Allanson et al. 2008). Cependant, dans la

littérature, de nombreuses exceptions ont été décrites pour d’autres gènes : mutation de SOS1

chez un patient diagnostiqué CFC (Nystrom, Ekvall et al. 2008) ou mutation de BRAF chez

des patients diagnostiqués SN (Razzaque, Nishizawa et al. 2007; Nystrom, Ekvall et al. 2008).

28

De manière générale, les mutations responsables des syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés

semblent être de type gain de fonction, c'est-à-dire qu'elles conduisent à une activation de la

voie Ras/MAPK supérieure à la normale.

Des mutations germinales de gènes codant pour d’autres molécules de la voie

Ras/MAPK sont retrouvées dans certains syndromes qui ne rentrent pas dans le cadre strict

des syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés et seront décrites à part.

Enfin, des mutations somatiques acquises des mêmes gènes sont à l’origine du

développement de tumeurs malignes, elles seront précisées brièvement car elles peuvent

donner des indications sur le risque tumoral associé aux pathologies constitutives.

2.1. Gènes impliqués dans les syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés

2.1.1. Le gène PTPN11

Des mutations faux-sens du gène PTPN11, localisé en 12q24 , codant pour la tyrosine

phosphatase Shp2, sont retrouvées chez environ 40% des patients SN et 85% des patients SL.

Aucune mutation de PTPN11 n’a été retrouvée chez les patients CFC (Musante, Kehl et al.

2003).

En 1994, une analyse de liaison génétique dans 2 larges familles a permis de localiser

l’un des gènes impliqués dans le SN sur le bras long du chromosome 12 (Jamieson, van der

Burgt et al. 1994). Puis, d’autres analyses de liaison ont permis de mieux délimiter le locus

critique en 12q24.1 (Brady, Jamieson et al. 1997; Legius, Schollen et al. 1998). L’absence de

liaison à ce locus dans certaines familles a fait évoquer une hétérogénéité génétique

(Jamieson, van der Burgt et al. 1994). En 2001, une approche par gène candidat a permis de

mettre en évidence des mutations au niveau du gène PTPN11 situé à ce locus, composé de 16

exons dont 15 codants (Noonan 2006).

La prévalence des mutations de PTPN11 dans le SN a été initialement évaluée à 45% (Kosaki,

Suzuki et al. 2002). Les mutations sont significativement plus fréquentes dans les formes

transmises (59%) que dans les formes sporadiques (37%), suggérant que les autres gènes

impliqués dans le SN sont responsables d’une pénétrance incomplète ou un effet négatif plus

important sur la fertilité que PTPN11. Les études ultérieures ont retrouvé une fréquence des

29

mutations de PTPN11 chez 33 à 40% des patients SN (Kosaki, Suzuki et al. 2002;

Maheshwari, Belmont et al. 2002; Musante, Kehl et al. 2003; Yoshida, Hasegawa et al. 2004).

Une étude retrouve un pourcentage de détection de 60% soulignant que les critères

d’inclusion et le recrutement peuvent faire varier la fréquence (Zenker, Buheitel et al. 2004).

De plus, la fréquence varie également en fonction de la proportion des formes familiales et

sporadiques. Lorsque le SN est secondaire à une mutation du gène PTPN11, dans les formes

familiales, la pénétrance est complète et il y a une prédominance de garçons avec un sex ratio

de 2 :1 en leur faveur et dans les formes de novo, il existe une prédominance de l’origine

paternelle de l’allèle muté avec un effet de l’âge paternel (Tartaglia, Cordeddu et al. 2004).

Des mutations du gène PTPN11 codant pour Shp2 ont été décrites chez 75% des SL (Digilio,

Conti et al. 2002; Legius, Schrander-Stumpel et al. 2002).

Dans le SN, les mutations de PTPN11 entraînent une augmentation de l’activité de

Shp2 et une activation de la voie Ras/MAPK. Au contraire, dans le SL, les mutations de

PTPN11 sont responsables d’une diminution de l’activité PTP. Comment des mutations gain

de fonction (SN) et perte de fonction (SL) du même gène peuvent être responsables de

phénotypes similaires est à ce jour incompris. Ces données seront développées dans le

chapitre 4.

Des mutations activatrices de PTPN11 sont également retrouvées dans certaines

pathologies acquises comme les leucémies : chez 34% des enfants présentant une JMML

isolée (Tartaglia, Niemeyer et al. 2003), 10% des enfants présentant un syndrome

myéloprolifératif et 4% des enfants présentant une leucémie aigue myéloblastique (LAM)

(Loh, Reynolds et al. 2004; Tartaglia, Martinelli et al. 2004; Tartaglia, Niemeyer et al. 2004;

Loh, Martinelli et al. 2005). Ces mutations somatiques acquises, pratiquement exclusivement

(95%) localisées au niveau de l’exon 3 codant pour le domaine N-SH2 de Shp2, sont

différentes de celles retrouvées dans le SN.

30

2.1.2. Le gène SOS1

Des mutations faux sens du gène SOS1, localisé en 2p22-p21, sont retrouvées chez

environ 20% des patients SN (Pandit, Sarkozy et al. 2007; Roberts, Araki et al. 2007), il s’agit

donc après PTPN11 de la deuxième cause la plus fréquente de SN.

La plupart des mutations de SOS1 retrouvés dans le SN sont localisés dans les domaines DH-

PH et REM. Ces mutations semblent conduire à un relâchement de l’auto-inhibition, suivi par

une augmentation de l’activité GEF et par conséquent une augmentation de la forme active de

Ras liée au GTP et de l’activation de Erk in vitro (Pandit, Sarkozy et al. 2007; Roberts, Araki

et al. 2007).

Les mutations de SOS1 sont exceptionnelles dans les cancers. Ainsi, dans une étude

récente, seulement 3 mutations de SOS1 ont été identifiées dans une série de 810 tumeurs

malignes, leucémies myéloïdes aigues et neuroblastomes (Swanson, Winter et al. 2008).

2.1.3. Le gène RAF

2.1.3.1. RAF1

Des mutations de RAF1, localisé en 3p25, sont retrouvées chez environ 5% des

patients SN et SL. Il s’agit de mutations faux sens regroupées principalement au niveau de 2

régions et ayant des conséquences fonctionnelles distinctes.

La plupart des mutations sont localisées dans la région proche de la sérine 259 (dans le CR2)

qui permet l’auto-inhibition de Raf1 par sa liaison à 14-3-3. L’expression de ces mutants

entraîne, par rapport à la forme sauvage, une augmentation de l’activité kinase, de manière

basale et sous stimulation par l’EGF, responsable d’une activation constitutive de Mek et de

Erk plus forte (Pandit, Sarkozy et al. 2007; Razzaque, Nishizawa et al. 2007). Le mutant

S257L, le plus fréquemment retrouvé, est responsable d’une diminution de la liaison au 14-3-

3 malgré une phosphorylation normale de la sérine 259 (Pandit, Sarkozy et al. 2007). La

majorité (95%) des patients présentant ces mutations présente une HCM.

D’autres mutations sont localisées au niveau du segment d’activation de Raf1 dans le CR3.

L’expression de ces mutants entraîne, par rapport à la forme sauvage, une diminution de

l’activité kinase de Raf et par conséquent de l’activation de Erk (Pandit, Sarkozy et al. 2007).

De façon intéressante, ces mutations sont peu associées à une HCM.

31

Des mutations de RAF1 sont rarement observées dans les cancers (Greenman,

Stephens et al. 2007). Presque toutes les mutations de RAF1 retrouvées dans les SN et SL

sont différentes de celles retrouvées dans les cancers à l’exception de la mutation S259A

observée dans un carcinome ovarien (Greenman, Stephens et al. 2007).

2.1.3.2. BRAF

Le gène BRAF, localisé en 7q34, est muté chez presque la moitié des patients CFC.

Il s’agit de mutations faux-sens essentiellement regroupées au niveau de 2 domaines : le

domaine riche en cystéine au niveau du CR1 et le domaine protéine kinase. Plus rarement, son

retrouvées des mutations au niveau de la boucle riche en glycine, du domaine catalytique ou

du segment d’activation. Les analyses cristallographiques ont montré que les mutations

situées au niveau du domaine protéine kinase sont localisées au niveau de l’interface avec la

fente de liaison à l’ATP suggérant que ces mutations pourraient altérer l’activité catalytique

du domaine kinase (Narumi, Aoki et al. 2007). Les analyses fonctionnelles ont révélé que

certaines mutations dans le domaine riche en cystéine (A246P et Q257R) ou dans le domaine

kinase (S467A, L485F, L485S et K499E) sont responsables d’une augmentation de l’activité

kinase, comparable à celle de la mutation V600E retrouvée dans les cancers, alors que

d’autres mutations (E501G et G596V) la réduisent, ce qui est également retrouvé chez les

mutants de BRAF responsables de pathologie tumorale (Narumi, Aoki et al. 2007; Rodriguez-

Viciana and Rauen 2008).

L’expression des mutants activateurs de BRAF dans des cultures cellulaires entraîne une

activation de Erk1/2 et l’activation du facteur de transcription Elk situé en aval, alors que

l’expression des mutants perte de fonction ont un effet opposé (Narumi, Aoki et al. 2007;

Rodriguez-Viciana and Rauen 2008).

Des mutations de BRAF, différentes des mutations germinales, ont été identifiées

dans 7% des cancers notamment des mélanomes, des carcinomes thyroïdiens et des cancers

colo-rectaux (Garnett and Marais 2004). La mutation V600E, responsable d’une augmentation

de l’activité kinase, représente 90% des mutations somatiques. Les mutants associés à une

diminution de l’activité kinase activent Erk in vivo par un mécanisme activant Raf1 (Wan,

Garnett et al. 2004).

32

2.1.4. Les gènes MEK 1 et 2

Environ 20% des patients CFC présentent des mutations des gènes MEK1 et MEK2,

localisés respectivement en 15q22 et 19p13.3 (Rodriguez-Viciana and Rauen 2008). Les

mutations de MEK1 sont 2 fois plus fréquentes que les mutations de MEK2. Ces mutations

sont préférentiellement localisées dans la région régulatrice et la région adjacente N-terminale

du domaine catalytique. Ces mutations sont de type gain de fonction. Les souris transgéniques

exprimant des mutants activateurs de Mek1 ont également une activation de la signalisation

de Mek1-Erk1/2 et présentent une HCM (Bueno, De Windt et al. 2000), une hyperkératose,

une hyperprolifération épidermique (Hobbs, Silva-Vargas et al. 2004) et une cataracte (Gong,

Wang et al. 2001).

Bien que l’activation de Mek soit nécessaire à la transformation cellulaire et que les

mutants activateurs stimulent cette transformation, aucune mutation de MEK 1 ou 2 n’a été

reportée dans les cancers chez l’homme (Bansal, Ramirez et al. 1997).

2.1.5. Le gène RAS

2.1.5.1. HRAS

Une approche par gène candidat a permis d’identifier chez les patients SC des

mutations du gène HRAS localisé en 11p15.5 (Aoki, Niihori et al. 2005). Ces mutations qui

altèrent essentiellement les résidus Gly12 et Gly13 ont été identifiées auparavant dans des

tumeurs solides acquises, notamment des carcinomes de la vessie (Tabin, Bradley et al. 1982;

Taparowsky, Suard et al. 1982). Plusieurs études ont permis de préciser les données

moléculaires (Estep, Tidyman et al. 2006; Gripp, Lin et al. 2006; Kerr, Delrue et al. 2006; van

Steensel, Vreeburg et al. 2006; Zampino, Pantaleoni et al. 2007). Les mutations de HRAS sont

retrouvées chez 85% des patients présentant un SC. La mutation G12S est la plus fréquente,

retrouvée chez 80% des patients, alors qu’elle n’est présente que dans 5% des tumeurs

solides. La présence de tumeurs est plus fréquente chez les patients SC présentant la mutation

G12A (deuxième mutation la plus fréquente) que ceux avec la mutation G12S (57 versus 9%).

Ces mutations sont de type gain de fonction du fait de l’inactivation de l’activité GTPase

intrinsèque nécessaire à l’inactivation de RAS-GTP (Colby, Hayflick et al. 1986). Des études

à partir de fibroblastes cutanés de patients ont montré une augmentation de la prolifération

33

cellulaire induite par des facteurs de croissance (Aoki, Niihori et al. 2005). Les anomalies de

développement retrouvées dans le SC sont causées par des mutations gain de fonction moins

forte que dans la pathologie tumorale acquise.

Des mutations plus rares de HRAS, K117R et A146T affectant une portion différente de la

protéine, sont observées chez certains patients (Kerr, Delrue et al. 2006; Zampino, Pantaleoni

et al. 2007). Les analyses fonctionnelles ont montré que le mutant K117R a une activité

GTPase, intrinsèque et en réponse aux GAPs, normale. Cependant, le taux de dissociation

nucléotidique est augmenté ce qui entraîne une nette augmentation de la forme active liée au

GTP du fait de la concentration intra-cellulaire plus importante de GTP (Denayer, Parret et al.

2008). Toutes ces substitutions altèrent le même domaine de Ras (impliqué dans la liaison à la

guanine) que les mutations V152G et D153V de KRAS retrouvées chez des patients SN avec

un phénotype sévère (Carta, Pantaleoni et al. 2006).

Des mutations de HRAS ont été retrouvées chez des patients diagnostiqués initialement CFC.

Cependant, du fait du risque tumoral important associé aux mutations de HRAS et du

dépistage tumoral à mettre en place, il a été proposé de réserver le diagnostic de SC aux

patients porteurs de mutations de HRAS (Kerr, Allanson et al. 2008).

2.1.5.2. KRAS

Une approche par gène candidat a permis d’identifier des mutations du gène KRAS,

localisé en 12p12.1, chez moins de 3% des patients SN et chez 5% des patients CFC (Carta,

Pantaleoni et al. 2006; Schubbert, Zenker et al. 2006). De manière intéressante, les patients

SN présentaient un phénotype sévère et les patients CFC n’avaient pas d’atteinte cutanée

typique suggérant que le phénotype associé aux mutations de KRAS est distinct, à l’interface

entre le SN et le CFC. Les mutations D153V (la plus fréquente) et G60R sont retrouvées dans

ces 2 syndromes.

La position des 4 résidus (Val14, Thr58, Val152 et Asp153) altérés chez les patients NS

suggère 2 mécanismes pathogéniques distincts qui sont tous deux responsables d’une

activation de la voie Ras/MAPK.

Les deux mutants V14I et T58I, qui affectent respectivement la boucle P et Switch II, ont une

activité GTPase diminuée, de manière basale et sous stimulation par une protéine GAP, par

34

rapport à la forme sauvage (Schubbert, Zenker et al. 2006). Ainsi, ces mutants diminuent

l’inactivation de KRas.

Les deux autres mutants de KRAS associés au SN, V152A et D153V, altèrent des résidus

localisés au niveau de la zone d’interaction avec le nucléotide guanine ce qui entraîne une

augmentation de la dissociation GTP/GDP. La concentration de GTP dans la cellule étant plus

importante, ceci entraîne une prédominance de la forme active de KRAS (Carta, Pantaleoni et

al. 2006). Les analyses fonctionnelles ont montré que la mutation D153V (contrairement à la

mutation G60R) augmente la transactivation de Elk (niihori 2006).

