DANIELLE JEAN-MARIE

CARACTÉRIS ATION DES MUTANTS DE LEVURE (S. cerevisiae)

A F F E ~ É S DANS LA MATURATION PROTÉOLYTIQUE

Mémoire présenté

à la faculté des études supérieures de l'université Laval

pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)

Département de biochimie FACULTE DES SCIENCES ET DE GÉNIE

U N N E R S ~ ~ É LAVAL

Décembre 1997

O Danielle Jean-Marie, 1997

National Library Bibliothèque nationale du Canada

Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie SeMces seMces bibliographiques 395 Wellington Street 395, rue Wellington Ottawa ON K1A ON4 OttawaON KIAON4 Canada CaMda

The author has granted a non- exclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sell copies of this thesis in microform, paper or electronic formats.

The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or othennlse reproduced without the author's permission.

L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/film, de reproduction sur papier ou sur format électronique.

L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.

Ce mémoire de maîtrise h t le premier réalisé dans le laboratoire du Dr. Yves Bourbonnais. T'aimerais exprimer mes reconnaissances envers celui-ci pour m'avoir donné la possibilité d'exécuter ce projet. Ses encouragements, ses

judicieux conseils et surtout la liberté académique qu'il m'a laissée tout au long de ma formation ont été grandement appréciés.

Je remercie également les membres de mon comité aviseur, Dr. Dominick Pallotta et Dr. Michel Guertin, pour le temps qu'ils ont accordé à ce projet de maîtrise; le Dr. Pierre Belhumeur de L'Université de Montréal pour m'avoir permis d'effectuer certaines expériences dans son laboratoire; Manon Couture pour ses petits conseils tediniques et ses informations utiles lors de mon arrivée dans le laboratoire.

Finalement, j'adresse mes remerciements à tous mes parents et amis qui m'ont soutenue et encouragée durant toute cette période d'études.

Page

RÉSUMÉ ........................................................................................................................ 1 . . REMERCIEMENTS .................................................................................................... LI ... .............................................................. ....................... TABLE DES MA~ÈRES .. iu

...... ........................................-............................-............. LISTE DES TABLEAUX ..... viii LISTES DES FIGURES .................................. ............................................................... ix

................................................. ...................... LISTE DES ABBRÉVIATIONS ... fi

.................................................................................................................. CHAPITRE 1 ........................................................................................................ INTRODUCTION

..................... 1.1 Biosynthèse des protéines de sécrétion chez les eucaryotes ... 1.1.1 Peptide signal et translocation des protéines dans la lumière

.................................................................. du réticulum endoplasmique ............................................................ ..... 1.1.2 Transport intracellulaire ...

.............. ......................... 1.1.3 Modifications post- traductionnelles ....... ....... ...................... 1.1.3.1 La Glycosylation: généralités et rôles ...

1.1.3.1 -1 La N-glycosylation: biosynthèse et structure ........... 1 .1.3. 1.2 La O-glycos y la tion .........................................................

. ................................. 1.1.3.1.3 Glycosylation chez S cermisiae 1.1.3.2 Modification par le groupement

glycosy lp hosp hatid ylinositol ...................................................... .................... ................................... 1.1.3.3 Maturation protéolytique .....

1 .1.3. 3.1 Caractéristiques des précurseurs et des sites de maturation protéolytique ...........................................

1.1.3.3.2 Lieu d'activation des précurseurs .............................. 1.1.3.3.3 Découverte des endoprotéases responsables de

...................................... l'activation des précurseurs 1.2 La levure S . cerevisiae comme modèle expérimental pour

......................................................... l'activation des précurseurs protéiques

Page

............................................................. . Cycle cellulaire de S cereuisiae

1.2.1.1 Types cellulaires et conjugaison sexuelle ................................ 1.2.1.2 Sporulation .......... .... ............................................................... 1.2.1 -3 La génétique moléculaire: un outil puissant d'analyse ....... Biosynthèse, transport intracellulaire et maturation des précurseurs des pro téines sécrétées chez S . cereoisiae ....................... 1.2.2.1 Facteur a ..........................................................................................

.............................................................................. 1.2.2.2 Toxine «Killer>, Identification et caractérisation des gènes impliqués dans la

maturation des précurseur du facteur a et de la toxine &iller» .... Kex2: prototype d'une famille drendoprotéases identifiée chez . . les eucaryotes supeneurs .........................................................................

1.3 Identification d'une nouveue famille d'endo~rotéase im~fiauée dans

1.3.1

1.3.2

1.3.3

L L I

. ................... la maturation protéolytique chez la levure S cerevisiae 27

Maturation protéolytique du précurseur de la somatostatine ....................................................................................... chez S . cereuisine 27

Sélection de mutants de S . cerevisiae affectant la maturation protéolytique du précurseur de la somatostatine ....................... .... . 29 Clonage et caractérisation du gène YAP3 .............................................. 31

1.4 Problématique ........................................................................................................ 33 .................... ................................. 1.5 HypoWse et objectifs de la recherche ... 34

.................................................................................................. Microorganismes ................................................................................................................ Plasmides

........................................................................................... Milieux de croissance ........................................................................................................ 2.3.1 Bactéries .................................................................. 2.3.2 Levures

Préparation de cellules compétentes de E . coli et transformation ............ Purification de l'ADN plasmidique et transformation des levures ..........

............................................................. 2.5.1 Mini-prép aration de plasmides

v

Page

............................................................... 25.2 Maxi-préparation de plasmides

2.5.3 Midi-préparation de plasmides ............................................................... .............. 2.5.4 Transformation des levures traitées à l'acétate de lithium

................... .............................................. 2.6 Essais biologiques du facteur a .. 2.6.1 Zones d'inhibition de croissance .................. .... ...............................

.... ................................ 2.6.2 Conjugaison sexuelle .. ....... ........................................................................ 2.7 Analyse microscopique

...................... .................................................. 2.8 Test de complémentation ... ........................... ................... 2.8.1 Modification du type cellulaire ....

2.8.1.1 Transformation des lewres MAT a avec le plasmide pGAL-HO ................................................................... ...

2.8.1.2 Induction de l'expression du gène HO ..................................... 2.8.1.3 Sélection des levures MATa ....................................................... 2.8.1.4 Sélection des levures pour la perte du plasmide pGAL-

HO et construction des diploïdes ................. ....... ................... ...................................................................... 2.9 Analyse des produits méiotiques

2.9.1 Construction et sélection des souches diploïdes .................................. .................... 2.9.2 Sélection des levures pour la perte des deux plasmides

.................................................................... ................... 2.9.3 Spodation ..... ............... ...................... 2.9.4 Dissection des tétrades ...

... 2.9.4.1 Digestion de la paroi cellulaire de l'asque ........... ....... 2.9.4.2 Microdissection des ascospores ...................................................

...................................... 2.9.4.3 Sélection des spores haplo'ides MATa ..... ................................. 2.10 Immunodétection de I'endoprotéase Yap3 ..

................................... ......... 2.10.1 Préparation des extraits protéiques .. I . ..................................... .......... 2.102 Dosage des protemes ...........................

2.10.3 Digestion à l'endoglycosidase H .................. ... ................................ 2.10.4 Électrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide en

milieu dénaturant .......................................*....................................... 2.10.5 Transfert électrophorétique des protéines sur membrane de

nitrocellulose .............................. ..... ...... 2.10.6 Irnmunodétection de I'antigène ....................................................

................................................................................................................ CHAPITRE m RÉSULTATS ............................................. ... .. ... .... 3.1 Spécificité du défaut de maturation protéolytique chez les mutants

sex ............................................................................................................................. 3.1.1 Zones d'inhibition de croissance ............................................................ 3.1.2 Conjugaison sexuelle des mutants sex ..................................................

3.2 Étude de la croissance des mutants sex ............................................................ 3.2.1 Croissance des mutants sex à des températures extrêmes ................ 3.2.2 Croissance en milieu hypertonique (stress osmotique) ..................... 3-23 Croissance des mutants sex sut d'autres sources de carbone ...........

3.3 Croissance des mutants sur des milieux révélant une faiblesse dans ......................................................................... ................... la paroi cellulaire ..

3.3.1 Sensibilité des mutants au Calcofluor White ................................ .................... 3.3.2 Sensibilité des mutants à la zymolyase ............. .......

................ 3.3.3 Sensibilité des mutants à la caféine ...................... ....... ............................................................................ 3.4 Morphologie des mutants sex

..................................................................... 3.5 Analyse de la glycoprotéine Yap3 3.6 Récessivité des phénotypes et établissement des groupes de

.............................................. .......................................... complémentation .. ........................................ 3.6.1 Dominance et récessivité des mutations sex

3.6.2 Établissement des groupes de complémentation ......... ... ............. 3.6.2.1 Expression des phénotypes (NaCls, Cafs et Glyc-) dans les

.................. deux types cellulaires haploïdes ..................... .. 3.6.2.2 Investigation de l'origine du phénotype de non-

........... croissance sur glycérol (nucléaire ou cytoplasmique) ................... ......................... 3.6.2.3 Tests de complémentation ,...

....................................................... 3.7 Analyse de la ségrégation des phénotypes

CHAPITRE IV ............................................................................................................... 99

............................................................................................................. DISCUSSION 99 4.1 Effet des mutations sex sur la production du facteur a mature à partir

.................... de la protéine de fusion prosomatostatine/facteur a mature 100

4.2 Effet de I'hyperosmolarité sur les mutants sex .............................................. 103

vii

Page

4.3 Analyse fonctionnelle des mutations sex sur l'assemblage et/ou la ................................................ composition (structure) de la paroi cellulaire 104

4.4 Rôle possible pour les gènes SEX des mutants B3-2 et 87-2 dans une

voie de signalisation intracellulaire contrôlant la croissance et/ou

l'assemblage de la paroi cellulaire ................................................................ 106 ............................................................ 4.5 Analyse des tests de complémentation 110

4.6 Analyse des produits méiotiques ................................................................ 11 1

........................................................................................... .......... CONCLUSION ... 115

LISTE DES TABLEAUX

Souches de S. cermisiae

Production du facteur a mature sur un tapis de cellules MATa hypersensibles par les souches portant les plasmides pS3C ou paFF

Temps de génération des mutants sex

Croissance des mutants sex à des températures extrêmes

Résultats des tests de complémentation des mutants sex

Ségrégation des phénotypes du mutant 82-2

Ségrégation des phénotypes du mutant £33-2

Ségrégation des phénotypes du mutant B13-9

Ségrégation des phénotwes du mutant B7-2

Page

36

59

64

66

88

91

93

95

97

LISTES DES FIGURES

Page

Synthèse et translocation d'une protéine membranaire ou sécrétée dans la lumière du réticdum endoplasmique

Schéma général du transport intracellulaire des protéines membranaires et sécrétées

Formation des oligosaccharides de type complexe N-liés

Le processus de conjugaison chez S. cerevisiae

Méiose et sponilation

Modification du type cellulaire de a à a par le changement de la cassette génétique au locus MAT

Maturation des précurseurs facteurs a et la toxine &iller.

Représentation schématique de Kex2

Schéma de maturation de la prosornatostatine 1 et II

Représentation schématique des plasmides pS2B, pS3C et porFF

Exemple typique d'un champ d'asques digérés

No13 Schéma montrant un micromanipulateur attaché à un microscope

X

Page

NO 14 Exemple de positions de la miaoaigde, du support pour pétri et

des objectifs du microscope 53

NO 15 Les étapes dans la séparation séquentielle d'un groupe de

quatre spores sur un pétri 53

N o 16 Conjugaison sexuelle des mutants sex 61

NO 17 Courbes de croissance des mutants sex 63

NO 18 Croissance de la souche parentale et des mutants sur YPD, WG (contenant 3% glycérol) ou YPD additionné de NaCl 67

N o 19 Sensibilité des mutants au LiCI 68

NO 20 Sensibilité des mutants au CFW 71

No 21 Sensibilité des mutants sex à la zymolyase 73

NO 22 Sensibilité des mutants à la caféine et récupération de la

croissance en présence de stabilisateurs osmotiques

NO 23 Morphologie de la souche parentale et des mutants affectés dans la maturation protéolytique

NO 24 Immunodétection de I'endoprotéase Yap3

NO 25 Dominance et récessivité des différents phénotypes

No 26 Résultats attendus de certaines mutations affectant la fonction rnitochondriale dans les croisements génétiques avec une souche sauvage chez S. cerevisiae

NO 27 Réaction impliquant la glycérol phosphate déshydrogénase

NO 28 Modèles possibles pour l'interaction du gène SEX de 87-2 avec la voie de transduction du signal régulée par PKCI. 109

a.a:

ADNmt: ADP: Ala: M c :

Arg (RI: ARN: Asn: Asp: OC: cm2:

D.O.: DTT: EDTA: et al.: E. coli: GlcNac: Glyc-: Glu: GPI: GTP: His : kDA: Lys 0: m A:

MAPK:

MKK: MPK: M:

acide aminé acide désoxyribonudéique mitochondrial adénosine diphosp hate alanine adénosine monophosphate cyclique arginine acide ribonucléique asparagine acide aspartique ou aspartate degré celcius centimètre carré

sensibilité à la caféine sensibilité au calcofluor white densité optique dithiothréitol éthylène diamine tétraacétate et autres (et collaborateurs) Escherichia coli N-acétylglucosamine absence de croissance sur glycérol acide glutamique ou glutamate glycos ylp hosp hatidylinositol guanosine triphosphate histidine kilo Dalton lysine milliampère (10-3 ampère) protéine kinase activée par les mitogènes (mitogen activated protein kinase) M N ? kinase kinase MAP kinase unité de concentration molaire (mole/litre)

mg: mM: mu: ml: NaCIs: nm: PBS: PEG: PKC: Pro: P/V: RE: rpm: SC: SD:

SDS: Ser : sex:

SPM: SRIF: TE: Thr: Trp:

Pg: pl:

Pm: Ura: U.V.: v: Val: VIH-1: v/v: YPD:

milligramme (10-3 gramme) milholaire (10-3 mole /litre) milLunité (10-3 unités)

miililitre (10-3 litre) sensibilité au NaCl (dorure de sodium) nanomètre (10e9 mètre) tampon phosphate salin (phosphate buffer salin)

polyéthylène glycol protéine kinase C proline poids/volume re ticulum endop lasmique rotation par minute milieu synthétique complet milieu minimal synthétique dextrose minimal medium) dodécyle sulfate de sodium serine «somatostatin expression»

de dextrose (synthétique

milieu de sporulation (sporulation medium) somatotropin release inhibiting factor (somatostatine) tampon bis-EDTA thréonine tryp top hane microgramme (10-6 gramme)

microlitre (10-6 litre) micromètre mètre) uracile ultra violet volt valine virus immun0 déficience humaine 1

volume /volume milieu de base composé d'extrait de levure, de peptone et de dextrose (yeast extract, peptone, dextrose)

milieu d'extrait de levure, de peptone et de glycérol

CHAPITRE I

1.1 Biosynthèse des protéines de sécrétion chez les eucaryotes

1.1.1 Peptide signai et translocation des protéines dans la lumière du réticulum endoplasmique

Les protéines destinées aux membranes plasmiques ou à la sécrétion sont, par opposition aux protéines cytoplasmiques, synthétisées sur les ribosomes liés aux membranes du réticulum endoplasmique rugueux (RER). La plupart de ces protéines, nouvellement synthétisées, possèdent à leur extrémité amino-terminale une séquence signal qui les dirige vers la lumière du RER (terme désignant les citernes du RER).

Cette séquence signal varie d'une longueur de 15-30 résidus d'acides aminés (Gierasch, 1989; Kreil, 1981) et présente une structure comprenant une extrémité NH2-terminale relativement hydrophile avec un ou deux résidus basiques (fréquemment Arg ou Lys), un centre largement hydrophobe de sept ou huit résidus, et finalement une extrémité C-terminale hydrophile de cinq à

sept résidus d'acides aminés. Toutes les séquences signai des protéines de sécrétion et également certaines protéines rnembranaires comportent cette

région d'acides aminés hydrophobes, caractéristique indispensable à la fonction de la séquence signal. Des expériences suggèrent que la séquence signal en soi suffit à acheminer une protéine au RE. En effet une protéine chimérique comprenant la séquence signal d'une protéine de sécrétion attachée à la séquence aminée d'une protéine cytosolique est transportée dans la lumière du RE. D'autres protéines recombinantes composées d'une séquence signal d'un organisme donné et une protéine de sécrétion mature provenant d'un autre organisme sont ftéquemment compétentes pour l'exportation (Gierash, 1989). En dépit de leur forte conservation de la fonction cellulaire, les séquences signal ne possèdent pas d'homologie de séquence, même parmi les protéines étroitement apparentées Parnell et al., 1986).

Chez les eucaryotes supérieurs où les composants de l'appareil de

sécrétion ont été caractérisés de façon plus approfondie (Gierasch, 1989), la première interaction de la séquence signal semble être avec la particule de reconnaissance du signal, (Signal-Recognition Particle; SRI?) (Figure l), un hétérocomplexe nudéoprotéique formé de six protéines distinctes et d'un ARN de 300 nucléotides. La SRP se lie à la séquence signal de la chaîne poiypeptidique naissante au moment où celle-ci émerge du ribosome, soit lorsqu'une chaîne d'environ 70-80 résidus a été synthétisée. La formation de

cette liaison provoque une pause ou un arrêt dans la synthèse protéique. Le complexe ternaire (ribosome-polypeptide naissant-SRP) qui résulte se fixe ensuite sur une protéine bicaténaire de 72 kDa incorporée dans la membrane du RE, le récepteur de la SRP ou «docking protein», (Meyer et al., 1982; Vemer et Schatz, 1988). Celui-ci assure l'arrimage du ribosome et de la chaîne naissante à la membrane. Deux protéines, ribophorines 1 et II, présentes uniquement dans le RER, sont responsables de la liaison des ribosomes à la membrane du RE par leur grosse sous-unité (Kreil, 1981).

La SRP et son récepteur ne font qu'amorcer le transfert de la chaîne naissante à travers la membrane du RE, ils se dissocient ensuite du ribosome et de la chaîne naissante. La SRP étant relâchée, la synthèse du polypeptide reprend et celui-ci traverse la membrane du RE. La SRP libérée permet ainsi à

la séquence signal émergente d'interagir avec une glycoprotéine de 35 kDa intégrée dans la membrane du RE, le récepteur de la séquence signal, (signal sequence receptor; SSR) (Wiedmann et al., 1987; Verner et Schatz, 1988;

Figure 1: Synthèse et translocation d'une protéine membranaire ou sécrétée dans La

lumière du réticulum endoplasmique (Tiré de Singer et Berg, 1991).

Gierasch, 1989). La SSR faciliterait l'insertion de la séquence signal dans la membrane du RE. L'énergie d'hydrolyse du GTP est, elle aussi, nécessaire à

cette insertion.

Avant que la chaîne polypeptidique transférée dans la lumière du RE soit complétée, le peptide signal est divé par une protéase localisée dans le RE, la signal peptidase. Ce clivage protéolytique a lieu du côté luminal de la membrane du RE, et est essentiel à la sécrétion et à l'activité des enzymes. La spécificité du signal peptidase se résume en un lien X-Y, où Y peut être n'importe quel acide aminé et X un acide aminé avec une courte chaîne latérale (généralement la glycine ou l'alanine, quelquefois la sérine, la cystéine

ou la thréonine) (KreiI, 1981). La chaîne polypeptidique en croissance est ainsi libérée dans la lumière des citernes du RE où son élongation continue. Ce mécanisme est très bien conservé au cours de l'évolution puisque les mêmes constituants ont été retrouvés chez les eucaryotes inférieurs, telle que la levure (Louvard, 1988).

1.1.2 Transport intracellulaire

La voie de sécrétion, comprenant les différentes étapes qui conduisent une protéine synthétisée sur les ribosomes liés aux membranes du RER jusqu'à la surface cellulaire, a été décrite par Palade et ses collaborateurs i l y a environ

trente ans. Les protéines naissantes sont libérées dans la lumière des citernes du RE où s'effectue une variété de modifications post-traductiomelles incluant l'addition des chaînes glucidiques, la formation de pont disulfure, le clivage du peptide signal etc. Elles sont ensuite transportées par de petites vésicules de transport dérivées du RE vers les saccules empilées de la face cis de l'appareil de Golgi; elles traversent celui-ci via les vésicules golgiennes vers sa face tram. Dans l'appareil de Golgi, les protéines subissent d'autres modifications post- traductionnelles, principalement l'élongation ou la modification des chaînes d'oligosaccharides, et sont ensuite accumulées dans des vésicules de sécrétion spécialisées lesquelles fusionnent avec la membrane plasmique, libérant ta protéine dans le milieu extracellulaire (Figure 2). Certaines protéines sont sécrétées de façon continue à la surface cellulaire par les cellules qui les fabriquent. Enfermées à l'intérieur de vésicules de transport dans l'appareil de Golgi, elles sont rapidement acheminées vers la membrane plasmique. Ces

Milieu Q LL extracellulaire

Q&

&BZT Y O +

4 Réticulum du ~ ~ s o s o X e % C transGolgi

RE q u e u x

Figure 2 Schéma général du transport intracellulaire des protéines membranaires et

sécrétées. Les protéines synthétisées sur les ribosomes liés au membrane du RE sont achrmint'e-

dans l'appareil de Golgi, et transportées dans des résicules vers la suriace cellulaire ou

entreposées dans des granules de sécrétion. Dans la voie régulée ou contrôlée, le contenu des

granules est évacué à I'extérieur de la cellule par exocytose en réponse à un signal externe

approprié (hormone, influx nerveux, etc.), tandis que dans la voie constitutive les vésicules

Libèrent leur contenu sans stimulation. La membrane des vésicules ou granules assurant le transport

est récupérée sélecti\*ement par endocytose pour être réutilisée fliré de Darne11 et al., 1993).

protéines suivent la voie de sécrétion constitutive. Dans d'autres cellules, des protéines sont concentrées et entreposées dans des vésicules de sécrétion particulières (fréquemment appelées granules de sécrétion) qui ne fusionnent avec la membrane plasmique que lors d'une stimulation de la cellule par un

signal extracellulaire approprié. Ces protéines suivent la voie de sécrétion contrôlée ou régulée (Alberts et al., 1990; DarneU et al., 1993). C'est le cas

particulièrement des hormones.

1.1.3 Modifications pos t-traductionneUes

Les protéines néosynthétisées subissent souvent d'importantes altérations avant de devenir des protéines capables d'exercer les fonctions qui leur sont assignées. Ainsi, au cours de leur mouvement dans les cellules, chacun des compartiments impliqués, est le siège de diverses modifications covalentes pos t-traductio~elles. Chaque type de compartiment exerce une fonction spécifique et possède, à cette fin, un ensemble caractéristique de

protéines et d'enzymes. Certaines modifications dites réversibles sont catalysées par deux ensembles d'enzymes: l'un greffe un élément étranger à la protéine, l'autre l'enlève. La phosphorylation réversible des protéines sur des résidus sérines, thréonines et tyrosines catalysée par les protéines kinases et les phosphatases est l'exemple le plus répandu de ce type de modification. Cependant d'autres types de modifications sont également connus (Yan et al.,

1989):

*Sulfatafion sur des résidus tyrosines; vhnidation du carboxy-terminal; *Acétylation sur des résidus lysines, cystéines ou sérines; ADP-nbosylation; Hydroxylation; Méthylation des résidus glutamate ou aspartate; Tyrosinila tion sur le résidu N-terminal; Nudéotidylation sur des vrosines; Etc.

D'autres changements ont un caractère irréversible et impliquent une seule enzyme ou un ensemble d'enzymes. C'est le cas de nombreuses

protéines membranaires et sécrétées hors de la cellule. Il s'agit de la glycosylation et de nombreuses modifications secondaires, parmi lesquelles on retrouve le clivage protéolytique spécifique et l'addition d'un groupement glycosylphosphatidylinositol. E n plus de conférer à la protéine sa forme fonctionnelle, les modifications post-traductionnelles agissent aussi comme marqueur biochimique pour orienter la protéine vers sa destination finale.

1.1.3.1 La Glycosylation: généralités et rôles

La glycosylation, un des types de modification post-traductiomelle le plus répandu est présente dans toutes les cellules eucaryotes, y compris celles des levures. Les oligosaccharides rencontrés dans les glycoprotéines sont fixés au groupement NH2 des résidus Asn dans la N-glycosylation, et à l'oxygène des résidus sérine, thréonine ou parfois l'hydroxylysine dans le cas de la O- glycosylation. Les oligosaccharides O-liés sont généralement courts, faits le plus souvent de un à quatre résidus glucidiques. Par contre, les oligosaccharides N- liés comportent au minimum cinq glucides qui sont toujours du mannose et de la N-acétylglucosamine.

Les fonctions des glycanes sont nombreuses et variées. Chez beaucoup de glycoprotéines ils confèrent des propriétés physiques importantes telles que la stabilité conformationnelle, la résistance à la protéolyse ou à la dénaturation thermique, et la solubilité (Olden et al., 1985; Paulson, 1989; Opdenakker et al., 1993). Les divers processus biologiques dans lesquels les oligosaccharides sont impliqués incluent: les mécanismes de reconnaissance et d'adhérence; l'interaction entre les microorganismes et leur hôte; la transformation maligne; le ciblage des protéines; la phagocytose; le développement embryonnaire et la différenciation (Paulson, 1989).

1.1.3.1.1 La N-glycosylation: biosynthèse et structure

La N-glycosylation est le type de glycosylation le mieux connu. Dans le RE, le précurseur oligosaccharidique préassemblé comprenant trois résidus glucose, neuf résidus mannose et deux résidus N-acétylglucosamine (GLc3MangGlcNac2) est transféré en bloc du lipide donneur, le dolichol, à des résidus asparagine (Asn) spécifiques de la chaîne polypeptidique en cours de

synthèse. Cette réaction est catalysée par l'oligosaccharide transférase située à la

face luminale du RE. Malgré I'importance de la N-glycosylation, on connaît très peu sur les protéines de recomaissance qui contrôlent l'efficacité de l'addition des oligosaccharides à ces résidus d'Am. La séquence tripeptidique, Asn-X-Ser/Thr (où X est un acide aminé quelconque, sauf la proline) est généralement nécessaire, mais insuffisante pour induire la N-glycosylation: l'environnement cellulaire et notamment les stimuli hormonaux modulent l'addition des glycanes aux protéines membranaires, et les glycoprotéines sécrétées (Fenouillet, 1993).

La structure des oligosaccharides N-liés est très variable d'une protéine à

l'autre. Cette diversité résulte de la modification considérable du précurseur original (Figure 3). Tandis qu'ils sont encore dans le RE, les trois résidus glucose de la région terminale sont rapidement éliminés des oligosaccharides par les exoglucosidases (présentes dans le RE), pour donner une structure oligomannosidique MangGlcNacz. À cette étape, la protéine peut être modifiée subséquemment par une série de mannosidases présentes dans le RE et dans le cis-Golgi. La glycoprotéine naissante peut être sécrétée avec une structure oligomannosidique constituée exclusivement de nombreux résidus mannose et de deux N-acétylglucosamines. Alternativement, une série de glucosidases et de glycosyl transférases modifient davantage les chaînes d'oligosaccharides, dans l'appareil de Golgi, aux structures complexes [contenant de la N- acétytglucosamine, du mannose, du galactose, du N-acétylneuramidate (acide sialique) et dans certains cas, du fucose] et hybrides (contenant des structures complexes et riches en mannose). Les glycoprotéines sont ensuite exportées du Golgi vers leur destination finale (Kornfeld et Kornfeld, 1985). Le remaniement de l'oligosaccharide en sa forme mature telle qu'elle existe au niveau des protéines de la membrane plasmique se termine environ 10

minutes avant que la protéine n'atteigne celle-ci (Damell et al., 1993).

