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UNIVERSITE de MEDECINE de CRETEIL

(PARIS 12)

Année 2010

THESE

Pour le Diplôme de

DOCTEUR en MEDECINE

Spécialité : OPHTALMOLOGIE

Par

Monsieur Alexis CHASSIGNOL

Né le 29 Août 1979 à Montpellier (Hérault)

Présentée et soutenue publiquement le 22 Octobre 2010

INTERACTIONS CELLULAIRES IN VITRO DE CELLULES

CONJONCTIVALES EN LIGNEE ET DE LYMPHOCYTES ISSUS DU

SANG CIRCULANT. MODELE D’ETUDE DE LA SURFACE

OCULAIRE, IMMUNOLOGIE ET TOXICOLOGIE.

JURY :

MONSIEUR LE PROFESSEUR CHRISTOPHE BAUDOUIN (DIRECTEUR DE THÈSE)

MONSIEUR LE PROFESSEUR LAURENT LAROCHE (PRÉSIDENT DU JURY)

MONSIEUR LE PROFESSEUR BAHRAM BODAGHI

MADAME LE DOCTEUR FRANÇOISE BRIGNOLE-BAUDOUIN

MADAME LE DOCTEUR EMMANUELLE BRASNU

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Au président du jury de cette thèse, Monsieur le Professeur Laurent Laroche, pour m‟avoir

fait l‟honneur d‟accepter de présider la soutenance de cette thèse,

A mon directeur de thèse et Maître, Monsieur le Professeur Christophe Baudouin, pour votre

confiance, votre soutien et votre disponibilité sans faille,

Aux membres du jury de cette thèse, Monsieur le Professeur Bahram Bodaghi, Madame le

Docteur Françoise Baudouin et Madame le Docteur Emmanuelle Brasnu, pour m‟avoir fait

l‟honneur d‟accepter de siéger dans ce jury,

Veuillez accepter ce travail comme l‟expression de mon profond respect.

A ma femme, ma famille, mes amis et mes collègues,

Merci pour votre soutien, vos conseils, vos encouragements et votre confiance.

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TABLES DES MATIERES

I. INTRODUCTION...............................................................................................................5

II. TOXICOLOGIE OCULAIRE : EXEMPLE DU CHLORURE DE

BENZALKONIUM.............................................................................................................7

1. LES CONSERVATEURS UTILISÉS DANS LES COLLYRES EN OPHTALMOLOGIE................7

2. LE CHLORURE DE BENZALKONIUM.............................................................................8

3. CONSEQUENCES CLINIQUES : LA SURFACE OCULAIRE DES PATIENTS

GLAUCOMATEUX......................................................................................................10

III. MODES D’ETUDES DE LA TOXICITE DU CHLORURE DE BENZALKONIUM

SUR LA SURFACE OCULAIRE....................................................................................14

1. MODELES ANIMAUX.................................................................................................14

2. ETUDES CLINIQUES ..................................................................................................18

3. CHEZ L‟HOMME........................................................................................................20

4. MODÈLES CELLULAIRES...........................................................................................23

a. LES CULTURES PRIMAIRES............................................................................23

b. LES LIGNEES CELLULAIRES ..........................................................................24

c. LES MODÈLES D‟ÉPITHÉLIUMS RECONSTITUES EN 3 DIMENSIONS.................25

IV. ETUDE DES INTERACTIONS CELLULAIRES DE CELLULES

CONJONCTIVALES EN LIGNEES AVEC DES LYMPHOCYTES ISSUS DU

SANG CIRCULANT.........................................................................................................27

1. INTRODUCTION ........................................................................................................27

2. MATERIELS ET METHODES.......................................................................................28

a. LA LIGNÉE DE CELLULES CONJONCTIVALES .................................................28

b. LES LYMPHOCYTES ISSUS DU SANG CIRCULANT...........................................29

c. LES TRAITEMENTS CELLULAIRES..................................................................29

d. LA COCULTURE............................................................................................30

e. LA CYTOMÉTRIE DE FLUX.............................................................................31

f. LA MICROTITRATION CYTOFLUORIMÉTRIQUE ADAPTÉE AUX

MICROPLAQUES............................................................................................31

g. ANALYSE DE LA MORPHOLOGIE CELLULAIRE...............................................32

h. LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE À BALAYAGE............................................32

i. LES RÉACTIFS...............................................................................................33

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3. RÉSULTATS..............................................................................................................33

a. LES INTERACTIONS CELLULAIRES.................................................................33

b. L‟APOPTOSE.................................................................................................34

c. MODIFICATIONS DES CELLULES ÉPITHÉLIALES.............................................34

d. MODIFICATIONS DES CELLULES LYMPHOCYTAIRES......................................35

e. TEST TOXICOLOGIQUE SUR LE MODÈLE........................................................35

4. DISCUSSION ET CONCLUSION...................................................................................47

V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES..............................................................................54