Des mutations somatiques de KRAS sont retrouvées dans des tumeurs du poumon, du

colon ou du pancréas mais sont différentes des mutations germinales (Downward 2003). Les

analyses fonctionnelles ont montré que ces mutations sont responsables d’une augmentation

d’activation de Ras plus importante que les mutations germinales (Schubbert, Zenker et al.

2006). Une des hypothèses est que Ras joue un rôle important dans l’embryogenèse et que les

mutations fortement activatrices, comme celles retrouvées dans les cancers, seraient

responsable d’une létalité embryonnaire. Ceci est renforcé par le fait que les souris invalidées

pour KRAS meurent in utero alors que les souris invalidées pour HRAS et NRAS survivent

(Johnson, Greenbaum et al. 1997).

2.1.6. Le gène NF1

La NF1 est causée par des mutations du gène NF1 localisées en 17q11.2 (Legius,

Marchuk et al. 1993) qui code pour la Nf (Xu, O'Connell et al. 1990; Cichowski and Jacks

2001). Des mutations de ce gène sont retrouvées chez 95% des patients remplissant les

critères diagnostiques de la National Institutes of Health (NIH) (Messiaen, Callens et al. 2000;

Ferner, Huson et al. 2007). La plupart des mutations de NF1 (90 à 95%) sont des mutations

intragéniques, les mutations restantes (5 à 10%) sont des microdélétions comprenant le gène

NF1 et les gènes contigus (Kluwe, Siebert et al. 2004).

Les mutations faux sens de NF1 sont responsables d’une perte de fonction de la GAP

entraînant une réduction de l’activité GTPase de Ras et par conséquent une augmentation de

la forme active de Ras liée au GTP et une activation de la voie Ras/MAPK.

Les patients présentant une délétion de la région contenant NF1 ont un risque tumoral plus

important, des difficultés d’apprentissage plus marquées et sont plus grands que les patients

présentant des mutations intragéniques (De Raedt, Maertens et al. 2006).

35

2.1.7. Le gène SPRED1

Des mutations de SPRED localisé en 15q13.2 sont retrouvées chez 0.5% des patients

présentant une NF1 et 5% des patients présentant un syndrome de Legius (Pasmant, Sabbagh

et al. 2009). Ces mutations sont responsables d’une protéine tronquée résultant en une perte

de fonction du rôle régulateur négatif de cette molécule entraînant une activation de la voie

Ras/MAPK.

2.2. Les autres anomalies constitutives de la voie Ras/MAPK

Des mutations germinales constitutives de gènes codant pour d’autres molécules de la

voie Ras/MAPK sont retrouvées dans certains syndromes qui ne rentrent pas dans le cadre

strict des « syndromes neuro-cardio-facio-cutanés ».

2.2.1. RASA1 et le syndrome malformation artérioveineuse-malformation capillaire

Le syndrome malformation artérioveineuse-malformation capillaire (capillary

malformation-arteriovenous malformation, CM-AVM) est une maladie autosomique

dominante caractérisée par des malformations capillaires multifocales qui peuvent être

associées à des malformations artérioveineuses et des fistules (Boon, Mulliken et al. 2005).

Ces malformations peuvent survenir dans de nombreux tissus incluant la peau, les muscles,

les os et des organes internes comme le cerveau et le cœur. Ce syndrome est causé par des

mutations inactivatrices du gène RASA1 qui code pour p120RasGAP (Eerola, Boon et al.

2003). Des mutations de RASA1 ont également été associées au syndrome de Parkes Weber

(associant des flushs cutanés en rapport avec de multiples microfistules) et aux malformations

de la veine de Gallien (Revencu, Boon et al. 2008). Les mutations inactivatrices de RASA1

sont responsables d’une diminution de l’hydrolyse de Ras lié au GTP et donc d’une activation

de la voie Ras/MAPK. Les patients CM-AVM ne semblent pas à risque de développer des

tumeurs.

Des mutations somatiques de RASA1 ont été retrouvées dans des carcinomes

basocellulaires (Friedman, Gejman et al. 1993).

36

2.2.2. NRAS et le syndrome lymphoprolifératif autoimmun

Le syndrome lymphoprolifératif autoimmun (autoimmune lymphoproliferative

syndrome, ALPS) est caractérisé par une anomalie de l’apoptose des lymphocytes, une

accumulation de lymphocytes non malins et une augmentation du risque de développer des

hémopathies malignes (Oliveira, Bidere et al. 2007). La plupart des cas d’ALPS sont causés

par des mutations au niveau de la voie CD95 et entraînent une anomalie de l’apoptose médiée

par le récepteur Fas extrinsèque (Oliveira, Bidere et al. 2007). Cependant, récemment une

mutation germinale de NRAS, non impliqué dans la voie CD95, a été identifiée chez un patient

présentant un ALPS (Oliveira, Bidere et al. 2007). Cette mutation est responsable d’une

stabilisation de la forme active de Ras liée au GTP entraînant une activation de la voie

Ras/MAPK. L’augmentation de la phosphorylation de Erk inhibe l’expression d’une protéine

stimulant l’apoptose (BCL-2-interacting mediator of cell death, BIN) dans les lymphocytes,

inhibant ainsi l’apoptose mitochondriale intrinsèque (Oliveira, Bidere et al. 2007).

Contrairement aux mutations de HRAS et KRAS, les mutations activatrices de NRAS ne sont

pas associées à des anomalies du développement soulignant les fonctions différentes de ces

isoformes.

2.2.3. SOS1 et la fibromatose gingivale héréditaire

La fibromatose gingivale héréditaire (hereditary gingival fibromatosis, HGF) est

caractérisée par une fibrose progressive et bénigne de la gencive kératinisée (Hart, Pallos et

al. 1998). Il s’agit d’une maladie génétique hétérogène avec une transmission qui peut être

autosomique dominante ou récessive. Une mutation par insertion du gène SOS1 a été

identifiée dans une forme autosomique dominante (Hart, Zhang et al. 2002). Cette insertion

est responsable d’un décalage du cadre de lecture qui entraîne l’apparition de 22 nouveaux

acides aminés avant un codon stop prématuré ce qui abolit 4 domaines de liaison SH3 riches

en proline impliqués dans la liaison à Grb2 (Hart, Zhang et al. 2002). Les études

fonctionnelles ont montré que la protéine tronquée, qui est localisée à la membrane en

l’absence de stimulation par un facteur de croissance, active Ras et la voie Ras/MAPK (Jang,

Lee et al. 2007). Contrairement aux mutations de SOS1 retrouvées dans le SN, ces mutations

associées à HGF ne sont pas associées à des anomalies du développement.

37

Conclusion

Les syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés sont donc en rapport avec des mutations

germinales constitutives de molécules impliquées dans la voie Ras/MAPK. La plupart de ces

mutations sont responsables d’une activation soutenue de cette voie ce qui semble fournir un

mécanisme relativement commun à l'origine de ces syndromes.

La découverte de ces gènes a permis une meilleure description clinique de ces syndromes en

fonction du gène concerné.

Chapitre III

Corrélations phénotype/génotype

dans les syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés

La découverte des gènes impliqués dans les syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés a

permis de préciser la fréquence des différents signes en fonction des mutations mises en

évidence.

1. Syndrome de Noonan

Les données des principales études concernant les anomalies de PTPN11 (Tartaglia,

Kalidas et al. 2002; Musante, Kehl et al. 2003; Sarkozy, Conti et al. 2003; Yoshida, Hasegawa

et al. 2004; Zenker, Buheitel et al. 2004; Jongmans, Sistermans et al. 2005; Niihori, Aoki et

al. 2005; Sznajer, Keren et al. 2007; Ferrero, Baldassarre et al. 2008; Ko, Kim et al. 2008),

SOS1 (Roberts, Araki et al. 2007; Tartaglia, Pennacchio et al. 2007; Zenker, Horn et al. 2007;

Ko, Kim et al. 2008), RAF1 (Pandit, Sarkozy et al. 2007; Razzaque, Nishizawa et al. 2007;

Ko, Kim et al. 2008) et KRAS (Carta, Pantaleoni et al. 2006; Schubbert, Zenker et al. 2006;

Nava, Hanna et al. 2007; Zenker, Lehmann et al. 2007; Ko, Kim et al. 2008) sont résumées

dans le tableau 3.

38

31% (5/16)NDND23% (13/56)51% (46/90)Ecchymoses

50% (5/10)NDND9% (2/22)14% (17/122)Anomalie coagulation

25% (3/12)38% (3/8)58% (7/12)53% (19/36)69% (97/141)Cryptorchidie

21% (11/51)NDND0% (0/10)15% (5/33)Surdité

30% (15/50)88% (15/17)41% (14/33)15% (9/61)39% (90/233)Retard développement

NDNDNDND32% (32/99)Cubitus valgus

68% (17/25)75% (6/8)50% (5/10)74% (37/50)59% (135/228)Déformation thorax

18% (4/22)84% (16/19)85% (29/34)35% (22/63)73% (185/254)Retard statural

4% (1/27)ND23% (13/13)16% (4/25)7% (17/223)CIV

12% (1/8)12% (5/8)35% (12/34)20% (5/25)23% (66/291)CIA

54% (28/52)42% (5/12)76% (26/34)11% (7/66)8% (30/362)HCM

15% (8/52)67% (8/12)12% (4/34)70% (46/66)66% (240/362)Sténose pulmonaire

82% (43/52)67% (10/15)94% (32/34)72% (28/39)82% (274/333)Cardiopathie

NDNDNDND85% (110/129)Dysmorphie typique

1,3 (8/6)1,4 (18/13)0,8 (25/31)1,3 (189/143)Sex ratio M/F

85% (52)2-3% (19)5% (31)20% (72)40% (387)Fréquence (n patients)

PTPN11(inactivatrice)KRASRAF1SOS1PTPN11

(activatrice)

Syndrome LEOPARDSyndrome de Noonan

31% (5/16)NDND23% (13/56)51% (46/90)Ecchymoses

50% (5/10)NDND9% (2/22)14% (17/122)Anomalie coagulation

25% (3/12)38% (3/8)58% (7/12)53% (19/36)69% (97/141)Cryptorchidie

21% (11/51)NDND0% (0/10)15% (5/33)Surdité

30% (15/50)88% (15/17)41% (14/33)15% (9/61)39% (90/233)Retard développement

NDNDNDND32% (32/99)Cubitus valgus

68% (17/25)75% (6/8)50% (5/10)74% (37/50)59% (135/228)Déformation thorax

18% (4/22)84% (16/19)85% (29/34)35% (22/63)73% (185/254)Retard statural

4% (1/27)ND23% (13/13)16% (4/25)7% (17/223)CIV

12% (1/8)12% (5/8)35% (12/34)20% (5/25)23% (66/291)CIA

54% (28/52)42% (5/12)76% (26/34)11% (7/66)8% (30/362)HCM

15% (8/52)67% (8/12)12% (4/34)70% (46/66)66% (240/362)Sténose pulmonaire

82% (43/52)67% (10/15)94% (32/34)72% (28/39)82% (274/333)Cardiopathie

NDNDNDND85% (110/129)Dysmorphie typique

1,3 (8/6)1,4 (18/13)0,8 (25/31)1,3 (189/143)Sex ratio M/F

85% (52)2-3% (19)5% (31)20% (72)40% (387)Fréquence (n patients)

PTPN11(inactivatrice)KRASRAF1SOS1PTPN11

(activatrice)

Syndrome LEOPARDSyndrome de Noonan

Tableau 3. Corrélations phénotype/génotype dans les syndromes de Noonan et LEOPARD

1.1. Retard statural

La fréquence du retard statural est évaluée à environ 70% chez les patients SN

présentant une mutation de PTPN11 (Tartaglia, Kalidas et al. 2002; Musante, Kehl et al.

2003; Sarkozy, Conti et al. 2003; Yoshida, Hasegawa et al. 2004; Zenker, Buheitel et al.

2004; Jongmans, Sistermans et al. 2005; Niihori, Aoki et al. 2005; Ferrero, Baldassarre et al.

2008; Ko, Kim et al. 2008). Chez les autres patients SN, la fréquence du retard statural est

estimée à 35% si il existe une mutation de SOS1 (Roberts, Araki et al. 2007; Tartaglia,

Pennacchio et al. 2007; Zenker, Horn et al. 2007; Ko, Kim et al. 2008), 85% si mutation de

RAF1 (Pandit, Sarkozy et al. 2007; Razzaque, Nishizawa et al. 2007; Ko, Kim et al. 2008) et

84% si mutation de KRAS (Carta, Pantaleoni et al. 2006; Schubbert, Zenker et al. 2006; Nava,

Hanna et al. 2007; Zenker, Lehmann et al. 2007; Ko, Kim et al. 2008).

39

Concernant la croissance prénatale, dans l’étude de Limal et al., il existe une tendance

non significative chez les patients SN présentant une mutation de PTPN11 (PTPN11+) à

présenter une taille de naissance abaissée (-1.4+/-1.2 DS, p=0.24) comparés aux patients SN

sans mutation de PTPN11 (PTPN11-) (-0.9+/-1 DS); de plus, 32% des patients mutés

présentent un SGA asymétrique versus 13% chez les patients non mutés (Limal, Parfait et al.

2006). Dans cette étude, le poids et le périmètre crânien sont normaux et identiques dans les 2

groupes. La taille de naissance des patients PTPN11+ est de -0.6 DS dans l’étude de Yoshida

et al., et de -0.5 DS dans l’étude de Binder et al., sans différence significative comparée aux

patients PTPN11- (Yoshida, Hasegawa et al. 2004; Binder, Neuer et al. 2005).

Concernant la croissance postnatale, les données sont contradictoires. Dans l’étude de Limal

et al., les patients PTPN11+ ont un retard statural significativement plus important à l’âge de

6 ans (-3.1 vs -2.4, p=0.04) (Limal, Parfait et al. 2006) ce qui n’est pas retrouvé dans l’étude

de Binder et al. (retard statural identique -3 DS dans les 2 groupes) (Binder, Neuer et al.

2005). Dans l’étude de Zenker, 88% des patients PTPN11+ âgés d’au moins 3 ans ont un

retard statural inférieur à -2DS versus 57% chez les patients non mutés (p=0.04) et leur taille

est plus petite que les patients PTPN11- (-3.1 vs -2.4 DS) (Zenker, Buheitel et al. 2004).

Les données hormonales et la réponse à GH en fonction de la présence ou non de mutations

de PTPN11 ont été précisées dans 3 études (Binder, Neuer et al. 2005; Limal, Parfait et al.

2006) (Ferreira, Souza et al. 2005). Dans ces études, la sécrétion de GH sous stimulation est

normale avec une tendance à être plus élevée chez les patients PTPN11+ (Binder, Neuer et al.