La O-glycosylation, comme l'extension des chahes d'oligosaccharides N- glycosylés, est catalysée par une série de glycosyltransférases qui utilisent les nucléotides glucidiques spécifiques dans la lumière du Golgi pour ajouter, un à

la fois, les résidus glucidiques sur la protéine. Habituellement, la N-

Figure 3: Formation des oligosaccharides de type complexe N-liés. Les enzymes

localisées dans chacun des organites distincts interviennent les unes à la suite des autres pour

transformer le précurseur commun à tous les oligosaccharides N-Liés. Les réactions catalysées par

les différentes enzymes sont les suivantes: enlèvement des trois résidus glucose par a-glucosidase I

(2) et i'a-glucosidase II (3); élimination de quatre résidus mannose, un par la a-mannosidase I de

la membrane du RE (4), et trois par la a-mannosidase 1 du Golgi (5); transfert d'une N-

acétylglucosamine par la N-acétylglucosamine transférase (6); enlèvement de deux r6sidus

manriose par la a-mannosidase II du Golgi (7); transfert d'un fucose et de deux N-

acétylglucosamines par la N-acétylglucosamine transférase et la fucosyltransférase

respectivement (8, 9), ainsi que de trois galactoses par la galactosyltransférase (10). et de trois N-

acétylneuraminates par la sialyltransférase (11) (Tiré de Darneil e t al., 1993).

acétylgalactosamine est ajoutée en premier, suivie par un nombre variable de résidus glucidiques supplémentaires. L'incorporation de ces glucides d m des polymères comme les glycoprotéines requiert une source d'énergie. Les intermédiaires d'énergie élevée participant dans la biosynthèse des oligosaccharides sont des glucides nucléotidiques diphosphates ou monophosphates, produits dans le cytosol et accèdent aux citernes du Golgi par des antiporteurs spécifiques situés dans la membrane du Golgi. Ces antiporteurs sont des pennéases. Toutes les glycosyltransférases connues sont des protéines membranaires intrinsèques dont le site actif est orienté sur la face luminale du RE ou du Golgi. La plupart des glucides O-liés sont ajoutés aux protéines de sécrétion et à celles de la membrane plasmique dans les vésicules du Golgi peu de temps avant d'atteindre la surface cellulaire. L'addition de l'acide sialique (N-acétylneuraminate), dernière étape de la biosynthèse des oligosaccharides N-liés aussi bien que ceux O-liés se produit dans le tram-Golgi et son réticulum (Darnell et al., 1993).

1.1.3.1.3 Glycosylation chez Saccharomyces cerevisiae

Chez S. cerevisiae, les aspects initiaux de la synthèse des glycanes N-liés

sont identiques à ceux retrouvés dans les cellules animales. Les différences résident dans les étapes de maturation tardive, ou au niveau des modifications que les chaînes glucidiques subissent dans le Golgi. En effet, les chaînes d'oligosaccharides sont allongées par une addition successive de résidus mannose exclusivement. La chaîne d'oligosacchande peut contenir plus de 50 résidus mannose (Ballou et al., 1982; K u k ~ i n s k a s et al., 1987; Orléan et al., 1991).

Contrairement aux eucaryotes supérieurs, les glycanes O-liés chez la levure sont composés uniquement de résidus mannose (Kukuruzinskas et al., 1987; Orléan et al., 1991).

1.1.3.2 Modification par le groupement glycosylphosphatidylinositol

Certaines protéines de la membrane plasmique et des vésicules de sécrétion con t i e~en t en C-terminal un peptide hydrophobe de 17-30 résidus. Peu de temps après leur entrée dans le RE, ce peptide est excisé et la nouvelle extrémité carboxylée est liée de façon covalente à un résidu glucidique d'un

glycolipide, le glycosylphosphatidylinositol (GPI). Chez les cellules eucaryotes, beaucoup de protéines sont attachées à la surface externe de la membrane plasmique par ce GPI et pourraient ainsi être libérées sous forme soluble en réponse à des signaux qui activent une phospholipase spécifique dans la membrane plasmique &ow et al., 1988; Englung et al., 1993).

1.1.3.3 Maturation protéolytique

La maturation protéolytique de précurseurs protéiques est un mécanisme de régulation physiologique universel qui se produit chez tous les eucaryotes, aussi bien unicellulaires que pluricellulaires. Elle représente l'étape finale dans l'expression de l'activité biologique de nombreuses protéines. Elle consiste en une endoprotéolyse à des liens peptidiques spécifiques, d'où le terme de protéolyse limitée, dans le précurseur inactif. Ce clivage induit un changement conformationnel dans le précurseur protéique inactif qui génère ensuite la

protéine bioactive (Neurath, 1989; 1991). Le répertoire de protéines qui subit de telle protéolyse limitée est immense et varié (Douglas et al., 1984; Barr, 1991; Neurath, 1991). Celui-ci inclut les prohormones, les précurseurs des neuropeptides, les précurseurs des récepteurs à la surface cellulaire, les précurseurs des facteurs de croissance, les précurseurs des protéines membranaires, les glycoprotéines d'enveloppe virale (cas de la gp160 du VIH- l), le précurseur du peptide P-amyloïde associé à la maladie d'Alhzeimer (Octave et al., 1995) et les précurseurs des molécules d'adhérence. Ces protéines jouent des rôles très variés dans les processus biologiques et leurs fonctions ne s'expriment qu'à la condition que les précurseurs correspondants soient activés par clivage endoprotéolytique. Ce type de maturation a également été mis en évidence pour l'activation des zymogènes (précurseurs des enzymes protéolytiques), qui sont parmi les premiers précurseurs protéiques à être parfaitement bien étudiés (Neurath, 1957).

1.1.3.3.1 Caractéristiques des précurseurs et des sites de maturation protéolytique

Les protéines dotées d'activité biologique qui doivent être excrétées ou maintenues dans la membrane plasmique sont synthétisées sous forme de précurseurs de haut poids moléculaire. Outre la séquence signal hydrophobe,

pré-, la plupart des pro téines contiennent une région supplémentaire, pro-, formant ainsi une préproprotéine. Suite au clivage protéolytique CO-

traductionnel de la séquence pré-, le précurseur intermédiaire, la proprotéine ou la prohormone, doit subir des clivages protéolytiques additionnels afin que la protéine devienne biologiquement fonctionnelle. Certains précurseurs (dits monofonctio~els) contiennent une seule copie du peptide bioactif qui, dans la plupart des cas, représente une petite fraction de la séquence codante disponible. Par contre, d'autres précurseurs dits multiples ou polyprotéines renferment soit plusieurs séquences du même peptide bioactif (cas du préprofacteur a de la levure), soit plusieurs séquences différentes où chacune d'elles génère une fonction biologique unique (cas de la POMC, proopiomelanocortine) (Douglas et al 1984).

Les domaines nécessaires à l'activité physiologique des peptides sont généralement délimités par des acides aminés basiques qui, dans la majorité des cas sont arrangés en paire, dont les séquences sont habituellement Lys-Arg et Arg-Arg, ou plus rarement Lys-Lys et Arg-Lys putton et al., 1990; Barr, 1991). On retrouve moins fréquemment un seul résidu Arg entourant le peptide bioactif. Les séquences polybasiques, tri- (Arg-Lys-Arg), tétra- (Arg-Arg-Lys- kg), et même pentabasiques, quoique beaucoup plus rares, sont également rencontrées. Ces séquences existent surtout dans les glycoprotéines d'enveloppe virale. Ces motifs basiques constituent les sites de clivage initiaux pour les enzymes protéolytiques, communément appelées endoprotéases ou convertases, responsables de l'activation des précurseurs. Cependant, tous les sites potentiels d'un précurseur donné ne sont pas reconnus par les enzymes protéolytiques et c'est seulement un nombre limité d'entre eux qui va permettre le clivage du precurseur. Ceci indique que la présence des doublets d'acides aminés basiques, quoique essentielle, est insuffisante; certaines caractéristiques formant la structure secondaire autour des sites de divage des prohormones par exemple, sont nécessaires pour la reconnaissance des protéases de maturation (Rholarn et al., 1986; Brakch et al., 1989). Toutefois, ü n'existe aucun consensus quant au rôle des séquences primaires.

La comparaison des acides aminés autour des sites de clivage monobasiques indique que ces clivages sont dirigés dans plusieurs cas par la présence d'un résidu proline situé immédiatement avant ou après le résidu

basique, soit en position - 1 ou + 1 (Schwartz, 1986). Lorsque la proline est absente, ces clivages suivent d'autres sites consensus (Devi, 1991) qui peuvent

être décrits comme des règles qui gouvernent les divages monobasiques.

1.1.3.3 t Lieu d'activation des précurseurs

Les clivages protéolytiques s'effectuent dans le réseau tram du Golgi et/ou dans les vésicules de séaétion qui se forment à partir de ce réseau pour entreposer ces protéines (Sossin et al., 1989; Hutton, 1990). La distribution et la localisation sous-cellulaire des divages endoprotéolytiques sont des paramètres importants dans la régulation de la maturation et l'emballage. Ainsi, le clivage dans le Golgi peut amener à un classement indépendant des portions variées d'une prohormone, tandis que le divage après l'emballage dans les granules de sécrétion assure la coexistence et la libération d'un ensemble de produits de

peptides. Cette maturation tardive dans la voie de sécrétion présente l'avantage potentiel d'empêcher la protéine active d'agir à l'intérieur de la cellule qui I'a produite, et constitue donc un mécanisme de régulation

physiologique

1.1.3.3.3

très important.

Découverte des endoprotéases précurseurs

responsables de l'activation des

Depuis la documentation, durant le milieu des années 60, du divage de

la proinsuline en insuline aux résidus Lys-Arg et Arg-Arg (Steiner et al., 1967), la recherche pour l'identification et la caractérisation des endoprotéases de maturation spécifiques des paires de résidus basiques était intensive. Cependant, l'isolation et la caractérisation de ces endoprotéases physiologiquement impliquées dans la conversion des proprotéines, notamment les prohormones, s'est révélée une tâche ardue qui a pris plusieurs années (au moins 20 ans) de recherche à de nombreux laboratoires. Chez les mammifères, ces enzymes étaient particulièrement difficiles à isoler et caractérisées par les approches biochimiques conventionnelles. Ceci est dû principalement à leur faible concentration dans les cellules aussi bien que la présence dans les lysosomes d'endoprotéases plus abondantes ayant des spécificités similaires. Le premier modèle d'une endoprotéase de neuropeptides et d'hormones fut identifié chez un eucaryote unicellulaire,

Saccharomyces cerevisiae (Julius et al., 19Mb). Cette endoprotéase, Kex2, était nécessaire pour la maturation protéolytique des précurseurs du facteur a (phéromone sexuelle chez S. cerevisiue) et des toxines &iller», du côté carboxyl des paires d'acides aminés basiques. Cette découverte fut la clé dans l'identification des endoprotéases chez les mammifères (Hutton, 1990; Seidah et ai., 1991; Steiner et al., 1992; Smeekens, 1993).

1.2 La levure S . cerevisiae comme modèle expérimental pour l'activation des

précurseurs protéiques

De nombreux peptides bioactifs sont générés de leur précurseur par clivage protéolytique aux résidus basiques, plus particulièrement dibasiques. Cependant les endoprotéases impliquées physiologiquement dans la maturation de précurseur ne sont pas encore parfaitement bien connues. Les cellules de S. cerevisiae synthétisent et sécrètent le facteur a et la toxine «KiIlem, lesquels sont aussi activés de leurs précurseurs par clivage spécifique aux paires de résidus basiques. Par conséquent, la levure peut fournir un système modèle simple pour l'étude de la maturation des précurseurs, en particulier les prohormones chez les cellules d'eucaryotes supérieurs. De plus, la voie de sécrétion des cellules de levure est très semblable à celle des cellules d'eucaryotes supérieurs (Schekman et Novick, 1982; Schekman, 1985).

1.2.1 Cycle cellulaire de S. cerevisiae

11.1.1 Types cellulaires et conjugaison sexuelle

La levure S. cerevisiae existe sous trois types cellulaires distincts. Les deux types cellulaires haploïdes, désignés MATa et M A T a , peuvent se fusionner par un processus appelé conjugaison pour former le troisième type de cellule, les cellules diploïdes M A T a / a . Ces différents types cellulaires se reproduisent par cyde cellulaire mitotique (passage de une cellule à deux).

Cependant, lorsque les deux types cellulaires haploïdes se trouvent dans une même culture, elles laissent le cycle de division cellulaire mitotique et entrent en phase de conjugaison (Sprague et al., 1983; Herskowitz, 1988; Berlin

et al., 1991) (Figure 4). La conjugaison sexuelle entre les cellules haploïdes différentes (MATa et MATa) nécessite l'action réciproque des phéromones (Sprague et al., 1983), ou facteurs de conjugaison, sécrétés dans le milieu par chacun du type ceMaire haploïde, et les récepteurs pour ces phéromones. La production et la réponse à ces phéromones sont strictement spécifiques du type cellulaire. Ainsi, la génération des cellules compétentes pour la conjugaison sexuelle nécessite l'expression différentielle de trois ensembles de gènes: les gènes spécifiques du type a; les gènes spécifiques du type a; et les gènes spécifiques de l'haploïdie. L'expression appropriée de ces gènes est accomplie par l'action des protéines régulatrices, al, a2, al, codées par les deux allèles du locus MAT, MATa et MATa. Ces protéines se lient à des séquences d'ADN spécifiques sur des éléments promoteurs en amont. Alors que la protéine al active ia transcription d'un ensemble de gènes spécifiques aux cellules a, a2

bloque la transcription d'un ensemble de gènes spécifique aux cellules a. La protéine a l par elle-même est sans effet. Cependant, avec a 2 elle forme un complexe qui réprime un ensemble de gènes différents de celui que la protéine a2 affecte lorsqu'elle est seule. Les protéines a2 et al-a2 ensemble bloquent l'expression des trois ensembles de gènes nécessaires à la conjugaison sexuelle, dans les cellules diploïdes (Herskowitz, 1988; Sprague Jr., 1990).

Le type haploïde MATa sécrète le facteur a, qui se lie à un récepteur présent uniquement sur la surface des cellules a; le type haploïde MATa produit le facteur a, qui interagit avec un récepteur présent seulement sur la

surface des cellules a. Les phéromones et les récepteurs jouent un rôle crucial

dans le processus de conjugaison. Ainsi toute mutation génétique affectant soit la sécrétion et/ou la maturation des phéromones ou l'expression des récepteurs de ces phéromones entraîne un phénotype stérile (absence de conjugaison). Le mode d'action du facteur a est le plus exploité de ces deux phéromones.

La liaison du phéromone au récepteur active la voie de transduction du signal qui est partagée par les deux types de cellule (Bender et al., 1986; Nakayama, 1987). La propagation du signal le long de cette voie amène les changements physiologiques en réponse à la cellule qui est capable de se conjuguer efficacement (Sprague Jr., 1991). Ces changements incluent l'augmentation de la transcription d'un nombre de gènes dont les produits sont impliqués dans la conjugaison, l'arrêt momentané du cycle de division

Cell cycle arrest (STE genes)

Figure 4:

Projeciion formation

Cell contact. agglutination (agglutinins)

Cellular fusion (FUS1. FUS2)

Nuclear fusion (KAR. BIK)

Start of diploid vegetative cycle

Le processus de conjugaison chez 5. cerevisiae. Lorsque les cellules MATa et

MATa sont incubées ensemble, elles subissent une stimulation réciproque via les phéromones

peptidiques sécrétées. Cette stimulation provoque un arrêt dans le cycle de division cellulaire en

phase G1, induit la transcription des gènes spécifiques à la conjugaison, et forme des projections en

direction d u type cellulaire opposé. Le contact entre les cellules se passe habituellement à

l'extrémité des projections et amène une réorganisation de la surface cellulaire (synthèse d'une

nouvelle paroi cellulaire et membrane) et le mélange des contenus cytoplasmiques. La fusion

nucléaire succède la tusion cellulaire, et la cellule dipioïde commence la croissance végétative

(Tiré de Berlin et al., 1991).

cellulaire en phase G1, juste avant l'initiation de la synthèse d'ADN. Quoique les cellules en contact avec les phéromones ne peuvent plus se diviser par mitose, elles continuent à croître, formant des projections de surface très allongées d o ~ a n t à la cellule une forme de poire appelée «shmoo». Les cellules de type cellulaire opposé s'adhèrent étroitement à l'extrémité de ces projections grâce à l'agglutine, une glycoprotéine à la surface des cellules et spécifique du type cellulaire. Une fois que le contact est établi entre les paires de cellule a et a, elles deviennent intimement associées de telle sorte qu'elles ne puissent être séparées par sonification. La paroi cellulaire survenue au site de contact cellule-cellule est dissout, exposant les membranes plasmiques de chaque cellule parentale lesquelles ensuite fusionnent pour former une seule membrane continue autour des contenus cellulaires. Durant la dissolution et la fusion membranaire, les jonctions de paroi cellulaire sur la périphérie externe deviennent continues, par la synthèse de la paroi cellulaire locale. La demière étape de la conjugaison, la fusion nudéaire ou karyogamie, survient immédiatement après la fusion membranaire (plasmogamie) et est initiée spécifiquement aux extrémités distales des corps polaires du fuseau sur chaque noyau haploïde. Le résultat de la conjugaison est la formation d'une ceilde large, contenant un noyau diploïde. Le zygote par la suite produit les cellules végétatives diploïdes par bourgeonnement (Sprague et al., 1983; Herskowitz, 1988; Sprague Jr., 1990; Berlin et al., 1991).

La concentration de la phéromone facteur a nécessaire pour induire les réponses biologiques, incluant l'arrêt du cycle de division cehiaire en phase Gi, la morphologie aberrante des cellules a, l'augmentation des contacts cellule- cellule, conduisant à la formation d'une cellule diploïde, dépend de la densité de la population de cellules a. Ceci est dû, en partie, aux protéases des cellules a

qui dégradent le facteur a assez rapidement (Thorner, 1981). La dégradation protéolytique est un mécanisme par lequel les cellules a inactivent le facteur a afin de rétablir la croissance cellulaire arrêtée en phase Gl. Chez les cellules sensibles, portant les mutations dans les gènes responsables de la dégradation du facteur a , l'arrêt cellulaire provoqué par la présence de la phéromone est permanent (Sprague Jr., 1983). Lorsque les colonies des cellules a sont déposées sur un tapis de ces cellules a mutantes, cet arrêt se manifeste par une zone claire ou halo autour des colonies qui sécrètent le facteur a biologiquement actif (Julius et al., 1983).

Les cellules diploïdes issues de la conjugaison sexuelle ne produisent ni

ne répondent aux phéromones. Par conséquent, elles ne peuvent pas se conjuguer. Les cellules diploxdes comme les cellules haploïdes, dans les conditions favorables c'est-à-dire lorsque les nutriments sont abondants, bourgeonnent et prolifèrent par mitose. En cas de carence, seules les cellules diplo'ides sont capables de sporuler et entrer en méiose. Durant la sporulation, le processus de la méiose est étroitement couplé à la formation de spores. Les produits d'une seule méiose sont quatre spores haploïdes (la tétrade) enveloppées ensemble dans un seul asque (Herskowitz, 1988) (Figure 5). Chaque spore peut germer et donner naissance à une colonie de cellules haploïdes dès que les conditions sont de nouveau favorables. Durant la méiose, les nouvelles recombinaisons des chromosomes et des gènes sont générées, par ségrégation indépendante des chromosomes non homologues et la recombinaison intrachromosomale. La sporulation et la méiose sont donc employées pour construire de nouvelles souches et d'étudier I'allélisme aussi bien que les relations de liaison entre les gènes.

1.2.1.3 La génétique moléculaire: un outil puissant d'analyse

Les souches de levure peuvent être de type cellulaire stable (homo thalique) ou instable (hétérothalique) (Herskowitz et Oshima, 1981; Herskowitz, 1988). La plupart des souches de laboratoire qui portent l'allèle récessive ho, sont de type cellulaire stable. Autrement dit les cellules de type a (génétiquement MATa) doment naissance à des cellules qui sont MAT& et les cellules a (génétiquement MATa) génèrent les cellules qui sont MATa. Dans les souches qui portent le gène HO, le type cellulaire d'une cellule est instable et peut changer de a à a ou inversement presqu'à chaque division cellulaire (Herskowitz, 1988; Herskowitz et Jensen, 1991). Le mécanisme moléculaire responsable de cette commutation au cours du développement est spécifique des levures et est rigoureusement contrôlé.

Le locus MAT (pour mating type) contenant la séquence d'ADN a ou a, détermine et contrôle le type cellulaire MATa ou MATa (Herskowitz, 1988). Les différentes souches de levure gardent en réserve l'information a ou a

Méiose dédenchée par carence, et formation des

1 Digestion de la paroi de l'asque

Figure 5: Méiose et sponilation.

supplémentaire en position gauche (HML: copie hornothalique placée à

gauche), ou droite (HMR: copie homothalique placée à droite) respectivement sur le chromosome. Ces segments d'informations, dénommés <<cassette génétique», sont exprimés lorsqu'ils sont situés au locus MAT; ils restent silencieux lorsqu'ils sont situés au locus HML et HMR. Les gènes HML et HMR sont maintenus silencieux par l'action des produits des gènes SIR (Silent Information Regulator), qui bloquent leur expression.

La modification du type cellulaire est un processus remarquable impliquant un réarrangement génétique stéréotypé catalysé par le gène HO, qui code pour une endonucléase spécifique (Herskowitz et Jensen, 1991). La conversion du type cellulaire est déclenchée lorsque l'endonucléase Ho, effectue une coupure bicaténaire au niveau d'une séquence spécifique au locus MAT (Figure 6). Ceci provoque l'excision du fragment d'ADN et son remplacement grâce à une synthèse d'ADN qui utilise le gène silencieux de

Retrait de l'ancienne Insertion d'une nouvde cassette cassette

gène silencieux

I gène silenaeux

gène silenaeux gène silencieux

Figure 6: Modification du type cellulaire de a à a par le changement de la cassette

génétique au l o w MAT. L'interconversion du type cellulaire est initiée par I'endonudéase Ho qui

effectue une coupure bicaténaïre au locus M A T . La réparation de I'ADN résulte dans le

remplacement d'une cassette a par I'information contenue au locus m a . Les régions centrales

des cassettes représentent les séquences de nudéotides distinctes provenant des cassettes a (région

Ya) et a (région Ya) . Les régions adjacentes à Y (les régions X et Z) sont impliquées dans la

recombinaison entre ies cassettes au locus MAT et HML ou HMR. Les distances entre MAT et les

cassettes sont indiquées.

type opposé (HML ou HMR) comme matrice. Dans le cas d'un remplacement d'une cassette a par une cassette a, le locus domeu, HMRa demeure inchangé suite à la transposition de l'information a de HMRa. L'interconversion du type cellulaire est donc un transfert non réciproque de l'information d'une position (HM L ou H M R ) à une autre (MA T). Ce processus est très efficace: approximativement 65% de toutes les cellules dans une population qui sont compétentes (cellules mères ayant subit au moins une division cellulaire) pour l'interconversion, le font.

Une cellule végétative MATE HO forme des colonies contenant des

ceIldes du type original a, des cellules qui ont changé de type sexuel, a, et des cellules diploïdes a / a résultant de la conjugaison enae ces deux dernières. La conversion du type cellulaire est une facon remarquable de construire un

ensemble de souches isogéniques (a, a, a / a ) qui diffère seulement au locus MAT. Cea fadite les tests de complémentation où les types cellulaires opposés et isogéniques sont nécessaires.

1-22 Biosynthèse, transport intracellulaire et maturation des précurseurs des

protéines sécrétées chez S. cereoisiae

1.2.2J Facteur a

Deux gènes, MF al et MF a2, codent pour les précurseurs étroitement apparentés du facteur a, (Kurjan et al., 1982; Singh et al., 1983; Fuller et al., 1988; Bussey, 1988). MFaI produit la majorité du facteur a sécrété. Les précurseurs contiennent une région pré qui constitue la séquence signal hydrophobe en N- terminal, un segment pro (dont la fonction est inconnue) contenant trois sites consensus (Asn-X-Ser/Thr) pour l'addition des oligosaccharides N-liés, et une région C-terminale composée de séquences répétées du facteur a mature. La protéine codée par MFal contient quatre copies identiques du facteur a mature (Figure 7A), alors que Mfa2 n'en contient que deux. Chacune d'elles est précédée par un Nspacer segment)> cornmengant avec les résidus dibasiques, Lys-Arg suivis par deux ou trois paires des résidus -X-Ala- (ou X représente 1'Asp ou la Glu dans Mfal et llAsp, la Glu, l'Am, ou la Val dans Mfa2).

Le précurseur codé par MFal , préprofacteur a, un polypeptide de 165 acides aminés, emprunte la voie de sécrétion analogue à celle des eucaryotes supérieurs. Une fois transloqué dans le RE, la séquence signal est clivée (Waters et al., 1988), et le précurseur est glycosylé (Julius et al., 19Ma) par l'addition de trois chaînes d'oligosaccharides liés à des résidus Asn. Dans le Golgi, une fraction du précurseur subit l'élongation extensive des résidus mannose (Julius et al., 1984a; Julius et al., 1984b). Ce précurseur, largement glycosylé, subit ensuite une série de clivages protéolytiques bien définis (Figure 7A) qui commencent dans un compartiment tardif de l'appareil de Golgi et sont complétés dans les vésicules de sécrétion où le précurseur est emballé (Julius et al., 19û4a). Le temps de transit du précurseur, préprofacteur a, dans la voie de sécrétion est rapide, ce qui suggère que la sécrétion suit la voie constitutive.

1.2.2.2 Toxine «Killer»

Les souches «Killer» de S. cereoisiae portent un virus à ARN double brin (Bussey, 1988; Fuller et al., 1988). Elles séaètent une toxine &iller toxin» qui est létale pour les souches sensibles et présentent une immunité à la toxine qu'elles produisent. Les toxines «Killer» et le composant de l'immunité sont codés par un seul gène, qui détermine une protéine précurseur préprotoxine/immunité. La préprotoxine est un précurseur de 316 résidus d'acides aminés. Eue comprend une séquence leader (région 6) qui sert de signal pour l'entrée dans le RE. Cette séquence est suivie par les sous-unités a (103 résidus) et P (83 résidus) de la toxine mature lesquelles sont délimitées par des résidus d'acides amin& basiques, et séparées par un espace polypeptidique (y) (Figure 7B) contenant trois sites potentiels pour les oligosaccharides N-liés. La structure complète est semblable à la molécule précurseur de l'insuline. L'analyse des séquences N-terminales et C-terminales des sous-unités a et B de la toxine purifiée définie trois sites de maturation dans le précurseur: ProArg, ArgArg, et LysArg entre les jonctions &a, a-y et y-P respectivement.

L'utilisation des mutants de levure, sensibles à la température, qui sont bloqués à des étapes spécifiques dans la voie de biosynthèse a permis de démontrer que la sécrétion de la toxine suit la voie de sécrétion classique de la levure, (RE-Golgi-vésicules de sécrétion-surface cellulaire) (Bussey, 1988).