VI. ANNEXES .........................................................................................................................56

VII. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES..................................................................69

VIII. TITRE ET RESUME EN ANGLAIS...........................................................................82

5

I. INTRODUCTION.

L‟étude de la toxicité des médicaments ou cosmétiques sur la surface oculaire se développa au

cours du 20ème

siècle avec l‟essor de l‟industrie pharmaceutique et la survenue de

complications liées à l‟instillation de certains collyres ou l‟utilisation de certains produits

cosmétiques. Il devint alors indispensable de développer des méthodes permettant d‟étudier la

toxicité oculaire de ces nouveaux produits ou des produits incriminés dans la survenue

d‟évènements indésirables (1). En effet, en 1933, Mc Cally et al. (2) relatent le cas de 17

personnes atteintes de lésions oculaires graves provoquées par l‟utilisation du p-

phénylènediamine dans un produit de maquillage. Ce produit ne sera retiré du marché que

cinq ans plus tard. Latvenar et Molitor (1939) sont parmi les premiers à proposer l‟utilisation

du lapin pour prédire l‟irritation oculaire chez l‟homme, mais ce n‟est qu‟en 1944 que

Friedenwald et al. (3) décrivent les effets des acides et des bases sur l‟œil de lapin et mettent

en place pour la première fois un système de cotation subjective pour qualifier les effets sur la

cornée, la conjonctive et l‟iris. Ainsi, John Draize et al. (4) publient, la même année, les

résultats de leur étude de la toxicité de produits et améliorent le système de cotation décrit par

Friedenwald en standardisant la méthode et en simplifiant les cotations. La toxicité oculaire

est ainsi déterminée par l‟observation des lésions de la cornée, de l‟iris et de la conjonctive,

tout cela regroupé sous le terme « test de Draize ». Mais rapidement, pour des raisons

éthiques évidentes, la mise en place de méthodes alternatives aux modèles animaux s‟imposa

avec le développement de modèles In vitro et In vivo d‟étude de la toxicologie oculaire. En

1978, le terme d‟« alternative » fut exploité par le physiologiste David Smyth (5) qui l‟utilisa

pour décrire tout changement à partir des procédures de l‟époque visant à remplacer les

animaux, à en réduire leur nombre utilisé et à diminuer leur douleur et leur stress.

De nos jours, un des grands axes de recherche en toxicologie oculaire est l‟étude de l‟effet des

conservateurs contenus dans les différentes formulations ophtalmologiques (collyres, produits

de conservations des lentilles). En effet, la Pharmacopée actuelle recommande la présence

d‟un agent antimicrobien dans chaque flacon de collyre afin de limiter la prolifération

d‟agents infectieux une fois que la bouteille de collyre a été ouverte. Les conservateurs en

ophtalmologie appartiennent à différentes familles de composés chimiques incluant l‟EDTA,

les dérivés mercuriels, l‟alcool, le paraben, les biguanides chlorés (comme la chlorhexidine)

et les ammoniums quaternaires (comme le chlorure de Benzalkonium). Ces derniers, du fait

de leur faible pouvoir allergisant et de leur apparente innocuité, se sont rapidement imposés

comme les conservateurs les plus largement utilisés en ophtalmologie. Cependant, depuis un

6

passé récent, l‟accumulation de preuves cliniques et expérimentales sur l‟implication des

traitements anti-glaucomateux au long cours dans l‟apparition d‟une inflammation chronique

de la surface oculaire mettent en exergue le potentiel toxique des conservateurs de ces

collyres (et principalement du chlorure de benzalkonium) et leur nocivité pour l‟œil.