2005). Les taux d’IGF-I sont bas notamment chez les patients mutés associés à des taux

normaux d’IGFBP-3 (Binder, Neuer et al. 2005; Limal, Parfait et al. 2006), ce qui est en

faveur d’une résistance à GH. Les patients PTPN11+ ont un rattrapage significativement

moins important que les patients PTPN11-. Concernant la taille finale, dans l’étude de

Noordam et al., il n’y a pas de différence en fonction de la présence ou non de mutation de

PTPN11 mais il existe une tendance à une meilleure réponse chez les patients PTPN11-;

cependant la prépondérance de patients PTPN11+ ne permet pas de conclure (Noordam, Peer

et al. 2008).

Ces données sont donc en faveur d’une résistance à GH plus marquée chez les patients

Noonan présentant une mutation de PTPN11.

40

Dans deux études, les patients avec une mutation du gène SOS1 (SOS1+) présentent un retard

statural significativement moins fréquent que les patients PTPN11+ et les autres patients SN

(Tartaglia, Kalidas et al. 2002; Zenker, Buheitel et al. 2004).

1.2. Cardiopathie

La fréquence des cardiopathies chez les patients PTPN11+ est évaluée à 82% dont

66% de sténose des valves pulmonaires, 8% de cardiomyopathie hypertrophique, 23% de CIA

et 7% de CIV (Tartaglia, Kalidas et al. 2002; Musante, Kehl et al. 2003; Sarkozy, Conti et al.

2003; Yoshida, Hasegawa et al. 2004; Zenker, Buheitel et al. 2004; Jongmans, Sistermans et

al. 2005; Niihori, Aoki et al. 2005; Sznajer, Keren et al. 2007; Ferrero, Baldassarre et al.

2008; Ko, Kim et al. 2008). Concernant les autres mutations retrouvées chez les patients SN,

la fréquence des cardiopathies est estimée à 72% (70% de sténose pulmonaire, 11% de

cardiomyopathie) chez les patients porteurs d’une mutation de SOS1 (Roberts, Araki et al.

2007; Tartaglia, Pennacchio et al. 2007; Zenker, Horn et al. 2007; Ko, Kim et al. 2008), 94%

(12% de sténose pulmonaire, 76% de cardiomyopathie) chez les patients porteurs d’une

mutation de RAF1 (Pandit, Sarkozy et al. 2007; Razzaque, Nishizawa et al. 2007; Ko, Kim et

al. 2008) et 67% (67% de sténose pulmonaire, 42% de cardiomyopathie) chez les patients

porteurs d’une mutation de KRAS (Carta, Pantaleoni et al. 2006; Schubbert, Zenker et al.

2006; Nava, Hanna et al. 2007; Zenker, Lehmann et al. 2007; Ko, Kim et al. 2008).

La plupart des études ont montré que les patients PTPN11+ présentent de manière

significative une augmentation de la fréquence des sténoses pulmonaires et une diminution de

la fréquence des HCM comparées aux patients PTPN11- (Tartaglia, Kalidas et al. 2002;

Sarkozy, Conti et al. 2003; Yoshida, Hasegawa et al. 2004; Zenker, Buheitel et al. 2004;

Sznajer, Keren et al. 2007; Ferrero, Baldassarre et al. 2008). Deux études retrouvent une

augmentation significative de la fréquence des CIA chez les patients PTPN11+ (Yoshida,

Hasegawa et al. 2004; Sznajer, Keren et al. 2007).

Chez les patients porteurs d’une mutation de RAF1 (RAF1+), il existe une fréquence

significativement augmentée d’HCM par rapport aux autres mutations (Pandit, Sarkozy et al.

2007; Razzaque, Nishizawa et al. 2007).

41

Concernant les différentes cardiopathies, les patients SOS1+ ne sont pas

significativement différents des patients PTPN11+, par contre la fréquence des sténoses

pulmonaires est significativement plus élevée que chez les autres patients SN PTPN11-

(Roberts, Araki et al. 2007).

1.3. Anomalies hématologiques

Les anomalies hématologiques (ecchymoses faciles, tendance hémorragique,

thrombocytopénie) ainsi que la présence de LMMJ sont significativement plus fréquentes

chez les patients PTPN11+ comparés aux patients PTPN11- (Yoshida, Hasegawa et al. 2004;

Zenker, Buheitel et al. 2004; Ko, Kim et al. 2008).

La recherche de mutation de PTPN11 chez 7 patients SN présentant une LMMJ, s’est

révélée positive dans tous les cas (Tartaglia, Niemeyer et al. 2003); il s’agissait de mutations

germinales de novo. La mutation substitution Thr73Ile (T73I), présente chez 2% des patients

SN, est retrouvée chez plus de la moitié des patients SN avec LMMJ (Tartaglia, Niemeyer et

al. 2003; Kratz, Niemeyer et al. 2005). Ceci suggère que la présence d’anomalie spécifique de

PTPN11 permet d’identifier le sous-groupe de patients SN à risque de LMMJ.

1.4. Autres atteintes

Une seule étude retrouve une fréquence significativement augmentée d’anomalie

thoracique chez les patients PTPN11+ comparés aux patients PTPN11- (Zenker, Buheitel et

al. 2004). Dans cette même étude, il est retrouvé une tendance non significative à un retard

mental moins fréquent chez les patients PTPN11+.

Les patients SOS1+ présentent une diminution significative de la fréquence du retard

mental comparée aux patients PTPN11+ ou aux autres patients SN PTPN11- (Pandit, Sarkozy

et al. 2007; Roberts, Araki et al. 2007; Zenker, Horn et al. 2007). Ces patients présentent

également une augmentation significative de la fréquence des anomalies thoraciques (pectus)

(Pandit, Sarkozy et al. 2007; Zenker, Horn et al. 2007). La corrélation avec les autres atteintes

est variable suivant les études.

A l’exception de la mutation T73I associée à la LMMJ, il n’existe pas de différence en

fonction du type de mutation de PTPN11 quelque soit l’atteinte considérée.

42

2. Syndrome LEOPARD

Les données des principales études concernant les anomalies de PTPN11 associées au

syndrome LEOPARD sont résumées dans le tableau 3 (Keren, Hadchouel et al. 2004;

Sarkozy, Conti et al. 2004; Digilio, Sarkozy et al. 2006).

2.1. Retard statural

Différentes études estiment la fréquence du retard statural chez les patients SL

présentant une mutation de PTPN11 (SL PTPN11+) à environ 20% (Sarkozy, Conti et al.

2003; Keren, Hadchouel et al. 2004; Sarkozy, Conti et al. 2004; Digilio, Sarkozy et al. 2006)

ce qui est significativement plus faible comparé aux patients SN PTPN11+. Certaines

mutations sont associées à une fréquence faible de retard statural, ainsi dans 2 études seuls 2

enfants avec une mutation T468M sur 10 présentent un retard statural (Zenker, Buheitel et al.

2004; Digilio, Sarkozy et al. 2006). Il n’existe pas de données sur l’axe somatotrope chez ces

patients.

2.2. Cardiopathie

La fréquence des cardiopathies chez les patients SL PTPN11+ est identique à celle des

patients SN PTPN11+, aux alentours de 80%. Cependant, le type d’anomalie varie entre ces 2

syndromes avec chez les patients SL PTPN11+, comparés aux patients SN PTPN11+, une

fréquence de cardiomyopathie hypertrophique plus importante (54% versus 8%) et une

fréquence de sténose des valves pulmonaires moins importante (15% versus 66%). Les

anomalies de l’ECG sont retrouvées chez 20% des patients SL PTPN11+.

2.3. Autres atteintes

Les patients SL PTPN11+ semblent présenter des anomalies de la coagulation plus

fréquente mais sur un petit nombre de patients.

Il existe peu de données sur la prédisposition tumorale chez ces patients qui ne peut être

affirmée. Un mélanome malin a été diagnostiqué chez un patient avec une mutation germinale

de PTPN11 (Seishima, Mizutani et al. 2007).

43

3. Syndrome Cardio-facio-cutané

Les fréquences des signes cliniques en fonction des anomalies de BRAF, MEK 1/2 et

KRAS sont résumées dans le tableau 4 (Gripp, Lin et al. 2007; Narumi, Aoki et al. 2007;

Nava, Hanna et al. 2007; Zenker, Lehmann et al. 2007; Armour and Allanson 2008; Nystrom,

Ekvall et al. 2008; Rodriguez-Viciana and Rauen 2008; Schulz, Albrecht et al. 2008; Dentici,

Sarkozy et al. 2009).

67% (6/9)73% (49/67)92% (35/38)Sourcils épars

77% (10/13)91% (64/70)67% (33/49)Cheveux épars

28% (2/7)34% (16/47)33% (4/12)Hémangiomes

28% (2/7)23% (11/47)17% (5/30)Taches café au lait

12% (1/8)52% (27/52)32% (11/34)Naevi

11% (1/9)40% (33/82) 44% (14/32)Kératose folliculaire

NDND98% (43/44)Anomalies ectodermiques

ND45% (9/20)16% (3/19)Hypoplasie nerf optique

20% (1/5)64% (23/36)22% (6/27)Myopie

67% (4/6)62% (41/66)46% (17/37)Strabisme

50% (1/2)28% (14/14)100% (5/5)Cryptorchidie

0% (0/3)37% (24/65)36% (16/44)Convulsions

100% (13/13)100% (71/71)96% (47/49)Retard développement

50% (4/8)51% (28/55)82% (24/29)Déformation thorax

90% (9/10)64% (39/61)79% (30/38)Retard statural

90% (9/10)79% (46/58)83% (29/35)Difficultés à grossir

50% (3/6)80% (40/50)52% (13/24)Macrosomie

20% (2/10)27% (24/89)18% (7/38)CIA/CIV

57% (8/14)35% (35/98)33% (14/42)HCM

43% (6/14)51% (46/89)40% (17/42)Sténose pulmonaire

100% (14/14)78% (80/102)64% (25/39)Cardiopathie

5% (14)50% (102)20% (61)Fréquence (n patients)

KRASBRAFMEK 1/2

Syndrome Cardio-facio-cutané

67% (6/9)73% (49/67)92% (35/38)Sourcils épars

77% (10/13)91% (64/70)67% (33/49)Cheveux épars

28% (2/7)34% (16/47)33% (4/12)Hémangiomes

28% (2/7)23% (11/47)17% (5/30)Taches café au lait

12% (1/8)52% (27/52)32% (11/34)Naevi

11% (1/9)40% (33/82) 44% (14/32)Kératose folliculaire

NDND98% (43/44)Anomalies ectodermiques

ND45% (9/20)16% (3/19)Hypoplasie nerf optique

20% (1/5)64% (23/36)22% (6/27)Myopie

67% (4/6)62% (41/66)46% (17/37)Strabisme

50% (1/2)28% (14/14)100% (5/5)Cryptorchidie

0% (0/3)37% (24/65)36% (16/44)Convulsions

100% (13/13)100% (71/71)96% (47/49)Retard développement

50% (4/8)51% (28/55)82% (24/29)Déformation thorax

90% (9/10)64% (39/61)79% (30/38)Retard statural

90% (9/10)79% (46/58)83% (29/35)Difficultés à grossir

50% (3/6)80% (40/50)52% (13/24)Macrosomie

20% (2/10)27% (24/89)18% (7/38)CIA/CIV

57% (8/14)35% (35/98)33% (14/42)HCM

43% (6/14)51% (46/89)40% (17/42)Sténose pulmonaire

100% (14/14)78% (80/102)64% (25/39)Cardiopathie

5% (14)50% (102)20% (61)Fréquence (n patients)

KRASBRAFMEK 1/2

Syndrome Cardio-facio-cutané

Tableau 4. Corrélations phénotype/génotype dans le syndrome cardio-facio-cutané

44

Quel que soit le type d’anomalie génétique, les patients CFC partagent la plupart des

caractéristiques cliniques notamment la dysmorphie faciale, les anomalies ectodermiques et le

retard mental.

Cependant, les patients présentant des mutations de MEK (MEK+) semblent présenter un

phénotype plus modéré. Ainsi, les patients MEK+, comparés aux patients BRAF+, présentent

une fréquence d’anomalies oculaires et de cardiopathie (notamment des anomalies septales et

de la valve mitrale) significativement plus faible (Nava, Hanna et al. 2007; Dentici, Sarkozy

et al. 2009). Chez ces patients, le retard de développement est plus modéré (âge moyen de la

marche 2 ans versus 2,5 ans chez les patients BRAF+ et 2,7 ans chez les patients KRAS+) et la

dysmorphie inclut moins fréquemment l’hypertélorisme et les cheveux épars (Nava, Hanna et

al. 2007).

Chez les patients KRAS+, l’atteinte cutanée (naevi, kératose pilaire, hémangiome) semble

moins fréquente (Zenker, Lehmann et al. 2007; Schulz, Albrecht et al. 2008).

Comparés aux patients SN, les patients CFC, quel que soit l’atteinte génétique, ont une

fréquence accrue de difficultés prolongées d’alimentation, d’anomalies du système nerveux

central, de convulsions et d’hypoplasie du nerf optique. Ainsi, dans l’étude de Armour et al.,

84% des patients CFC présentent au moins un de ces 4 signes et 5% des patients présentent

les quatre, ce qui peut aider à distinguer le CFC du SN (Armour and Allanson 2008).

Un hépatoblastome a été décrit chez un patient CFC avec une mutation de MEK1. Ce

type de tumeur n’est habituellement pas décrit chez les patients Costello. De plus l’apparition

de cette tumeur pourrait être liée chez ce patient au traitement immunosuppresseur mis en

place après une transplantation cardiaque (Gripp, Lin et al. 2007). Globalement, le syndrome

CFC ne semble pas associé à une prédisposition tumorale et donc ne justifie pas chez ces

patients de dépistage systématique.

45

4. Syndrome de Costello

Les données des principales études sont résumées dans le tableau 5 (Aoki, Niihori et

al. 2005; Estep, Tidyman et al. 2006; Gripp, Lin et al. 2006; Kerr, Delrue et al. 2006;

Zampino, Pantaleoni et al. 2007; Schulz, Albrecht et al. 2008).

60% (68/116)Papillomes

100% (118/118)Faciès épais

100% (118/118)Peau capitonnée

14% (17/119)Tumeurs solides

41% (17/41)Nystagmus

86% (28/33)Anomalies oculaires

27% (32/111) Anomalies SNC

15% (7/45)Convulsions

100% (118/118)Retard développement

100% (118/118)Retard statural

100% (122/122)Difficultés à grossir

20% (14/70)Hypoglycémie

82% (37/45)Macrocéphalie

88% (36/41)Macrosomie

35% (42/118) Arythmie

51% (60/118) HCM

23% (11/48)Sténose pulmonaire

26%(31/117) Cardiopathie

88% (147)Fréquence (nombre patients)

Costello (mutation HRAS)

60% (68/116)Papillomes

100% (118/118)Faciès épais

100% (118/118)Peau capitonnée

14% (17/119)Tumeurs solides

41% (17/41)Nystagmus

86% (28/33)Anomalies oculaires

27% (32/111) Anomalies SNC

15% (7/45)Convulsions

100% (118/118)Retard développement

100% (118/118)Retard statural

100% (122/122)Difficultés à grossir

20% (14/70)Hypoglycémie

82% (37/45)Macrocéphalie

88% (36/41)Macrosomie

35% (42/118) Arythmie

51% (60/118) HCM

23% (11/48)Sténose pulmonaire

26%(31/117) Cardiopathie

88% (147)Fréquence (nombre patients)

Costello (mutation HRAS)

Tableau 5. Corrélations phénotype/génotype dans le syndrome de Costello

Les patients Costello présentant une mutation de HRAS (HRAS+) présentent la dysmorphie

typique avec faciès grossier, la peau capitonnée, les difficultés à grossir, le retard de

croissance et le retard mental constant et sévère. L’augmentation de l’incidence de tumeurs

solides, notamment des rhabdomyosarcomes, des neuroblastomes ou des cancers de la vessie,

est une caractéristique importante de patients Costello. Cette incidence est de l’ordre de 15%

46

pour l’ensemble des patients mais varie en fonction du type de mutation : 10% pour les

patients présentant la mutation la plus fréquente G12S versus 40% pour ceux présentant la

mutation G12A. Ces données justifient un dépistage tumoral systématique chez ces patients

en particuliers ceux présentant la mutation G12A.