A

I I ~ I I ~ I I - PS Pro A A A A

Exasion par I'endoprotéase Kex2

Enlèvement de l'extrémité carboxylée par la Kexl

de l'extrémité aminée par 'aminopep tidase S tel3

= Facteur a mature

Kexî ?

i Kexî

PR KR

1 I l a Y 111 l3 1 PS Pro Kexl ? x -

Toxine B mature

Toxine a mature

Figure 7: Maturation des précurseurs facteurs a (A) et la toxine W e r (B). Le peptide signal

(PS), la région pro (Pro). les sites pour la N-glycosylation (dans le pr6profacteur a)( ? ), sont indiqués. Les aades amines qui constituent les sites de maturation dibasique et monobasique sont représentés

par leur code à une lettre. Dans A, les dipepdides dpétés AspAla ou Glu-Ala qui succèdent les

résidus basiques sont indiqués.

L'entrée de la préprotoxine dans le RE par la séquence signal qui est rapidement enlevée, est marquée par la glycosylation des trois sites dans la séquence y. La maturation protéolytique commence dans le Golgi et continue dans les vésicules de sécrétion.

1.2.3 Identification et caractérisation des gènes impliqués dans la maturation des précurseur du facteur a et de la toxine «Killen>

En 1984, le groupe de J. Thorner a caractérisé une souche mutante de S. cerevisiae incapable de transformer, à la fois, les précurseurs du facteur a et de la toxine «Killed» en peptides biologiquement actifs par clivage aux sites dibasiques. Le gène responsable, désigné KEX2 &iller cvression), fut don6 par complémentation d'un allèle mutant de kex2 (Julius et al., 1984b). Toutes les évidences démontrent sans équivoque que le gène K E X 2 cloné code pour I'endoprotéase impliquée dans la maturation au site dibasique des précurseurs du facteur a et la toxine «killer». L'utilisation de substrats synthétiques pour l'activité de I'endoprotéase dibasique a permis de mettre en évidence une activité réduite chez les mutants kex2 comparativement à celle du type sauvage. Cette activité est fortement élevée d m les extraits des transfomants surexprimés. Cette réduction dans l'activité de I'endoprotéase chez les mutants coségrègue avec la perte de la production du facteur a et la toxine. De plus, l'introduction du gène KEX2 normal dans les souches déficientes récupère à la fois l'activité de maturation, et l'activité de I'endoprotéase spécifique pour le clivage sur le côté carboxyl des paires d'aades aminés basiques.

L'endoprotéase Kex2 effectue les premiers clivages du précurseur facteur a après les paires d'acides aminés basiques pour générer la séquence mature encadrée de six acides aminés en N-terminal et de deux acides aminés en C- terminal (Julius et al., 1984a; Fuller et al., 1988; Bussey, 1988; Bourbonnais et al., 1991) (Figure 7A). L'extension NH2-terminale, (Glu-Ala ou Asp-Ala) est ensuite enlevée par le dipeptide aminoterminal codé par le gène STEl3 (Julius et al., 1983). Finalement, le carboxypeptidase Kexl (Dmochowska et al., 1987) coupe les résidus Lys-Arg en C-terminal pour libérer le peptide mature de 13 acides aminés à la surface cellulaire. La maturation protéolytique de la préprotoxine est également initiée par l'action de l'endoprotéase Kex2 qui dive aux doublets des résidus basiques ArgArg et LysArg (Figure 78). Ensuite

l'enlèvement des résidus Arg du côté C-temiinal est effectué par le produit du gène KEXl pour libérer les peptides matures.

Les études sur la spécificité du substrat révèlent que l'enzyme Kex2 clive

après les résidus -Lys-Arg- et -Arg-Arg- avec une efficacité semblable, mais démontre une faible affinité pour le clivage après un résidu Arg ou une paire de résidus Lys (Fuller et al., 1988; Mizuno et al., 1989). L'enzyme possède une activité optimale à un pH neutre et nécessite le Ca2+. Elle présente un spectre de sensibilité aux inhibiteurs spécifiques, un domaine fortement homologue et la séquence autour des résidus du site actif particulièrement bien conservée avec les subtilisines, une classe de protéase à sérine des bactéries. Ces

obse~ations ont permis de classifier l'enzyme Kex2 comme une protéase à

s é ~ e du type subtiüsine.

Le gène a été séquencé (Mizuno et al., 1988) et code pour une protéine mernbranaire de 814 résidus d'acides aminés. Ce polypeptide contient

plusieurs domaines distincts (Figure 8): un peptide signal de 19 résidus suivi d'une région pro; le domaine catalytique qui contient l'homologie avec les subtilisines; un domaine riche en Ser/Thr de 85 résidus; un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique de 115 résidus. Le domaine

transmembranaire divise la protéine en un long segment N-terminal, le domaine luminal responsable de l'activité catalytique, (contenant le site actif et

les séquences d'activation du Ca2+) et une petite section en C-terminal, la queue cytosolique (Mizuno et al., 1988; Fuller et al., 1989). La protéine contient cinq sites consensus (Asn-X-Ser/Thr) pour la N-glycosylation dans le domaine luminal, et un site additionnel dans la queue cytosolique.

La séquence de la protéine Kex2 suggère plusieurs modifications post- traductio~elles. Ainsi, la maturation de la protéase Kex2 implique le divage du peptide signal et l'addition des chaînes glucidiques (Wilcox et al., 1991). Le segment riche en Ser/Thr est modifié par les oligosaccharides O-liés lesquels, dans la levure, consiste en des chaînes linéaires de plus de quatre mannosides a-liés (Kukunikinska et al., 1987). La séquence pro en NH2-terminal est excisée par un mécanisme d'autoclivage après les résidus Lys-Arg (Germain et al., 1992).

Le domaine transmembranaire et la queue cytosolique localisent l'enzyme dans un compartiment tardif du Golgi (Redding et al., 1991;

Gluschankof et Fder, 1994). La clathrine est également un élément important dans la rétention de la protéase Kex2 (Payne et al., 1989) puisque les mutants déficients dans la chaîne lourde de la clathrine libèrent l'enzyme à la surface cellulaire.

Figure 8: Représentation schématique de K e x 2 ( H ) peptide signal; (8 ) région pro;

( O ) domaine catalytique; ( E ) domaine-P (indique une séquence conservée de 155 résidus des

homologues de Kex2 chez les mammifères); ( 0 ) région riche en Sr/%; ( . ) domaine

hansrnemb-aire; ( ) queue cytoplasmigue (y) site pour la Kglycosylation.

1.2.4 Kex2: prototype d'une famille d'endoprotéases identifiée chez les eucaryotes supérieurs

Aussi bien la fonction que la structure de Kex2 semblent avoir été très bien consenrées au cours de l'évolution. Kex2 transforme correctement la

proinsuline humaine en insuline aux sites Lys-Arg et Arg-Arg lorsque ce précurseur est exprimé dans la levure (Fuller et al., 1989b). Inversement,

l'expression hétérologue de Kex2 dans les lignées de cellules des mammifères affectées dans la maturation résulte, dans le clivage spécifique du précurseur neuroendocrine propiomélanocortine (POMC) de souris aux sites Lys-Arg (Thomas et al., 1988). Kex2 clive aussi d'autres proprotéines telles que, la proalbumine humaine (Barthurst et al., l987), la glycoprotéine d'enveloppe gp160 du VM-1 (Moulard et Baharaoui, 1995). En plus de son habileté à diver les précurseurs de mammifères in vitro et in aioo, Kex2 présente une forte similarité structurale avec les endoprotéases identifiées chez les mammifères. L'enzyme Kex2 est donc considérée comme le prototype pour les endoprotéases

de type subtîlisine de mammifère, physiologiquement responsables du clivage des proprotéines aux paires de résidus basiques.

1.3 Identification d'une nouvelle famille d'endoprotéase impliquée dans la maturation protéolytique chez la levure S. cerenisiae

1.3.1 Mahiration protéolytique du précurseur de la somatostatine chez S.

cerevisiae

Comme la plupart des hormones peptidiques, la somatostatine est initialement synthétisée sous forme d'un long précurseur, la préprosomatostatine (prépro-SRIF). L'organisation générale de ce précurseur est hautement conservée dans beaucoup d'espèces en ce qu'elle consiste en un peptide signa1 de 23-25 audes aminés suivi d'une prorégion de 90-100 résidus, et l'hormone mature est localisée à l'extrémité carboxy-terminale (Warren et Shields, 1984). La prépro-SRIF, une des plus simples des molécules précurseurs, contient un doublet d'acides aminés basiques (kg-Lys) et un résidu monobasique ( k g ) aux sites de maturation protéolytique. Selon le clivage, dibasique ou monobasique, le précurseur génère soit la somatostatine- 14, (un peptide de 14 acides aminés) soit la somatostathe-28 (une extension en N-terminal de la somatostatine-14) respectivement (Figure 9).

Chez les mammifères, ce précurseur est codé par un seul gène et subit une protéolyse différentielle selon le tissu où il est synthétysé. Chez plusieurs espèces de poisssons, deux gènes indépendants codent pour les précurseurs homologues mais distincts, la prépro-SRIF-I et la prépro-ÇRIF-II (Warren et

Shields, 1984; Bourbonnais et al., 1991; 1994). Ces deux précurseurs présentent globalement 45% d'homologie de séquence, mais l'identité est beaucoup plus forte à l'extrémité C-terminale. En dépit de la présence des mêmes sites de divage potentiels, la prépro-SRIF-I est clivée aux doublets Arg-Lys pour générer la SRIF-14; tandis que la prépro-SRIF-II libère exdusivernent la SRIF-28 par clivage au résidu monobasique Arg. La base moléculaire de ce clivage différentiel n'est pas encore connue.

Figure 9: Schéma de maturation de la prosornatostatine 1 et II. R et K représentent les

résidus Lysine et Arginine respectivement, au site de clivage. SRIF: somatotropin release

inhibithg factor (somatostatine).

L'introduction dans la levure des ADNs recombinants qui codent pour une protéine de fusion composée de la prorégion du facteur a de levure, induant les sites de maturation Lys-Arg et/ou la séquence «spacer» Glu-Ma, et

la section de la SRIF-14, résulte dans la maturation exacte et efficace du précurseur hybride, et la sécrétion de la SRIF-14 mature (Green et al., 1986). De plus, les mêmes enzymes qui divent le profacteur a endogène (c'est-à-dire les produits des gènes KEX2 et STE13) sont nécessaires pour la maturation de ces

protéines de fusion (Bourbonnais et al., 1988), puisque la SRIF mature n'est pas sécrétée dans les mutants kex2 et steZ3.

Dans une autre étude visant à examiner dans les proSRIFs le rôle des domaines structurales conservés, qui pourraient conférer la spécificité de maturation, et l'existence d'une endoprotéase ayant la spécificité pour le clivage aux résidus monobasiques (Arg), Bourbonnais et ses collaborateurs (1991) ont construit une protéine de fusion composée du peptide signal plus 30

résidus de la région pro du facteur a et la proSNF II (préprorégion facteur a-

proSRE II). Le peptide signal du précurseur endogène du facteur a était nécessaire pour le transport efficace de la protéine de fusion dans la voie de sécrétion de la levure. La conversion de ce précurseur exclusivement en SRIF- 28 mature a permis de condure que la levure possède une endoprotéase capable de cliver les précurseurs au site monobasique. Cette activité enzymatique est indépendante de Kex.2 puisque la maturation a lieu même dans une souche

mutante de kex2.

Afin

maturation

Sélection de mutants de S. cerevisiae affectant la maturation protéolytique du précurseur de la somatostatine

d'identifier la nouvelle classe d'endoprotéase impliquée dans la protéolytique au site de clivage monobasique, Bourbonnais et ses

collaborateurs (1993) ont développé une procédure permettant la sélection des mutants de levure qui sont affectés dans la sécrétion du précurseur hybride, (mutants sex). La stratégie utilisée était basée sur la sécrétion du facteur a biologiquement actif. Pour faciliter la sélection de ces mutants, le plasmide pS2B (Figure lOA), qui code pour la protéine de fusion proSRIF-II, comprenant la préprorégion du facteur a et la proSRIF-II, a été modifié par mutagenèse dirigée afin de remplacer la section SRIF-28 mature par une seule copie du

facteur a. Le gène résultant, pS3C, code pour une protéine hybride (contenant un site de clivage monobasique) (Figure 10B) dont l'expression est sous Ie contrôle du promoteur facteur a.

Le plasmide pS3C a été ensuite introduit dans les cellules de type a qui portent une copie défectueuse des deux gènes MFal et MF& (souche parentale DS7), de sorte que ces cellules dépendent uniquement de la maturation du précurseur hybride au site monobasique pour sécréter le facteur a biologiquement actif. Pour distinguer entre les mutants qui affectent spécifiquement la maturation du précurseur de ceux où la régulation transcriptionnelle du promoteur facteur a est réprimée, ou d'autres mutants dont le défaut principal n'est pas directement impliqué dans la maturation protéolytique spécifique des sites monobasiques, deux autres plasmides ont été construits. Le plasmide pGS3C est un dérivé de pS3C où le gène chimérique est sous le contrôle du promoteur GALI, et le plasmide paFF (Figure 10C) est une version tronquée du gène MFal et code pour un polypeptide qui contient une

Figure 10: Représentation schématique des pIasmides (A) pSZB, (BI pS3C et (C) paFF.

(CI) préprorégion facteur a; (9) site N-glycosylation; ( M) prosomatostatine-II; (O) site de

divage; (H) sornatostatixte-28 mature; (O) facteur a mature; K et R représentent les acides

aminés basiques Lys et Arg respectivement, au site de divage.

seule copie du peptide facteur a immédiatement précédée par le site de maturation dibasique, Lys-Arg. Ainsi une souche mutante capable de séaéter le facteur a lorsqu'elle porte le plasmide paFF, maïs pas pS3C, serait un candidat potentiel pour un défaut dans le gène codant pour l'endoprotéase spécifique des sites monobasiques.

Les transformants de DS7 qui exprimaient les plasmides pS3C et paFF, mais pas ceux qui exprimaient pS2B produisaient une zone sur un tapis de cellules MATa hypersensibles, et étaient capables de se conjuguer avec les cellules MATa. Donc elles sécrétaient le facteur a mature. La souche DS7 portant le plasmide pS3C, était ensuite soumise aux rayons U.V. Les colonies qui ont sunrécu à cette exposition (soit plus de 9 000 colonies venant de deux expériences independantes) ont été d'abord sélectionnées pour leur incapacité à

se conjuguer avec les cellules MATa et ensuite testées pour la production de zone. De cette sélection, une des classes de mutants, désignée classe III, comprenant sept membres, a été retenue. Ces mutants étaient incapables de se conjuguer et produisaient une zone dont la taille était significativement réduite par rapport à celle de la souche parentale, démontrant ainsi une faible production du facteur a biologiquement actif. L'expression du plasmide pGS3C dans trois membres représentatifs de cette classe ne révélait aucune différence dans la réduction de la taille des zones lorsque le gène hybride était sous le contrôle du promoteur G A L I . Par ailleurs, une des trois souches mutantes testées avec le plasmide paFF, B3-4, sécrétait le facteur a mature à un taux comparable à celui du type sauvage, lorsqu'elle portait ce plasmide, exprimant le précurseur endogène contenant un site de maturation Lys-Arg. Cette souche était donc présumément affectée spécifiquement dans la maturation protéolytique aux sites monobasiques.

1.3.3 Clonage et caractérisation du gène YAP3

Le gène impliqué dans la maturation protéolytique au site monobasique a été cloné en complémentant l'incapacité de la souche B3-4 ( s e x l - 1 ) à se conjuguer, et à produire une zone sur un tapis de cellules MA Ta hypersensibles (Bourbonnais et al., 1993). Ceci a été réalisé en introduisant une banque de gènes de levure construite dans un plasmide multicopie, YEp24. Deux plasmides corrigeant les phénotypes du mutant B3-4, contenaient un

fragment génomique commun. Ils ont été récupéréç, et le gène a été caractérisé. Ce gène, lorsque présent sur le plasmide mdticopie, YEp24, corrigeait les phénotypes (conjugaison et production de zone) de la mutation sexl-1, mais était incapable de le faire lorsqu'il était exprimé sur un plasmide à copie unique. Le gène cloné n'est donc pas allélique au gène SEXI-1, mais agit plutôt comme un supresseur de la mutation.

La séquence du gène doné était identique à celle de YAP3 Eeast Sçpartyl Protease), un gène cloné pour son habileté à corriger partiellement la mutation - kex2, lorsqu'il est présent sur un plasmide multicopie (Egel-Mitani et al., 1990).

Le gène YAP3 code pour une protéase aade (ayant deux acides aspartiques au site actif) de 569 résidus d'aùdes aminés. L'endoprotéase Yap3 (Figure 11)

contient une séquence signal en amino-terminal. Ce domaine est suivi d'une prorégion (de 46 résidus d'acides aminés) qui contient en C-terminal une paire de résidu Lys-Arg, suggérant que Yap3 est initialement synthétisée sous forme de zymogène inactif. Le domaine catalytique suivi d'une région de 43 résidus, est riche en Ser/Thr. Finalement, la séquence de lfendoprotéase se termine avec une région d'acides aminés hydrophobes de 19 résidus. Cette extrémité carboxy-terminale est modifiée par un groupement glycosylphosphatidyl- inositol (GPI) qui est nécessaire à l'attachement de la protéine à la membrane plasmique, où elle est localisée (Ash et al., 1995). Yap3 est une protéine de 168 kDa qui est largement glycosylée. Elle contient 10 sites potentiels pour

l'addition d'oligosaccharides N-liés. Ceux-ci contribuent pour environ 92 kDa de la masse moléculaire de la protéine. Yap3 est probablement soumise aussi à

la O-glycosylation sur les résidus Ser/Thr.

La séquence d'acides aminés de Yap3 est fortement homologue à un nombre de protéases acides, notamment le produit du gène BARI ( S S T I ) codant pour l'endoprotéase Bamer (Bar) qui attaque le facteur a. Sa sensibilité à un inhibiteur spécifique et son activité optimale à un pH de 4,O-5,0,

confirment son appartenance aux protéases aspartiques (Ash et al., 1995).

Yap3 est exprimée dans les trois types cellulaires. Selon les études effectuées in vivo (Egel-Mitani et al., 1990; Bourbonnais et al., 1993) et in vitro (Azarian et al., 1993; Cawley et al., 1993; Bourbonnais et al., 1994), Yap3 peut cliver après un seul k g , et également après les paires de résidus basiques. La

spécificité de Yap3, quoique chevauchant avec celle de Kex2, semble être distincte (Bourbonnais et al., 1994).

Figure 11: Structure de Yap3. ( . ) peptide signal; ( bl ) prorégion; ( O ) domaine

catalytique; ( ) domaine riche en Ser/ïhr; ( a ) domaine hydrophobique; ( ? ) site pour la N-

glycosyia tion.

1.4 Problématique

Le gène YAP3, cloné chez le mutant sexl-1, était nécessaire pour la maturation protéolytique du précurseur hétérologue aux sites de clivage monobasique, puisque sa délétion dans la souche parentale entraînait une diminution considérable (> 75%) du peptide mature. Cependant, YAP3 ne

comgeait aucun des six autres mutants sex de la dasse KU, laissant croire que ces mutants définissaient d'autres gènes, impliqués dans la production du facteur a biologiquement actif à partir de la protéine de fusion. Ceci soulevait la question suivante: combien de gènes sex différents existerait-il dans cette dasse de mutants? Pour l'établir, nous devons faire des tests de complémentation. Ces tests consistent essentiellement à croiser tous les mutants entre eux pour obtenir des cellules diploïdes et, selon le phénotype de ces derniers (mutant ou sauvage) on pourra classer les différents mutants en «groupe de complémentation». Or, l'expression de Ia protéine de fusion prosomatostatine/facteur a étant sous le contrôle du promoteur a et donc, ne pouvait être exprimé que dans les cellules haploïdes a. Ainsi, ce phénotype ne pouvait pas être utilisé.

1.5 Hypothèse et objectifs de la recherche

Les mutants sex expriment des phénotypes additionnels.

Les objectifs du projet consistaient à exploiter ces phénotypes: établir la récessivité et la dominance des mutations; déterminer le nombre de gènes mutés différents; connaître la nature précise de la fonction physiologique mutée; et finalement vérifier s'il existe un lien entre la maturation protéolytique et les autres phénotypes.

La découverte et l'investigation des phénotypes associés aux mutations sex faciliterait le clonage des gènes ÇEX, impliqués dans la maturation protéolytique, par complémentation génétique.

2.1 Microorganismes

Les souches de levure utilisées sont décrites dans le Tableau 1. Tous les mutants haploïdes MATa (B2-2, 83-1, B3-2, B3-4, B7-2, B8-1, 813-9) sont dérivés de la souche parentale DS7 qui porte une copie défectueuse des deux gènes (MFa l et MF&) codant pour la phéromone, facteur a. Ces souches possèdent plusieurs marqueurs auxotrop hiques.

Les souches haploïdes MATa possèdent le même génotype que celles de MATa desquelles elles dérivent. Seul le locus MATa été modifié.

YBADl est issue de la souche parentale dans laquelle le gène qui code pour l'endoprotéase Yap3 a été remplacé par le gène HIç3.

M200-6C contient les allèles mutants des gènes SST1 et SST2 qui la rendent hypersensible au facteur a. AWM4, également hypersensible au facteur a contient une copie mutée du gène SSTZ.

Tableau 1. Souches de S. cermisiae

Souches Génotype R é f h c e s ou source

DS7

83-4

82-2

B3-1

B3-2

87-2

B8-1

B13-9

YBADZ

AWM4

M 2 M C

hisl a

hisl a

DS7/DS7

B3-4/DS7

B2-2/DS7

B3-1/ DS7

B3-2 / DS7

B7-2/DS7

B8-l / DS7

813-9 /DS7

MATa SEX mfal/aZ::LEU2 ude2 leu2 his3 bpl ura3 Bourbonnais et al., 1993

MATa sex-l mfal/aZ::LEU2 adeî leu2 hi33 trpl ura3 Bourbo~ais et ai., 1993

MATa ser mfal/aZ::LEU2 ade2 leu2 his3 trpl ura3 Bourbonnais et ai., 1993

MATa sex mfal/crZ::LEUZ ade2 leu2 his3 trpl um3 Bourbonnais et al., 1993

MATa sex mfal/a2::LEU2 ade2 leu2 his3 hpl ura3 Bourbonnais et al., 1993

MATa sex mfal/a2::LEU2 ade2 leu2 his3 trpl ura3 Bourbonnais et ai., 1993

MATa s a mfal/crt::LEU2 ude2 l e 3 his3 trpl ura3 Bourbonnais et ai., 1993

MATa sex mfrrl/aZ::LEU2 ade2 leu2 his3 hpl ura3 Bourbonnais et al., 1993

MATa YA P3::H153 mfal/aZ::LEUZ ade2 leu2 his3 trpl Bourbonnais et al., 1993

ura3

MATa sstl::LEtl2 leu2 -1 ura3 Whïteway. M.

MATa sstl::LEU2 sst2::HISJ adel iIv3 ura3 leu2 his3 Whiteway et aL, 1988

MATa hisl

MATa hisl

MATa/a diploïde isoghique de DS7 Ce mémoire

M A Tafa sex-l/SEX mfa I / a 2::LEU2/mfa I/a 2::LELIZ Ce mémoire

ade2/ade2 leu2/Ieu2 his3his3 trpl/trpl ura3/ura3

MATaIa sex/SEX mfa I/a 2::LEU2/mfa I / a 2::LEUZ Cemémoire

ade2/ade2 leuZ/leu2 his3/his3 hpl /trpl ura3/ura3

MATaIa sex/SEX mfa Z/a 2::LEUt/mfa I / a 2::LEUZ Ce mémoire

ade2/ade2 leu2fleu2 his3his3 trpl/trpl ura3/ura3

MATaIa sex/SEX mfa I/a2::LEUZ/mfa I /a2: :LEU2 Cemémoire

ade2/ade2 leu2fleu2 his3his3 trpl/trpl ura3/ura3

MATaIa sex/SEX mfa Z/a 2::LELIZ/mfa 1/a 2::LEU2 Ce mémoire

ade2/ade2 leuZ/IPuZ his3his3 trpl/trpl ura3/ura3

MATala sex/SEX mfa I / a 2::LEUZ/mfa I/a 2::LELIZ Ce mémoire

ade2/ade2 leu2fleu2 his3/his3 trpl/trpl ura3/ura3

MATa/a sex/SEX mfa Z/a 2::LEUZ/mfa I / a 2::LEUZ Ce mémoire

ade2/ade2 leu2fieu2 his3his3 trpl/trpl ura3/ura3

Pour certaines expériences d'autres diploïdes MATa/a ont été construits. Les souches parentales

utilisées pour la construction de ces diploides sont décrites dans la section appropriée du matériel

et méthode.

La souche contient tous les

La souche

hisl existant dans les deux types cellulaires, MATa et MATa, marqueurs de complémentation awotrophiques sauf HISI.

bactérienne, E. coli MC1061 F-araD139 A(ara-leu)7696 galE I 5

gulK16 A(Iac)X74 rpsL (Str) hsdR2 (ri;mk+) mcrA mcrBl] (New England Biolabs

Catalog, 1995, p. 219) a été utilisée pour l'amplification et la purification des

ADNs plasmidiques.

2.2 Plasmides

Le plasmide pS2B (Bourbonnais et al., 1993) est dérivé du plasmide p82-5 (Green et al., 1986) et contient le déterminant de réplication de 2 pn de la levure, lui permettant ainsi de se répliquer de façon autonome. Ce plasmide exprime le gène chimérique préprofacteur a-proSRIF-II (prosomatostatine II) (Figure IOA) sous le contrôle du promoteur facteur a. Il peut se répliquer aussi

bien dans E. coli que dans la levure. Il contient le gène de résistance à

l'ampialline utilisé comme marqueur de sélection dans E. coli et le gène TRP

pour la sélection dans la levure.

Le plasmide pS3C (Bourbonnais et al., 1993) est similaire au plasmide pS2B mais exprime le préprofacteur a-proSRIF-II-facteur a mature (Figure 10B).

Le plasmide paFF (Bourbo~ais et al., 1993) est semblable au plasmide

pS2B mais exprime la version tronquée du préprofacteur a endogène dans lequel une seule copie du peptide mature a été retenue (Figure 10C).

Le plasmide YEp24 (New England Biolabs Catalog, 1995, p. 192) contient

les séquences de pBR322 (origine de réplication et le gène de résistance à

l'ampicilline) permettant sa réplication et sa sélection dans E. d i . Il possède également l'origine de réplication de 2 pm de la levure et le gène U R A 3 responsables respectivement de la réplication et de la sélection dans la levure. Le gène de résistance à la tétracycline du plasmide pBR322 est aussi présent

mais il est séparé de son promoteur par la séquence URA3.

Le plasmide pGAL-HO contient le gène HO de levure qui est sous le contrôle du promoteur GALIO. Le gène HO code pour l'endonucléase Ho utilisée dans la modification du N e cellulaire de la levure. pGAL-HO est dérivé du plasmide YCp50 (Herskowitz et Jensen, 1991) qui contient les séquences de pBR322 et le gène URA3, tel que décrit pour le plasmide YEp24, mais il porte aussi une séquence centromérique (CEN4) et une séquence d e réplication autonome (ARSI).

2.3 Milieux de croissance

2.3.1 Bactéries

La souche bactérienne, E. c d i MC1061, a été d t i v é e à 37°C dans un milieu 2YT contenant 1,6% de bacto-tryptone (Difco), 1% d'extrait de levure (Difco), 0,5% de NaCl (J.T.Baker), et 0,2% de glucose (Anachemia). Pour les milieux solides du bacto-agar à 1,5% (Difco) a été ajouté. L'ampicilline (ICN), lorsque nécessaire, a été additionnée à une concentration de 50 ~g / rn l dans les milieux liquides et à 100 p g / d dans les milieux solides. Les solutions mères d'ampicilline, 100 mg/ml, ont été préparées dans de l'eau déminéralisée, et

stérilisées par filtration sur un filtre nalgène de 0,22 m.