La première partie de cette thèse sera consacrée à la description des conservateurs dans les

collyres en ophtalmologie en s‟attardant sur leur chef de file, le chlorure de benzalkonium,

pour détailler ensuite les conséquences cliniques de leur utilisation prolongée. Dans la

seconde partie, nous nous intéresserons plus particulièrement aux différents modèles d‟études

de la toxicité oculaire de ces conservateurs. En effet, l‟essor des méthodes « alternatives »,

afin de diminuer l‟utilisation des modèles animaux, tant à privilégier maintenant les modèles

In vitro, tels que l‟utilisation des lignées cellulaires. Les lignées cellulaires sont un outil

intéressant car peu coûteux, reproductible et applicable à différentes techniques d‟analyse.

Cependant, l‟utilisation de ces lignées monocellulaires dans l‟étude des effets toxiques des

collyres sur la surface oculaire présente comme principal inconvénient de ne pas correspondre

parfaitement à la réalité anatomique de la conjonctive ou de la cornée. En effet, la cornée et la

conjonctive sont des épithéliums au sein desquels coopèrent différents types cellulaires

associés aux cellules épithéliales. Extrapoler les résultats d‟études de toxicité des

conservateurs sur des lignées monocellulaires de cellules épithéliales de conjonctive pourrait

paraître réducteur. Ainsi, l‟objectif du travail faisant l‟objet de cette thèse fut d‟étudier le

comportement et les interactions cellulaires d‟une coculture de lignée de cellules épithéliales

de conjonctive (Wong Kilbourne Derivative of Chang) et de lymphocytes issus du sang

circulant, puis d‟effectuer des tests de toxicité avec le chlorure de benzalkonium. Les résultats

de cette étude seront exposés dans la troisième partie de cette thèse.

7

II. TOXICOLOGIE OCULAIRE : EXEMPLE DU CHLORURE DE BENZALKONIUM.

1. Les conservateurs utilisés dans les collyres en ophtalmologie.

La contamination des flacons de collyres se fait essentiellement par le contact avec les mains

du patient lors de la manipulation du flacon ou lors de l‟utilisation du collyre. Un contact de

l‟embout du flacon peut se produire avec les cils, les paupières, les larmes, la conjonctive ou

la peau du visage. Une transmission interhumaine est également possible lorsque le même

flacon est utilisé pour différents patients, situation qui peut se présenter au sein d‟une

structure hospitalière ou d‟une structure privée de soins ou au sein d‟une famille. Dans les

années 60, dans les suites d‟un incident de ce type à l‟hôpital de Birmingham, les autorités

britanniques avaient alerté l‟industrie pharmaceutique sur la nécessité de développer des

préparations de collyres sous la forme d‟unidoses et de limiter la durée d‟ouverture d‟un

flacon (6). Ce n‟est que dans les années 1970 qu‟il a été décidé de rendre obligatoire la

présence d‟agents antimicrobiens (conservateurs) dans les flacons multidoses de collyre. La

pharmacopée américaine basait l‟efficacité d‟un conservateur sur le « test du pouvoir

conservateur ». Ce test consistait, In vitro, à inoculer 1x106 Colony Forming Units (CFU)/mL

à l‟instant T=0 de divers micro-organismes tels que des bactéries (Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli) ou des champignons (Aspergillus niger et

candida albicans). L‟efficacité prouvée du conservateur se base sur les résultats suivants :

réduction de 1.0 Log au 7ème

jour, réduction de 3.0 Log au 14ème

jour sans prolifération des

survivants, pas de prolifération des survivants au 28ème

jour (7). Cependant, de tels effets

cytotoxiques des conservateurs sur les micro-organismes ne peuvent être obtenus sans une

certaine toxicité, même minimale, sur les tissus sur lesquels la goutte de collyre a été

appliquée. Les autorités de santé sont, de nos jours, particulièrement sensibilisées à ce

problème, de telle façon que, récemment, l‟Agence Européenne de Médecine (EMEA,

European Medicine Agency) a statué sur la nécessité pour l‟industrie pharmaceutique et tous

les partenaires de santé de supprimer l‟utilisation des conservateurs pour « les patients ne

tolérant pas les collyres conservés » et ceux traités au long cours, en utilisant « la

concentration minimale efficace qui satisfasse la fonction antimicrobienne du conservateur »

et en promulguant « de nouvelles préparations ophtalmiques ne contenant pas de

conservateurs à base de mercure » (8).

8

2. Le chlorure de benzalkonium.

De nos jours, le conservateur le plus communément utilisé dans les préparations

ophtalmologiques est le chlorure de benzalkonium (BAC). Le BAC, aussi connu sous le nom

de chlorure d'alkyldiméthylbenzylammonium et ADBAC, est un mélange de chlorures

d'alkylbenzyldiméthylammonium avec des chaînes carbonées de longueur variable. Ce

produit est un agent de surface cationique de la famille des ammoniums quaternaires.