Conclusion

La connaissance des gènes impliqués dans les syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés

permet une meilleure description et délimitation de ces syndromes. Ainsi, s’il l’on considère

le SN, les formes associées aux mutations de PTPN11 et SOS1 sont relativement semblables

et de gravité modérée, alors que les formes associées aux mutations de RAF1 sont

spécifiquement associées à un risque d’HCM plus élevé. Avec la caractérisation génétique, il

est probable que la classification de ces syndromes reposera de plus en plus à l’avenir sur la

détermination génétique plutôt que clinique. Ainsi, certaines entités pourront peut être

individualisées comme les mutations du gène KRAS responsables de tableaux cliniques à la

frontière de plusieurs syndromes (SN, CFC, SC).

Enfin, une bonne description clinique et génétique permet d’appréhender les mécanismes

physiopathologiques. Ainsi, le fait que les mutations activatrices de PTPN11 soient associées

à des sténoses pulmonaires et un retard statural alors que les mutations inactivatrices sont

associées à des cardiomyopathies et une croissance normale, peut nous aider à comprendre le

rôle de Shp2 dans le développement cardiaque et la croissance.

Nous décrirons dans le dernier chapitre les conséquences fonctionnelles des mutants

(activateurs et inactivateurs) de Shp2.

47

Chapitre IV

Conséquences fonctionnelles des mutants de Shp2

Nous décrirons dans un premier temps la structure et la fonction normale de Shp2 sur

les différentes voies de signalisation. Puis, nous étudierons les conséquences biochimiques,

cellulaires et sur le développement, des formes mutées associées aux SN et SL.

1. Structure et fonctions biologiques de Shp2

1.1. Tyrosines kinases et tyrosines phosphatases

De nombreuses voies de signalisation sont régulées par des phosphorylations sur

tyrosine qui entraînent une modification de structure et/ou de fonction des molécules

concernées, permettant la régulation de leur activité enzymatique, leur localisation cellulaire

et/ou leur association à d’autres molécules. Ces phosphorylations sur tyrosine sont contrôlées

d’une part par des protéines tyrosine kinases (protein tyrosine kinases, PTKs), qui catalysent

la phosphorylation, d’autre part par des protéines tyrosine phosphatases (protein tyrosine

phosphatases, PTPs), qui déphosphorylent.

Les récepteurs de la plupart des facteurs de croissance et hormones sont des protéines

transmembranaires qui possèdent une activité kinase intrinsèque et sont appelés récepteurs

tyrosine kinases (receptor tyrosine kinases, RTKs) (Schlessinger 2000). D’autres récepteurs

sont associées à des protéines kinases non transmembranaires comme par exemple les kinases

de la famille Src (Src family kinases, SFKs) et Fak associées aux intégrines, ou encore Janus

kinase (JAK) associée aux récepteurs des cytokines. Tous ces récepteurs présentent des

mécanismes similaires d’activation des voies de signalisation situées en aval. La liaison au

ligand active l’activité PTK intrinsèque (cas des RTKs) ou associée (cas des intégrines et

récepteurs des cytokines) entraînant ainsi la phosphorylation sur tyrosine du récepteur. Cela

provoque le recrutement de molécules contenant des domaines Src homology-2 (SH2) et/ou

phosphotyrosine binding (PTB) capables de se lier à des sites spécifiques contenant une

tyrosine phosphorylée. La plupart des molécules recrutées sont alors les substrats des PTKs.

Ainsi, l’activation du récepteur initie la signalisation en permettant la relocalisation cellulaire

48

de molécules et/ou l’activation ou l’inhibition de leur fonction. Différentes voies de

signalisation sont alors activées en aval de ces récepteurs, incluant les voies Ras/MAPK (ou

d’autres voies MAPKs comme p38 ou JNK), Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K)/Akt, RhoA,

Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT), et/ou calcineurin/nuclear factor of

activated T cells (NFAT).

Les PTPs constituent une superfamille importante (environ 100 membres) de

molécules caractérisées par la présence d’une courte séquence d’enchaînement C(X5)R (C

correspondant à une cystéine et R à une arginine) située au cœur du domaine catalytique qui

constitue le motif de signature des PTPs (Andersen, Mortensen et al. 2001). Le domaine

catalytique, constitué de 240 à 250 acides aminés, présente une spécificité absolue pour

l’hydrolyse de résidus tyrosines phosphorylés. Les PTPs peuvent être divisées en PTPs

transmembranaires (receptor-like PTP, RPTP) et en PTP non-transmembranaires.

1.2. Structure et régulation de l’activité de Shp2

Les PTPs contenant des domaines SH2 (SH2 domain-containing PTP, Shp)

constituent une sous-famille des PTPs non-transmembranaires. Chez les vertébrés, ces

phosphatases ont deux représentants, dont la communauté de structure est extrêmement forte :

Shp1, essentiellement exprimée au niveau des cellules hématopoïétiques, et Shp2, exprimée

de manière ubiquitaire. Dans la suite de ce document, nous limiterons notre propos à Shp2,

Shp1 n'étant pas impliqué dans des maladies génétiques de la croissance.

Shp2 est codée par le gène PTPN11. Les homologues de Shp2 chez Drosophila et

Caenorhabditis elegans sont respectivement Corkscrew (Csk) et Ptp-2. Shp2 est constituée de

deux domaines SH2 (N-SH2 et C-SH2) en position N-terminale, d’un court domaine

catalytique PTP central et d’un domaine C-terminal (figure 14a).

Les deux domaines SH2 permettent la liaison de Shp2 à de nombreux types de récepteurs et

de molécules adaptatrices (incluant IRS, DOS/Gab et FRS) contenant des tyrosines

phosphorylées. Ces deux domaines sont également très importants dans la régulation de

l’activité PTP. Ainsi, de manière basale, Shp2 présente une activité catalytique faible du fait

de l’interaction entre les domaines N-SH2 et PTP qui maintient la phosphatase dans une

conformation dite fermée. Cette interaction est rompue lors de la liaison des domaines SH2 à

des résidus phosphotyrosines activateurs (rencontrés par exemple sur la protéine

49

multiadaptatrice Gab1), ce qui entraîne la stimulation de la phosphatase (figure 14b) (Hof,

Pluskey et al. 1998; Neel, Gu et al. 2003).

Figure 14. Structure et fonction de Shp2

Le domaine C-terminal contient deux sites de phosphorylation sur tyrosine (Tyr 542

et 580) et un domaine riche en proline capable de lier des protéines contenant un domaine

SH3. Les deux tyrosines de ce domaine sont phosphorylables, sous PDGF par exemple, et

peuvent alors lier Grb2 (Li, Nishimura et al. 1994). Il a été proposé que ce domaine puisse

également participer à la régulation de l’activité de la phosphatase. Ainsi, le remplacement

des deux résidus tyrosine par des tyrosines phosphorylées non hydrolysables par des

techniques de ligation protéique stimule l’activité catalytique in vitro (Lu, Gong et al. 2001).

Cet effet stimulateur serait du à une interaction intramoléculaire entre les domaines N-SH2 et

C-SH2 avec les Tyr542p et Tyr580p respectivement. Cependant, l’augmentation de l’activité

catalytique observée reste faible. De plus, ces modifications pourraient ne pas avoir les

mêmes effets in vivo, Shp2 étant capable de s’autodéphosphoryler rapidement après son

activation.

Enfin, l’activité catalytique de Shp2 pourrait être également régulée par des espèces

réactives de l’oxygène (reactive oxygen intermediates, ROIs). Ainsi, Shp2 est inactivé

transitoirement par les ROIs dans des cellules de rat stimulées par le Platelet derived growth

factor (PDGF) (Meng, Fukada et al. 2002). Cependant, d’autres études retrouvent un rôle

positif de Shp2 dans l’activation du signal en aval du récepteur au PDGF (Ostman, Hellberg

et al. 2006).

50

1.3. Gab1, une protéine adaptatrice essentielle à la fonction de Shp2

Le recrutement et l’activation de Shp2 fait intervenir principalement la protéine

adaptatrice Gab1. Cette molécule, qui est mobilisée rapidement en réponse à la stimulation de

nombreux récepteurs membranaires, notamment les RTKs, est également un médiateur

important de l’activation de nombreuses voies de signalisation, particulièrement les voies

Ras/MAPK et PI3K/Akt.

Gab1 est le premier représentant de la famille des protéines adaptatrices Gab qui

comprend 5 membres dont Gab1, Gab2, et Gab3 chez les mammifères, Dos chez la

Drosophile et Soc-1 chez C. elegans. Gab1, comme les autres membres de la famille Gab,

possède un domaine PH au niveau N-terminal, des motifs riche en proline dans leur région

centrale qui leur permettent de lier le domaine SH3 de Grb2 et de nombreuses tyrosines, sites

de phosphorylation potentiels permettant le recrutement de protéines à domaine SH2 (Gu and

Neel 2003). Gab1 possède également un domaine MBD (Met Binding Domain) qui permet sa

liaison direct au récepteur Met phosphorylé.

Le recrutement de Gab1 auprès des récepteurs activés est un mécanisme inductible qui

fait intervenir son association avec l’adaptateur Grb2 et/ou son domaine PH. Ces deux

mécanismes ne sont généralement pas exclusifs et coopèrent la plupart du temps bien que les

modalités de translocation membranaire de Gab puissent varier en fonction du récepteur

activé. La protéine Grb2 est constitutivement associée par ses domaines SH3 à Gab, le

module Gab-Grb2 est recruté auprès du récepteur activé grâce au domaine SH2 de Grb2

capable d’interagir avec des tyrosines spécifiques du récepteur (Lock, Royal et al. 2000).

Le domaine PH de Gab peut également intervenir dans leur recrutement en aval de certains

récepteurs, notamment le récepteur à l’EGF. En effet, Gab1 est initialement recruté auprès du

récepteur activé via Grb2, il est alors phosphorylé sur tyrosine ce qui lui permet notamment

de lier les domaines SH2 de la sous unité p85 de PI3K. Ceci conduit à l’activation de la kinase

qui génère alors du PI3,4,5 P3 que le domaine de Gab1 est capable de lier conduisant à une

amplification de la translocation sous-membranaire de molécules additionnelles de Gab1,

indépendamment de sa liaison au récepteur (Yart, Laffargue et al. 2001). En accord avec ce

modèle, le domaine PH de Gab1 est nécessaire à sa phosphorylation maximale et à

l’activation efficace de ses effecteurs.

51

Gab1, étant dépourvue d’activité catalytique, son rôle dans la signalisation des

récepteurs membranaires est du à sa fonction de protéine multiadaptatrice. En effet, Gab1

possède de nombreuses tyrosines qui, lorsqu’elles sont phosphorylées, servent de site

d’ancrage pour des protéines à domaine SH2 (figure 15). Parmi ces tyrosines, les tyrosines

627 et 659 sont impliquées dans le recrutement et l’activation de Shp2 mais seule la

phosphorylation de la tyrosine 627 suffit à l’activation de la phosphatase in vivo. Gab1

possède également des tyrosines permettant de recruter et d’activer d’autres molécules

notamment PI3K (tyrosines 447, 472 et 619) et un inhibiteur de Ras p120RasGap (tyrosines

307 et 317) (Montagner, Yart et al. 2005).

Gab1 wt1

PH694

YXXP

242

YXXP

259

YXXP

317

YXXP

373

YXXP

406

YXXP

307

Y

447

Y

472

Y

627

Y

619

Y

659

PI3K SHP2

Grb2-BSGrb2-BS Met-BD

RasGAP

Gab1 wt1

PH694

YXXP

242

YXXP

259

YXXP

317

YXXP

373

YXXP

406

YXXP

307

Y

447

Y

472

Y

627

Y

619

Y

659

PI3K SHP2

Grb2-BSGrb2-BS Met-BD

RasGAP

Figure 15. Structure de Gab1

De manière intéressante, en plus de son rôle activateur de Shp2, Gab1 est également

un substrat de la phosphatase. Ainsi, en interagissant avec les sites de liaison d’autres

molécules, Shp2 va pouvoir moduler l’activation de certaines voies de signalisation en

particuliers Ras/MAPK et PI3K/Akt comme nous allons le voir dans le chapitre suivant.

52

1.4. Rôle dans les différentes voies de signalisation, en aval de différents récepteurs

Shp2 est impliquée dans la régulation de nombreuses voies de signalisation en aval de

nombreux récepteurs, notamment les RTKs, les récepteurs aux cytokines et les intégrines

(Neel, Gu et al. 2003). La fonction régulatrice de Shp2 est complexe puisqu’en fonction de la

voie de signalisation, et parfois du récepteur, elle peut jouer un rôle de modulateur positif ou

négatif du signal. Seuls quelques aspects de ses différentes fonctions seront évoqués dans ce

paragraphe.

1.4.1. Régulation de Ras et PI3K en aval des RTKs

1.4.1.1. Régulation de Ras

Shp2 est nécessaire à l’activation de la voie Ras/MAPK en aval de la plupart des

PTKs, cette fonction ayant été particulièrement étudiée en aval des RTKs (Maroun, Naujokas

et al. 2000; Shi, Yu et al. 2000; Cunnick, Meng et al. 2002). Shp2 permet la pleine activation

de la voie Ras/MAPK en contribuant au maintien de l’activation initiale et parfois en

permettant cette activation initiale (par exemple dans les fibroblastes stimulés par l’IGF-I)

(Feng 1999). Ainsi, les cellules exprimant un mutant dominant négatif de Shp2 (Noguchi,

Matozaki et al. 1994) ou invalidées pour le gène PTPN11 (Shi, Yu et al. 2000) présentent un

défaut de l’activation de Ras qui est compatible avec un effet de Shp2 en aval de Ras.