2.3.2 Levures

La croissance des souches de levure a été effectuée à 30°C. Les principaux milieux utilisés sont les suivants: le milieu complexe YPD contenant 1% d'extrait de levure, 2% de bacto-peptone (Difco), 2% de dextrose (Anachemia); les milieux synthétiques complets (SC) contenant 0,679'0 d'azote (ebacto-yeast nirogen base without amino acids~) (Difco), 2% de dextrose. Ces derniers sont supplémentés de 0,15% d'un mélange («drap out») contenant tous les acides aminés (ICN) (selon les quantités décrites par Sherman et al., 1986) sauf le tryptophane, plus l'adénine et l'uracile (ICN) (SC-Trp), ou tous les acides aminés plus l'adénine mais sans l'uracile (SC-Ura). Les milieux synthétiques complets sans le tryptophane ou l'uracile ou encore les deux (SC-Trp-Ura) ont été utilisés pour la sélection ou la maintenance des plasmides. Pour les milieux solides du bacto-agar à 1,5?40 (Difco) a été ajouté.

Le milieu minimal, SD (0,67% d'azote, 2% de dextrose), a été employé pour la sélection des diploïdes prototrophes.

Pour induire la sporulation, les cellules diploïdes sont d'abord cultivées dans le milieu YEPA composé de 2% d'acétate de potassium (Anachemia), 2%

de bacto-peptone, 1% d'extrait de levure, et additionné d'adénine et d'uracile (5 pg/ml) (solution mère 2 mg/mi). Les acides aminés histidine (His) à 5 @ml (solution mère 10 mg/ml) et la leucine (Leu) à 25 pg/ml (solution mère 10 mg/ml) ont été ajoutés pour permettre la compensation des déficiences nutritionnelles. Le tryptophane n'a pas été ajouté car les souches utilisées possèdent un plasmide contenant ce gène marqueur. La sporulation des cellules a été provoquée dans le milieu SPM, contenant 0,3% d'acétate de potassium, 0,02% de raffinose (ICN) et supplémenté avec les acides aminés cités précédemment.

Les solutions mères d'acides aminés ont été préparées avec de l'eau déminéralisée et stérilisées par filtration sur un filtre nalgène de 0,45 m. Les acides aminés sont ajoutés avant ou après le passage des milieux à l'autoclave.

Le milieu YPD a constitué le milieu de base pour étudier la sensibilité des souches à différents composés ainsi que leur croissance sur d'autres sources de carbone. Tous les tests ont été réalisés sur des milieux solides.

La capacité des souches mutantes de levure à croître sur d'autres sources de carbone a été vérifiée sur un milieu YPD dans lequel les 2% de dextrose ont été d'abord remplacés par 2% de galactose (ICN) (YPGal), ensuite par 3'' de

glycérol 0.T. Baker) (YPG), une source de c a r b o ~ e non fermentable.

La fragilité de la paroi cellulaire a été révélée sur un milieu YPD contenant différentes concentrations de Calcofluor White (CFW) M2R (Sigma). La solution mère de CFW 1% est toujours fraîchement préparée; stérilisée par filtration sur un filtre nalgène de 0,45 pm et additionnée dans le milieu à 70°C dans les concentrations requises (Ram et al., 1994).

La sensibiiité des souches mutantes à la caféine (CAFs) a été évaluée sur un milieu YPD additionné de caféine (ICN) à l,O, 1,2, 1,4 ou 1,5 mg/ml supplémenté ou non par des stabilisateurs osmotiques [sorbitol 1 M (Fisher), NaCL 0,s M, galactose 1 Ml.

La sensibilité des souches mutantes aux sels a été évaluée sur un milieu YPD additionné de chlorure de sodium (NaCL) à 1,3 et 1,5 M, ou de chlorure de lithium (LiCl) (J.T.Baker) à 0,15 et 0,20 M.

2 4 Préparation de cellules compétentes de E. coli et transformation

Pour rendre les cellules de E. coli MC1061 compétentes à la transformation (introduction de l'ADN plasmidique), la méthode au chionire de calcium (CaCh) a été utilisée (Hanahan, D. 1983).

Le milieu 2YT (500 ml) est inoculé avec 5 ml d'une culture en phase stationnaire (culture dans 5 ml de 2YT incubée avec agitation durant 12-16 heures) de E. coli et la culture est incubée à 37OC, à 200 rpm. Lorsque la densité optique atteint environ O,8 à 550 n m (D.O.550 -) (Spectro~c Genesis 5), la

culture est séparée dans deux tubes naigènes stériles et froids de 250 ml, incubée sur de la glace 5-10 minutes avant d'être centrifugée à 4°C à 7 000 rpm (Sorvall)

pendant 10 minutes. Il est important de garder les cellules à 0-4°C durant le reste des manipulations. Après avoir jeté le surnageant, les cellules sont lavées avec 62,s ml d'une solution MgC12 0,l M (Anachemia) stériles et froids, pour être ensuite centrifugées dans les conditions précédentes. Les culots de cellules sont resuspendus dans 62,5 ml d'une solution stérile et froide de CaC12 0,l M (Anachemia), et maintenus dans la glace pendant 1 heure. Une dernière centrifugation est effectuée à 4OC et à 7 000 rpm pendant 10 minutes, et les cellules sont finalement resuspendues dans 25 ml d'une solution stérile et

froide contenant du CaC12 0,l M et du de glycerol 15%. Déposées sur de la glace, les cellules sont aliquotées à raison de 250 p.l/tube froid et peuvent être utilisées immédiatement ou être conservées à -70°C pour utilisation ultérieure. Il est préférable de préparer les aliquotes sur de la glace sèche.

Habituellement une efficacité de transformation d'environ 107

transformants/pg d'ADN est obtenue avec les cellules fraîches. Toutefois cette efficacité diminue graduellement avec les cellules congelées.

L'ADN à transformer (5-10 pi) est ajouté à un microtube contenant 130

pl de cellules compétentes et 70 pl d'une solution de TrisHCl 0,l M, pH 7,4, CaCl2 0,l M et MgC12 0,l M (TCM). Les cellules sont incubées sur de la glace pendant 30 minutes. Elles subissent ensuite un choc thermique à 42°C sous

agitation modérée. Après l'addition de 1 ml de 2YT, le tube contenant les cellules compétentes est incubé à 37°C sans agitation pendant 30 minutes. D e w cents microlitres du mélange réactionnel sont ensuite étalés sur un milieu 2YT additionné d'ampicilline 100 pg/mI, pour la sélection des transformants. Les pétris sont finalement incubés à 37OC durant 12-16 heures.

2.5 Purification de l'ADN plasmidique et transformation des levures

2.5.1 Mini-préparation de plasmides

La méthode utilisée a été décrite par Maloy Stanley en 1990. Les cellules bactériennes contenant un plasmide recombinant sont incubées une nuit à

37°C dans 3 ml de milieu 2YT supplémenté avec de i'ampiulline 50 pg/ml. Un aliquote de cette culture (1,s ml) est ensuite centrifugé dans un microtube à 8 000 rpm (Sorvall) pendant 1 minute afin de récupérer le culot ceUulaire. Celui- ci est resuspendu dans 200 pl d'une solution glucose 50 mM, TrisHCl 25 rnM, pH 8,0, et EDTA 10 mM (GTE) avant d'être incubé à la température de la pièce durant 5 minutes. On ajoute alors 400 fl de la solution alcaline fraîche [NaOH 0 2 N (Anachexnia), SDS 1% (Fisher)] dans le tube et le mélange est effectué en inversant le tube 3 à 6 fois (la suspension devient claire et visqueuse). Suite à

une incubation de 5 minutes sur de la glace, 300 pl de la solution d'acétate d'ammonium (NWOAc) 7,5 M (Oméga) sont ajoutés et le contenu du tube est

mélangé doucement pendant quelques secondes. L'incubation se poursuit durant 10 minutes sur de la glace. Les débris cellulaires, l'ADN chromosomique et les protéines dénaturées sont éliminés par une microcentrifugation à 4OC, 10 000 rpm, pendant 3 minutes; et le surnageant clair est transféré dans un nouveau tube, dans lequel 0,6 volume (400-500 pl) d'isopropanol est ajouté. Le tout est incubé à la température de la pièce pendant 10 minutes puis centrifugé à 12 000 rpm pendant 10 minutes également. Le culot d'ADN récupéré est lavé avec 70% (v/v) d'éthanol froid (500-800 pl), séché à la température de la pièce (environ 15 minutes), et dissous dans 50 p1 d'une solution de TrisHCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM (TE) contenant 10 pg de mase A. La suspension est alors incubée à 37°C pendant 30 minutes afin de permettre la dégradation de I'ARN. L'ADN obtenu peut être utilisé immédiatement ou conservé à -20°C.

2.5.2 Maxi-préparation de plasmides

La technique est semblable à celle de la mini-préparation de plasmides sauf que les volumes ont été augmentés (culture et solutions) afin d'obtenir une quantité plus élevée de plasmides.

2.5.3 Midi-préparation de plasmides

Cette méthode a été effectuée d'après les instructions du fournisseur Qiagen, toujours dans le but d'augmenter la capacité de rendement et de

purification des plasmides.

2.5.4 Transformation des levures traitées à l 'achte de lithium

Les cellules de levure, tout comme celles de E. coli , doivent être

compétentes avant d'être transformées. Deux méthodes de transformation utilisant les cellules de levure traitées à l'acétate de lithium (LiAc) pour

l'induction de la compétence ont été employées. Ces deux méthodes sont dérivées du protocole original déait par Ito et al., (1983).

Une culture de chacun des mutants MATa est préparée dans 5 ml de

milieu YPD et incubée sous agitation pendant une nuit à 30°C. Cette culture est ensuite diluée dans 50 ml du milieu original à une D.O. de 0,3-0,4 à 600 nm. L'incubation a lieu à 30°C dans un Erlenmeyer de 250 ml jusqu'à l'obtention d'une D.0.600 - de l'ordre de O$ à 0,7 (une unité d'absorbante à 600 nm - 1x107 cellules/ml). Lorsque cette densité optique est atteinte, la culture est transférée dans un tube conique de 50 ml avant d'être centrifugée à la

température de la pièce à 3 000 rpm (SomaIl clinique) durant 3 minutes. Suite à deux lavages successifs à l'eau stérile (10 ml), 2x108 cellules/ml sont resuspendues dans une solution de LiAc 0,1 M, TrisHC1 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM. Les cellules deviennent compétentes après une incubation sous agitation à 30°C pendant 1-24 heures. Elles sont déposées sur de la glace pendant 5 minutes avant d'être transférées dans des microtubes à raison de 200 @/tube.

On ajoute alors aux cellules compétentes 4 pl d'ADN de sperme de saumon 10

mg/ml préalablement chauffés à 90°C pendant 15-20 minutes, et environ 0,5 à

1,O pg d'ADN plasmidique. Au cours de L'incubation de 30 minutes à 30°C, les

cellules sont mélangées délicatement 2 à 3 fois par inversion du tube. Une

solution (1 ml) composée de LiAc 0,l M et de polyéthylène glycol 4 000 40% (PEG 4 000) (Fisher) est ajoutée dans le tube et l'incubation se poursuit dans les mêmes conditions. Après avoir été soumises à un choc thermique à 42°C

pendant 15 minutes. les cellules sont centrifugées durant 2 secondes. Le culot est lavé 2 fois avec 500 p1 de YPD et remis en suspension dans 200 pl d'une solution TE pH 73 contenant du sorbitol O,5 M. Les cellules sont ensuite étalées

sur le milieu sélectif SC-Trp ou SC-Ura, qui est incubé à 30°C durant 2-3 jours ou jusqu'à apparition complète des colonies.

La deuxième méthode de transformation des levures à l'acétate de lithium est une modification de la procédure originale (Kaiser et al., 1994). Cette méthode, plus rapide et plus simple que la première, est très efficace et très utile pour la transformation à grande échelle.

Une culture de levue (dans un milieu YPD) en phase stationnaire (1 ml)

est centrifugée dans un microtube durant 5 secondes à vitesse maximale (SomaIl). Les cellules sont mélangées au vortex (1 sec) dans 50-100 pl du

surnageant restant. Aux cellules sont ajoutés 2 ~1 d'une solution préchauffée (90°C/15-20 min) d'ADN de sperme de saumon 10 mg/ml, et environ 1 pg de plasmide (1-3 p1 d'une mini-préparation ou d'ADN purifié). Le tout est mélangé au vortex et suivi d'une addition de 0,5 ml d'une solution de 36%

PEG 4 000 (p/v), LiOAc 100 mM, TrisHCl10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM. Après avoir mélangé de nouveau au vortex, 20 pl de DïT' 1,O M sont ajoutés dans le tube et le mélange est agité une dernière fois. Le tube contenant le mélange réactionnel est ensuite incubé à la température de la pièce durant 6-8 heures. (Le nombre de cellules augmente linéairement avec le temps, par conséquent l'incubation des cellules peut s'étendre entre 2-24 heures). Durant cette incubation les cellules se déposent au fond du tube. Elles subissent un choc

thermique à 42°C durant 10 minutes, Finalement un volume de 50-100 pl de cellules est prélevé directement au fond du tube et est étalé sur un milieu sélectif, (SC-Trp ou SC-Ura), permettant la sélection des transformants. Le pétri est incubé durant 2-4 jours à 30°C.

La culture en phase stationnaire peut être remplacée par des colonies prélevées directement sur un pétri. À l'aide d'un cure-dent stérile, ces colonies sont resuspendues dans le mélange de la solution décrite précédemment. Cette procédure est aussi efficace que la première.

2 6 Essais biologiques du facteur a

La production du facteur a a été vérifiée chez les mutants haploïdes a par deux essais biologiques basés sur l'activité biologique du facteur a mature.

2.6.1 Zones d'inhibition de croissance

La sécrétion du facteur a actif a été analysée en suivant la formation de

zones d'inhibition de croissance autour des cellules a déposées sur les tapis de cellules a hypersensibles, AWM4 sstl et M200-6c sst 2, ssf2, au facteur a (Bourbonnais et al., 1993; Reneke et d., 1988).

Un échantillon d'une culture stationnaire de cellules M200-6C (30 pl) ou AWM4 (25 pl) est mélangé mélangé avec 5 ml du milieu sélectif SC-Trp contenant de l'agar à 1,7%, lequel est préchauffé à 42OC. Le tout est immédiatement étalé de façon uniforme sur les pétris contenant 8 ml YPD déjà solidifiés (frais ou préchauffé à 30°C). Pendant que I'agar se solidifie (15-30

min), 500 pl d'une culture (préparée dans 3 ou 5 ml SC-Trp) de cellules

contenant le plasmide pS3C ou paFF en phase stationnaire, sont centrifugés dans un microtube durant 15 secondes. Le culot est resuspendu dam 25 pI du milieu original. Après avoir mélangé au vortex, 3-5 @ de cellules sont déposés directement sur I'agar préparé précédemment; et les pétris sont ensuite incubés pour une journée à 30°C (M200-6C) ou à la température de la pièce (AWM4). L'incubation à la températue de la pièce produit des zones d'inhibition de croissance plus grandes que celies produites à 30°C.

2.6.2 Conjugaison sexuelle

Cette méthode consiste à croiser deux souches de sexe opposé possédant des marqueurs auxotrophiques différents (Sprague, Jr. 1991). Le diploïde prototrophe résultant est sélectionné sur un milieu minimal.

Les cellules haploïdes MATa contenant le plasmide pS3C ou paFF sont appliquées (à l'aide d'un cure-dent stérile) sous forme de grosses taches, sur un pétri contenant le milieu sélectif SC-Trp. Celui-ci est ensuite incubé à 30°C durant 1-2 jours. Parallèlement, environ 500 pl d'une culture «tester» MATa

hisl en phase stationnaire sont é t a k sur un pétri YPD qui est incubé à son tour

à 30°C pendant 1-2 jours, afin d'obtenir un tapis cellulaire très dense. Par la suite, une empreinte de ces deux pétris est effectuée sur le même tissu en velours. Les cellules sont répliquées sur un pétri contenant le milieu YPD et incubées à 30°C pour 1 jour. Ensuite, le pétri est répliqué sur un milieu minimal, SD, qui permet uniquement la croissance des diploïdes prototrophes. Une réaction de conjugaison positive avec une souche .tester» donne une

croissance confluente à la contact, soit à la position de

position où les deux types cellulaires étaient en la grosse tadie de cellules.

2.7 Analyse microscopique

Vingt microlitres d'une culture de levure en phase exponentielle sont déposés sur une lame. Celle-ci a été préalablement immergée dans une solution de polylysine (Sigma) à 1 mg/ml pendant 5 minutes, rincée à t'eau et

séchée. Après 1-2 minutes, l'excès de cellules est enlevé. Les cellules restantes

sont alors lavées deux fois avec 50 pl de tampon PBS contenant par litre: 8,Og de NaCL, 0,2 g de KC1 (Anachemia), 1,44 g de Na2HP04 (Anachemia) et de 024 g de KH2P04 (Anachemia). Suite à une incubation de 1-2 minutes à la température de la pièce, 5 pl du milieu de montage contenant du glycérol 90%

et de PBS 10% sont déposés sur la lame qui est ensuite couverte d'une lamelle. Les cellules sont examinées et photographiées au microscope à contraste de phase avec un objedif 40 X.

2.8 Test de complémentation

2.8.1 Modification du type cellulaire

Pour déterminer le nombre de gènes différents qui sont mutés dans la collection de 7 mutants, des tests de complémentation génétique ont été effectués. La complémentation génétique nécessite le croisement du type cellulaire MATa avec le type cellulaire MATa. Les mutants sont ensuite caractérisés en examinant le phénotype du diploïde avec la perte du phénotype mutant indiquant la complémentation. Vu que tous les mutants ont été

générés dans des cellules MATa, la construction des cellules de sexe opposé, MATa (Herskowitz et Jensen, 1991), qui sont isogéniques aux cellules MATa à

l'exception du locus MAT, est nécessaire. La levure possède cette capacité de passer d'un type cellulaire à un autre grâce à l'endonudéase Ho portée par le plasmide pGAL-HO (voir section 1.2.1.2 de l'introduction).

2.8.1.1 Transformation des levures MAT a avec le plasmide pGAL-HO

Le plasmide pGAL-HO a été introduit dans les cellules MATa par transformation selon le protocole décrit à la section 2.5.1. Les transformants ont été d'abord sélectionnés s u le milieu SC-Ura contenant du glucose.

2.8.1.2 Induction de l'expression du gène HO

La technique qui suit a été mise au point spécialement pour l'induction de l'expression du gène HO chez les mutants à l'étude (Herskowitz et Jensen 1991).

Une culture des souches MATa possédant le plasmide pGAL-HO est préparée dans 4 ml du milieu SC-Ura contenant du glucose et incubée environ 2 jours ou jusqu'à épuisement complet du glucose. Le galactose est ensuite ajouté à la culture à une concentration finale de 20 mg/ml afin de débuter l'induction de l'expression du gène HO. Les cellules sont incubées pour une nuit à 30°C. Le milieu SC-Ura galactose (4 ml) est inoculé avec 1 ml de la culture précédente. Suite à une incubation d'une durée minimale de 16 heures, 200 pi de cette nouvelle culture sont étalés sur un pétri contenant Le milieu SC-Ura galactose. L'incubation de ces pétris dure environ une semaine. 11 est important d'effectuer les cultures dans ces conditions (croissance en milieu Liquide avec du galactose puis en milieu solide) afin de permettre non seulement la croissance des transfonnants sur le milieu solide sélectif galactose mais aussi l'induction de l'expression du gène HO qui est très lente, lorsque les cultures proviennent directement d'un milieu contenant du glucose. La répression du glucose par le glycérol ne peut pas être employée ici puisque les mutants sont incapables de croître sur un milieu contenant cette source de carbone.

Les colonies du pétri SC-Ura galactose sont transférées sous forme de

grosses taches à l'aide d'un cure-dent stérile sur un pétri SC-Ura glucose (50

taches/pétri), afin d'arrêter l'induction de l'expression du gène HO. Les pétris sont effectués en duplicata et incubés pendant 1-2 jours.

2.8.1.3 Sélection des levures AUTa

Étant donné que les transformants forment des colonies contenant des cellules du type original a, des cellules ayant changé de type sexuel a et des cellules diploïdes MA T a /MA Ta, résultant du croisement entre ces deux dernières, le test de conjugaison sexuelle avec les deux souches «tester», MATa hisl et MATa his 1, (voir section 2.6.2) a été utilisé pour la sélection des cellules MATa. Les colonies se conjuguant avec MATa hisl ont été sélectionnées pour les tests de complémentation.

28.1.4 Sélection des levures pour la perte du plasmide pGAL-HO et

construction des diploïdes

Une culture de cellules MATa identifiées dans la section précédente est préparée dans 5 ml de milieu YPD additionné de 55 gl d'une solution d'uracile 2 m g / d , afin d'amener les cellules à se débarrasser du plasmide pGAL-HO. Après 12-16 heures d'incubation, 200 jd de cette culture sont étalés sur YPD à

raison de 200-300 cellules par pétri (effectué en duplicata). L'incubation est

réalisée à 30°C durant 1-2 jours. Les colonies sont ensuite répliquées sur les milieux SC-Ura et YPD. L'absence de croissance d'une colonie sur SC-Ura suite à une incubation de 1-2 jours, indique la perte du plasmide pGAL-HO. Les cellules ayant perdu ce plasmide sont donc sélectionnées et transformées par la

suite avec le plasmide YEp24.

Les cellules de type MATa portant le plasmide paFF et celles de type

MATa contenant le plasmide YEp24 sont croisées entre eux selon la procédure décrite dans la section 2.6.2 avec les ajustements suivants: les cultures sont effectuées dans le milieu approprié pour la maintenance des plasmides, et les diploïdes sont sélectionnés sur le milieu SC-Trp-Ura. Les diploïdes résultants de ces croisements sont testés pour la sensibilité aux différents composés indiqués dans la section appropriée des résultats. La perte de la sensibilité indique la complémentation.

2.9 Analyse des produits méiotiques

L'analyse de la progéniture haplo'ide issue d'une méiose est une méthode couramment employée dans la génétique de la levure. Elle permet d'étudier l'allélisme, les relations de liaison entre les gènes etc. Eile a été utilisée dans cette étude afin d'examiner la ségrégation des phénotypes, d'une

part pour déterminer si les gènes responsables des différents phénotypes induant la maturation protéolytique sont liés; d'autre part, pour investiguer la nature des mutations (ségrégation cytoplasmique ou nudéaire) affectant la fonction mitochondriale. Cette technique comprend plusieurs étapes.

2.9.1 Construction et sélection des souches diploïdes

Les souches haploïdes MATa contenant le plasmide paFF (source

endogène du facteur a) sont croisées avec la souche parentale DS7 MATa portant le plasmide YEp24. Comme les deux types de celluIes portent les mêmes marqueurs auxotrophiques, l'introduction du plasmide YEp24, contenant le marqueur URA3, dans la souche parentale MATa est nécessaire pour la sélection des diploïdes par complémentation.

La procédure utiiisée est la même que celle décrite à la section 2.6.2 avec les ajustements suivants: la souche «tester» MATa hisl est remplacée par DS7 MATa et celle-ci est cultivée dans 5 ml de milieu SC-Ura. La sélection des diploïdes est effectuée sur un milieu sélectif SC-TT-Ura.

2.9.2 Sélection des levures pour la perte des deux plasmides

Une culture de chacune des souches diploïdes obtenues est préparée dans 5 ml de milieu YPD, supplémenté d'une solution de tryptophane 30 pg/ml et d'une solution d'uracile 22 pg/rnl, afin d'amener les souches à se débarrasser de leur plasmide. L'incubation est effectuée durant une nuit à 30°C. Deux cents microlitres de cette culture sont ensuite étalés sur YPD (en duplicata) à

raison de 200-300 cellules par pétri et l'incubation est effectuée pendant 1-2

jours à 30°C. Les colonies formées sont répliquées sur les milieux YPD, SC-Trp et SC-Ura et les pétris sont incubés durant 1-2 jours. L'absence de croissance

d'une colonie sur les deux milieux sélectifs indique Ia perte des deux plasmides. Cette colonie est donc identifiée et transformée par la suite avec le plasmide pS3C.

La sporulation protocole de Kassir

a été effectuée en milieu liquide (modification et Simchen, 1991) afin d'améliorer l'efficacité

sporulation des mutants qui est très faible et même nulle en milieu solide. Une culture de chacune des souches diploydes (DS7/DS7 (contrôle), 82-2/DS7, B3-1/DS7, B3-2/DS7, B3-4/DS7, B&1/DS7, B13-9/DS7) contenant le plasmide pS3C est effectuée à 30°C dans 5 ml de milieu SC-Trp jusqu'à la phase stationnaire. Les cellules de cette culture sont diluées dans 10 ml du milieu original à une D.O. de 0,6 à 600 m, ensuite incubées à 30°C. Lorsque la D.O. atteint environ 1,2, les cellules sont lavées une fois à l'eau stérile (environ 10

ml) et le culot est reçuspendu dans 10 ml du milieu YEPA supplémenté avec les acides aminés appropriés (voir section 2.3.2). L'incubation dure 12-16 heures à 30°C. Les diploïdes hétérozygotes ne poussent pas s u ce milieu, d'où l'importance des étapes de croissance dans le miheu SC-Trp. Suite à deux lavages successifs dans 10 ml d'eau stériler les cellules sont resuspendues dans 25 ml du milieu de sporulation SPM, et incubées avec beaucoup d'aération dans un Erlenmeyer de 250 ml. Après 2-3 jours les tétrades apparaissent.

2.9.4 Dissection des tétrades

2.9.4.1 Digestion de la paroi cellulaire de l'asque

Les cultures spomlées contiennent habituellement un mélange de cellules végétatives non sporulées, des asques de 4 spores, 3 spores, etc. La dissection des asques nécessite l'identification d'un asque de 4 spores (la tétrade), et la relocalisation de chacune des 4 ascospores à des positions séparées où elles peuvent former des colonies isolées. La procédure nécessite la digestion de la paroi cellulaire de l'asque avec une enzyme de dégradation, la zymolyase ou la glusulase, sans provoquer la dispersion des 4 spores de l'asque. Les produits de la digestion peuvent être obsewés au microscope à contraste de phase à 400 X. L'échantillon est prêt pour la dissection lorsque les spores dans

la plupart des asques sont visibles comme des sphères arrangées en forme de losange (Figure 12).

Environ 50 (la quantité varie avec la densité des cellules) d'une culture sporulée sont centrifugés dans un microtube durant 10-15 secondes. Les cellules sont resuspendues dans 200 pl de sorbitol 1 M. Cinq microlitres de zymolyase 100 T sont ajoutés et le tout est mélangé délicatement avec l'embout de la micropipette. La digestion est réalisée à la température de la pièce durant 5 minutes. Il est important d'utiliser une concentration d'enzyme qui permet une digestion adéquate en quelques minutes. Une digestion trop prolongée peut diminuer la viabilité des spores et aussi provoquer leur dissociation. Lorsque la dissection dure longtemps, il est préférable d'effectuer la digestion pendant 3-5 minutes, de centrifuger les cellules pendant 3-5 minutes et de les resuspendre dans 200 @ de sorbitol 1 M.

5 du produit de la digestion sont étalés sur 1/3 d'un pétri contenant le milieu YPD et les tétrades sont prêtes à être disséquées. Le reste du contenu du tube est immédiatement maintenu dans la glace.

2.9.4.2 Microdissection des ascospores

La microdissection des ascospores est effectuée à l'aide d'un micromanipulateur attaché à un microscope semblable à celui de la figure 13.