FIG 1. FORMULE CHIMIQUE DU CHLORURE DE BENZALKONIUM

Le chlorure de benzalkonium est facilement soluble dans l'éthanol et l'acétone. Bien que sa

dissolution dans l'eau soit lente, les solutions aqueuses sont plus faciles d'emploi et sont plus

largement utilisées. Les applications sont très variées, allant de la formulation de désinfectants

à l'inhibition de corrosion microbienne dans les huiles en utilisant des propriétés d‟agent de

transfert de phase et de surfactant cationique. Les ammoniums quaternaires sont des

composés bipolaires hautement hydrosolubles. En pharmacologie, l'activité biocide la plus

importante est associée aux dérivés alkylés en C12 à C14. On pense que le mécanisme

bactéricide est dû à la disruption des interactions intermoléculaires. Ceci peut causer la

dissociation des lipides dans la membrane cellulaire, ce qui compromet la perméabilité de la

cellule et induit une fuite de son contenu. Les solutions de BAC sont des agents bactéricides à

action rapide et de durée modérément longue. Les spores des bactéries sont considérées

comme résistantes et les bactéries à Gram positif (Staphylococcus) sont généralement plus

sensibles que les Gram négatifs (Pseudomonas aeruginosa). L'activité n'est pas grandement

influencée par le pH, mais augmente aux températures élevées et avec la durée d'exposition.

9

De nouvelles formulations utilisant du benzalkonium mélangé à d'autres ammoniums

quaternaires peuvent être utilisées pour étendre le spectre biocide et augmenter l'efficacité du

désinfectant. Par exemple, l‟action combinée du BAC avec l‟EDTA 0.1% augmente l‟action

bactéricide contre les bactéries Gram négatif. De plus, le BAC a aussi une activité spermicide.

Enfin, les concentrations de BAC le plus généralement utilisées vont de 0.004 à 0.025%.

Le BAC a été largement utilisé pour son bon rapport efficacité/sécurité apparent. Il a été

décrit comme modérément allergisant (9, 10) mais possédant d‟importantes propriétés

antimicrobiennes. En effet, une étude a montré que parmi 5 conservateurs différents

(BAC/EDTA, paraben, chlorobutanol, complexe argent-chloride et le complexe stabilisé

purite oxychloré), seul le BAC/EDTA remplissait les critères de validité d‟activité

antimicrobienne (11).

De plus, il a été montré que les substituts lacrymaux conditionnés en unidoses sans

conservateur étaient à risque de contamination, après plusieurs utilisations au-delà de 10

heures d‟ouverture (12). Le risque de contamination est augmenté chez les patients les plus

âgés et en cas de manipulation inappropriée avec les doigts. Cependant, il faut noter que le

taux de contamination des unidoses de collyres ne dépasse pas les 2%, même dans les pires

cas de manipulations répétées, alors qu‟il a été répertorié près de 35% de taux de

contamination des flacons de collyres préservés avec le BAC après 15 jours d‟utilisation (13),

mettant en exergue la « relative » sécurité apportée par l‟utilisation du BAC en tant que

conservateur antimicrobien. De plus, il a été décrit que certaines souches de Pseudomonas

aeruginosa seraient résistantes à l‟action antimicrobienne du BAC et pourraient proliférer

dans des solutions contenant du BAC (14). Cette résistance serait corrigée par l‟addition

d‟EDTA au BAC, mais pourrait augmenter alors grandement la toxicité sur les tissus

avoisinants.

L‟un des principaux arguments de l‟utilisation du BAC comme conservateur des collyres

utilisés en ophtalmologie, est l‟amélioration de la pénétration du principe actif au niveau de la

chambre antérieure, du fait de l‟action de disruption de la barrière hydrophobe de l‟épithélium

cornéen par le BAC. L‟augmentation de concentration du principe actif dans l‟humeur

aqueuse pourrait permettre une meilleure efficacité du collyre. La pénétration cornéenne de

cyclosporine A appliquée en topique serait améliorée par la présence de BAC en solution dans

le collyre (15), et le couple BAC/EDTA permettrait une augmentation de la pénétration

transcornéenne d‟aciclovir (16) ou de certains antibiotiques (17). Cependant une autre étude

n‟a pas trouvé de différence dans la concentration de l‟analogue des prostaglandines