Les mécanismes à l’origine du rôle positif de Shp2 sur la voie Ras/MAPK sont encore

controversés. Plusieurs hypothèses ont été proposées :

a) Shp2, molécule adaptatrice couplant le module Grb2/Sos aux RTKs activés

Des travaux initiaux ont suggéré un rôle de molécule adaptatrice de Shp2. Ainsi, les résidus

tyrosine phosphorylés de l’extrémité C-terminale sont capables de lier les domaines SH2 de

Grb2 conduisant au recrutement du module Grb2/Sos à proximité de Ras qu’elle serait alors

capable d’activer (Bennett, Tang et al. 1994; Li, Nishimura et al. 1994). Cependant, des

études ont démontré que la mutation de ces résidus n’a pas d’effet sur l’activation de la voie

Ras/MAPK en aval des récepteurs au PDGF et au Fibroblast growth factor (FGF) (O'Reilly

and Neel 1998; Araki, Nawa et al. 2003). Au contraire, l’activité catalytique de Shp2 est

absolument nécessaire à sa fonction positive sur la voie Ras/MAPK. Ainsi cette fonction de

53

molécule adaptatrice serait plutôt un mécanisme auxiliaire de Shp2, mais des études sont

encore nécessaires pour mieux appréhender le rôle de Shp2 en tant qu'adaptateur.

b) régulation du recrutement de RasGap

Shp2 est capable de déphosphoryler les sites de liaison de RasGap sur le récepteur au PDGF

et à l’EGF entraînant une activation soutenue de la voie Ras/MAPK (Ekman, Kallin et al.

2002). De même, les travaux réalisés dans notre laboratoire ont montré que Shp2

déphosphoryle les sites de liaison de RasGap (tyrosines 307 et 317) sur la molécule

adaptatrice Gab1 en réponse à l’EGF (Montagner, Yart et al. 2005). Ce mécanisme apparaît

mis en jeu in vivo, par exemple dans le processus de régénération du foie, où l’exclusion de

RasGap de la fraction membranaire des hépatocytes par Shp2 est nécessaire à la prolifération

de ces cellules, via l’activation des MAPKs (Bard-Chapeau, Yuan et al. 2006). Ces données

suggèrent que Shp2 pourrait participer à l’activation de Ras en diminuant le recrutement d’un

de ses inhibiteurs.

c) régulation de l’activité des kinases de la famille Src

Les kinases de la famille Src (Src family kinases, SFKs) forment une famille de kinases

intracellulaires associées aux intégrines, comprenant chez les mammifères huit membres, dont

Src. Des mutations de ces protéines ont été identifiées dans de nombreuses tumeurs humaines.

Dans les cellules de mammifères, une protéine de fusion Gab1-Shp2 entraîne une activation

de Erk indépendante d’un facteur de croissance et potentialise l’activation en réponse à un

facteur de croissance ; la fusion du domaine PH de Gab1 au domaine PTP de Shp2 a les

mêmes effets (Cunnick, Mei et al. 2001). Les cellules exprimant cette protéine de fusion

Gab1-Shp2 présentent une activation de Src augmentée et les inhibiteurs de Src bloquent la

capacité de la protéine de fusion à activer Erk (Cunnick, Meng et al. 2002). Ces données

suggèrent que Shp2 est un régulateur positif des SFKs. Shp2 pourrait agir directement en

déphosphorylant les tyrosines inhibitrices des SFKs ou en empêchant la phosphorylation de

ces tyrosines par la kinase Csk (Kawabuchi, Satomi et al. 2000). En effet, plusieurs études ont

montré un effet négatif de Shp2 sur l’activation de Csk en empêchant son recrutement au

niveau de la protéine transmembranaire PAG/Cbp (Zhang, Yang et al. 2004) ou de la paxillin

(Ren, Meng et al. 2004).

Cependant, si il est reconnu que les SFKs sont impliquées dans la réponse mitogène, leur rôle

dans l’activation de la voie Ras/MAPK reste discutée (Bromann, Korkaya et al. 2004).

54

d) régulation de l’activation des protéines Sprouty

Shp2 serait capable de déphosphoryler ces protéines contrebalançant ainsi leur action

inhibitrice sur la voie Ras/MAPK (Hanafusa, Torii et al. 2004). Cependant, l’expression de

Shp2 étant beaucoup plus ubiquitaire que celle des protéines Spry, ces données ne permettent

donc pas d’expliquer le rôle positif de Shp2 en aval de tous les RTKs.

De plus, comme nous l’avons vu, le rôle des protéines Spry dans l’activation des RTKs reste

controversée car leurs effets dépendent de l’isoforme, du récepteur activé, du type et du

contexte cellulaire (Mason, Morrison et al. 2006).

1.4.1.2. Régulation de PI3K

A côté de son effet positif sur la voie Ras/MAPK, Shp2 module l’activation de la voie

PI3K suivant un mode dépendant du type de récepteur. En aval de l’EGFR, Shp2 joue un rôle

modulateur négatif de l’activation de PI3K en déphosphorylant les sites de liaison de cette

molécule sur Gab1 (Zhang, Tsiaras et al. 2002). Ainsi, Shp2 serait responsable d’une

diminution du recrutement de PI3K et par conséquence d’une inhibition des voies de

signalisation dépendantes de PI3K. Au contraire, en aval d’autres RTKs comme les récepteurs

au PDGF et à l’IGF-1, Shp2 serait nécessaire à l’activation de PI3K (Wu, O'Rourke et al.

2001; Zhang, Tsiaras et al. 2002).

1.4.2. Régulation de Rho en aval des intégrines

Le phénotype de cellules invalidées pour PTPN11 (Yu, Qu et al. 1998; Oh, Gu et al.

1999) ou surexprimant un mutant catalytiquement inactif de Shp2 (Inagaki, Noguchi et al.

2000; Kodama, Matozaki et al. 2000; Lacalle, Mira et al. 2002) a fait suggérer que Shp2, en

aval des intégrines, intervient dans l’étalement et la migration cellulaire. Cet effet pourrait

expliquer les anomalies de la gastrulation observées dans les modèles animaux. Shp2 pourrait

moduler l’activation de RhoA qui participe au contrôle de ces mécanismes en aval des

intégrines.

Cependant, si plusieurs études ont souligné le rôle de Shp2 dans la régulation de

RhoA, les mécanismes précis restent controversés et dépendants du système cellulaire utilisé.

Dans certaines études, Shp2 est un régulateur négatif de RhoA (Kodama, Matozaki et al.

2000; Schoenwaelder, Petch et al. 2000). Ainsi, les fibroblastes invalidés pour Shp2

55

présentent une augmentation des fibres de stress et des adhésions focales en rapport avec une

augmentation de l’activation de Rho (Inagaki, Noguchi et al. 2000; Schoenwaelder, Petch et

al. 2000). Au contraire, la surexpression de Shp2 dans des cellules musculaires lisses

aortiques entraîne une diminution de l’activation de RhoA avec pour conséquence une

diminution de la mobilité cellulaire induite par le NO (Chang, Ceacareanu et al. 2002).

Cependant, l’effet de Shp2 sur RhoA est opposé dans d’autres modèles cellulaires. Ainsi, dans

les cellules musculaires squelettiques, Shp2 stimule la déphosphorylation de p190-B

RhoGAP, une GAP de RhoA, stimulant ainsi l’activation de cette voie (Kontaridis, Eminaga

et al. 2004).

1.4.3. Régulation de JAK/STAT en aval des récepteurs aux cytokines

Shp2 pourrait moduler l’activation de la voie JAK/STAT qui est particulièrement

importante dans la transduction du signal en aval des récepteurs aux cytokines. Ces récepteurs

sont constitués de 2 groupes : les récepteurs de classe I comprenant des récepteurs

d’hormones (comme la GH, la prolactine et la leptine) et des récepteurs de médiateurs de

l’inflammation (comme le granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), le granulocyte-

macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), les interleukines 2-7, 9, 11 et 12), et les

récepteurs de classe II comprenant les récepteurs à l’interféron α et γ. La fixation du ligand

sur le récepteur permet l’activation de JAK, la PTK constitutivement associée au récepteur, ce

qui permet ainsi le recrutement et la phosphorylation des facteurs de transcription STATs

porteurs de domaines SH2. Ces facteurs activés vont alors former des dimères, pénétrer dans

le noyau et stimuler la transcription de gènes cibles (Levy and Darnell 2002).

Les différentes études concernant le rôle exact de Shp2 sur cette voie de signalisation

sont contradictoires. En aval du GHR ou des récepteurs aux interleukines, la plupart des

études sont en faveur d’un rôle modulateur négatif de Shp2 sur la voie JAK/STAT, que ce soit

l’isoforme STAT5 (You, Yu et al. 1999; Stofega, Herrington et al. 2000; Yu, Jin et al. 2000;

Chen, Wen et al. 2003) ou STAT3 (Ohtani, Ishihara et al. 2000). Cependant, d’autres études

ne retrouvent pas d’effet (Lundin Brockdorff, Woetmann et al. 2002; Wheadon, Edmead et al.

2003) ou un effet modulateur positif (Yu, Hawley et al. 2003; Ke, Lesperance et al. 2006).

Enfin, en aval des récepteurs aux cytokines, Shp2 pourrait également réguler la survie

cellulaire en ayant un rôle négatif sur l’activation de JNK (Wheadon, Edmead et al. 2003) et

56

positif sur la translocation nucléaire de NFκB (You, Flick et al. 2001) suivant des mécanismes

encore indéterminés.

1.5. Rôle de Shp2 dans le développement

Shp2 est exprimé de manière ubiquitaire et est nécessaire très précocement au cours du

développement embryonnaire (Tang, Freeman et al. 1995; Yang, Klaman et al. 2006).

Plusieurs modèles animaux ont permis de préciser son rôle, notamment dans le mouvement

morphogénique au cours de la gastrulation, le développement des membres, la valvulogenèse

et l’engagement des cellules progénitrices hématopoïétiques.

1.5.1. Chez les invertébrés

Chez drosophila, Corkscrew (Csw) signifie « tire-bouchon » et tient son nom de la

forme des embryons déficients pour cette PTP. Le rôle de Csw dans le développement est

expliqué par sa fonction positive dans l’activation du signal en aval de nombreux RTKs

incluant Torso (développement des structures terminales), Sevenless (développement des

photorécepteur R7 au niveau oculaire), Deranged (développement de plusieurs structures

incluant l’œil, les ailes et les poumons), Breathless (développement de la trachée) et Heartless

(développement de l’aorte dorsale) (Lu, Perkins et al. 1993; Perrimon, Lu et al. 1995; Perkins,

Johnson et al. 1996; Cleghon, Feldmann et al. 1998; Ghiglione, Perrimon et al. 1999; Firth,

Manchester et al. 2000). Csw est également requis dans l’activation du signal en aval du

récepteur au FGF (FGF receptor, FGFR) et de l’EGFR (Van Vactor, O'Reilly et al. 1998).

Ptp-2, l’orthologue de Shp2 chez Caenorhabditis elegans, intervient au moins en aval

de deux types de RTK : en aval de Let-23, l’orthologue de l’EGFR qui contrôle le

développement de la vulve, et en aval d’EGL-15, l’orthologue du FGFR impliqué dans

l’oogénèse (Gutch, Flint et al. 1998). En aval de Let-23, les mutations isolées de Ptp-2 n’ont

pas d’effet, cependant elles suppriment les conséquences des mutations du régulateur négatif

lin-15.

57

1.5.2. Chez les vertébrés

Le mutant dominant négatif de Shp2 interrompt la gastrulation de Xenopus, entraînant

des troncations de la queue, similaires quoique moins sévères à celles causées par le mutant

dominant négatif du FGFR, et inhibe l’induction et l’élongation du mésoderme induite par le

FGF dans des explants ectodermiques (Tang, Freeman et al. 1995; O'Reilly and Neel 1998).

La délétion totale de PTPN11 chez la souris est responsable d’un arrêt de

développement au stade péri-implantatoire avec, au niveau cellulaire, une diminution de la

survie des cellules souches trophoblastiques (Yang, Klaman et al. 2006). La délétion

homozygote des exons 2 (exon 2-/-) ou 3 (exon 3 -/-) de PTPN11 chez la souris conduit à une

létalité embryonnaire précoce entre E8.5 et 10.5 (Arrandale, Gore-Willse et al. 1996; Saxton,

Henkemeyer et al. 1997). Les embryons meurent avec un ensemble d’anomalies compatibles

avec des anomalies de la gastrulation et de la différenciation du mésoderme similaires à celles

induites par des mutations du FGFR chez la souris (Saxton, Henkemeyer et al. 1997; Saxton

and Pawson 1999). Shp2 joue également un rôle dans la valvulogenèse cardiaque comme l’a

montré l’étude des effets combinés de l’homozygotie pour l’allèle hypomorphe EGFRwa2 et

l’hétérozygotie pour un allèle nul de PTPN11 (Chen, Bronson et al. 2000).

Des études utilisant des chimères ont montré un rôle essentiel de Shp2 dans le

développement des membres et la formation des arcs branchiaux, deux mécanismes contrôlés

par le FGFR (Qu, Yu et al. 1998; Saxton, Ciruna et al. 2000). Des études de cellules souches

embryonnaires exon 3 -/- et de chimères chez la souris ont également montré un rôle essentiel

de Shp2 dans l’hématopoïèse (Qu, Shi et al. 1997; Qu, Yu et al. 1998; Feng 1999). En effet,

Shp2 serait recruté dans les progéniteurs hématopoïétiques précoces et interviendrait dans la

signalisation de Kit, le récepteur du facteur des cellules souches SCF.

Des invalidations tissu-spécifiques de PTPN11 ont également permis de préciser la

fonction de Shp2 dans le développement.

Ainsi, la délétion de PTPN11 au niveau des cardiomyocytes chez la souris entraîne le

développement rapide d’une cardiopathie dilatée sans phase hypertrophique, avec des signes

de dysfonction cardiaque apparaissant au cours du deuxième mois de vie (Kontaridis, Yang et

al. 2008). Ces anomalies sont en rapport avec un défaut d’activation de la voie Ras/MAPK et

à une hyperactivation de la voie RhoA. Dans cette étude, l’activation d’Akt est augmentée en

58

réponse à l’heregulin (et dans une moindre mesure à l’IGF-I) mais n’est pas affectée en

réponse à l’EGF, l’IL-6 ou l’Angiotensine. L’activation d’autres voies de signalisation,

comprenant p38 et JNK MAPKs, STAT (1, 3 et 5) et NFAT, n’est pas modifiée.

L’invalidation de PTPN11 dans les neurones prosencéphaliques suggère que Shp2 joue un

rôle dans le contrôle de la balance énergétique et le métabolisme, en régulant négativement la

voie JAK2/STAT3 en aval du récepteur à la leptine Obrb dans l’hypothalamus (Zhang,

Chapeau et al. 2004).

D’autres études ont montré le rôle négatif de Shp2 sur l’activation de STAT3 dans la

différenciation des progéniteurs neuronaux. La voie de signalisation gp130/STAT3 est

nécessaire aux précurseurs multipotents pour favoriser la différenciation gliale par rapport à la

prolifération neuronale (Bonni, Sun et al. 1997). L’invalidation de PTPN11 dans des

précurseurs corticaux en culture ou dans le cortex embryonnaire entraîne l’inhibition de la

neurogénèse basale et l’augmentation de la formation précoce des astrocytes. Ainsi, Shp2

régule la prolifération des cellules progénitrices et la différenciation cellulaire

neurone/astroglie en agissant positivement sur Erk et négativement sur STAT3 (Gauthier,

Furstoss et al. 2007; Ke, Zhang et al. 2007).