Le pétri de la dissection est positionné de façon à ce que l'inoculum de la culture sporulée et digérée soit dans le champ du microscope au-dessus de la microaiguille (Figure 14) attachée au micromanipulateur.

Les quatre spores provenant d'une tétrade individuelle sont prélevées au moyen de la microaiguille, et déposées séparément à une distance d'environ 5 mm sur le pétri selon la procédure illustrée à la figure 15. Les pétris sont incubés à 30°C durant 2 jours, ou jusqu'à apparition des colonies de spores.

Figure 12. Exemple typique d'un champ d'asques digérés. Les flèches montrent les

tétrades (Tiré de Sherman et Hicks 1991).

Figure 13: Schéma montrant un micromanipulateur attaché à un microscope (Tiré de

Sherman et Hicks, 1991).

Figure 14: Exemple de positions de Ia rniaoaiguiIIe, du support pour pétri et des objectifs

du microscope (Tiré de Sherman et Hicks, 1991).

Figure 15: Les étapes dans Ia siiparation séquentielle d'un groupe de quatre spores sur un

pétri (Tiré de Sherman et Hicks, 1991).

2.9.4.3 Sélection des spores haploïdes lMATa

Sachant que la conjugaison sexuelle s'effectue entre deux cellules de sexe

opposé, les cellules des spores de type a sont sélectionnées par leur incapacité à

se conjuguer avec la souche «tester» MATa hisl (consulter la section 2.6.2 pour le test de conjugaison sexuelle). Les cellules MATa sont ensuite transférées sur le milieu SC-Trp pour vérifier la maintenance du plasmide pS3C. Celles qui l'ont perdu, car la dissection a été effectuée sur un milieu non sélectif pour s'assurer de la viabilité des spores, sont retransfomées avec le plasmide pS3C.

Finalement, les ségrégants haploïdes MA T o! issus des tétrades individuelles sont évalués pour la production du facteur a (essais biologiques section 2.6), ainsi que pour la sensibilité aux différents composés (section 2.3.2).

2.10 Immunodétection de I'endoprotéase Yap3

2.10.1 Préparation des extraits protéiques

Une culture des mutants haploïdes M A T a en phase stationnaire (préparée dans 5 ml YPD et incubée une nuit à 30°C) est diluée dans 5 ml de YPD à une D.O. de 1 unité/ml. Cette nouvelle culture est incubée sous agitation constante à 37°C pendant une période de 4 à 5 heures, afin d'induire l'expression de l'endoprotéase Yap3. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 3 000 rpm (centrifugeuse clinique Sorvall) pour une durée de 5 minutes à la température de la pièce, et resuspendues dans 100 pl d'eau froide contenant 8 pl/ml d'une solution d'aprotinine (un inihbiteur de protéase) 1 mg/ml. Elles sont ensuite transférées dans un microtube contenant 50 pl de

billes de verre, et sont brisées par une forte agitation au vortex durant 30 secondes suivie d'une incubation de 30 secondes sur de la glace. Ce processus alternatif est répété 6 fois. La suspension cellulaire est bouillie durant 2 minutes suite à l'ajout d'une solution de SDS 1%. Les débris sont éliminés par une microcentrifugation de 2 minutes. Le surnageant, contenant les protéines, est récupéré dans un nouveau microtube, et peut être utilisé immédiatement ou consenré à -20°C.

2.10.2 Dosage des protéines

Les extraits protéiques obtenus sont dosés selon les instructions du fournisseur Bio-Rad en utilisant la procédure du miuoessaî. Le dosage est effectué à i'aide d'une courbe standard d'albumine sérique de bœuf @SA) (Bio-

Rad).

2.10.3 Digestion à l'endoglycosidase H

Un échantillon contenant 30,8 pg de protéines de chacun des mutants

MATa est bouilli pendant 3 minutes dans une solution tampon de TrisHCl 1 mM, pH 7,5, 40 mM dithiothreitol (Dm (ICN) et SDS 0,5%. Le mélange dilué deux fois (concentration final de SDS 0,25%) est additionné d'une solution d'acétate d'ammonium 0,2 M, pH 5,O (Oméga), suivi d'une incubation à 37OC durant 5 heures en présence d'endoglycosidase H (Endo H) 5 m u (Boehringer

Mannheim). L'échantillon est ensuite ajusté à une concentration 1 X du tampon échantillon du gel de polyauylamide (50 mM TrisHC1, pH 6,8,2% SDS, 10% glycérol, 0,1% bleu de bromophénol (ICN), 100 mM DTT), placé dans un bain d'eau bouillante durant 3 minutes. L'échantillon ainsi préparé peut être déposé immédiatement dans les puits du gel ou conservé à -20°C.

Des échantillons, ayant la même concentration de protéines, non traités à

l'endoglycosidase H sont ajustés à une concentration 1 X du tampon échantillon du gel de polyacrylamide et bouillis durant 3 minutes.

2.10.4 Électrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant

Les protéines sont séparées par électrophorèse sus un gel de polyacrylamide dans un appareil «Mini-Slab» (Idea Scientific compagny). L'électrophorèse est effectuée à 100 V lors du passage des protéines dans le gel d'empilement (3%) et à 200 V pendant la migration dans le gel de séparation (7%) [(la préparation des gels est effectuée d'après la méthode décrite dans le manuel de laboratoire (Sarnbrook et al., 1989)]. La migration est effectuée dans le tampon Tris-glycine [tris base 0,3% (p/v), glycine 1,88% (p/v), SDS 0,1%

(ph)], pendant environ 2 heures 1/2 ou jusqu'à ce que le bleu de bromophénol

atteigne le bas du gel.

2.10.5 Transfert électrophorétique des protéines sur membrane de nitrocellulose

Après la migration, le gel est démoulé et placé dans l'appareil de transfert Western semi-sec (Multiphor), selon la procédure indiquée dans le manuel du fabricant (Multiphor II electrophoresis system) . Le transfert des protéines sur filtre de nitrocellulose en conditions semi-sèches a Lieu durant 1 heure dans le tampon de transfert pour système continu [glycine 0,2g0' (p/v), Tris 0,5876 (p/v)

SDS 0,03874 (p/v), méthanol 20% (v/v)] sous un courant de 0,8 mA/cm2 de gel.

2.10.6 Immunodétection de l'antigène

La membrane est incubée une nuit à la température de la pièce sous légère agitation dans 9% de lait (Carnation), afin de bloquer les sites non spécifiques. Le lendemain, l'incubation se poursuit durant 2 heures dans un nouveau récipient contenant 2% de lait supplémenté avec le premier anticorps, anti-Yap3, à une dilution 1/1 000. Après 4 lavages successifs dans une solution tampon de TrisHCl 20 mM pH 7,5, NaCl 0,5 M, et Tween 20 0,05% (ICN), comprenant 5 minutes d'incubation entre chaque lavage, la membrane est de nouveau incubée dans les même conditions dans une nouvelle boîte contenant 12 ml de la solution tampon précédente plus le second anticorps (dilution 1/3 000) (anticorps de chèvre dirigé contre le premier anticorps de lapin), qui est combiné à la phosphatase alcaline. Quatre lavages sont de nouveau effectués dans les mêmes conditions.

La protéine Yap3 est ensuite révélée par le substrat chromogène de la phosphatase alcaline, selon les indications du fournisseur (Bio-Rad).

3.1 Spécificité du défaut de maturation protéolytique chez les mutants sex

Les mutants sex ont été originalement sélectionnés pour leur incapacité à

produire le facteur a actif, lorsque celui-ci est exprimé du précurseur hybride, prosomatostatine/facteur a mature, contenant un site de clivage monobasique (Figure 10B) (Bourbonnais et al., 1993). Dans la présente étude, la production du facteur a mature à partir de ce précurseur est davantage approfondie, par les deux essais biologiques basés sur l'activité biologique du facteur a.

3.1.1 Zones d'inhibition de croissance

Le premier essai biologique tire son avantage de l'arrêt du cycle cellulaire en réponse au facteur a. Lorsque les cellules a sont déposées sur un pétri où un tapis de cellules MATa hypersensibles a été étalé, une zone d'inhibition de

croissance (zone claire) apparaît autour des colonies, qui sécrètent le facteur a actif (Sprague Jr. et Herskowitz, 1981). Les cellules de type a qui sont proches du

facteur a subissent un arrêt de croissance permanent en phase G1 du cycle de division cellulaire; tandis que celles qui sont plus éloignées continuent à croître

normalement (Julius et al., 1983). Le rayon de la zone produite sur le tapis de

cellules a est proportionnel au logarithme de la concentration initiale du facteur a appliqué (Julius et al., 1983; Reneke et al., 1988). Les souches MATa uulisées portent des mutations qui rendent leurs cellules hypersensibles au facteur a. Les mutations au locus S S T i qui causent une déficience dans l'habilité des cellules a à dégrader protéolytiquement le facteur a rendent les cellules 10-30 fois plus sensibles à la phéromone que les cellules normales. Les mutations dans le gène SST2 rendent les cellules a 100-300 fois plus sensibles au facteur a que les cellules de type sauvage (Julius et al., 1983; Reneke et al., 1988). Chez ces derniers mutants, même les formes incomplètement maturées du facteur a peuvent induire un arrêt de croissance (Julius et al., 1983; Sprague

et al., 1983).

En utilisant cet essai biologique, les cellules de la souche parentale contenant le plasmide pS3C, produisaient une zone détectable sur les deux tapis de cellules MATa hypersensibles, AWM4 (sstl) et M200-6C (sstl ss t2 ) . Par contre, les mutants sex généraient une zone dont la taille était significativement réduite (mutants 82-2 et B3-l), ou ne produisaient pas de zone (mutants B3-4 et B7-2) sur le tapis de cellules AWM4 (Tableau II). La taille de la zone pour les mutants B3-2, B8-1 et 813-9 n'a pas été déterminée parce que la forme élongée (<dunoos») des cellules MATa en réponse au facteur a n'a

pas été observée (voir discussion, section 4.1). Sur la souche hypersensible M200-6C, tous les mutants, à l'exception des souches 87-2 et B13-9 produisaient des zones d'inhibition avec le plasmide pS3C. Ces zones étaient soit

légèrement plus grandes (B8-l), comparables (B2-2 et B3-1) ou fortement réduites (B3-2 et 83-4) comparativement à celle observée pour la souche parentale.

Les tests de zone d'inhibition de croissance ont révélé que le facteur a mature n'est pas sécrété ou la quantité produite est insuffisante pour générer une zone détectable sur la souche AWM4 avec les mutants B3-4 et 87-2. Chez

les mutants B2-2 et B3-1 le taux de facteur a sécrété quoique suffisant pour produire une zone détectable sur AWM4, est fortement réduit. Étant beaucoup plus sensible au facteur a que la souche AWM4, l'utilisation de la souche M200-6C a permis de confirmer qu'il y a sécrétion, bien que plus faible, de

Tableau II Production du facteur a mature sur un tapis de cellules

MATa hypersensibles par Ies souches portant Les plasmides pS3C ou paFF

A W 4 sstl M200-6C ssf 2 /sst2

Souches pS3C paFF pS3C paFF

f+ : Taille de la zone produite par la souche parentale

+ : Réduction d'environ 50% dans le diamètre de la zone

ttt : Augmentation de 10-25% dans le diamètre de Ia zone

- : Absence de zone

ND : Taille de la zone non déterminée

facteur a mature ou partiellement mature pour la plupart des mutants sauf 87- 2 et B13-9. L'absence totale d'une zone d'inhibition de croissance pour ces deux mutants sur M2006C pourrait suggérer soit que ces mutants sex affectent plus sévèrement la maturation protéolytique du précurseur, ou la sécrétion du

peptide mature ou encore qu'il n'y a pas synthèse de précurseur hybride chez ces mutants (voir section 4.1).

Afin de déterminer si les mutants sex retiennent leur habilité à sécréter le facteur a mature, lorsque celui-ci est exprimé de son précurseur endogène contenant un site de divage dibasique (Lys/Arg), le plasmide paFF a été introduit dans toutes les souches mutantes MATa. Sur le tapis de cellules AWM4 (ssfl), les mutants portant le plasmide paFF produisaient une zone dont la taille était soit supérieure (82-2, B3-1, B7-2, B8-l), ou semblable (83-4) à

celle de la souche parentale (Tableau II). Une seule exception, la zone générée par le mutant 83-2 était fortement réduite. Par ailleurs, pour les raisons expliquées ci-dessus, il n'était pas possible de déterminer la production du facteur a avec la souche 813-9. Des résultats presqu'identiques ont été obtenus avec la souche M200-6C (Tableau II). Cependant, l'utilisation de cette souche a

révélé que le mutant B13-9 sécrète considérablement moins de facteur cx que le type sauvage à partir du précurseur endogène.

3.1.2 Conjugaison sexuelle des mutants sex

La production de facteur a mature est essentielle pour la conjugaison sexuelle (Chan et al., 1983). Dans une population ou la densité des cellules a est élevée, l'efficacité de conjugaison dépend de la concentration de facteur a mature présent.

Pour confirmer les résultats obtenus avec les tests de zone, la conjugaison sexuelle a été effectuée avec la souche .tester» MATa hisl. Tous les mutants exprimant le plasmide pS3C étaient incapables de se conjuguer, ou leur taux de conjugaison était tellement faible qu'on en détectait presque pas (Figure 16). La souche YBADl ( y a p 3 A ) utilisée comme contrôle négatif présentait des résultats identiques. Le défaut de conjugaison sexuel renforce la conclusion précédente selon laquelle les mutants sont incapables de sécréter le facteur a mature, ou la quantité générée est insuffisante pour induire des réponses physiologiques.

Figure 16: Conjugaison sexuelle qualitative des mutants sex. Sélection des diploïdes

prototrophes résultant de croisement entre la souche «tester» MATa hisl et les différents

transfoxmants MATa. A) souches contenant le plasmide PS3C, B) souches contenant le plasmide

paFF.

En revanche, avec le plasmide paFF tous les mutants sauf B13-9, pouvaient se également la souche contrôle YBAD1.

exprimant le précurseur endogène, conjuguer (Figure 16). Ceci inclut

Les résultats des essais biologiques avec les deux types de plasmide indiquent que la majorité des mutants sont affectés dans leur capacité soit à

maturer ou tt sécréter le précurseur hétérologue, mais conservent leur habilité à sécréter le facteur a mature provenant du précurseur endogène. Toutefois, le mutant B13-9 semble incapable de séaéter le facteur a mature quelque soit le précurseur utilisé. Par ailleurs, le mutant 83-2 bien qu'étant capable de se conjuguer aux cellules MATa lorsqu'il exprime le plasmide paFF, il semble évident que la production de facteur a avec l'un ou l'autre des précurseurs est plus faible.

3.2 Étude de la croissance des mutants sex

La courbe de croissance des mutants sex a été effectuée et leur temps de génération (temps requis pour compléter une division cellulaire) a été déterminé. Une différence entre les courbes de croissance de la plupart des mutants et celle de la souche parentale a été observée (Figure 17). Les mutants 82-2, B3-4, B8-1 et B13-9 démontraient une croissance légèrement plus faible et présentaient respectivement des temps de génération de 113, 116, 127 et 125 minutes, comparés à 87 minutes pour la souche parentale (Tableau El). Le défaut de croissance était plus prononcé chez les mutants B3-1 (152 minutes) et B3-2 (155 minutes). Par contre aucune différence significative dans Ia vitesse de croissance de 87-2 n'a été observée (85 minutes).

Le ralentissement significatif dans le temps de génération obsewé chez la plupart des mutants sex nous laissait supposer qu'en modifiant les conditions de l'environnement, ces différences pourraient être accentuées ou possiblement conduire à l'arrêt de croissance. Dans une première série d'expériences nous avons donc suivi la croissance des mutants sex : i) à des températures extrêmes pour la levure; ii) dans un milieu hypertonique et; iii) en l'absence de sucres fermentables.

O 100 2 0 0 300 400 5 0 0 6 0 0

Temps (min)

Figure 17: Courbes de croissance des mutants sex. Les cemes ont été cultivées à 30°C sous

agitation dans un milieu complexe, YPD, à une D.O. initiale d'environ 0,05 à 600 m. La croissance

cellulaire a été suivie par mesure de la D.O. effectuée à intervalles régulières (a chaque 90

minutes au départ puis à chaque 45 minutes durant la phase exponentielle de croissance). Chaque

courbe représente la moyenne de trois expériences.

Tableau III Temps de génération des mutants sex

Souches Temps de génération (minutes)a

=La valeur des temps de génération représente ia moyenne de trois

expériences [k la déviation standard]. Ces valeurs ont été détermi-

nées à partir de la phase exponentide des courbes de croissance.

3.2.1 Croissance des mutants ser à des températures extrêmes

La croissance à différentes températures (16", 23", 30° et 37OC) a permis de montrer que la majorité des mutants (B2-2, B3-4, B7-2, Bû-1, 813-9) sont viables à des températures extrêmes pour la levure (Tableau IV). Cependant, le mutant B3-1 était incapable de croître à 37OC, et 83-2 présentait une croissance partielle à 1 6 O et 23OC. La vitesse de croissance plus lente de cette dernière pourrait en être la cause.

3.22 Croissance en milieu hypertonique (stress osmotique)

La croissance des mutants comparée à celle de la souche parentale a été examinée en présence de forte concentration de sel. Alors que le mutant 87-2 se comportait comme la souche parentale sur un milieu YPD supplémenté avec du NaCl 1,s M, tous les autres mutants étaient incapables de croître (Figure 188) à cette même concentration de NaCl, suggérant ainsi leur incapacité à répondre à un stress osmotique.

Afin de confirmer cette hypothèse, la croissance des mutants a été comparée à celle de la souche parentale sur un milieu YPD additionné des concentrations de LiCl 0,15 et 0,20 M. Le Li+ peut être utilisé comme un analogue de NaC. Parce que le Li+ est beaucoup plus toxique que le Na+, l'inhibition de croissance est obtenue à des concentrations beaucoup plus faibles (Mendoza et al., 1994; Posas et al., 1995). On peut donc distinguer la toxicité des ions de l'effet de l'hyperosrnolarité sur la croissance des mutants. Les résultats obtenus indiquent que le défaut de croissance des mutants observé en présence du NaCl 1,s M est dû à la forte osmolarité du milieu puisque tous les mutants sensibles au NaCl sont capables de croître jusqu'à une concentration de LiCl0,Z M, sauf B3-2 (Figure 19).

3.2.3 Croissance des mutants s a sur d'autres sources de carbone

Une des approches employées dans la caractérisation des mutants consistait à vérifier leur capacité à métaboliser des sources de carbone autres que le glucose. Bien qu'une déficience dans le métabolisme de certains sucres

Tableau IV Croissance des mutants sex à des températures extrêmes.

Les souches ont été striées à partir des cultures en phase stationnaire sur YPD. Les pétris ont été incubés durant une semaine pour la croissance à 16"C, 2 jours à 23 et à 30°C, 1 1/2 jour à 37T.

Températures

Souches 16OC 23OC 30°C 37OC

+ : Croissance

+/- : Faible croisance - : Absence de croissance

B YPD

YPD + NaCI 13 M YPG

Figure 18: Croissance de la souche parentale et des mutants sur YPD, YPG (contenant 3%

glycérol) ou YPD additioné de NaCI. Les cellules des différentes souches en phase stationnaire

ont été étalées sur ces milieux et les pétris ont été incubés pendant 3 4 jours à 30°C.

YPD + LiQ 0,15 M YPD + L i a 02 M

Figure 19: Sensibilité des mutants au L i a . Les cellules des diffkentes souches en phase

stationnaire ont été striées sur YPD additionné des concentrations indiquées de LiU. Ces pétris ont

été incubés durant 3-4 jours à 30°C.

soit un phénotype très peu spécifique, eue pourrait néanmoins foumir des informations supplémentaires sur le rôle fonctionnel des gènes SEX. Elle pourrait également donner des informations très utiles pour les procédures nécessitant une source de carbone par t idère telle que l'induction d'un gène par le galactose. Les résultats de croissance obtenus sur un milieu contenant le galactose ont révélé que les mutants peuvent utiliser ce sucre aussi bien que le glucose.

Par contre, sur un milieu contenant une source de carbone non fermentable comme le glycérol, tous les mutants à l'exception de B7-2, étaient incapables de croître (Figure 18C). Ces mutants seraient donc incapables de tirer leur énergie de la respiration mitochondriale. Ces résultats étaient identiques à

ceux obtenus en présence de NaCI, suggérant que ces deux phénotypes sont probablement liés.

3.3 Croissance des mutants sur des milieux révélant une faiblesse dans la paroi cellulaire

La paroi cellulaire de la levure est une structure rigide et complexe qui détermine la forme de la cellule (Cabib et al., 1982). Elle est constituée de deux

classes de polysaccharides: les polymères de mannoses (les mannoprotéines), et les polymères de glucose (les glucanes). Les mannoprotéines et les glucanes se trouvent en quantités équivalentes. Un troisième polymère de sucre de N- acétylglucosarnine, la chitine, est présent seulement dans une faible proportion (Cabib et al., 1982). Toutefois, une délétion des gènes codant pour les chitines synthases est létale, illustrant le rôle essentiel de la chitine pour la croissance de la levure (Shaw et al., 1991).

Trois gènes désignés CHS 1, CHS 2, C H S 3 , codent pour les chitines synthases (Chsl, Chs2, C h 3 respectivement) nécessaires pour la synthèse de la chitine dans S. cerevisiae (Choi et al., 1994; Nagahashi et al., 1995). Chacune d'elles exerce une fonction spécifique. Dans tous les cas, les produits g6nétiques existent sous forme de zymogène, précurseur d'enzyme qui nécessite une activation protéolytique (Cabib et al., 1982; Choi et al., 1994; Nagahashi et al., 1995). Puisque certains mutants sex semblent présenter un défaut de

maturation protéolytique, il est plausible de penser que l'activation de l'une ou l'autre de ces chitines synthases soit perturbée, ce qui entraînerait possiblement un défaut de paroi cellulaire. Afin de vérifier cette hypothèse, des tests de aoissance sur des milieux qui révèlent la fiagilité de la paroi cellulaire ont été effectués-

3.3.1 Sensibilité des mutants au Calcofluor White

La drogue qui a été utilisée, le Calcofluor White (CFW), possède une forte affinité pour la chitine (Roncero et al., 1988; Ram et al., 1994). Cette drogue interfère avec l'assemblage normal de la paroi cellulaire. L'idée était que les cellules ayant une paroi cellulaire affaiblie ne supporteraient pas une désorganisation additionnelle de la paroi cellulaire causée par une telle drogue, ce qui résulterait en une létalité à des concentrations de CFW ou le type sauvage serait encore viable (Rarn et al., 1994).

La sensibilité des mutants au CFW (CFWs) a donc été évaluée sur un

milieu YPD supplémenté avec diverses concentrations de CFW. La croissance de tous les mutants, à l'exception de B3-1, était affectée à une concentration de 0,4 m g / d de CFW; tandis que la souche parentale était capable de croître en présence d'une concentration de 02 m g / d (Figure 20). On notait toutefois la présence de plusieurs colonies isolées chez la plupart des mutants. Ces colonies représentent posssiblement des révertants ou pseudorévertants. Les mutants B3-4 et B7-2 semblent être plus sensibles à cette drogue (selon d'autres résultats non présentés). La souche parentale ainsi que tous les mutants étaient inhibés à des concentration de 1,O et 1,5 mg/rnl de CFW. Ces résultats suggèrent que les mutants sex (sauf B3-l), mais plus particulièrement les mutants B 3 4 et 87-2, possèdent une paroi cellulaire fragile.

3.3.2 Sensibilité des mutants à la zymolyase

Parmi les mutants de levure sensibles au CFW récemment caractérisés par Ram et al. (1994), et définissant 53 groupes de complémentation (mutants cwh), plus du tiers (19) montraient une hypersensibilité à la zymolyase. Celle-ci consiste en un mélange complexe d'enzymes lytiques, dont la principale étant responsable de l'hydrolyse des polymères de glucose de la paroi cellulaire aux

Figure 20: Sensibilité des mutants au CFW. Les cellules en phase stationnaire ont été

étalées sur YPD additionné de CFW O,4 mg/ml et les pétris ont été incubés pendant 3-4 jours à

30°C.

liens P-1,3. Tel que démontré par De nobel et al. (1990), le degré de sensibilité des levures au traitement par la zymolyase peut donc refléter des modifications dans la composition de la paroi cellulaire. La plupart des mutants sex étant sensibles au CFW nous avons donc testé la sensibilité de ces derniers à la

zymolyase.

Les résultats de cet essai ont révéIé qu'à l'exception des mutants B2-2 et

813-9, les mutants sex sont s i ~ c a t i v e m e n t plus sensibles à la zymolyase que la souche parentale (Figure 21). Pour les mutants B3-4, B&l, 83-1 et B3-2 la

cinétique d'hydrolyse de la paroi, telle qu'estimée par la perte d'absorbante des levures à 600 nm, était environ 2 fois plus rapide (16, 17, 18, 21 respectivement) que la souche parentale (8) alors qu'elle était - 4 fois plus rapide chez le mutant B7-2 (28); suggérant une anomalie dans la composition de la paroi cellulaire chez ces mutants.

3.3.3 Sensibilité des mutants à la caféine

L'assemblage de la paroi cellulaire est régulée par une signalisation

intracellulaire complexe impliquant une cascade de protéines homologues aux «Mitogen Activated Protein Kinase» (MAPK) chez les mammifères (Errede et Levin, 1993; Levin et al., 1994; Roemer et al., 1994; Herskowitz et al., 1995). Cette cascade de protéines kinases chez la levure est sous le contrôle du gène PKCl lequel code pour un homologue de la protéine kinase C (Levin et al., 1990). La

délétion dans n'importe quel des gènes kinases impliqués dans cette voie affecte l'assemblage de la paroi cellulaire (Irie et al., 1993; Lee et al., 1993a; Lee et al., 1992), tandis qu'une souche portant une délétion dans le gène PKCZ est létale (Levin et al., 1990). Les défauts de paroi cellulaire peuvent être remédiés par des stabilisateurs osmotiques. Il a été démontré que les mutations impliquées dans la voie de transduction du signal PKCI/MPKI (MAP Kinase) sont plus sensibles à la caféine (Posas et al., 1993; Costigan et al., 1992; Costigan et al., 1994).

Puisque nos mutants semblent posséder une déficience dans la

construction de la paroi cellulaire, leur croissance comparée à celle de la souche parentale a été analysée en présence des concentrations variées de caféine. Les résultats ont démontré que seuls les mutants B3-2 et B7-2 présentent une

Temps d'incubation (min)

Figure 21: Sensibilité des mutants sex à la zymolyase. Les cellules ont été incubées en

présence de la zymolyase 1ûû T à 20 pg /d , à une DO. 600 - de 1 unité/ml, dans un d e u YPD.

La diminution de la D.O. a été suivie à une intervalle de 10 mutes. Les échantillons ont été

réalisés en duplicata.

sensibilité accrue à la caféine, t d e que testée à 5,7 (Figure 22) et 6,6 mM de caféine (résultats identiques non présentés).

De plus, l'hypersensibilité à la caféine de ces mutants était réversible et pouvait être supprimée en présence de stabilisateurs osmotiques tels que le sorbitol 1 M, NaCl 0,5 M et le galactose 1 M (Figure 22). Ces résultats suggèrent que la déficience dans l'ulh'astructure de la paroi cellulaire telle que révélée par les tests de sensibilité au CFW et à la zymolyase pour les mutants B3-2 et 87-2 pourrait être due à un défaut dans la voie de signalisation intracellulaire, régulée par PKCI.