Tafluprost dans l‟humeur aqueuse après instillation d‟une solution conservée et d‟une solution

10

non conservée (18). Il apparaît tout de même évident que les différentes formulations

(hydrophilie vs. lipophilie, solutions vs. suspension ou émulsion, prodrogue vs. principe actif)

de la multitude de variétés de produits actuellement disponibles, entraînent des différences

majeures de pharmacocinétique, alors qu‟il n‟y a souvent pas de corrélation réelle entre la

pharmacocinétique d‟un produit et son efficacité. Et, de plus, hormis le fait que les

modifications histologiques majeures de la barrière cornéenne, liées à l‟utilisation de collyres

conservés permettant l‟amélioration de la pénétration d‟un produit, peuvent être considérées

comme des effets secondaires toxiques (19), il a fréquemment été démontré, à quelques

exceptions près, une équivalence totale en terme d‟efficacité des collyres antiglaucomateux

conservés et non conservés.

3. Conséquences cliniques : la surface oculaire des patients glaucomateux.

Le glaucome est une maladie chronique qui concerne près d‟un million de personnes en

France et environ 30 millions dans le monde. Il s„agit initialement d‟une dégénérescence du

trabéculum, conduisant à une raréfaction cellulaire progressive, à un remodelage matriciel et à

une hyperpression oculaire qui entraîne secondairement la perte des cellules ganglionnaires

rétiniennes et donc, de facto, la perte de la fonction visuelle. Le troisième tissu touché par le

glaucome, et qui nous importe ici, est la surface oculaire, qui reçoit pendant des années ces

traitements locaux toxiques et/ou proinflammatoires, stimulant à la fois l‟apoptose épithéliale

et le système immunitaire. Cliniquement, il est possible d‟observer que, par exemple, suite à

l‟instillation chronique au long cours de ces collyres conservés, des symptômes de

conjonctivite allergique ou de syndrome sec oculaire, une pseudophemphigoïde cicatricielle

ou encore une augmentation de l‟échec de la chirurgie filtrante peuvent survenir.

Les symptômes d‟allergie oculaire sont dominés par le prurit, le chemosis, l‟œdème palpébral,

le larmoiement, la rougeur oculaire et la photophobie. Dans certains cas, il est noté jusqu‟à la

présence d‟une conjonctivite giganto-papillaire, voire de sévères réactions allergiques de type

IV. L‟ensemble de ces manifestations d‟allergie oculaire est donc très varié dans sa

présentation ainsi que le délai de survenue, certaines réactions retardées pouvant même mimer

une blépharite chronique avec une inflammation à bas bruit. Par conséquent, le traitement

simple de l‟allergie oculaire visant à soustraire l‟allergène en arrêtant le traitement n‟est que

11

rarement envisagé. Une méta-analyse de 28 essais cliniques randomisés relatait de 0% à 16%

seulement d‟arrêt du traitement pour des manifestations d‟allergie oculaire (20).

Les manifestations de sécheresse oculaire rassemblent un cortège de symptômes aspécifiques

mais particulièrement fréquents tels que l‟ « inconfort » lors de l‟instillation du collyre, une

sensation de brûlure ou de picotement, une sensation de corps étranger, une sensation d‟ « œil

sec », un larmoiement ou des démangeaisons palpébrales. Une enquête épidémiologique

conduite en 2002 sur 4107 patients glaucomateux a évalué le taux de manifestations oculaires

d‟œil sec en pratique clinique de routine et trouvé une prévalence des symptômes très élevée

pour les patients utilisant des collyres conservés. Cette fréquence de signes et de symptômes

oculaires augmentait avec le nombre de collyres conservés utilisés (21). Sur le même

principe, l‟analyse des données provenant de 9658 patients retrouvait une incidence des

symptômes oculaires de sécheresse comprise entre 30 et 50% (22). Les symptômes de

sécheresse oculaires surviennent plus fréquemment lorsque le glaucome est plus sévère,

lorsque trois (ou plus) collyres sont utilisés, et cette fréquence augmente avec la durée

d‟évolution du glaucome (23). Il a par ailleurs été montré que ces effets secondaires oculaires

liés à l‟instillation des collyres avaient un effet néfaste non négligeable sur la qualité de vie

des patients (24) et étaient la deuxième cause de non observance ou de changement de

traitement (25).