Shp2 participe à de nombreuses autres fonctions biologiques. Ainsi, elle stimule la

croissance alvéolaire et lobulaire au niveau des cellules épithéliales mammaires (Ke,

Lesperance et al. 2006), participe à la croissance des cellules musculaires squelettiques

(Fornaro, Burch et al. 2006), favorise la régénération des hépatocytes (Bard-Chapeau, Yuan et

al. 2006), stimule la prolifération des lymphocytes T au niveau du thymus (Nguyen, Ke et al.

2006), et participe au contrôle de la synthèse d’insuline par les cellules β du pancréas (Zhang,

Hao et al. 2009).

59

2. Conséquences fonctionnelles des mutants de Shp2

2.1. Mutants SN de Shp2

2.1.1. Conséquences sur l’activité de la phosphatase

L’accumulation de données concernant plus de 500 mutations du gène PTPN11 ont

permis de montrer que ces mutations ne sont pas distribuées de manière homogène le long du

gène mais affectent des domaines particuliers de la protéine (Tartaglia, Martinelli et al. 2006).

Ainsi, les résidus affectés par les mutations sont situées au niveau (Asn58, Gly60 61 62, Asp , Tyr ,

Tyr63, Glu69 71 72 73, Phe , Ala , Thr , Glu76, Gln79, Gln256 279 2 et Tyr ) ou à proximité (Thr , Ile282,

Phe285 501 502, Arg , Ser , Gly503 et Met504) de la surface d’interaction entre les domaines N-SH2

et PTP qui bloque la molécule dans sa forme inactive: il s’agit donc de mutations gain de

fonction car elles perturbent l’état auto inhibé de la PTP (figure 14c) (Tartaglia, Kalidas et al.

2002; Keilhack, David et al. 2005).

A côté de ces mutations les plus fréquentes, cinq mutations affectent des résidus situés

à distance de la surface d’interaction. Les mutations altérant les résidus Asp106 et Glu11O sont

localisées dans la région connectant les domaines N-SH2 et C-SH2. Il a été suggéré que ces

mutations diminuent la flexibilité du domaine N-SH2 empêchant ainsi son interaction avec le

domaine PTP (Kosaki, Suzuki et al. 2002). Les mutations affectant les résidus Thr42 du

domaine N-SH2, Glu139 du domaine C-SH2 et Thr411 du domaine PTP sont spatialement

éloignées de cette interface. Les résidus Thr42 et Glu139 sont impliqués dans l’interaction

intermoléculaire entre les domaines SH2 et les phosphotyrosines des peptides partenaires de

Shp2 (Lee, Kominos et al. 1994; Huyer and Ramachandran 1998).

Il a été proposé de classer les mutations en 6 groupes en fonction de leur effet sur la fonction

de la protéine (tableau 6) (Tartaglia, Martinelli et al. 2006).

60

Tableau 6. Classification et distribution relative des mutations germinales et somatiques de PTPN11

(Tartaglia, Martinelli et al. 2006)

Comme nous l’avons vu, des mutations activatrices acquises de PTPN11 sont

fréquemment retrouvées dans des hémopathies de l’enfant, notamment la LMMJ. Malgré le

fait que les enfants présentant un SN exprime un allèle muté de PTPN11 dans leurs cellules

hématopoïétiques, la LMMJ est rarement observée chez ces enfants (<1%) et, lorsqu’elle

survient, l’évolution est souvent plus bénigne comparée aux LMMJ isolées. Ceci s’explique

par le fait que la répartition et les conséquences fonctionnelles des mutations de PTPN11

retrouvées dans les pathologies constitutionnelles (SN) et acquises (anomalies myéloïdes)

diffèrent. En effet, la comparaison des anomalies moléculaires observées dans le SN et les

leucémies indique une corrélation phénotype/génotype claire soulignant que les mutations

germinales ont un effet différent sur le développement et l’hématopoïèse que les mutations

acquises. Ainsi, les mutants de Shp2 associés aux leucémies ont une activité phosphatase plus

augmentée (Keilhack, David et al. 2005; Tartaglia, Martinelli et al. 2006) responsable d’une

activation plus importante de la voie Ras/MAPK (Mohi, Williams et al. 2005; Schubbert,

Lieuw et al. 2005) que les mutants associés au SN. Ces données supportent le fait que des

seuils d’activation de Shp2 différents sont à l’origine de phénotypes cellulaires,

tissulaires et de développement spécifiques (Tartaglia, Niemeyer et al. 2003). Ce modèle

expliquerait que les mutants SN de Shp2 ont un effet gain de fonction modéré suffisants pour

perturber le développement du cœur, de la face et du squelette contrôlé par de nombreux

facteurs de croissance, mais insuffisant pour déréguler la prolifération des précurseurs

hématopoïétiques. Les mutants de Shp2 observés dans les JMML isolées présentent un effet

gain de fonction plus important avec un retentissement sur les cellules précurseurs.

L’expression d’un mutant fort de Shp2 affecterait le développement embryonnaire et la survie

fœtale.

61

Cependant, le fait que des corrélations phénotype-génotype franches n’aient pas été mises en

évidence et que certains membres de la même famille avec la même mutation de PTPN11 ont

des phénotypes différents suggèrent qu’il existe des gènes modificateurs.

2.1.2. Conséquences sur les voies de signalisation

Des études biochimiques, réalisées dans des cellules transfectées transitoirement par

des mutants SN de Shp2, ont montré que ces mutants seraient responsables d’une activation

soutenue de la voie Ras/MAPK selon un mécanisme encore mal compris (Fragale, Tartaglia et

al. 2004). Les cultures cellulaires et les études sur l’embryon ont révélé que l’activation de la

voie Ras/MAPK était variable en fonction du type cellulaire et du tissu : augmentée dans

les tissus ou sont observés les anomalies (face, bourgeon des membres, tissus endocardiques)

mais non modifiée dans d’autres (MEF) (Araki, Mohi et al. 2004; Nakamura, Colbert et al.

2007; Krenz, Gulick et al. 2008; Araki, Chan et al. 2009).

Dans les modèles animaux, l’activation des autres voies de signalisation (p38, JNK et Erk5

MAPKs, PI3K/Akt, JAK/STAT ou RhoA) est inchangée.

L’activation de STAT3 est diminuée dans des cellules sanguines périphériques de

patients SN et dans des cellules de la moelle osseuse transformées par un mutant activateur

(N308D) de Shp2 en réponse à l’EGF. Cette downrégulation de STAT3 pourrait intervenir

dans la physiopathologie de l’hyperplasie des progéniteurs myéloïdes et la sténose pulmonaire

(Zhang, Chan et al. 2009).

Des études utilisant des mutants somatiques (retrouvés dans les LMMJ) ont permis de

préciser les conséquences des mutations activatrices de PTPN11 sur les différentes voies de

signalisation.

L’expression de différents mutants de Shp2 associés aux LMMJ (E76K, D61V, D61Y) dans

des cellules murines de moelle osseuse murine induit une hypersensibilité des cellules

progénitrices myéloïdes hématopoïétiques au GM-CSF et une transformation maligne

ressemblant à la LMMJ, médiés par une activation de la voie Ras/MAPK (Chan, Leedy et al.

2005; Mohi, Williams et al. 2005; Schubbert, Lieuw et al. 2005).

L’expression de ces mêmes mutants augmente la migration cellulaire et l’angiogenèse dans

différents types cellulaires (cellules hématopoïétiques, endothéliales et fibroblastes) et chez la

62

souris KI. Ces modifications seraient notamment médiées par une augmentation de

l’activation de RhoA en aval des intégrines (Oishi, Zhang et al. 2009).

Dans ces modèles cellulaires ou animaux, les mutants activateurs seraient responsables d’une

activation de la voie PI3K/Akt (Mohi, Williams et al. 2005; Yu, Daino et al. 2006; Oishi,

Zhang et al. 2009).

Concernant l’activation de STAT, l’expression du mutant gain de fonction D61G dans des

progéniteurs neuronaux est responsable d’une diminution d’activation de STAT3 avec pour

conséquent une augmentation de la différenciation neuronale et une réduction de l’astrogénèse

(Ke, Zhang et al. 2007). Cependant, ces données paraissent contradictoires avec une étude

montrant que, dans des cellules macrophagiques de moelle osseuse exprimant le mutant E76K

de Shp2, l’activation de STAT5 est augmentée en réponse à l’IL-3 (Mohi, Williams et al.

2005).

2.1.3. Conséquences sur le développement : les modèles animaux

L’élucidation de la pathogenèse du SN, en particulier en ce qui concerne les anomalies

de développement, a été permise en grande partie par des modèles animaux.

2.1.3.1. La Drosophile

Oishi et al. ont utilisé des drosophiles transgéniques pour modeler les conséquences

sur le développement des mutations activatrices de PTPN11 associées au SN ou aux

leucémies (Oishi, Gaengel et al. 2006). L’expression ubiquitaire de l’allèle gain de fonction

de Csw ne perturbe pas le développement en aval de tous les RTKs ; ainsi, le développement

de la trachée et de l’aorte dorsale est normal ainsi que l’activation des voies en aval de Torso.

Deux allèles Csw portants des mutations fortes sont responsables d’une létalité embryonnaire

alors que l’expression d’un allèle plus modéré associé au SN (N308D) entraîne une formation

ectopique des veines des ailes. Les phénotypes des ectopies des veines ressemblent à celles

observées avec les mutations gain de fonction de l’EGFR (Baker and Rubin 1992).

L’activation de Ras est nécessaire mais pas suffisante pour l’expression de ces phénotypes.

Des études épistatiques ont montré que l’allèle N308D interagit avec pratiquement tous les

gènes de la voie Ras/MAPK ainsi qu’avec les voies de signalisations JAK/STAT, Notch et

Decaptentaplegic (l’orthologue de bone morphogenetic protein, BMP).

63

2.1.3.1. Les modèles murins

Un modèle murin portant la mutation SN D61G de PTPN11 a été généré par

recombinaison homologue dans des cellules souches embryonnaires (Araki, Mohi et al. 2004).

Dans ce modèle, les souris mutantes homozygotes meurent au stade embryonnaire alors que

les souris hétérozygotes ont une viabilité diminuée. PTPN11D61G/D61GA E13.5, les embryons homozygotes sont oedémateux et hémorragiques et

ont une nécrose hépatique diffuse. Des malformations cardiaques sévères sont présentes

incluant des anomalies septales et de la voie d’éjection du ventricule droit. La valve

atrioventriculaire primordiale et les voies d’éjection sont élargies. De plus, le myocarde est

significativement plus épais comparé aux contrôles. D61G/+Les embryons PTPN11 présentent des malformations cardiaques à type d’hyperplasie

des valves, de défects septaux (CIA, CIV, CAV) et d’anomalies de la voie d’éjection droite.

Le développement du myocarde est grossièrement normal. Ces anomalies cardiaques ont une

pénétrance incomplète avec la moitié des embryons PTPN11D61G/+ mourant en périnatal du

fait de malformations cardiaques et l’autre moitié présentant une hyperplasie valvulaire

modérée au cours de l’embryogénèse avec parfaois une résolution spontanée. L’analyse des

tissus endocardiques de ces embryons retrouve une prolifération augmentée et une apoptose

diminuée. L’augmentation du dosage génique de PTPN11D61G augmente la pénétrance des

anomalies valvulaires et septales et est responsable d’un épaississement du myocarde ce qui

est compatible avec le fait que des niveaux d’activation différents de Shp2 sont

responsables de phénotypes différents.

Les autres aspects du phénotype SN sont observés chez la souris PTPN11D61G/+. Ces animaux

présentent une petite taille harmonieuse malgré des taux sériques normaux d’IGF-I. Le

développement cardiofacial est perturbé. Enfin, ces souris présentent un syndrome

myéloprolifératif modéré, similaire à celui observé chez les patients.

Des souris transgéniques exprimant des mutants SN de Shp2 au niveau de différents

tissus ou types cellulaires ont été générées.

L’expression du mutant Q79R dans les cardiomyocytes à différents stades du développement

(in utero et en post-natal) conduit à des devenirs différents. Ainsi, les cœurs d’embryons de

souris transgéniques présentent des malformations cardiaques (défects septaux, anomalie de la

voie d’éjection) comparables à celles observées chez les souris PTPN11D61G/+, alors que

64

l’expression postnatale des mutants n’entraîne aucune modification notable (Nakamura,

Colbert et al. 2007).

La surexpression du mutant Q79R dans des tissus endocardiques en développement entraîne

une mortalité embryonnaire à E14.5 avec des embryons présentant un élargissement des tissus

endocardiques dans le canal atrioventriculaire et dans les voies d’éjection, ce qui pourrait

expliquer le développement anormal des valves (Krenz, Gulick et al. 2008).

Enfin, en utilisant une approche par KI inductible, il a été montré que les malformations

cardiaques seraient secondaires à l’expression des mutants de Shp2 dans les tissus

endocardiques (et non les tissus myocardiques ou de la crête neurale) alors que les anomalies

faciales seraient causées par l’expression de ces mutants dans les cellules de la crête neurale.

De plus, la pénétrance des malformations est modifiée par le fond génétique (Araki, Chan et

al. 2009).

2.2. Mutants SL de Shp2

Dans le SL, les mutations de PTPN11 sont localisées au niveau de résidus situés à

proximité ou localisés dans le site actif de la phosphatase et sont donc responsables d’une

diminution de l’activité PTP (figure 14d) (Hanna, Montagner et al. 2006; Kontaridis,

Swanson et al. 2006; Tartaglia, Martinelli et al. 2006). Ces mutations affectent des résidus très

conservés au sein de la superfamille des PTP et importants pour l’activité catalytique de

l’enzyme localisés dans les motifs clés tels que la boucle PTP (T468M), la boucle p-Tyr

(Tyr279) ou la boucle Q.

Contrairement aux mutants SN de Shp2, il existe peu de données sur les conséquences

fonctionnelles des mutants SL au niveau cellulaire, tissulaire ou du développement.

Concernant la voie Ras/MAPK, selon le modèle utilisé, les mutants SL de Shp2 ont un effet

dominant négatif ou positif. Ainsi, dans des cellules transfectées, les mutants SL de Shp2

inhiberaient l’activation des MAPKs en réponse à de nombreux facteurs de croissance

(Kontaridis, Swanson et al. 2006). Cependant, dans des modèles de drosophiles transgéniques,

l’expression de l’allèle SL de Csw conduit à la formation ectopique des veines des ailes en

rapport avec une activation de la voie Ras/MAPK ectopiques et nécessitant une activité

résiduelle de la phosphatase (Oishi, Zhang et al. 2009).

65

Dans des cellules transfectées, les mutants SL de Shp2 seraient responsables d’une

augmentation de l’association PI3K/Gab1 du fait de la diminution de la déphosphorylation

des sites de liaison de PI3K sur Gab1 (Hanna, Montagner et al. 2006).

Enfin, l’expression de 2 mutants SL de Shp2 (A462T et G465A) chez l’embryon de

Zebrafish, induit des anomalies de la gastrulation responsables de malformations

craniofaciales et cardiaques similaires au phénotype humain (Jopling, van Geemen et al.

2007).

Conclusion

Les études fonctionnelles ont permis de mieux appréhender la physiopathologie des

SN et SL.