3.4 Morphologie des mutants sex

Les mutants de paroi cellulaire sont souvent associés à une morphologie aberrante (anormale) des cellules. Pour renforcer l'hypothèse voulant que certains mutants sex aient une paroi cellulaire déficiente, les cellules en phase exponentielle de croissance ont été examinées au microscope à contraste de phase. L'analyse microscopique a démontré que la plupart des mutants affectés dans la structure de la paroi cellulaire présentent une différence morphologique (Figure 23) comme l'ont révélée les essais précédents, . E n

effet, la paroi cellulaire des mutants 03-1, B3-4 et Bû-1 semblait être plus dense (plus foncée) et mieux délimitée que celle de la souche parentale. Les mutants B3-2 et B7-2 présentaient une caractéristique morphologique plus marquée. Alors que les cellules de 83-2 étaient regroupées en agrégat, suggérant un défaut dans la séparation cellulaire; celles de 87-2 étaient beaucoup plus grosses et semblaient posséder un cytoplasme plus dense, comparativement aux cellules de la souche parentale. Cependant, les mutants B2-2 et 813-9 dont le degré de sensibilité à la zymolyase était comparable à la souche parentale, montraient une morphologie cellulaire normale.

caféine 5,7 mM

caféine 5 7 mM + sorbitol 1 M

caféine 5,7 mM + NaU O,5 M caféine 5,7 mM + galactose 1 M

Figure 22: Sensibilité des mutants à la caféine et récupération de la croissance en présence

de stabilisateurs osmotiques. Les cultures en phase stationnaire ont été striées sur YPD

supplémenté avec les différents composés dont les concentrations sont indiquées. Les pétris ont été

incubés durant 3-4 jours à 30°C.

Figure 23: Morphologie de la souche parentaie (A) et des mutants affectés dans la

maturation protéolytique. (B) 82-2, (C) 83-1, (D) 83-2, (E) B3-4, (F) 87-2, (G ) B8-1, (H) 813-9.

Les cellules en phase exponentielle de croissance à 30°C dans un d e u YPD, ont été

photographiées au microscope à contraste de phase.

3.5 Analyse de la glycoprotéine Yap3

Yap3, l'endoprotéase responsable de la maturation du précurseur hétérologue au site monobasique, est une protéine largement glycosylée au cours de son transport (du RE) jusqu'à la membrane plasmique. Cette modification post-traductionnelle représente un marqueur pour la localisation de cette enzyme. Afin de vérifier l'hypothèse selon laquelle le transport de

Yap3 serait affecté résultant en une mauvaise localisation de la protéine, l'état de glycosylation de celle-ci a été analysé chez les mutants et la souche parentale. À cette fin 30,8 pg d'extraits protéiques de chacune des souches ont été incubés avec l'endoglycosidase H, une enzyme qui dive de façon spécifique les chaînes d'oligosaccharides N-liées, entre les résidus GlcNAc, réduisant ainsi le poids moléculaire apparent de la protéine; avant d'être analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. Suite au transfert électrophorétique, l'endoprotéase Yap3 a été détectée parmi les extraits protéiques par immunodétection à l'aide de I'anticorps anti-Yap3. Une bande de 68 kDa a été obsemée aussi bien chez les mutants que chez la souche parentale (Figure 24A). Yap3 est donc exprimée chez tous les mutants. En revanche aucune bande n'a été révélée avec la souche contrôle YBADl (YBAD1: YAP3::HIS3) où le gène YAP3 a été délété.

Lorsque les extraits protéiques n'ont pas été traités avec llEndoglycosidase H, une bande diffuse de poids moléculaire d'environ 160 kDa a été détectée dans tous les cas sauf chez la souche YBADl (Figure 24B). L'hétérogénéité dans le poids moléculaire observée chez tous les mutants résulte du phénomène d'hyperglycosylation de l'endoprotéase Yap3. Ainsi Yap3 est hyperglycosylée chez tous les mutants et par conséquent est transportée jusqu'à la membrane plasmique.

Comme la concentration d'extraits protéiques qui a été déposée dans chaque puits pour chacun des mutants était équivalente, la différence observée dans l'intensité de la bande de 83-2 est probablement due à une plus faible expression de l'endoprotéase chez ce mutant. Cependant, cette hypothèse devra être approfondie davantage en faisant d'autres tests quantitatifs.

Figure 24: Immunodétection de L'endoprotéase Yap3. 30,8 pg des extraits ceildaires

totaux ont été incubés avec (+) ou sans (-) Endo H avant I'analyse par éIectrophorèse sur un gel de

polyacryiamide SDS de 7%. Suite a un transfert sur filtre de nitroceiiulose, la glycoprotéine

Yap3 a été imrnunodétectée par L'anticorps anti-Yap3. Les colo~es 1 à 9 représentent dans l'ordre:

1) DS7; 2) B2-2; 3) B3-1; 4) B3-2; 5) B3-4; 6) B7-2; 7) B8-1; 8) B13-9 9) YBAD1 (Yap3::HiS3,

contrôle négatif).

3.6 Récessivité des phénotypes et établissement des groupes de complémentation

3.6.1 Dominance et récessivité des mutations sex

Pour établir le nombre exact de gènes sex mutés dans notre collection de mutants (i.e le nombre de groupe de complémentation), nous avons d'abord confirmé le caractère récessif des phénotypes associés à ces derniers. Puisque le défaut de maturation de la protéine chimérique est spécifique aux cellules haploïdes de type a, d'autres caractères phénotypiques pour l'analyse de ces mutants ont été utilisés. Comme la CFWs favorise la sélection de révertants ou pseudorévertants, ce phénotype a été écarté. Nous avons choisi d'utiliser les phénotypes plus facilement observables, comme la croissance. Nous avons retenu les trois phénotypes suivants: i) croissance sur glycérol; ii) croissance en milieu hypertonique et; iii) croissance en présence de caféine. La dominance a

été déterminée en examinant les phénotypes des diploïdes hétérozygotes sex/SEX résultant du croisement des mutants haploïdes MATa avec la souche parentale DS7 MATa, sur les différents milieux mentionnés ci-dessus.

La sensibilité à la caféine observée chez le diploïde hétérozygote B7- 2/DS7 sex/SEX indique que la mutation de 87-2 est dominante (Figure 25A). Toutefois la dominance de cette mutation dépend des conditions du milieu puisque le diploïde hétérozygote pouvait croître partiellement sur un milieu synthétique complet en présence de la caféine (Résultat non présenté).

D'autre part la sensibilité au NaCl (NaCls) et l'inhibition de croissance en présence du glycérol (Glyc-) des hétérozygotes B3-1/DS7 et B3-4/DS7 (Figure 258

et C) pouvaient nous laisser croire que ces deux phénotypes étaient dominants. Cependant, le fait que certaines mutations mitochondriales (rho-) sont suppressives et se comportent de façon dominante dans les croisements avec une souche de type sauvage (voir section 3.5.2.2), n'ont pas permis de conclure avec certitude la dominance dans ces souches. Il est important de noter que les résultats de croissance obtenus avec les diploïdes hétérozygotes ainsi que les mutants haploïdes en présence du glycérol étaient identiques à ceux obtenus sur un milieu contenant du NaCl; suggérant ainsi un lien entre ces deux phénotypes.

€? YPD + caféine 5,7 mM

YPG YPD + NaCI 1 2 M

Figure 25: Dominance et récessivité des différents phhotypes. Une culture en phase

statio~aire des diploïdes hétérozygotes, résultant de aoisement entre la souche parentale DS7

MATa et les différents mutants MATa, a ét6 étalée sur les milieux indiqués. Les pétris ont été

incubés durant 3-4 jours à 30°C.

Tous les autres mutants sont récessifs pour les phénotypes Glyc- (inhibition de croissance sur glycérol), et NaCls (sensibilité au NaCl) (B2-2, B3-2,

B8-1, B13-9) et Cafs (sensibilité à la caféine) (83-2), comme le révèlent la croissance des diplo'ides hétérozygotes (Figure 258 et C).

3.6.2 Établissement des groupes de complérnentation

3.6.2.1 Expression des phénotypes (NaCls, Cafs et Glyc-) dans les deux

types cellulaires haploïdes

La dassification des mutants en groupes de complémentation consiste à croiser tous les mutants entre eux (MATa sex avec MATa çex) afin de générer des cellules diploïdes. Les mutants à l'étude étant issus de cellules MATa, l'obtention de ceIldes isogéniques MATa, à l'exception du locus MAT, est nécessaire. La modification du type cellulaire des mutants MATa en MATa a été réalisée en introduisant le plasmide pGAL-HO dans les lignées MATa. Les cellules haploïdes qui expriment le gène HO ont un caractère sexuel instable qui peut changer de a à a ou inversement (de a à a) presqu'à chaque division cellulaire (Herskowitz et Jensen, 1991). Ce processus peut être bloqué en transférant les cellules sur un milieu contenant du glucose (consulter la section 2.8). Les cellules MATa peuvent être identifiées en appliquant le test de conjugaison sexuel avec les deux souches «tester» MATa hisl et MATa hisl. Nous avons donc généré des lignées MATa isogéniques et vérifié que les phénotypes considérés pour l'analyse s'expriment dans les deux types cellulaires haploïdes. Les défauts de croissance des cellules haploïdes a sur des milieux contenant du NaCl, ceux des cellules haploïdes ainsi que ces phénotypes particulier .

3.6.2.2 Investigation

de la caféine et du glycérol étaient identiques avec a isogéniques (résultats non présentés), indiquant ne sont pas spécifiques d'un type cellulaire en

de l'origine du phénotype de non-croissance sur glycérol (nucléaire ou cytoplasmique)

Le défaut de croissance en présence du glycérol, indiquant une déficience dans une fonction mitochondriale, peut être dû à des mutations affectant soit le génome mitochondrial ou certains gènes nucléaires (gènes PET). Les

mutations touchant l'ADN mitochondrial (ADNmt) peuvent être soit des délétions partielles (mutants rho-), ou la perte totale du génome entier (mutants rhoo). Les souches ayant le système génétique mitochondrial fanctionnel sont dénommées rho+. Les mutations mitochondriales se produisent spontanément à une fréquence élevée, c'est-à-dire 1-2% dans certaines souches de levure en croissance (Fukuhara et Rabinowitz, 1979). Quoique les mutants rho* sont déficients dans la respiration, ils retiennent encore leurs mitochondries, bien que celles-ci soient morphologiquement anormales et non fonctionnelles. Les mutants affectés dans le génome mitochondnd montrent un mode de transmission génétique cytoplasmique et peuvent par conséquent être différenciés des mutants nucléaires, lesquels suivent la ségrégation mendélienne. Le croisement entre une souche sauvage (PET) et une souche mutante nucléaire (pet) donne un diploïde hétérozygote de

phénotype sauvage c'est-à-dire capable de respirer; les produits méiotiques de la sporulation sont deux spores de type sauvage et deux spores mutantes, soit une ségrégation mendélienne 2 PET : 2 pet (Figure 26A). Le croisement d'un mutant mitochondrial rhoo avec une souche sauvage rho+ produit une descendance diploïde de phénotype sauvage rho+, et les quatre produits méiotiques (4 ascospores) sont tous rho+ (Figure 26B). De plus, lorsque cette descendance rhof est à nouveau croisée avec le mutant rhoo La progéniture émergeante est également rho+. Par contre, le croisement entre le mutant rho- et le type sauvage peut générer des diploïdes mutants qui, suite à la méiose donne tous des ascospores de type mutant rho- (Figure 26C). La mutation rho- peut en effet se comporter de façon dominante et supprimer la fonction mitochondriale du type sauvage. Pour cette raison, les mutants rho- sont appelés mutants supresseurs. Il existe aussi des supressions partielles où une portion des diploïdes ou des spores sont mutants et l'autre, de phénotype sauvage (Lints, 1981; Ursula, 1983; Suzuki et al., 1986; Klug et Cummings, 1986).

Les mutants affectés dans le génome mitochondrial montrent donc une ségrégation cytoplasmique avec une ratio de tétrades 4:O ou 0:4 (soit 4 sauvages : O mutant ou, O sauvage : 4 mutants).

Afin de déterminer la nature du phénotype Glyc- chez les mutants, des diploïdes hétérozygotes résultant de croisement entre la souche parentale DS7 MATa et les mutants M A T a ont été construits. Après sporulation, les tétrades ont été disséquées (section 2.8.2). Les ségrégants (spores) haploïdes ont été

0 . 0 PET , pet

Zygote œ $g;; C Méiose et

sporulation

Ascospores hapIoïdes

2 PET: 2pet

zygote

" W )

Méiose et spodation

Ascospores ' haploïdes

Zygote

(,h~$,e, Méiose et

spordation

Ascospores haploïdes

Figure 26: Résultats attendus de certaines mutations affectant la fonction mitochanciriale

dans les croisements génétiques avec une souche sauvage chez S. cerevisiae. Les mutations

nucléaires (A) montrent une ségrégation mendélienne; les mutations mitochondriales neutres (B) et

supressifs (C) présentent une ségrégation cytoplasmique.

étalés sur le milieu YPG, contenant le glycérol comme source de carbone. Les diploïdes hétérozygotes B3-1/DS7 et B3-4/DS7 n'ont pu être analysés parce qu'étant incapables de respirer. Cependant, le fait que ces deux diploïdes exprimaient le phénotype mutant pourrait signifier que les deux mutants haploïdes 83-1 et B3-4 portent des mutations mitochondriales suppressives rho-.

Toutes les spores provenant du diploïde B2-2/DS7 (20) peuvent croître sur YPG (Tableau VI). Cependant, aucun asque n'a domé quatre spores viables après la dissection, rendant toute condusion ixmossible.

Pour chacune des 2 tétrades hétérozygote B3-2/DS7, seulement indiquant spores ou croître sur nucléaire.

une ségrégation 2:2. De

complètes obtenues à partir du diploïde deux spores pouvaient croître sur YPG, plus, parmi les autres asques contenant 3

2, il y avait toujours au moins un ségrégant qui était incapable de YPG (Tableau W) indiquant que la mutation dans 83-2 est d'origine

Bien qu'aucune tétrade complète n'a été obtenue à partir du diploïde B8- 1/DS7, la croissance de tous les ségrégants haploïdes provenant surtout des asques ayant 3 spores (soit 4 asques de 3 spores) (résultats non présentes) permettait de déduire que le phénotype Glyc- est d'origine cytoplasmique.

Par ailleurs chacune des 5 tétrades complètes examinées chez le mutant B13-9 a toujours montré une ségrégation 2:2 du phénotype Glyc- (Tableau VIII), indiquant que la mutation dans ce mutant causant la perte d'une fonction mitochondriale provient d'un seul gène localisé dans le génome nucléaire.

3.6.2.3 Tests de complémentation

Des tests de complémentation, permettant d'établir le nombre de gènes sex mutés différents, ont été effectués avec des souches diploïdes résultant de croisements entre chacun des mutants portant des mutations nucléaires récessives. Ces diploïdes ont été testés pour la croissance sur les milieux glycérol, NaCl, caféine et LiCl. Si le diploïde hétérozygote exprime le phénotype mutant, nous avons conclu que les deux gènes mutants sont

alléliques. À l'inverse, la perte du phénotype mutant indique la complémentation suggérant que les deux mutants ne sont pas affectés dans le même gène.

L'inhibition de croissance sur glycérol et NaCl a été observée pour les diploïdes construits à partir des cellules haploïdes B2-2, B3-2 et B13-9, que nous avons utilisées pour les tests de complémentation. Ces trois mutants ne se

complémentaient donc pas entre eux. Cependant, cette observation n'a pas permis de conclure que ces mutants étaient affectés dans le même gène et par conséquent définissaient un seul groupe de complémentation. Ceci vient du fait que la plupart des mutants PET (déficients dans la fonction mitochondriale et portant des mutations nucléaires) perdent rapidement leur ADNmt devenant ainsi des mutants cytoplasmiques, c'est-à-dire ayant le génotype pet rhoo. De ce fait, les mutants B2-2, B3-2 et 813-9 pourraient être affectés dans des gènes nucléaires différents, mais la perte de mitochondries fonctio~elles dans chacune des cellules haploïdes donnerait un diploïde de génotype petx pety/rhoor exprimant toujours le phénotype mutant. À l'appui de cette hypothèse, les mutants 82-2 et 813-9 corrigent la sensibilité du mutant 83-2 au LiCl ainsi qu'à la caféine (Tableau V). Ainsi, les mutants B2-2, 83-2 et B13-9 définiraient au moins deux groupes de complémentation distincts.

3.7 Analyse de la ségrégation des phénotypes

Il était surprenant de constater que six des sept mutants manifestaient, à

la fois, une inhibition de croissance au NaCl et glycérol. Six de ces mutants étaient également sensibles au CFW. Ces observations ont permis de formuler l'hypothèse selon laquelle il existerait une relation entre ces différents phénotypes et la maturation protéolytique.

Pour vérifier cette hypothèse l'analyse des quatre produits méiotiques, une méthode utilisée pour étudier les relations de «linkage» des gènes, a été effectuée. Les diploïdes hétérozygotes sex/S E X, issus du croisement des mutants haploïdes MATa, B2-2, B3-2, B7-2 et B13-9 avec la souche parentale

Tableau V Résultats des tests de complémentation des mutants sex

YPD + 1,5 M YPglycérol YPD + 5,7 mM YPD + O,2 M Souches

caféine LiCI

+ : Croissance

- : Absence de croissance

Noter que la construction de l'homozygote B13-9/B13-9 était impossible à obtenir, étant donné

l'incapacité de la souche haploïde à se conjuguer avec une souche .testem, même lonqu'elle

portait le plasmide p05F (exprimant le précurseur endogène).

DS7 MATa, portant le plasmide pS3C ont été construits. Suite à la spotdation, les tétrades (4 ascospores) ont été disséquées (voir section 2.8 pour plus de détails). Les diploïdes 83-1/DS7 et B3-4/DS7 n'ont pas été soumis à cette analyse à cause de leur incapacité à sporuler et à entrer en méiose. Le mutant 88-1 possédant une mutation d'origine cytoplasmique était également mis à

l'écart. Les spores haploïdes MATa ont été identifiés d'après leur incapacité à se conjuguer avec la souche .tester» MATa hisl. Cette descendance haploïde a été ensuite analysée pour la production du facteur a par les essais biologiques (décrits dans la section 2,6), et pour la croissance sur les milieux glycérol, NaCl, CFW (B3-2 et B7-2) et la caféine (B7-2). Lorsque dans une tétrade, montrant une ségrégation 2:2, les deux spores du type mutant présentent toujours tous les phénotypes mutants, on peut condure que ces phénotypes sont liés et que la mutation affecte un seul gène nudéaire.

Selon les résultats présentés dans le tableau VI les phénotypes NaCl et glycérol coségrégaient dans toutes les spores (16) issues du diploïde 82-2/DS7. Cependant, la ségrégation entre ces phénotypes et la maturation protéolytique semblait être indépendante.

L'analyse de la progéniture du diploïde B3-2/DS7 a permis de montrer que l'inhibition de croissance en présence de NaCl coségrège toujours avec l'incapacité de métaboliser le glycérol (Tableau VII). De plus, l'inhibition de

croissance sur NaCl, glycérol et CFW coségrégait dans 26 spores sur un total de 27, suggérant que ces phénotypes sont tous liés. La ségrégation indépendante d'une seule spore pourrait s'expliquer par la présence d'un pseudorévertant ou par une mutation spontanée qui a corrigé certains phénotypes (soit NaCl et glycérol). Toutefois, ces phénotypes ségrégaient de façon indépendante avec la maturation protéolytique.

Pour le diploïde hétérozygote 813-9/DS7, la coségrégation du défaut de croissance sur NaCl et glycérol n'était pas observée seulement dans une spore sur un total de 28 (Tableau Vm). Ce résultat pourrait être dû soit à une mutation spontanée qui a corrigé un des deux phénotypes dans cette spore; soit à la présence d'un pseudorévertant. Par conséquent, il laissait supposer que ces deux phénotypes sont liés. Par contre, une ségrégation indépendante de ces phénotypes et la maturation protéolytique a été observée.

Finalement, parmi les quelques spores obtenues du diploïde B7-2/DS7, les phénotypes caféine et CFW, maturation protéolytique et caféine et/ou CFW coségrégaient dans plus de la moitié des cas (Tableau IX) suggérant une ségrégation indépendante de ces phénotypes lors de la méiose.

Ahsi de cette analyse de tétrades le Lien entre les différents phénotypes et la maturation protéolytique n'a pu être établi de façon convaincante pour aucun des mutants.

Tableau VI (Suite) - - -- - -- - - - - - -- - - - -

Production Croissance sur Tétrades Spores MAT du facteur a NaCl glycéroi

Tableau VII Ségrégation des phénotypes du mutant B3-2a

Production Croissance sur

Tétrades S~ores M A T du facteur a NaCl ~lvcérol CFW

"(Suite page suivante)

Tableau W (Suite)

Tétrades Spores MAT Production Croissance sur du facteur CC NaCl glycérol CFW

Tableau VIII Ségrégation des phénotypes du mutant B13-9a

- -

Production Croissance s u r

Tétrades Spores M A T du facteur a NaCl glycérol

1 a a + + + b a + + - c a - - -

a(sui te page sui van te)

Tableau Vm (Suite)

Production Croissance sur Tétrades Spores MAT du facteur a NaCl dvcérol

Tableau IX (Suite)

Production Croissance sur Tétrades Spores MAT du facteur a Caféine CFW

DISCUSSION

Les mutants sex ont été initialement sélectiomés en raison de leur

incapacité à produire le facteur a biologiquement actif à partir du précurseur hybride, prosomatostatine /facteur a mature. YAP3, le gène codant pour

l'endoprotéase responsable de la maturation protéolytique de ce précurseur aux

sites de clivage monobasiques ne complémentait aucun de ces mutants, suggérant que d'autres gènes sont impliqués indirectement dans le processus de maturation et/ou sécrétion du facteur a mature. Pour déterminer le nombre

de gènes sex différents, le test de complémentation pour la production du facteur a mature n'a pu être effectué dans un diploïde ( M A T a / a ) , puisque la sécrétion du facteur a actif à partir du précurseur hybride est spécifique du type cellulaire haploïde a. Par conséquent des phénotypes additionnels étaient nécessaires. Le but de cette étude était d'exploiter les phénotypes assoaés aux

sept mutants sex de la classe III. Ceci permettrait de déterminer la nature

fonctionnelle des mutations sex, d'identifier la nature récessive ou dominante des mutations, définir le nombre de gènes différents mutés et, finalement

faciliter le clonage de ces gènes ultérieurement.

4.1 Effet des mutations sex sur la production du facteur a mature à partir de la protéine de fusion prosomatosta~elfacteur a mature

Dans cette étude, nous avons examiné la production du facteur a actif à

partir du précurseur hybride prosomatostatine/facteur a chez les mutants sex

de la dasse El, par les tests de zone d'inhibition de croissance et de conjugaison sexuelle. Six des sept mutants (B2-2, B3-1, B3-2, B3-4, B7-2, Bû-1) examinés sont spécifiquement affectés dans leur capacité à générer le facteur a actif mais conservent leur habilité à sécréter la phéromone du précurseur endogène contenant un site de clivage dibasique (Lys/Arg). En effet, toutes ces souches se conjuguent avec le type cellulaire opposé uniquement lorsqu'elles portent le plasmide paFF. Ces résultats suggèrent que le produit du gène KEX2 divant de façon préférentielle aux sites dibasiques (Julius et al., 1984b) est f o n c t i o ~ e l dans ces mutants. La mutation n'affecte donc pas la maturation aux sites dibasiques, ce qui n'est pas le cas pour le mutant B13-9, lequel ne se conjuguait pas avec la souche «tester» MATa hisl et générait une zone dont la taille était fortement réduite sur le tapis de cellules hypersensibles M200-6C, avec le plasmide paFF.

Puisque la maturation complète du précurseur prosomatostatine/facteur a est nécessaire pour l'activité biologique, l'absence de cette activité se traduit par une production insuffisante du facteur a et entraîne l'incapacité des mutants SPX à se conjuguer avec le type cellulaire opposé, ce qui pourrait indiquer soit un défaut de maturation ou de biosynthèse. Le fait que des formes partiellement maturées du facteur a chez les mutants 82-2, B3-1, 83-2, B3-4 et

B8-1 sont sécrétées suggère que le défaut se situe à l'étape de la maturation protéolytique. Par ailleurs, l'absence de zone d'inhibition de croissance observée chez les mutants B7-2 et 813-9 sur le tapis cellulaire M200-6C, qui permet de révéler les formes incomplètement maturées du facteur a, suggère soit un défaut plus sévère dans la maturation protéolytique ou dans la sécrétion du peptide mature. Il serait également possible qu'une perturbation dans la régulation transcriptionnelle du promoteur facteur a empêche la synthèse du précurseur hybride. Nos résultats ne permettent pas de déterminer laquelle de ces hypothèses est la bonne. Toutefois, il serait possible de les vérifier en marquant les cellules mutantes et celles de la souche parentale portant le plasmide pS3C avec du 35S042-; immunoprécipiter le facteur a du

milieu et ensuite examiner les différentes formes du facteur a immunoréactives sécrétées. Si le matériel précipité de chaque mutant migre avec le précurseur facteur a hautement glycosylé, on conclura que la déficience des mutants dans la production du facteur a actif est due à un défaut dans la maturation protéolytique. Quant à la souche parentale, eue devrait présenter dans le milieu un peptide de petit poids moléculaire. Dans le cas où aucune forme de facteur a ne serait détectée dans le milieu, il faudrait alors déterminer si ceci résulte d'un problème de sécrétion de la molécule ou de l'expression du gène hybride.

Étant donné que Ie gène YAP3 ne peut rétablir la production du facteur a chez les mutants sex, les autres gènes sex impliqués dans la maturation de ce précurseur pourraient être responsables de l'activation de l'endoprotéase Yap3. La séquence pro de Yap3 est suivie par un site potentiel de clivage (une paire de résidu Lys/Arg) (Ash et al., 1995) suggérant que l'enzyme est initialement synthétisée sous forme de zymogène, devant lui-même subir une activation protéolytique avant de devenir actif, comme c'est le cas chez la plupart des endoprotéases, incluant Kex2 (Germain et al., 1992). Pour vérifier cette hypothèse il faudrait d'abord confirmer que Yap3 nécessite réellement une activation protéolytique, et si oui, évaluer si certains des mutants sex affectent cette activation. 11 serait également important de mesurer l'activité de l'endoprotéase Yap3 dans les mutants et la souche parentale.

Nous avons montré que la protéine Yap3 est exprimée et hyperglycosylée dans tous les mutants. Chez la levure, les protéines hyperglycosylées connues sont soit des protéines sécrétées ou les mannoprotéines de la paroi cellulaire et, donc, doivent d'abord être acheminées à la membrane plasmique (Kukuruzinska et al., 1987). Yap3 serait donc transportée jusqu'à la membrane plasmique, qui est sa destination finale (Ash et al., 1995). Ceci suggère également que la protéine Yap3 a reçu le groupement glycosylphosphatidylinositol (GPI), modification essentielle pour son ancrage dans la membrane plasmique. Ainsi aucune des mutations sex ne semble affecter le transport intracellulaire de l'enzyme. Par conséquent, l'hypothèse voulant que le défaut dans la maturation du précurseur hybride résulte d'une mauvaise localisation intracellulaire n'est pas valable.