Les manifestations de pseudopemphigoïde cicatricielle conjonctivale surviennent chez les

patients glaucomateux traités de longue date. Elles sont liées à une augmentation de la densité

fibroblastique au niveau de la substantia propria sous-conjonctivale en rapport avec une

augmentation de la présence de cellules inflammatoires (26). L‟instillation de collyres

conservés serait de loin la première cause de pemphigoïde cicatricielle (27).

L‟échec de la chirurgie filtrante pratiquée chez les patients glaucomateux, telle que la

trabéculectomie, serait initialement lié à une réponse fibroblastique conjonctivale excessive

au niveau de la bulle de filtration dans le premier mois post-opératoire. Cette inflammation

conjonctivale avec prolifération fibroblastique et dépôts au niveau de la matrice

extracellulaire aboutit à un blocage de l‟évacuation de l‟humeur aqueuse dans l‟espace sous

conjonctival fibrosé. Par conséquent, tous les facteurs favorisant la fibrose post opératoire au

niveau de la bulle de filtration de la trabéculectomie sont des facteurs de risque d‟échec de la

chirurgie. L‟utilisation au long cours de collyres conservés chez les patients glaucomateux

induit à terme une inflammation conjonctivale avec pour principale conséquence, une

augmentation de la fibrose post opératoire. Différentes études cliniques viennent confirmer

que le taux de succès de la trabéculectomie est influencé négativement par l‟utilisation au

12

long cours de collyres conservés (28) et qu‟il y a une relation entre le taux d‟échec de la

chirurgie et le nombre de collyres conservés utilisés et leur durée d‟utilisation (29).

A un stade infra clinique, il a été clairement démontré que même sans la présence de

symptômes oculaires évidents comme ceux précédemment décrits, l‟utilisation de collyres

anti-glaucomateux conservés était responsable de la présence anormale d‟inflammation au

niveau de l‟épithélium conjonctival et de la substantia propria. Il a en effet été noté une

augmentation du nombre de macrophages, lymphocytes, mastocytes et fibroblastes et une

diminution des cellules à mucus chez les patients opérés après de longues années de

traitement en comparaison à ceux opérés en thérapeutique primaire. Ces résultats ont été

observés lors d‟études immunohistologiques faites sur la conjonctive et la capsule de Tenon

des patients, obtenues par biopsies conjonctivales réalisées au moment de la chirurgie (30).

Notre équipe a réalisé des travaux similaires et a montré, par le biais d‟études

immunohistologiques, une expression positive de marqueurs d‟inflammation et d‟apoptose sur

les cellules conjonctivales des patients traités au long cours par les collyres conservés, les

cellules conjonctivales ayant été obtenues par biopsies (26). Les empreintes conjonctivales

permettent de collecter de manière rapide, non invasive et indolore, la couche la plus

superficielle de l‟épithélium conjonctival comprenant les cellules épithéliales, les cellules à

mucus et les cellules inflammatoires infiltrant la conjonctive (31). Les empreintes

conjonctivales sont donc un outil indispensable d‟étude des manifestations infra cliniques de

la surface oculaire, en particulier des manifestations de sécheresse oculaire. Initialement, les

empreintes conjonctivales avait permis de mettre en évidence des changements de la surface

oculaire (augmentation du degré de métaplasie, diminution de la densité en cellules à

mucus…) (32), mais récemment, différentes techniques immunohistologiques appliquées aux

empreintes conjonctivales ont été développées pour évaluer plus précisément l‟inflammation

conjonctivale au cours des maladies de la surface oculaire. Notre équipe a ainsi été capable de

quantifier l‟expression d‟HLA-DR sur les empreintes conjonctivales. HLA-DR n‟est

normalement pas exprimé sur les cellules conjonctivales, sauf en cas de processus

inflammatoire. HLA-DR est alors apparu comme le marqueur fiable pour démontrer que

l‟épithélium est impliqué dans une pathologie inflammatoire de la surface oculaire, mais

également pour quantifier cette inflammation, montrant son intérêt principalement lorsque la

pathologie n‟est cliniquement pas ou peu inflammatoire. La première étude

immunocytologique réalisée par notre équipe, incluant 107 yeux de 55 patients glaucomateux

montrait une absence totale de réactivité pour l‟anticorps monoclonal HLA-DR dans le

groupe non traité et à l‟inverse une positivité de l‟expression de HLA-DR pour 43/88 yeux