Ainsi, les mutations de PTPN11 associées au SN entraîneraient une augmentation d’activité

de la phosphatase Shp2, responsable d’une activation tissu-spécifique de la voie Ras/MAPK

qui pourrait expliquer les anomalies cardiaques et hématologiques observées. Les variations

phénotypiques pourraient être secondaires à des différences au niveau du seuil d’activation de

Shp2 et du fond génétique.

Cependant, de nombreuses questions restent posées. Par exemple, existe-t-il des impacts

différents des mutations SN et SL sur certaines voies de signalisation permettant d’expliquer

le développement spécifique de certains symptômes ? Ou encore, quelles sont les

conséquences des mutants de Shp2 les voies de signalisation en aval du GHR et leurs

implications physiopathologiques sur la croissance? Ou enfin, comment des mutations aux

effets opposés, gain de fonction dans le SN et perte de fonction dans le SL, sont responsables

de phénotypes similaires ? Ces différentes questions seront abordées dans la partie

expérimentale et les perspectives de ce document.

66

-Résultats expérimentaux et perspectives-

67

Résultats expérimentaux

1. Introduction :

Bien que de nombreuses études aient permis des avancées importantes, comment les

mutations de PTPN11 sont à l’origine des signes observés dans les SN et SL reste une

question ouverte. D’autant plus que ces deux syndromes, qui partagent des phénotypes très

proches, sont causés par des mutations aux effets opposés sur l’activité de la phosphatase,

gain de fonction dans le SN et perte de fonction dans le SL. Pour expliquer cette observation

paradoxale, différents mécanismes avaient été proposés dans la revue que nous avions publiée

(annexe 1).

Un point important dans la compréhension de la physiopathologie des SN et SL est

l’identification des voies de signalisation altérées par les mutants de Shp2. Jusqu’ici, la

plupart des études se sont focalisées sur la voie Ras/MAPK. En effet, les études génétiques

ont montré que la plupart des syndromes Neuro-cardio-facio-cutanés sont causés par des

mutations de gènes codant pour des molécules impliquées dans cette voie. Actuellement, il est

reconnu que les mutants NS de Shp2, comme les mutants des autres molécules impliquées

dans ce syndrome (Sos1, Raf1), ont un effet dominant positif sur l’activation de la voie

Ras/MAPK. Les modèles animaux ont montré que cet effet positif serait probablement

responsable des anomalies cardiaques associées au SN (Araki, Mohi et al. 2004; Fragale,

Tartaglia et al. 2004; Oishi, Gaengel et al. 2006; Krenz, Gulick et al. 2008). Cependant, les

mécanismes moléculaires précis à l’origine de cette activation ne sont actuellement pas

connus. En ce qui concerne le SL, nos connaissances sont plus limitées car même l’effet des

mutants SL de Shp2 sur la voie Ras/MAPK est toujours débattu (Kontaridis, Swanson et al.

2006; Oishi, Zhang et al. 2009).

Pour aller plus loin dans la physiopathologie de ces syndromes, il nous a semblé

important d’étudier l’impact des mutants de Shp2 sur d’autres voies de signalisation,

notamment celles qui jouent un rôle au cours du développement embryonnaire. La voie

PI3K/Akt était un bon candidat comme cible potentielle des mutants de Shp2. En effet, par sa

régulation de nombreux mécanismes cellulaires comme la croissance, l’apoptose, la migration

et la différenciation, en réponse à de nombreux facteurs de croissance, cette voie joue un rôle

68

majeur au cours du développement (Engelman, Luo et al. 2006). De plus, les études

biochimiques réalisées dans notre laboratoire ont suggéré que les mutants SL de Shp2

pourraient stimuler l’activation de la kinase PI3K (Hanna, Montagner et al. 2006). Nous

avons donc voulu explorer les conséquences des mutants de Shp2 sur l’ensemble de la voie de

signalisation PI3K/Akt. Pour cette étude, nous avons travaillé à partir de cultures de

fibroblastes cutanés immortalisés de patient NS et SL ce qui constituait un outil original et

unique à ce jour.

2. Résultats et discussion :

Functional effects of PTPN11 (Shp2) mutations causing LEOPARD syndrome on EGF-

induced PI3K/Akt/GSK-3β signalling.

Thomas Edouard, Jean-Pilippe Combier, Sophie Bel-Vialar, Audrey Nédelec, Mélanie

Métrich, Frank Lezoualc’h, Françoise Conte-Auriol, Stanislas Lyonnet, Béatrice Parfait,

Maithé Tauber, Armelle Yart, Jean-Pierre Salles, and Patrick Raynal.

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100

101

102

103

104

105

106

Edouard Fig. S1

P-Akt

V5

0 5 0 5 0 5 0 5E.V. WT N308D Y279C

EGF (min)

Shp2-V5-

HA

Effect on Akt phosphorylation of transfecting empty vector or vectors encoding Shp2-WT or mutants. HEK293 cells were co-transfected with HA-tagged Akt and empty vector (EV) or vectors encoding the indicated V5-tagged Shp2 WT or mutant. Following EGF stimulation as indicated, cells were subjected to HA-Aktimmunoprecipitation, then analysed by anti-P-Akt immunoblotting (top panel). Aliquots of corresponding cell lysates were subjected to anti-HA or anti-V5 immunoblotting(middle and bottom panels, respectively). These data are representative of threeindependent experiments.

0 5 10 0 5 10 5 10 0 5 10 5 10

- control Gab1

WT Y279C

control Gab1

T468M

EGF (min):

siRNA:

Patient:

050

100150200250300350

Phos

pho-

Akt

(% o

fctrl

)

** *

*

Edouard Fig. S2

Quantification of Akt phosphorylation in LS patient cells treated with Gab1 siRNA. Immortalized skin fibroblasts from healthy subject (WT) or from LS patients carrying the indicated PTPN11 mutation were treated with control or Gab1-targeting siRNAs, as indicated. Following stimulation with EGF when indicated, cells were subjected to anti-phospho-Akt immunoblotting. Immunoblots were then quantified using ImageJ. Only significant differences vs. WT cells for the corresponding time are indicated (* p<0.05, n=3).

Edouard Fig. S1

P-Akt

V5

0 5 0 5 0 5 0 5E.V. WT N308D Y279C

EGF (min)

Shp2-V5-

HA

Effect on Akt phosphorylation of transfecting empty vector or vectors encoding Shp2-WT or mutants. HEK293 cells were co-transfected with HA-tagged Akt and empty vector (EV) or vectors encoding the indicated V5-tagged Shp2 WT or mutant. Following EGF stimulation as indicated, cells were subjected to HA-Aktimmunoprecipitation, then analysed by anti-P-Akt immunoblotting (top panel). Aliquots of corresponding cell lysates were subjected to anti-HA or anti-V5 immunoblotting(middle and bottom panels, respectively). These data are representative of threeindependent experiments.

0 5 10 0 5 10 5 10 0 5 10 5 10

- control Gab1

WT Y279C

control Gab1

T468M

EGF (min):

siRNA:

Patient:

050

100150200250300350

Phos

pho-

Akt

(% o

fctrl

)

** *

*

Edouard Fig. S2

Quantification of Akt phosphorylation in LS patient cells treated with Gab1 siRNA. Immortalized skin fibroblasts from healthy subject (WT) or from LS patients carrying the indicated PTPN11 mutation were treated with control or Gab1-targeting siRNAs, as indicated. Following stimulation with EGF when indicated, cells were subjected to anti-phospho-Akt immunoblotting. Immunoblots were then quantified using ImageJ. Only significant differences vs. WT cells for the corresponding time are indicated (* p<0.05, n=3).

107

Edouard Fig. S4

Total amounts of EGFR and Shp2 (PTPN11) in patient cells. Aliquots of cell lysates from immortalized skin fibroblasts from a healthy subject (WT) or from LS or NS patients carrying the indicated PTPN11 mutation were subjected to immunoblotting with the indicated antibody.

WT Y279C T468M

LS

E76D N308DNS

Tubulin

Shp2 (PTPN11)

EGFR

p85

Myc

WT YF3 WT-Ab Lysate

Edouard Fig. S3

Association of p85 with Gab1-WT or with Gab1 mutated on its three PI3K-binding sites (Gab1-YF3). HEK293 cells were transfected with constructs encoding Myc-tagged Gab1-WT or Gab1-YF3. Following EGF stimulation, cells were subjected to anti-Myc immunoprecipitation, then analysed by anti-p85 (top panel) or anti-Myc immunoblotting (bottom panel). Lane WT-ab: mockimmunoprecipitation performed from Gab1-WT-transfected cells without primaryantibody. Lane lysate: aliquot of transfected cell lysate loaded on the gel as a positive control for Western blot revelation.

Gab1-Myc-:

Edouard Fig. S4

Total amounts of EGFR and Shp2 (PTPN11) in patient cells. Aliquots of cell lysates from immortalized skin fibroblasts from a healthy subject (WT) or from LS or NS patients carrying the indicated PTPN11 mutation were subjected to immunoblotting with the indicated antibody.

WT Y279C T468M

LS

E76D N308DNS

Tubulin

Shp2 (PTPN11)

EGFR

p85

Myc

WT YF3 WT-Ab Lysate

Edouard Fig. S3

Association of p85 with Gab1-WT or with Gab1 mutated on its three PI3K-binding sites (Gab1-YF3). HEK293 cells were transfected with constructs encoding Myc-tagged Gab1-WT or Gab1-YF3. Following EGF stimulation, cells were subjected to anti-Myc immunoprecipitation, then analysed by anti-p85 (top panel) or anti-Myc immunoblotting (bottom panel). Lane WT-ab: mockimmunoprecipitation performed from Gab1-WT-transfected cells without primaryantibody. Lane lysate: aliquot of transfected cell lysate loaded on the gel as a positive control for Western blot revelation.

Gab1-Myc-:

108

3. Conclusion

Ce travail nous a permis d’observer, qu’en réponse à l’EGF, la voie PI3K/Akt est

hyperactivée dans les cellules de patients SL comparées à celles des patients SN ou des

contrôles. Cet effet dominant positif des mutants SL de Shp2 est dû à une diminution de la

déphosphorylation des sites de liaison de PI3K sur Gab1, augmentant ainsi l’association

PI3K/Gab1 et l’activation de la voie PI3K/Akt. Nous avons également observé dans les

cellules de patients SL que cette hyperactivation de PI3K/Akt entraîne une augmentation de

l’inactivation de GSK3-β et par conséquent une régulation positive des marqueurs

d’hypertrophie cardiaque. Enfin, les inhibiteurs de PI3K annulent la croissance

hypertrophique induite par les mutants SL dans des cardiomyocytes en culture et des explants

cardiaques d’embryons de poulet, suggérant que l’hyperactivation de PI3K/Akt pourrait

participer à l’hypertrophie cardiaque souvent observée dans le SL. Ces données

expérimentales sont concordantes avec les données cliniques qui ont montré que, dans le

cadre des mutations de PTPN11, la fréquence des HCM est élevée (≈50%) chez les patients

SL, et basse (<10%) dans le SN.

Il s’agit donc de la première étude suggérant l’implication de la voie PI3K/Akt dans la

physiopathologie des SN et SL. Ces données obtenues in vitro restent bien sur à valider,

notamment dans des modèles animaux, mais ouvrent de nouvelles perspectives de recherche.

109

Perspectives

Les axes de recherche de notre laboratoire visent à poursuivre la caractérisation

fonctionnelle et les implications physiopathologiques des mutants SN et SL de Shp2.

Dans un premier temps, il apparaît important de confirmer notre modèle de développement de

l’HCM chez les patients SL impliquant la voie PI3K/Akt dans des tissus cardiaques humains

et/ou des modèles animaux. La mise en évidence du rôle de la voie PI3K/Akt dans ces

syndromes ouvre de nouvelles pistes pour expliquer la physiopathologie d’autres atteintes

notamment le retard statural. Enfin, ces travaux pourront être poursuivis par la recherche

d’anomalies au niveau d’autres voies de signalisation.

1. Validation du modèle de développement de l’HCM chez les patients SL dans des tissus

cardiaques humains et/ou des modèles animaux

Les données de notre étude ont été obtenues initialement dans des fibroblastes issus de

biopsies cutanées de patients SL et SN. Une des critiques qui peut être faite est l’utilisation de

cellules cutanées pour explorer la physiopathologie de l’atteinte cardiaque chez ces enfants,

d’autant plus que les modèles animaux ont montré que la dysrégulation des voies de

signalisation est tissu-spécifique. C’est pourquoi, nous avons confirmé nos résultats initiaux

dans des cardiomyocytes infectés par adénovirus exprimant les différents mutants de Shp2 et

des cellules humaines HEK293 transfectées transitoirement, qui constituent un modèle

standard pour explorer les fonctions moléculaires de Shp2.

La confirmation de nos résultats dans des tissus cardiaques de patients SN et SL

pourrait être envisagée, ces tissus pouvant être obtenus lors d’une intervention de chirurgie

cardiaque. Cependant, hormis le fait que ces interventions sont rares, il faudrait bénéficier de

tissus provenant à la fois de patients SL, SN et sains pour comparer les niveaux d’activation

de la voie PI3K/Akt, ce qui apparaît difficilement réalisable. De plus, ces analyses ne nous

renseigneraient pas sur les conséquences des mutants de Shp2 au cours du développement.

Pour obtenir des cellules cardiaques de patients, une approche originale utilisant des

cellules souches pluripotentes induites (induced pluripotent stem cell, IPSc) est envisagée.

110

Cette méthode consiste à reprogrammer des cellules somatiques en un état pluripotent par une

succession de manipulations : transfert nucléaire de cellules somatiques, fusion avec des

cellules souches pluripotentes et reprogrammation pour produire des IPSc (Cowan, Atienza et

al. 2005; Byrne, Pedersen et al. 2007; Takahashi, Okita et al. 2007; Yu, Vodyanik et al. 2007;

Park, Zhao et al. 2008). Les IPSc peuvent secondairement être redifférenciées en un type

cellulaire particulier comme par exemple les cardiomyocytes (Zwi, Caspi et al. 2009). Ainsi,

nous pourrions utiliser les cultures de fibroblastes de patients SL et SN dont nous disposons

pour les dédifférencier en cellules souches pluripotentes puis dans un second temps les

redifférencier en cellules cardiaques. Des contacts avec des équipes françaises maîtrisant ces

techniques ont été pris et des projets de collaboration doivent être finalisés.

Enfin, il est clair que la démonstration définitive de notre hypothèse repose sur

l'analyse du niveau d'activation de PI3K et de GSK3 au niveau cardiaque in vivo, ce qui

deviendra possible lorsqu'un modèle animal de la pathologie sera disponible.

Afin de disposer d'un modèle murin s'approchant le plus possible de la pathologie humaine,

nous développons en collaboration avec l’Institut Clinique de la Souris (Strasbourg) une

souris transgénique mutée sur un des deux allèles du gène PTPN11, au niveau de tous ses

tissus, et de façon constitutive (non conditionnelle). La mutation choisie est T468M, une

mutation fréquente dans le SL et pour laquelle nous disposons d'une culture de fibroblastes

d'un patient. A noter qu'une équipe américaine a mis en œuvre une stratégie similaire pour

produire un modèle murin du SN, qui s'est avéré particulièrement similaire à la pathologie

humaine (Araki, Mohi et al. 2004).