La taille des zones pour les mutants B3-2, B8-1 et B13-9 n'a pas été déterminée avec la souche AWM4, hypersensible au facteur a, et de ce fait la

production du fadeur a n'a pu être estimée. Ceci est dû à la contamination par des souches «K.ülen> de S. cmmisiae. Ces souches sécrètent une toxine qui peut être détectée par le même essai biologique utiliçé pour mettre en évidence la production du facteur a. Les souches «Killer» sont inoculées sur la surface d'un tapis de cellules sensibles. L'activité de la toxine est manifestée par une zone daire, témoignant d'un arrêt de croissance des souches sensibles, limitée par une zone de cellules mortes qui, peuvent être colorées en bleu noir par le bleu de méthylène. L'indicateur de l'activité de &iller» est la zone bleue des cellules mortes entourant la zone d'inhibition. Ceci distingue le phénomène de «Killer» de l'arrêt de croissance produit par le facteur a des cellules haploïdes a. Dans ce cas, la zone d'inhibition o b s e é e n'est pas entourée de cellules mortes, mais est plutôt limitée par des cellules exagérément ailongées, appelées «shmoos», qui peuvent facilement être observées sans aucune coloration au microscope à contraste de phase. Vu que cette morphologie aberrante était absente ou presque chez les cellules B3-2, B8-1 et 813-9, et vu l'apparence morte des cellules entourant la zone daire, nous avons déduit que

ces souches ont été contaminées par &iller». Toutefois, une fason d'éliminer l'activité de «KiUer» dans ces souches serait d'effectuer les essais biologiques d m un milieu où le pH excède 4,7, et à une température élevée, soit environ 49°C. E n effet, il a été rapporté que l'activité de &iller» est exprimée uniquement dans les conditions acides (entre 43 et 4,7), et la plupart des toxines sont rapidement inactivées à des températures supérieures à 20°C (Young, 1987).

Malgré que la taille des zones révélant la production du facteur a n'a pas pu être déterminée à cause de l'absence de <&moo», chez les mutants B3-2, B8- 1 et 813-9, l'incapacité de conjugaison de ces souches avec une souche «tester» MATa indique que le facteur a mature n'a pas été produit ou la quantité générée est insuffisante pour induire des réponses physiologiques.

4.2 Effet de I'hyperosmolarité sur les mutants sex

Plusieurs évidences incluant l'analyse génétique suggèrent que la perte de l'intégrité de la fonction mitochondriale dans un gène nucléaire chez les mutants sex, rend les cellules incapables de répondre à un stress osmotique. De plus, une souche portant une délétion partielle dans 1'ADNmt (mutant rho-), était incapable de croître sur les milieux YPG et YPD additionné de NaCl 1,5 M, tandis que la croissance de la souche parentale (souche rho+) n'était pas affectée sur ces milieux (résultats non présentés). (La souche rho- a été isolée grâce à la fréquence de mutations spontanées rho- élevée dans la culture la souche parentale en croissance). Un mutant rho- est donc incapable de croître en

présence d'une forte concentration de sel. À notre connaissance, aucun mutant de ce genre n'a été décrit antérieurement.

Lorsque les cellules de levure sont exposées à une forte osmolarité de l'environnement extracellulaire par l'addition de NaCi 0.4 M ou de sorbitol 0,6 M au milieu de croissance, elles répondent en augmentant rapidement la synthèse du glycérol intracellulaire pour ainsi augmenter leur osmolarité interne. La voie de signalisation activée en réponse à une augmentation dans l'osmolarité externe, HOG (High Osmolarity Glycerol) (Levin et al., 1994;

Herskowitz, 1995; Waskiewiu et Cooper, 1995), est semblable aux cascades de protéines kinases responsables pour les réponses aux phéromones de conjugaison chez la levure ou les facteurs de croissance dans les cellules animales. Cette voie implique au moins deux protéines kinases découvertes

récemment (Brewster et al., 1993; Errede et Levin. 1993), Hogl et Pbs2, représentant Ies homologues des «mitogen activated proteim (MM) kinases et des MAP kinases kinases respectivement, qui régulent la croissance dans les cellules animales et de levure.

À la lumière de nos résultats, il semble donc que l'intégrité de la fonction mitochondriale soit essentielle pour la réponse au stress hyperosmotique régulée par cette voie de signalisation. L'enzyme glycérol phosphate

déshydrogénase (GPD) que l'on retrouve autant dans le cytosol que dans la

mitochondrie (Lehninger, 1977), pourrait expliquer la relation entre la fonction respiratoire et le stress hyperosmotique. En effet, les cellules de levure répondent à un stress hyperosmotique en surexprimant le gène codant pour la

GPD, une enzyme essentielle danç la production du glycérol intracellulaire (Blomberg, 1995). La GPD catalyse la réduction du dihydroxyacétone phosphate en glycérol phosphate, qui est ensuite converti en glycérol par une phosphatase spécifique (Figure 27). Le glycérol phosphate pénètre dans la mitochondrie où il est oxydé à nouveau en dihydroxyacétone phosphate, par la GPD mitochondriale. Le dihydroxyacétone phosphate formé dans cette réaction diffuse hors de la mitochondrie dans le cytosol, et le cycle recommence. L'intégrité de la fonction mitochondriale joue donc un rôle important dans ce processus. On peut alors s'attendre à ce que les cellules affectées dans l'intégrité de la fonction mitochondride gardent à l'intérieur de leurs mitochondries le glycérol phosphate, empêchant ainsi la formation et/ou la sortie du dihydroxyacétone phosphate. Ce qui résulte en une cellule incapable d'augmenter sa concentration de glycérol intracellulaire et par conséquent ne croîtra pas en présence d'un stress osmotique.

4.3 Analyse fonctionnelle des mutations sex sur l'assemblage eUou la composition (structure) de la paroi cellulaire

Comme la souche parentale, les mutants sex croissent sur les milieux minimal et complexe (riche), ce qui indique que les produits des gènes sex ne

sont pas essentiels à la croissance. Cependant, six des sept mutants (B2-2, B3-2, B3-4, B7-2, B8-1, B13-9) montrent une hypersensibilité au CFW. Ce dernier se lie spécifiquement à la chitine de la paroi cellulaire de levure. Chez S. cereoisiae, la chitine est concentrée au septum séparant la cellule mère de la cellule fille. Le CFW peut donc être utilisé comme une coloration spécifique à

la chitine dans la levure pour obtenir I'information sur les mécanismes de formation et d'assemblage des polymères de paroi. Celui-ci cause un changement dans la structure de la paroi cellulaire et amplifie les effets des défauts de la paroi cellulaire (Elorza et al., 1983; Ram et al., 1994). En présence de concentration élevée de CFW, une diminution marquée dans la formation des polymères structuraux (glycane + chitine) a été détectée chez S. cereoisiae (40%) et C. albicans (80%) (Elorza et ai., 1983). Le dépôt de chitine ne semble pas être affecté de façon très significative dans les mutants puisque les observations microscopiques n'ont pas révélé de différence marquée (résultats non présentés). En effet, certaines études antérieures ont déjà suggéré que le CFW

LUS

lycérol phosphate

!:L?:El

Membrane intenie de la mitochondrie

Figure 27: Réaction impliquant la glycérol phosphate déshydrogénase. Le glycérol

phosphate est oxydé en dihydroxyacétone phosphate, soit par la GPD cytoplasmique, soit par la

GPD mitochondriaie-

ne bloque pas la synthèse de la chitine, mais inhibe probablement la formation des fibrilles dans le polymère naissant dans la paroi cellulaire de levure (Elorza et al., 1983). Le fait que les mutants B3-4 et B7-2 sont plus sensibles à ce composé que les autres mutants peut s'expliquer par un défaut plus sévère dans la paroi cellulaire, causant une plus grande perturbation. 11 se peut également qu'une légère augmentation de chitine puisse être à l'origine de la sensibilité accrue de ces mutants au CFW.

La majorité des mutants de paroi cellulaire isolés pour une sensibilité accrue au CFW, sont aussi hypersensibles à la zymolyase (Ram et a., 1994). Zlotnik et collaborateurs (1984) ont démontré que la couche externe de mannoprotéines de la paroi cellulaire, particulièrement les chaînes N- glycosylées, réduit la perméabilité de la paroi aux macromolécules, protégeant ainsi la structure des glucanes (couche interne) de l'action des glucanases,

particulièrement la 2-glucanase. Ceci est en accord avec l'observation que la majorité des mutants de paroi cellulaire ayant un faible taux de mannose sont hypersensibles à la zymolyase (Ram et a., 1994) dont l'activité principale semble être une p(1+3)-endoglucanase @Citamura et al., 1972). De plus, les mutants de délétion des mannoprotéines de la paroi cellulaire montrent une forte sensibilité au CFW, au Congo Red (un composé ayant les mêmes caractéristiques que le CFW), et à la zymolyase (Van Der Vaart et al., 1995). La sensibilité des mutants à la zymolyase observée chez les mutants 83-1, B3-2, 83- 4, 87-5 B8-1, pourrait être causée par une couche de mannoprotéines plus mince dans la paroi cellulaire. Cette diminution dans la quantité de mannoprotéines est plus sévère chez ie mutant B7-2 où la digestion de la couche de glucane par la zymolyase était plus rapide.

Les mannoprotéines de la paroi cellulaire sont des protéines sécrétées qui sont hyperglycosylées (par la N- et la O-glycosylation) et attachées aux GPI (Van Der Vaart et al., 1995). Les mutations sex pourraient affecter le transport intracellulaire de ces protéines ou une des modifications post-traductionnelles, causant ainsi une diminution dans la couche de mannoprotéines. Il serait donc intéressant de comparer la propotion de mannoprotéines de la paroi cellulaire des mutants avec celle de la souche parentale.

Par ailleurs, la sensibilité des mutants B2-2 et B13-9 uniquement au CFW, pourrait s'expliquer soit par le fait que la membrane plasmique soit devenue plus perméable au CFW, ou les mutations ont causé des changements dans l'organisation, l'assemblage de la paroi, qui ne correspondent pas à des modifications très importantes.

4.4 Rôle possible pour les gènes SEX des mutants B3-2 et 87-2 dans une voie de signalisation intracellulaire contrôlant la croissance etlou l'assemblage de la paroi cellulaire

Nous avons trouvé que les mutants 83-2 et 87-2 sont également hypersensibles à la caféine. Bien que les effets de la caféine sont pléiotropiques, ce composé est un inhibiteur bien connu de la phosphodiestérase AMPc et par conséquent, il provoque une augmentation dans la concentration

intracellulaire dfAMPc activant ainsi la protéhe kinase dépendant de 1'AMPc (protéine kinase A). On peut donc s'attendre à ce que les mutants qui possèdent une activité protéine kinase A élevée, soient hypersensibles à Ia caféine, comme c'est le cas des cellules bcyl (Costigan et al., 1992). Dans S. cereuisiae, la caféine affecte également d'autres processus cellulaires telle que la réparation de l'ADN (Zaborowska et Zuk, 1990). Plusieurs mutants impliqués dans le contrôle de la croissance et le bourgeonnement sont aussi sensibles à ce composé (Costigan et al., 1992).

Bien que les autres phénotypes caractéristiques de ces mutants n'ont pas été examinés, 87-2 ne semble pas avoir de défaut dans la formation du bourgeon (selon analyse microscopique), et le contrôle de la croissance puisqu'il forme des colonies aussi bien que la souche parentale aux températures extrêmes pour la levure. Cependant, le mutant B3-2 présente une croissance plus lente par rapport à la souche parentale, et une morphologie anormale suggérant un défaut dans la séparation du bourgeon entre la cellule mère et la cellule fille. Ce mutant pourrait donc avoir des défauts dans la voie de RAS/ AMPc. Pour confirmer cette hypothèse il faudrait vérifier si le mutant 83-2 est sensible au choc termique, un phénotype assoué aux mutants affectant la voie de signalisation régulée par RAS (Posas et al., 1993).

D'autres études ont permis de préciser la nature de la sensibilité à la caféine chez les mutants B3-2 et 87-2. En effet chez ces mutants la sensibilité à

cette drogue est réversible et peut être supprimée lorsque des stabilisateurs osmotiques (comme le NaCl, le Sorbitol) sont ajoutés dans le milieu de culture. Ces résultats suggèrent que l'inhibition de la croissance observée en présence de la caféine est liée directement ou non, à un défaut dans la maintenance de l'intégrité osmotique. Les défauts de stabilité osmotique sont aussi caractéristiques des souches de S. cereuisine où la protéine Pkcl, l'homologue de la protéine kinase C des mammifères chez la levure (Levin et al., 1990; 1992; Paravicini et al., 1992), n'est pas fonctionnelle. La délétion du gène PKCl est

létale parce qu'elle entraîne la lyse cellulaire. Ce défaut peut être supprimé en stabilisant l'osrnolarité du milieu. On a pu ainsi identifier quatre gènes fonctionnant en aval de P K C l à l'intérieur de la même voie de signalisation (Errede et Levin, 1993; Levin et al., 1994). Ces gènes, BCKl (aussi appelé S L K i ) (Lee et Levin, 1992; Costigan et al., 1992), M K K I / M K K 2 (hie et al., 1993) et

MPKZ (SLT2) (Lee et al., 1993a), codent pour des protéines kinases homologues respectivement aux MAPKKK, W K K et MAPK (mitogen activated protein kinase) des cellules animales qui sont tour à tour activées en cascade par phosphorylation (Errede et Levin, 1993). La délétion de n'importe quel de ces gènes résulte en une incapacité de croissance à 37°C due à la lyse cellulaire, ce qui a permis d'établir que ces gènes agissent en aval de PKC1 dans la voie de signalisation. Le fait que le mutant 87-2 ne lyse pas à 37OC pourrait suggérer que le gène muté ne fonctionne pas à l'intérieur de la voie de PKCI. Cependant, l'inhibition de la croissance du mutant B7-2 par de faible concentration de caféine tel qu'observée pour les mutants de déIétion slkl et m p k l , suggère un rôle, même indirect, pour le gène SEX de ce mutant dans cette voie. La sensibilité du mutant 87-2 à ce composé n'est pas une évidence directe de la participation du gène SEX dans la voie régulée par PKCI. Néanmoins, le rétablissement de la croissance en présence de stabilisateurs osmotiques, de même que la morphologie anomale de ce mutant, le défaut danç la composition de la paroi cellulaire, sont certainement en accord avec un rôle dans la voie de PKCZ, qui contrôle l'assemblage de la paroi cellulaire. Donc ce gène S EX pourrait soit fonctionner sur la branche bifurquée de PKCl (étant donné son phénotype de croissance beaucoup moins sévère), ou intervenir de façon indirecte à n'importe quel niveau de cette voie, plus particulièrement à

la f in au niveau de MPKI, comme cela a été proposé pour les gènes redondants PPZ1/2 (Lee et al., 1993b) (Figure 28A). Les gènes, PPZ1/2 , récemment découverts, codent pour une paire de protéines phosphatases reliées au type 1 (Lee et al., 1993b). PPZ2 peut supprimer les défauts de lyse dans n'importe quels composants de protéines kinases de la voie, incluant PKCI. La délétion des deux gènes entraîne un défaut de lyse cellulaire dépendant de la température qui est très semblable à celui observé pour les composants de la voie de PKCI.

Une demière possibilité: le gène ÇEX de B7-2 pourrait correspondre soit au gène NHP6A ou NHP6B (Figure 28B) qui sont des facteurs de transcription activés par cette voie. Le gène SEX pourrait être le maillon manquant pour les modèles proposés par Costigan et ses collaborateurs (1994) (Figure 28B). Cependant, d'autres études devront être réalisées pour confirmer l'une ou l'autre de ces hypothèses. Il faudra donc attendre le clonage du gène SEX de B7- 2 par complémentation de la sensibilité à la caféine et vérifier si ce gène peut corriger les défauts de stabilité osmotique des mutants de cette voie d'une

PKCI

SEX ? BCKl

MKK1/2

BCKl (SLKI)

MPKl (SLT2)

X- SEX? 4 \

?

SEX?

Figure 28: Modèles possibles pour l'interaction du gène SEX de 87-2 avec la voie de

transduction du signal médiée par PKCI.

part, et selon le cas, établir le site d'action de ce gène dans la voie régulée par PKCI,

4.5 Analyse des tests de complémentation

L'analyse de complémentation consiste à examiner des souches diploïdes construites à partir de deux mutants haploïdes qui possèdent le même phénotype mutant. Si le diploïde exprime le caractère mutant et si les deux gènes mutés sont récessifs, ces gènes sont donc alléliques; les mutations sont dans des gènes qui contrôlent la même fonction ou, dans la plupart des cas, la même chaîne polypeptidique. Cependant, il existe certains cas où un diploïde double hétérozygote peut présenter le phénotype mutant sans que les deux mutants haploïdes soient affectés dans le même gène, ce qui complique l'analyse des tests de complémentation. L'exemple des diploïdes issus de

croisement entre deux mutants haploïdes incapables de croître en présence de glycérol, pourraît bien illustrer ce fait. En effet, les mutations dans les gènes nucléaires contrôlant l'intégrité de la fonction mitochondriale (gènes PET) entraînent la perte de 1'ADNmt (Attardi et Schatz, 1988) (mutants rhoo OU -, voir section 3.5.2.2), ce qui produit une cellule dépourvue de mitochondries fonctionnelles (ayant le génotype pet rhoo OU -). De ce fait, les croisements entre deux souches déficientes dans l'intégrité de la fonction mitochondriale et ayant deux mutations nucléaires dans deux gènes différents (par exemple pefx et p e b ) peuvent générer un diploïde double hétérozygote (petx/pety ) exprimant le phénotype mutant. Malgré que chaque souche compense pour le défaut de l'autre, la perte de mitochondries fonctionnelles dans le diploïde rend la cellule toujours incapable de croître en présence du glycérol. Ceci s'applique certainement pour l'analyse des tests de cornplémentation entre les mutants B2-2, B3-2 et B13-9, et explique pourquoi il est impossible de définir des groupes de complémentation avec ces mutants sur la base de la croissance sur glycérol et NaCI. Néarnoins, la croissance en présence de LiCl a permis de définir un groupe de complémentation avec B3-2. L'établissement des groupes de complémentation avec les autres mutants serait également possible en utilisant d'autres phénotypes, en paticulier la CFWs. En effet, ce phénotype a été écarté lors des analyses de complémentation à cause de la faible solubilité du CFW qui amenait la précipitation dans les géloses, et semblait favoriser la sélection de

pseudorévertants. Maintenant que les conditions de croissance en présence de cette drogue sont mises au point, on peut envisager d'utiliser ce phénotype.

La nature semi-dominante de la sensibilité à la caféine de B7-2 permettra aussi de le dasser en groupe de complémentation. Cependant, déjà plusieurs évidences suggèrent que ce mutant définit un groupe de complémentation distinct. Ses caractéristiques morphologiques et de croissance se distinguent des autres mutants; et un croisement de 87-2 avec chacun des mutants sex permet de restaurer Ia croissance de ces derniers sur glycérol et NaCI.

Finalement, le test de complémentation pour la sécrétion du facteur a à

partir de la protéine de fusion ne pouvant être effectué dans un hétérozygote M A T a / M A T a (parce que les souches avec cette configuration du locus MAT sont incapables de produire le facteur a), rend toujours impossible l'utilisation de ce phénotype pour établir des groupes de complémentation. Cependant, des évidences indirectes suggèrent que la mutation est différente dans la plupart des mutants. En effet, les mutants présentent des caractéristiques distinctes en ce qui concerne la production du facteur a: la taille des zones diffère d'un mutant à l'autre; certains mutants semblent être affectés dans la maturation protéolytique, d'autres dans la biosynthèse; et dans le cas de B13-9 le défaut de maturation ne semble pas être spécifique au site de clivage monobasique. De plus, Yap3, l'endoprotéase responsable de la maturation du précurseur hybride, corrigeait seulement le défaut de B3-4 et ce, uniquement Lorsqu'exprimé en plusieurs copies.

4.6 Analyse des produits méiotiques

Nous avons disséqué les tétrades des diploïdes sporulés de B2-2/DS7,83- 2/DS7, B7-2/DS7, 88-1 /DS7 et B13-9/DS7. Les tétrades complètes viables obtenues étaient très rares et même absentes chez certains diploïdes, particulièrement 82-2/DS7 et B7-2/DS7. Chez S. cereuisiae, le nombre de spores par asque varie de un à quatre dans une culture sporulée; rarement des asques de cinq spores sont présents. Les résultats obtenus pourraient laisser croire que les asques sélectionnés pour la dissection contenaient moins de quatre spores. Or, ceci serait presqu'impossible dans la majorité des cas,

puisque des asques de quatre spores ont toujours été identifiés minutieusement et les spores individuelles déposées à une distance d'environ 10 mm ont été très bien visualisées. Une des hypothèses pouvant expliquer pourquoi le nombre de spores viables dans une tétrade est si faible serait que les gènes SEX sont reliés à la viabilité des spores.

Toutefois, certains détails techniques pourraient également expliquer la faible viabilité des spores. D'abord, il est possible que même dans des cas très rares, deux spores soient déposées au même endroit. Il est possible également que la concentration en zymolyase utilisée pour la digestion des asques soit trop élevée pour ce genre de mutants; de même que la durée de digestion soit trop longue. En effet, un traitement prolongé à cette enzyme peut quelquefois diminuer la viabilité des spores (Sherman et Hicks, 1991). Vu que la plupart de nos mutants haploïdes sont sensibles à la zymolyase, la séparation des

ascospores pourrait être effectuée suite à l'éclatement la paroi de l'asque avec une microaiguille, comme cela a été suggéré pour des souches qui sont particulièrement sensibles aux traitements d'enzymes (Sherman et Hicks, 1991). Cependant si la zymolyase affecte au moins en partie la viabilité des spores chez nos mutants, le cas de B2-2, résistant à ce traitement d'enzyme et présentant très peu de spores viables reste inexpliqué.

Finalement, une dernière hypothèse serait que la progéniture haploïde héritant la paroi cellulaire fragile ne supporte pas l'effet de la micromanipulation et par conséquent perd leur viabilité.

Les résultats de l'analyse des produits méiotiques ont permis de montrer qu'une déficience dans l'ntégrité de la fonction mitochondriale était associée à

l'intolérance à un stress osmotique (sensibilité au NaCI), chez toutes les souches à l'étude, et ceci aussi bien pour les mutations nucléaires que mitochondriales. Par ailleurs, un seul gène semble responsable d'une déficience dans la composition de la paroi cellulaire (révélée par la CFWs), de l'incapacité de croissance en présence de NaCl et de la perte de l'intégrité de la fonction mitochondriale dans le mutant 83-2. Il faudra tester également les autres phénotypes (tels que caféine, LiC1, de même que la morphologie anormale) de B3-2 afin de vérifier s'ils sont liés aux phénotypes précédents. Les mutants déficients dans l'assemblage de la paroi cellulaire et sensibles au CFW,

qui ont été décrits jusqu'à maintenant, n'ont pas été testés pour l'iricapacité à

croître sur des milieux contenant du NaCl ou du glycérol.

D'autre part, il ne semble pas exister de relation entre la maturation protéolytique et les phénotypes testés lors de l'étude de ségrégation réalisée sur quatre des mutants sex. Dans le cas des mutants 82-2 et 813-9 les phénotypes testés ont tous été reliés à l'intégrité de la fonction mitochondriale. Puisque l'origine de la perte de cette dernière (nucléaire ou cytoplasmique) chez le mutant B2-2 n'a pu être déterminée, il nous a été impossible de condure si plus d'une mutation nucléaire est présente chez ce mutant. Chez le mutant B13-9, la ségrégation 2:2 des spores pour la croissance sur glycérol indique clairement que la déficience dans l'intégrité de la fonction rnitochondriale est d'origine nudéaire, tout comme chez le mutant B3-2. Le fait que la production de facteur a ne soit pas liée à la croissance sur glycérol dans six spores de type a sur 13, soit environ 50% des spores, suggère donc fortement que chez ce mutant ces phénotypes originent de deux mutations nucléaires distinctes. II sera certes, intéressant de vérifier si la CFWs coségrège avec l'un ou l'autre de ces phénotypes (voir ci-contre).

Chez le mutant B3-2, qui montre plusieurs déficiences, la CFWç semble liée à la mutation nucléaire affectant la croissance sur glycérol et NaCI, mais non à la production de facteur a. Près de 50% des spores de type a (7/17) présentent en effet une production de facteur a qui n'est pas en relation avec la sensibilité au CFW, suggérant également la présence de plus d'une mutation nucléaire chez ce mutant. Ce résultat est plutôt é t o ~ a n t compte tenu que six des sept mutants présentent une sensibilité accrue au CFW. Il est en effet statistiquement hautement improbable que deux mutations indépendantes, l'une affectant la maturation protéolytique et, l'autre la paroi cellulaire, se retrouvent simultanément chez la plupart des mutants sex. Une explication

pour ce phénomène serait que parmi les mutants sex certaines mutations qui affectent l'assemblage et/ou la composition de la paroi cellulaire auraient des répercussions sur la stabilité des plasmides multicopies dans la cellule. Le nombre de copies du plasmide pS3C influence en effet grandement la production de facteur a bien qu'une seule copie du plasmide soit nécessaire pour corriger l'auxotrophie de la souche pour le tryptophane. La variation du nombre de copies dans la cellule et non un défaut de maturation protéolytique,

pourrait donc pour certains mutants, dont 83-2 être à l'origine de la nature aléatoire de ségrégation de ce phénotype. Il est également possible qu'une transmission inégale du plasmide pS3C lors de la méiose soit, du moins en partie, responsable de l'absence de zones dans des spores apparemment normales pour les autres phénotypes.

Pour le mutant B7-2, bien que la coségrégation de tous les phénotypes n'était pas parfaite, une faible proportion de spores (2/17) présentait l'un ou l'autre des phénotypes suivants: absence de zone et sensibilité à la caféine. Par ailleurs, des proportions similaires étaient observées entre la CFWs et l'absence de zone ou la CAFs; donc des proportions relativement éloignées de celle attendue (50%) pour la ségrégation de deux gènes situés soit sur différents chromosomes ou éloignés l'un de l'autre sur le même chromosome. La faible viabilité des spores de ce mutant et l'observation qu'une grande majorité des spores viables (13/14) présentent un phénotype sauvage pour la CFWs ou à la CAFs nous suggèrent que certaines spores viables présentent des

pseudoréversions. Des mutations extragéniques spontanées corrigeant l'un ou l'autre des phénotypes expliqueraient en effet la coségrégation imparfaite des phénotypes.

Toutefois, la meilleure faqon de confirmer l'absence de lien entre ces phénotypes consiste à cloner un gène par complémentation génétique d'un des phénotypes et tester la correction des autres phénotypes en introduisant le gène

cloné dans la souche portant une délétion pour ce gène. La correction de tous les phénotypes par le gène cloné sera une preuve directe que toutes les mutations sont attribuables à un seul gène et qu'un défaut de maturation protéolytique entraîne nécessairement des phénotypes additionnels.

CONCLUSION

Les données rapportées dans cette étude montrent que les mutants sex,

incapables de maturer ou synthétiser le précurseur hybride prosomatostatine/facteur a mature, sont affectés dans plusieurs autres fonctions cellulaires incluant: 1) la vitesse de croissance (B2-2, B3-1, B3-2, 83-4, 88-1 et B13-9); 2) l'assemblage et/ou la composition de la paroi cellulaire (82-2,

B3-1, 83-2, 83-4, 87-2, B8-1 et 813-9); 3) la voie de signalisation intracellulaire médiée par PKCl (87-2); 4) la tolérance à un stress osmotique (NaCl) (B2-2,834, B3-2, B3-4, 88-1 et 813-9) et; 5) le métabolisme du glycérol comme source de carbone (E32-2, B3-1, B3-2,83-4,88-1 et 813-9). Nos études ont également mis en évidence que la réponse à un stress osmotique requiert l'intégrité de la fonction mitochondriale. Nous avons montré la récessivité des mutations causant l'inhibition de croissance sur glycérol et NaCl chez la plupart des mutants, et la semi-dominance de la CAFs chez 87-2. L'utilisation des principaux phénotypes de NaCls et de Glyc-, génétiquement Liés, n'a pas permis de déterminer le nombre exact de gènes SEX mutés (c'est-à-dire le nombre de groupe de complémentation) dans la collection de sept mutants. D'autre part, aucun fien direct n'a pu être établi entre la maturation protéolytique et les autres fonctions cellulaires par les analyses génétiques. Seul le donage des gènes SEX, par complémentation génétique d'un des phénotypes, permettra de poursuivre la caractérisation approfondie des mutants sex. En effet, l'identification des gènes

apportera une meilleure connaissance sur la nature et la fonction exacte des mutations sex. Le clonage de ces gènes est actuellement en cours dans ce laboratoire. Plusieurs gènes (provenant des mutants B7-2, 83-2 et 83-4) sont même déjà identifiés et caractérisés partiellement.

Nberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. et Watson, J. D. (1990) Biologie moléculaire de la cellule. Medecine-Sciences Flammarion, Paris. p. 324-325,

Ash, J., Dominguez, M., Bergeron, J. J. M., Thomas, D. Y. et Bourbonnais, Y. (1995) The yeast proprotein convertase encoded by Y A P 3 is a

glycophosphatidylinositol-anchored protein that localizes to the plasma membrane. J. Biol. Chem. 270, 20847-20854.

Attasdi, G. et Schatz, G. (1988) Biogenesis of mitochondria. Ann. Rea. Ce11 B i d . 4, 289-333.

Azarian, A. V., Wong, M., Friedman, T. C., Cawley, N. X., Estivariz, F. E., Chen, H.-C. et Loh, Y. P. (1993) Purification and diaracterization of a paired basic residue-specific yeast aspartic protease encoded by the YAP3 gene. J. Biol. Chem. 268, 11968-11975.

Ballou, C. E. (1982) Yeast cell waU and celI surface. In The rnolecular biology of the yeast Saccharomyces: Mefabolism and gene expression. (Strathern, J. N.,

Jones, E. W. et Broach, J. R. eds.), volume 2, p. 335-360. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Barr, P.J. (1991) Mammalian subtüisins: the long-sought dibasic processing endoprotease. Cell 66, 1-3.

Barthurst, 1. C., Brennan, S. O., Carrell R. W., Cousens, L. S., Brake, A.J. et Barr, P. J. (1987) Yeast Kex2 protease has the properties of a human proalbumin converting enzyme. Science 23 5, 348-350.

Bender, A. et Sprague, Jr. F. G. (1986) Yeast peptide pheromones, a-factor and a-factor, activate a common response mechanism in their target cells. Cell47, 929-937.

Berlin, V., Brill, J. A., Trueheart, J., Boeke, J. D. et Fink, G. R. (1991) Genetics Screens and Selections for Cell and Nuclear Fusion Mutants. In Methods Enzymol. (Guthrie, C . et Fink, G. eds.), volume 194, p. 774-792. Acadernic Press, California-

Blomberg, A. (1995) Global changes in protein synthesis during adaptation of the yeast Saccharomyces cereoisiae to 0.7 M NaCI. 1. Bacteriol. 177, 3563-3572.

Bourbonnais, Y., Bolin, D. et Shields, D. Secretion of somatostatin by Saccharomyces secreoisiae. (1988) J. Biol. Chem. 263, 1534245347.

Bourbo~ais , Y., Germain, D., Latdiinian-Sadek, L., Boileau, G. et Thomas, D. Y. (1991) Prohormone processing by yeast proteases. Enzyme 45,244-256.

Bourbonnais, Y., Danoff, A., Thomas, D.Y. et Shields, D. (1991) Heterologous expression of peptide hormone precursors in yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 13203-13209.

Bourbonnais, Y., Ash, J., Daigle, M. et Thomas, D.Y. (1993) Isolation and

characterization of S. cerevisiae mutants defective in somatostatin expression: doning and hc t iona l role of a yeast gene encoding an aspartyl protease in precursor processing at monobasic deavage sites. Embo J.12,285-294.

Bourbonnais, Y., Germain, D., Ash, J. et Thomas, D. Y. (1994) Cleavage of prosomatostatins by the yeast Yap3 and Kex2 endoprotease. Biochimie (Paris) 76,226-233.

Brakch, N., Boussetta, H., Rholam, M. et Cohen, P. (1989) Processing endoprotease recognizes a structural feature at the cleavage site of peptide prohormones. J. Biol. Chem. 264, 15912-15916.

Brewster, J. L., De Valoir, T., Dwyer, N. D., Winter, E. et gustin, M. (1993) An osmosensing signal transduction pathway in yeast. Science 259, 1760-1763.

Bussey, H. (1988) Proteases and the processing of precursors to secreted proteins in yeast. YEAST4,17-26.

Cabib, E., Roberts R et Bowers, B. (1982) Synthesis of the yeast c d wall and its regdation. Ann. Ren. Biochem. 51, 763-793.

Cawley, N. X., Noe, B. D. et Loh, P. Y. (1993) Purified yeast aspartic protease 3

cleaves anglerfish pro-somatostatin 1 and II at di- and monobasic sites to generate somatostatin-14 and -28. FEBS Lett. 332,273-276.

Chan, R. K., Melnick, L. M., Blair, L. C. et Thomer, J. (1983) ExtraceIIdar suppression allows mating by pheromone-deficient sterile mutants of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 155, 903-906.

Choi, W.-J., Sburlati, A. et Cabib, E. (1994) Chitin synthase 3 Crom yeast has zyrnogenic properties that depend on both the CAL1 and the CAL3 genes. Proc. Nafl. Acad. Sci U. S. A. 91. 4727-4730.

Costigan, C., Gehrung, S. et Snyder, M. (1992) A synthetic lethal screen identifies SLK1, a novel protein Kinase homologue implicated in yeast ceU morphogenesis and cell growth. Mol. Cell. Biol. 12, 1162-1178.

Costigan, C., Kolodrubftz, D. et Snyder, M. (1994) NHP6A and NHP68, which encode HMG1-like proteins, are candidates for downstream components of the yeast SLT2 mitogen-activated protein kinase pathway. Mol. Cd . Biol. 14, 2391- 2403.

Darnell, J., Lodish, H. et Baltimore, D. (1986) Molecular Ce11 Biology, p. 948. eds. Sûentific American Book, New York.

Darnell, J., Lodish, H. et Baltimore D. (1993) Biologie moléculaire de la cellule. p. 639-680. Scientific Arnerican Book 2nd edition.

De Nobel, J. G., Klis, F. M., Priem, J., Munnik, T. et Van Den Hende, K. (1990) The glucanase-soluble mannoproteins limit ce11 wall porosity in Saccharomyces cerevisiae. Yeas f 6, 491-499.

Devi, 1. (1991) Consensus sequence for processing of peptide precurseurs at monobasique sites. FEBS Mt. 280, 189-194.

Dmochowska, A., Dignard, D., Henning, D., Thomas, D. Y. and Bussey, H. (1987). Yeast K E X l gene encodes a putative protease with a carboxypeptidase B- lïke function involved in m e r toxin and a-factor precursor processing. Cell

50,573-584

Douglas, J., Civelli, O. et Herbert, E. (1984) Polyprotein gene expression: generation of diversity of neuroendocrine peptides. Annu. Reu. Biochem. 263,

665-715

Egel-Mitani, M., Flygenring, H. P. et Hansen, M. T. (1990) A novel aspartyl protease allowing Kex2-independent Mfor propheromone processing in yeast. Yeast. 6, 127-137.

Elorza, M. V., Rico, H. et Sentandreu, R. (1983) Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. 1. Gen. Microbiol. 129, 1577-1582.

Elseth, G. D. et Baumgardner, K. D. (1984) Genetics. p. 318-320. Addison- Wesley Publishing Company, New York.

Englund, P. T. (1993) The structure and biosynthesis of giycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annu. Rev. Biochem. 62, 121-138.

Errede, B. et Levin, D. E. (1993) A conserved kinase cascade for MAP kinase activation in yeast. CUIT. Opin. Cell Biol. 5, 254-260.

Fenouillet, E. (1993) La N-glycosylation du WH: du modèle expérimental à

l'application thérapeutique. medecine/sciences 9, 901-906.

Fukuhara, H. et Rabinowitz. (1979) Yeast petite mutants for DNA gene amplification. In Methods enzymoL.(Fleischer, S. et Packer, eds.) volume 56, p. 154163. Academic Press, New York.

Fuller, R. S., Sterne, R. E., et Thorner, J. (1988) Enzyme required for yeast prohormone processing. Ann. Rev. Physiol. 50, 345-362.

Fuller, R. S., Brake, A. et Thomer, J. (1989a) Yeast prohormone processing enzyme (KEX2 gene product) is a Ca2+-dependant serine protease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 1434-1438.

Fuller, R. S. Brake, A. J. et Thomer, J. (1989b) Itraceliular targeting and structural conservation of a prohormone-processing endoprotease. Science 246,

482-486.

Germain, D., Dumas, F., Vernet, T., Bourbonnais, Y., Thomas, D. Y. et Boileau, G . (1992) The pro-region of the Kex2 endoprotease of Saccharomyces cereoisiae is removed by self-processing. FEBS Lett. 299,283-286.

Gierasch, L. M. (1989) Signal sequences. Biochemisty 28, 923-930.

Green, R., Schaber, M. D., Shields, D. et Kramer, R. (1986) Secretion of somatostatin Saccharomyces cerevisiae J. Biol. Chem. 261, 7558-7565.

Gluschankof, P. et Fuller, R. S. (1994) A C-terminal domain conserved in

precursor processing proteases is required for intramolecular N-terminal maturation of pro-Kex2 protease. Ernbo J. 13,2280-2288.

Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasrnids. 1. Mol. Biol. 166, 557.

Herskowitz, 1. et Oshima, Y. (1981) Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: mating type and mating-type interconversion. In The rnolecular biology of the yeast Sacchnromyces:Iife cycle and inheritance (Strathem, J. N., Jones, E. W. et Broach, J. R. eds.), volume 1, p. 181-210. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Herskowitz, 1. (1988) Life cycle of budding yeast Saccharomyces cereuisiae. Microbiol. Reviews. 52, 536-553.

Herskowitz, 1. et Jensen, R. (1991) Putting the HO gene to work: practical uses for mating-type switching. In Methods enzymol. (Guthrie, C . et Fink, G. eds), volume 194, p. 132-146. Academic Press, California.

Herskowitz. 1. (1995) Map kinase pathways in yeast: for mating and more. Ce11 80,187-197.

Hutton, J. C. (1990) Subtilisin-Iike proteinases involved in the activation of

proproteins of the eukaryotic seaetory pathway. Curr. Opin. Cell.Biol.2, 1131- 1142.

Irie, K., Takase, M., Lee, K. S., Levin, D. E., Araki, K, Matsumoto, K. et Oshima,

Y. (1993) M K K l et MKK2, which encode Saccharomyces cerevisiae mitogen- activated protein kinase-kinase homologs, function in the pathway mediated

by protein kinase C. Mol. Cell. Biol. 13, 3076-3083.

Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. et Kimura, A. (1983) Transformation of intact yeast ce& treated with alkali cations. J. Bacteriol. 153, 163-168.

Julius, D., Blair, L., Brake, A., Sprague, G. et Thomer, J. (1983) Yeast a factor is

processed from a larger precursor polypeptide: the essentiel role of a membrane-bound dipep tidyl aminopep tidase. Cell 32,839-852.

Julius, D., Schekman, R. et Thorner, J. (1984a). Glycosylation and processing of Prepro-a-Factor through the Yeast Secretory Pathway. Ce11 36, 309-318.

Julius, D., Brake, A., Blair, L., Kunisawa, R. and Thomer, J. (1984b). Isolation of the putative structural gene for the Lysine-ArginUie-cleaving endopeptidase

required for processing of yeast prepro-a-factor. Ce11 37,1075-1089.

Kaiser, C., Michaelis, S. et Mitchell, A. (1994) Methods in Yeast Genetic. p. 201- 202. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York .

Kassir,Y. et Simchem, G. (1991) Monitoring meiosis and sporulation in Saccharomyces cerevisiae. In Methods enzymol. (Guthrie, C. et Fink, G. eds.), volume 194, p. 94-110. Academic Press, California.

Kitarnura, K. et Yamamoto, Y. (1972) Purification and properties of an enzyme, zymolyase, which lyses viables yeast cells. Archi. Biochem. Biophys. 153, 403-

406.

Klug, W. S. et Cummings, M. R. (1986) Concepts of genetics, 2nd edition, p. 369- 370. Scott, Foresman and compagny, New York.

Kornfeld, R. et Kornfeld, S. (1985) Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Ann .Rm. Biochem. 45, 631-664.

Kreil, G. (1981) Transfer of proteins across membranes. Ann. Rev. Biochem. 50,317-348.

Kukuruzinska, M. A., Bergh, M. L. E. et Jackson, B. J. (1987) Protein glycosylation in yeast. Ann. Rm. Biochem. 56, 915-944.

Kurjan, J. et Herskowitz, 1. (1982) Structure of a yeast pheromone gene ma): a putative a-factor precurçor contains four tandem copies of mature a-factor. Cell 30, 933-943.

Lee, K. S. et Levin, D. E. (1992) Dominant mutations in a gene encoding a

putative protein kinase (BCKI) bypass the requirement for a Saccharomyces cerevisiae protein kinase C homolog. Mol. Cell. Biol. 12, 172-182.

Lee, K. S., hie, K., Gotoh, Y., Watanabe, Y., Araki, H., Nishida, E., Matsumoto, K. et Levin, D. E. (1993a) A yeast rnitogen-avtivated protein kinase homologue (Mpklp) mediates signaling by protein kinase C. Mol. Cell. Biol. 13, 3067-3075.

Lee, K. S., Hines, L. K. et Levin, D. E. (1993b) A pair of hctionaiiy redundant yeast genes (PPZI and PPZZ) encoding type 1-related protein phosphatases function within the PKCI-mediated pathway. Mol. Cell. Biol. 13, 5843-5853.

Lehninger (1977) Biochimie. Flammarion medecine sciences, 2nd edition, Paris.

Levin, D. E., Fields, F. O., Kunisawa, R., Bishop, J. M. et Thomer, J. (1990) A

candidate protein kinase C gene, PKC1, is required for the S. cerevisiae Cell cycle. Ce12 62, 213-224.

Levin, D. E. et Bartlett-Heubusch, E. (1992) Mutants in the S. cerevisiae PKCl gene display a cell cycle-specific osmotic stability defect. J. Cell Biol. 116, 1221- 1229.

Levin, D. E., Bowers, B., Chen, CA., Kamada, Y. et Watanabe, M. (1994) Dissecting the pro tein kinase C /MAP kinase signaling pathway of Saccharomyces cerevisiae. CelI. Mol. Biol. Research 40, 229-239.

Lints, F. (1981) Génétique p. 131-135. Office international de librairie, Paris.

Louvard, D. (1988) Mécanismes moléculaires du trafic intracellulaire: sécrétion et endocytose par récepteur. rnedecine/sciences no spécial, 6-20.

Low, M. G., et Saltiel, A. R. (1988) Structural and functionnal roles of glycosylphosphatidylinositol in membranes. Sciences, 239, 268-275.

Maioy, Stanley. (1990) Experimental techniques in bacterial genetics. Jones and Bartlett Publishers, Boston. p. 83.

Mendosas, I., Rubio, F., Rodriguez-Navaro, A. et Pardo, J. M. (1994) The protein phosphatase calcineurin is essentiel for NaCl tolerance of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 269, 8792-8796.

Meyer, D. I., Krause, E., Dobberstein, B. (1982) Secretory protein translocation across membranes-the roie of the 'dodcing protein'. Nature 297, 647-650.

Mizuno, K., Nakamura, T., Ohshima, T., Tanaka, S. et Matsuo, H. (1988). Yeast KEXZ gene encodes an endopeptidase homologous to subtilisin-like serine proteases. Biochem. Biophys. res. commun. 156, 246-254.

Mizuno, K., Nakamura, T., Oshima, T., Tanaka, S. et Matsuo, H. (1989) Characterization of KE X2-encoded endopep tidase from yeast Saccharomyces cereoisiae. Biochern. Biophyç. res. commun. 159, 305-311.

Moulard, M. et Bahraoui, E. (1995) Rôle de la maturation protéolytique des

glycoprotéines d'enveloppe virale. medecine/sciences 11, 73-80.

Nagahashi, S., Sudoh, M., Ono, N., Sawada, R., Yamaguchi, E., Uchida, Y., Mio, T., Takagi, M., Arisawa, M. et Yamada-Okabe, H. (1995) Characterization of chitin synthase of Saccharomyces cereoisiae. J. Biol. Chem. 270, 13961-13967.

Nakayama, N., Miyajima, A. and Arai, K. (1987) Common signal transduction system shared by STE2 and STE3 in haploïd cells of Saccharomyces serevisiae: cell-cycle arrest results from forced expression of STE2. Embo J. 6,249-254.

Neurath, H. (1957) The activation of zymogenes. Adv. Protein Chem. 12, 319- 386.

Neurath, H. (1989) Proteolytic processing and physiological regdation. Trends Biochem. Sci. 14, 268-271.

Neurath, H. (1991) Proteolytic Processing and Regulation. Enzyme 45, 239-243.

Octave, J.N., Macq, A.F., et Philippe, B. (1995) Le précurseur du peptide amyloïde dans la maladie d'Alzheimer. médecine/sciences 11, l2Sl-lZ59.

Olden, K., Bernard, B. A., Humphries, M. J., Yeo, T-K., Yeo, K-T., White, S. L., Newton, S. A., Bauer, H. C. et Parent, J. B. (1985) Function of glycoprotein glycans. Trends Biochem. Sci. 2, 78-80.

Opdenakker, G., Rudd, P. M., Ponting, C. P. et Dwek, R. A. (1993) Concepts and principles of giycobiology. FASEB J. 7, 1330-1337.

Orlean, P., Kuranda, M. J. et Albright, C. F. (1991) Analyse of glycoproteins from Saccharomyces cerevisiae. In Methods enzymol. (Guthrie, C. et Fink, G. eds.), volume 194, p. 682-697. Academic Press, California.

Palade, G. E. (1975) htracellular aspects of the process of protein synthesis. Science 189, 347-358.

Paravicini, G., Cooper, M., Friedli, L., Smith, D. J., Carpentier, J.-L., KIig, L. S. et Payton, M. A. (1992) The osmotic integrity of the yeast ceil requires a functional PKC1 gene product. Mol. Cell. Biol. 12, 4896-4905.

Paulson, J.C. (1989) Glycoproteins: what are the sugar chains for? Trends Biochem. Sci. 14, 272-276.

Payne, G. S. et Schekman, R. (1989) Clathrin: a role in the intracellular retention of a golgi membrane. Science 245, 13581365.

Posas, F., Casamayor, A. et Arino, J. (1993) The PPZ protein phosphatases are involved in the maintenance of osmotic stability of yeast cek. FEBS Letf. 318, 282-286.

Posas, F., Camps, M. et Anno, J. (1995) The PPZ protein phosphatases are important determinants of salt tolerance in yeast cells. J. Biol. Chem. 270,

13036-13041.

Ram, A. F. J., Wolters, A., Hoopen, R. T. et Klis, F. M. (1994) A new approach for isolating ce11 waU mutants in Saccharomyces cerevisiae b y screening for hypersensitivity to Calcofluor White. Yeast 10, 1019-1030.

Redding, K., Holcomb, C. et Fuller, R. S. (1991) Immunolocalisation of Kex2 protease identifies a putative late Golgi cornpartment in the yeast Saccharomyces cereoisiae. 1. Cell Biol. 113, 527-538.

Reneke, J. E., Blumer, K. J., Courchesne, W. E. et Thomer, J. (1988) The carboxy- terminal segment of the yeast a-factor is a regdatory domain. Cell55, 221-234.

Rholam, M., Nicolas, P. et Cohen, P. (1986) Precursors for peptide hormones share common secondary structures forming features at the proteolytic processing sites. FEBS Lett. 207,l-6.

Roemer, T., Paravicini, G., Payton, M. A. et Bussey, H. (1994) Characterization of the yeast (1-6)-B-glucan biosynthetic components, Kre6p and Sknlp, and genetic interactions between the P K C l pathway and extracellular matrix assembly. 1. Cell Biol. 127, 567-579.

Roncero, C., Valdivieso, M. H., Ribas, J. C. et Duriin, A. (1988) Isolation and Characterisation of Saccharomyces cerevisiae mutants resistant to Calcoffluor White. J. bacteriol. 170, 1950-1954.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. et Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A

laboratory manual, 2nd edition, p. 18.47-18.54. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Seidah, N. G., Day, R., Marcinkiewicz, M., Benjannet, S. et Michel, Chrétien. (1991) Mammalian neural and Endocrine pro-protein and pro-hormone convertases belonging to the subtilisin family of serine proteinases. Enzyme 45,

271-284.

Schekman, R. et Novick, P. (1982) The secretory process and yeast cell-surface assembly. In The Moleculnr Biology of the Yens f Saccharomyces: Mefizbolisrn and Gene Expression (Strathern, J., Jones, E. et Broach, J. eds.), volume 1, p. 361- 398. Cold Spring Harbor, New York.

Schekman, R. (1985) Protein localization and membrane haffic in yeast. Ann. Ra. Cell Biol. 1, 115-143.

Schwartz, T. W. (1986) The processing of peptide precursors. FEBS Lett. 200, 1- 10.

Shaw, J. A., Mol, P. C., Bowers, B., Silverman, S. J., Vadivieso, M. H., Duriin, A.,

et Cabib, E. (1991) The fonction of chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cereoisiae ce11 cycle. J. Ce12 Biol. 114, 111- 123.

Sherman, F., Fink, G. R. et Hicks, J. B. (1986) Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Sherman, F. et Hicks, J. (1991) Micromanipulation and dissection of asci. In Methods Enzymol. (Guthrie, C . et Fink, G. eds.), volume 194, p. 21-37. Academic Press, California.

Singer, M. et Berg, P. (1991) Genes & genomes, p. 190 . University Science Books, Caiifornia.

Singh, A., Chen, E. Y., Lugovoy, J. M., Chang, C. N., Hitzman, R. A., et Seeburg, P. H. (1983) Saccharomyces cereoisiae contains two discrete genes coding for the a-factor pheromone. Nucl. Acids Res. 11, 4049-4060.

Smeekens, S. P. (1993) Processing of protein precursors by a novel family of subtilisin-related mammalian endoproteases. Bio/Technology 11, 182-186.

Sossin, W. S., Fisher, J. M., et Scheller, R. H. (1989) Cellular and Molecular Biology of Neuropeptide Processing and Packaging. Neuron 2, 1407-1417.

Sprague, G. F. Jr. et Herskowitz, 1. (1981) Contxol of yeast ceU type by the mating type locus. J. Mol. Biol. 153,305-321 .

Sprague, Jr. G. F., Blair, L. C. et Jeremy, T. (1983) CeU interactions and reguiar regulation of cell type in the yeast Sacchnromyces cerevisiae. Ann. Rev. Microbiol. 37, 623-660.

Sprague, Jr. G. F., (1990) Combinatorid associations of regulatory proteins and the control of cell type in yeast. In Advances in Genetics (Scandalios, J. G., Wright, T. R. F. eds.), volume 27, p. 33-62. Academic Press, California.

Sprague, Ir. G. F. (1991) Assay of yeast mating reaction. In Methods in enzymology (Guthrie, C. and Fink, G. eds.) volume 194, p. 77-93. Academic

Press, California.

Steiner, D.F. et Oyer, P.E. (1967) The biosynthesis of insulin and a probable precursor of insulin by a human islet ce11 adenorna. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 57, 145-148.

Steiner, D. F., Smeekens, S. P., Ohagi, S., et Chan, S. J. (1992) The new enzymology of precursor processing endoproteases. 1. Biol. Chem. 267, 23435- 23438.

Suzuki, D. T., Griffiths, A,. J. F., Miller, J. H. et Lewontin, R. C. (1986) An introduction to genetic analysis third edition, p. 442-443. W. H. Freeman and Company, New York.

Thomas, G., Thome, B. A., Thomas, L., men, R. G., Hruby, D. E., Fuller, R. et Thomer, J. (1988) Yeast K E X 2 endopeptidase correctly cleaves a neuroendocrine prohormone in mammalian ce&. Science 241, 226-130.

Thorner, J. (1981) Pheromone regulation of development in Saccharomyces cerevisiae. In The molecular biology of the yeast Saccharomyces cereoisiae: life cycle and inheritance (Strathem, J . N., Jones, E. W. et Broach, J. R. eds.), volume

1, p. 143-180. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,

Thomer, J. (1988) Yeast Kex2 endopeptidase correctly cleaves a neuroendocrine

prohormone in mammalian cells. Science 241, 226-230.

Ursula, G. (1983) Genetics, third edition, p. 515-518. Saunders College Publishing, New York.

Van Der Vaart, J. M., Caro, L. H. P., Chapman, J. W., Klis, F. M. et Vemps, C. T. (1995) Identification of three mannoproteins in the cell wall of Snccharornyces cerevisiae. 1. Bacterioll77, 3104-31 10.

Vemer, K. et Schatz, G. (1988) Protein translocation across membranes. Science 241,1307-1313.

Warren, T. G. et Shields, D. (1984) Expression of preprosomatostatin in heterologouç cells: biosynthesis, posttranslational processing, and secretion of mature somatostatin. Ce11 39, 547-555.

Waskiewicz, A. J. et Cooper, J. A. (1995) Mitogen and stress response pathway: MAI? kinase cascades and phosphatase regulation in mammals and yeast. Cwr. Opin. Ce11 Biol. 7, 798-805.

Waters, M. G., Evans, E. A. et Blobel, G. (1988) Prepro-a-factor has a cleavable signai sequence. 1. Biol. Chem. 263, 6209-6214.

Whiteway, M., Hougan, L. et Thomas, D. Y. (1988) Expression MFal in MATa ce& supersensitive to a-factor ieads to self-arrest. M d . Gen. Genet. 214, 85-88.

Wiedmann, M., Kurzchalïa, T. V., Hartmann, E., Rapoport, T. A. (1987) A

signal sequence recep tor in the endoplasmique reticulum membrane. Nat u re 328,830-833.

Wilcox, C.A. et Fuller, R.S. (1991) Posttranslational processing of the prohormone-deaving Kex2 protease in the Saccharomyces cerevisiae secretory pathway. 1. CeZl Biol. 115, 297-307.

Yan, S.C.B., Grinnell, B.W., Wold, F. (1989) Post-translational modifications of proteins: some problems left to solve. Trends Biochem. Sci. 14, 264-267.

Young, T. W. (1987) Killer yeast. In The yeasfs (Rose, A. H. et Harrison, J. S. 2nd édidion), volume 2, p. 131-164. Academic Press, London.

Zaborowska, D. et Zuk, J. (1990) The effect of DNA replication on mutation of the Saccharomyces cereuisiae CDC8 gene. Curr. Genet. 17, 275-280.

Zlotnik, H., Femandez, M. P., Bowers, B. et Cabib, E. (1984) Saccharomyces cerevisiae mannoproteins form an extemal cell wall layer that determines wall porosity. 1. Bacterid. 159, 1018-1026.

APPLIED f IMAGE. lnc 1- East Main Street - -. - Rochester. NY 14609 USA -- -= Phone: 71 6/~8~-03OO -- -- - - Fm 71 W88-5989