Lorsque nous disposerons de ces souris SL, nous examinerons tout d'abord si elles présentent

les symptômes caractéristiques du SL, telles que malformations cardiaques et déficit de

croissance. Nous étudierons alors au niveau du cœur l'activation de la voie PI3K/GSK3, afin

de vérifier in vivo la validité de nos observations in vitro. Nous pourrions alors traiter des

souriceaux avec des inhibiteurs de cette voie, selon un protocole déjà réalisé dans l'équipe,

dans le but de freiner le développement des cardiomyopathies hypertrophiques fréquemment

associées au SL.

Après nous être intéressé aux mécanismes à l’origine de l’HCM chez les patients SN

et SL, nous souhaitons explorer la physiopathologie d’autres atteintes, en particulier le retard

statural. Suite à nos travaux, nous rechercherons tout d’abord si l’activation de la voie

PI3K/Akt est affectée en aval du GHR pouvant expliquer la résistance à GH.

111

2. Implication physiopathologique des mutants de Shp2 dans le retard statural et la

résistance à GH

Comme nous l’avons vu dans les chapitres précédents, le retard statural est fréquent

(80%) chez les patients NS porteurs d’une mutation de PTPN11. Chez ces patients, les

données cliniques, hormonales et la réponse au traitement par rhGH sont en faveur d’une GHI

partielle post récepteur. Actuellement, l’effet des mutants de Shp2 sur les voies de

signalisation en aval du GHR n’est pas connu, nous souhaitons donc nous y intéresser

(annexe 2). Les patients présentant une résistance partielle à GH étant traités par des doses

supraphysiologiques de GH, décrypter les mécanismes de résistance à cette hormone semble

un enjeu important pour permettre d’optimiser le traitement de ces patients et d’en limiter

ainsi les effets indésirables. De plus, les outils moléculaires développés à l’occasion de ce

travail pourront également être utilisés pour l’étude de la signalisation induite par GH chez

des cohortes de sujets plus étendues présentant une GHI tels que les enfants petits nés SGA,

mais également d'aborder les mécanismes de résistance à d'autres hormones.

2.1. Hyperactivation de la voie Ras/MAPK sous GH et déficit en IGF-I

Pour aborder l’étude des conséquences des mutants de Shp2 dans la signalisation du

GHR, nous privilégions d'utiliser la lignée murine préadipocytaire 3T3-F442A car il s'agit du

meilleur modèle d'étude de la signalisation du GHR, comme en attestent les études de la

littérature (Kim, Jiang et al. 1998; Kim, Loesch et al. 2002) et comme nous avons pu le

vérifier. Ces cellules peuvent être différenciées en adipocytes et sécréter de l’IGF-I,

mesurable par méthode Elisa ou par RT-PCR quantitative, ce qui permet d'évaluer la réponse

biologique à GH. De plus, l’obtention de ces adipocytes peut également présenter l'intérêt

d'explorer la résistance à d'autres hormones du métabolisme. Nous disposons également dans

le laboratoire de cellules HEK exprimant de manière constitutive le GHR ; cependant,

l’absence de sécrétion d’IGF-I en quantité mesurable par ces cellules limite leur utilisation à

l’étude de la signalisation précoce en réponse à GH. D’autres lignées (lignées

d’hépatocarcinomes, MRC5) ont été testées mais les résultats n’ont pas été concluants.

Une étude préliminaire a été réalisée au laboratoire pour déterminer la fonction

physiologique de Shp2, en comparant des cellules 3T3F442A exprimant ou pas Shp2. Ainsi,

112

les travaux d’Audrey Nédélec montrent que Shp2 intervient dans la réponse à GH

principalement dans l’activation de la voie Ras/MAPK. De façon intéressante, Shp2 apparaît

comme un régulateur négatif de la production d’IGF-I induite par GH. Le lien fonctionnel

entre activation des MAPK et inhibition de la production d’IGF-I est en cours d’étude. On

pourrait alors s’attendre à ce que les mutants SN, étant hyperactifs, induisent une

hyperactivation de la voie Ras/MAPK, corrélée à une diminution de la production d’IGF-I

induite par GH, ce qui serait en accord avec les données cliniques.

Pour tester cela, les cellules 3T3-F442A étant difficilement transfectables par les

techniques habituelles, des outils permettant de s'affranchir de cette limitation ont été

développés dans l’équipe: adénovirus exprimant des mutants SN (D61del, Y63C, E139D et

N308D) et SL (Y279C et T468M) capables d'infecter très efficacement les préadipocytes et

un système lentiviral exprimant de façon inductible ces mêmes mutants ainsi que des short

hairpin ARN ciblant spécifiquement Shp2. Ce dernier outil présente l'avantage d’exprimer les

formes mutantes de Shp2 tout en diminuant l'expression de Shp2 endogène, afin de

s’approcher au plus près de la situation physiopathologique de cellules de patients SN. Ces

mêmes constructions ont été utilisées pour produire des lignées de HEK-GHR exprimant les

différents mutants.

Les résultats préliminaires que j’ai obtenu dans les HEK GHR constitutives infectées par le

système lentiviral inductible exprimant différents mutants SN (D61del, N308D) ou SL

(Y279C, T468M) de Shp2, retrouvent une augmentation de la phosphorylation d’Erk en

réponse à GH chez les mutants SN et SL comparés aux contrôles ; par contre, il ne semble pas

y avoir d’effet significatif sur la phosphorylation d’Akt et STAT. De même, les résultats,

obtenus par A. Nédelec dans des préadipocytes infectés par lentivirus, retrouvent une

augmentation de la phosphorylation d’Erk, sans modification de la phosphorylation d’Akt et

Stat5. D’autres manipulations sont nécessaires pour confirmer ces données initiales, explorer

les mécanismes impliqués, et identifier l’impact de ces mutants sur la production d’IGF-I.

Une fois les causes moléculaires du retard statural identifiées in vitro, nous les

confirmerons in vivo dans les modèles murins que nous sommes en train de développer.

Lorsque l’identification des voies mobilisées par l'hormone de croissance et dont l'activation

est défectueuse sera établie in vivo, nous tenterons de les activer ou de les réprimer

pharmacologiquement, dans le même esprit que celui décrit ci-dessus à propos de

l'implication de la voie PI3K/GSK3 dans l'hypertrophie cardiaque.

113

2.2. Atténuation du retard statural chez les SL par hyperactivation de la voie PI3K/Akt

Chez les patients SL, le retard statural est plus rare (20%) et leurs caractéristiques

hormonales ne sont pas connues. Une étude est actuellement en cours dans l’unité

d’Endocrinologie de l’hôpital des enfants de Toulouse pour étudier de manière rétrospective

le statut hormonal des patients SL suivis en France, par l’intermédiaire du centre de référence

français (Service de Génétique de l’hôpital Robert Debré, Pr A. Verloes).

Concernant l’implication de la voie PI3K/Akt dans la physiopathologie du retard

statural chez les patients SN et SL, les données sur la croissance connues dans d’autres

pathologies génétiques pourraient fournir des pistes intéressantes. Ainsi, un gigantisme

(avance staturale supérieure à 3 DS), associé à des hamartomes et une prédisposition

tumorale, est présent dans les syndromes hamartomateux, qui sont le plus souvent en rapport

avec des mutations germinales de PTEN : Cowden (80%), Lehermitte-Duclos (83%),

Bannayan-Riley-Ruvalcaba (60%) et Proteus (<20%) (Eng 2003). Le gène suppresseur de

tumeur PTEN code pour une lipide phosphatase qui s’oppose aux effets de PI3K et par

conséquent inhibe l’activation de la voie PI3K/Akt. Les mutations germinales de PTEN

retrouvées dans les syndromes hamartomateux sont inactivatrices et sont donc responsables

d’une hyperactivation de la voie PI3K/Akt. Les modèles murins ont confirmé que

l’invalidation de PTEN qui entraîne une activation de la voie PI3K/Akt est responsable d’une

avance staturale (Di Cristofano, Pesce et al. 1998), alors que l’invalidation de PKBα/Akt1 ou

p70S6K qui entraîne une inactivation de la voie PI3K/Akt entraîne un retard statural (Cho,

Thorvaldsen et al. 2001; Um, Frigerio et al. 2004). D’autre part, dans les syndromes où une

activation de la voie Ras/MAPK est retrouvée, comme dans la plupart des syndromes Neuro-

cardio-facio-cutanés mais aussi l’achondroplasie, un retard statural est souvent observé.

Une hypothèse intéressante serait que l’activation de la voie Ras/MAPK retrouvée dans le SN

et le SL serait à l’origine du retard statural par des mécanismes restant à identifier. Chez les

patients SL, l’activation concomitante de la voie PI3K/Akt viendrait contrebalancer cet effet

sur la croissance ce qui expliquerait la fréquence moins importante du retard statural.

114

3. Effet des mutants de Shp2 sur différentes voies de signalisation :

Malgré la mise en évidence de certains effets des mutants SL et SN de Shp2 sur les

voies Ras/MAPK et PI3K/Akt, de nombreuses incertitudes persistent.

Concernant l’effet sur la voie Ras/MAPK, bien qu’il soit admis que les mutants SN de

Shp2 aient un effet dominant positif, les mécanismes précis sont inconnus. Les travaux

réalisés dans notre laboratoire ont montré que Shp2 joue un rôle de régulateur positif de Ras

en inhibant un de ses inhibiteurs RasGap (Yart, Laffargue et al. 2001; Montagner, Yart et al.

2005). Ces données nous conduisent à l’hypothèse que les mutants activateurs (SN) de Shp2

en augmentant la déphosphorylation des sites de liaison de RasGap sur Gab1, diminuant ainsi

le recrutement de RasGap, pourrait être à l’origine de l’hyperactivation de Ras. Ces

mécanismes vont être explorés en aval du GHR.

L’effet des mutants SL sur l’activation de la voie Ras/MAPK n’est pas connu avec selon le

modèle utilisé un effet dominant négatif ou positif. Une étude a suggéré que dans des cellules

transfectées, les mutants SL de Shp2 inhiberaient l’activation des MAPKs en réponse à de

nombreux facteurs de croissance (Kontaridis, Swanson et al. 2006). Cependant, dans des

modèles de drosophiles transgéniques, l’expression de l’allèle SL de Csw conduit à une

activation de la voie Ras/MAPK (Oishi, Zhang et al. 2009). Ces derniers travaux sont

concordants avec les observations réalisées dans notre laboratoire par JP. Combier (post-

doctorant). Ainsi, l’expression de différents mutants SL de Shp2 dans différents modèles

cellulaires (fibroblastes de patients, MEF, HeLa, Vero, HEK) en réponse à l'EGF entraîne, par

rapport aux contrôles, une hyperactivation de la voie Ras/MAPK. Sous stimulation par GH,

mes résultats préliminaires suggèrent également que les mutations SN et SL induisent une

hyperactivation de la voie Ras/MAPK. D’un point de vue mécanistique, cette hypothèse est

confortée par le fait que Shp2 peut stimuler l’activation de la voie Ras/MAPK par ses

capacités de molécule adaptatrice, indépendante de son activité catalytique (Li, Nishimura et

al. 1994). Dans nos observations, les mutants SL de Shp2 sont d’ailleurs responsables d’une

augmentation du recrutement de Grb2. On peut également envisager que les mutants SL de

Shp2 soient « substrats trappers » sur les sites de recrutement pour RasGap et que, même

s’ils ne peuvent pas déphosphoryler ces sites, ils puissent bloquer l’accès des tyrosines

phosphorylées à RasGap. Des explorations complémentaires sont nécessaires pour conforter

cette hypothèse.

115

Concernant l’effet sur la voie PI3K/Akt, notre étude a mis en évidence que les mutants

SL inactifs de Shp2, en ne déphosphorylant pas les sites de liaison de PI3K sur Gab1, sont à

l’origine d’une hyperactivation de la voie PI3K/Akt. Considérant l’effet des mutants SL de

Shp2, on pourrait s’attendre à ce que les mutants SN de Shp2 aient un effet opposé c'est-à-

dire de diminuer l’activation de PI3K/Akt en déphosphorylant les sites de liaison de PI3K sur

Gab1, ce qui n’est pas observé dans notre étude. Une explication possible est liée à l’effet

dominant positif des mutants SN de Shp2 sur Ras/MAPK. En effet, il est bien établi que Ras

activé peut stimuler l’activation de PI3K par des interactions directes avec sa sous-unité

catalytique p110 (Ramjaun and Downward 2007). Ainsi, l’hyperactivation de Ras induite par

les mutants SN de Shp2 pourrait compenser, par un effet direct sur PI3K, l’inhibition de la

voie PI3K/Akt induite par la déphosphorylation de Gab1.

Ces données soulignent l’importance des interactions entre les voies Ras/MAPK et

PI3K/Akt. Ainsi, les différences phénotypiques observées entre les SN et SL pourraient être

secondaires à la balance entre les différents niveaux d’activation de ces deux voies. Des

études spécifiques seront nécessaires pour explorer les mécanismes précis de ces interactions.

L’étude du niveau d’activation de molécules situées au carrefour de ces deux voies, comme

p70S6kinase, pourrait être intéressante.

L’identification d’autres voies de signalisation altérées par les mutants de Shp2 pourra

également apporter des éléments pour la compréhension de la physiopathologie des SN et SL.

Nous souhaitons ainsi examiner si les mutations de Shp2 influencent l'activation de tyrosine

kinases cytosoliques de la famille Src. Ces kinases sont très impliquées dans le contrôle de

mutiples processus liés au développement notamment tumoral. Or, des données récentes

suggèrent que Shp2 pourrait être un régulateur majeur de ces kinases (Zhang, Yang et al.

2004). Par conséquent, il nous parait important d'examiner si les mutations de Shp2 se

traduisent par un niveau d'activation anormalement élevé de certaines kinases de cette famille.

Cette étude sera entreprise à la fois dans des cellules transfectées et issues de patients. Si les

résultats sont positifs, nous identifierons les systèmes transductionnels controlés par ces

kinases et hyperactivés en conséquence de la surstimulation de ces kinases, comme par

exemple la voie Wnt-βcatenine.

116

Enfin, une étude par méthode phosphoprotéomique quantitative est développée dans notre

laboratoire en collaboration avec la plate-forme de spectrométrie de masse (B. Monsarrat,

Toulouse) à la recherche de nouveaux substrats de Shp2.

4. Conclusion

L’identification des voies de signalisation altérées par les mutants de Shp2 et la

description des mécanismes impliqués permettra une meilleure compréhension de la

physiopathologie des SN et SL. Ces données pourront peut-être permettre d’identifier de

nouveaux gènes impliqués dans ces syndromes et encore inconnus chez 10% des patients SL

et 30% des patients SN. De plus, ces découvertes pourront aboutir à l’identification de

nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, les modulateurs pharmacologiques des voies

Ras/MAPK et PI3K/Akt pourraient être utilisés dans le traitement de certaines atteintes,

notamment cardiologiques et hématologiques, présentes dans ces syndromes.

117

- Références bibliographiques -

118

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