13

dans le groupe traité (33). De plus, notre équipe a développé la technique de cytométrie de

flux appliquée aux empreintes conjonctivales, permettant d‟évaluer de façon fiable et

reproductible l‟expression du marqueur HLA-DR ou de cytokine proinflammatoires au sein

de l‟épithélium conjonctival chez les patients glaucomateux même asymptomatiques

cliniquement (34, 35, 36). Enfin, des travaux plus récents utilisant les mêmes techniques de

cytométrie de flux sur empreintes conjonctivales ont permis d‟étudier l‟expression des

marqueurs CCR5 et CCR4, deux marqueurs associés aux profils d‟inflammation de

lymphocytes T helper Th1 et Th2 respectivement, Th2 étant plutôt impliqué dans les réactions

allergiques et Th1 étant plutôt impliqué dans les réactions de toxicité. Il a été noté, chez des

patients glaucomateux traités au long cours, une expression élevée simultanée des deux

marqueurs, illustrant toute la complexité des mécanismes mis en œuvre au cours du

glaucome, incluant des réactions allergiques et toxiques, une stimulation directe de cellules

inflammatoires, une déficience du film lacrymal, une destruction des cellules épithéliales.

Toutes ces modifications infra cliniques surviennent très rapidement après l‟instauration d‟un

traitement anti-glaucomateux, puisque l‟expression du marqueur HLA-DR aurait été mise en

évidence dès le deuxième mois de traitement (37).

14

III. MODES D’ETUDES DE LA TOXOCITE DU CHLORURE DE BENZALKONIUM

SUR LA SURFACE OCULAIRE

1. Modèles Animaux

Les produits chimiques, les produits cosmétiques et les produits pharmaceutiques doivent être

testés avant toute utilisation chez l‟homme, du fait de leur pouvoir irritant potentiel et du

risque encouru pour l‟œil humain qui serait en contact avec l‟un de ces produits. Cependant,

jusqu‟à aujourd‟hui encore, la seule méthode admise et validée mondialement par les autorités

compétentes pour l‟étude du pouvoir irritant potentiel d‟un composé, est le test de Draize (4),

qui d‟ores et déjà est critiqué et condamné par les associations de défense et de protection de

animaux.

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Des alternatives au classique test de Draize ont été proposées, comme le test de Draize à

« faible volume » (M) qui serait plus prédictif et moins douloureux pour l‟animal, le volume

du produit instillé étant réduit à 0.01ml au lieu de 0.1ml (38). Une autre alternative au test de

Draize, se rapprochant encore plus des conditions du vivo sans sacrifier d‟animaux, est la

technique de « l‟œil énucléé », utilisant des yeux isolés de lapin, de bœuf ou de poulet

provenant d‟abattoirs, permettant de classer les irritants oculaires sévères selon trois

paramètres : l‟opacification cornéenne, la prise de fluorescéine et surtout l‟œdème cornéen

qui est le paramètre le plus objectif et le plus discriminant (39).

Par ailleurs, l‟utilité du test de Draize, sa fiabilité et sa précision sont également critiquées par

les équipes de recherche du fait de l‟importante variabilité des résultats, et donc de l‟absence

de prévisibilité de la réponse humaine au toxique préalablement testé sur l‟animal (40, 41). En

effet, le test de Draize est principalement basé sur les changements macroscopiques observés

sur les cornées, conjonctives et iris de lapin. Différents scores de réponse au collyre peuvent

être utilisés. Cependant, quelque soit le score mis en pratique, le modèle d‟œil de lapin montre

ses limites principalement lors de l‟utilisation de tests d‟irritation peu sévère et pour des

substances toxiques de faibles puissance.

Afin d‟améliorer le qualité du modèle d‟œil de lapin, il a été développé, en addition aux

mesures cliniques et histologiques post mortem, la méthode de l‟analyse de la surface oculaire

de l‟œil de lapin in vivo, non traumatique par le biais de l‟utilisation de la microscopie

cornéenne confocale in vivo (IVCM). Cet outil permet d‟examiner de façon reproductible,

sensible et sûre la surface oculaire des animaux de laboratoire en réalisant des images de

coupe de tissus vivants sans sacrifier les animaux et sans préparation préalable, avec une très

bonne corrélation entre les images obtenues et l‟histologie. L‟intérêt de la microscopie

confocale réside également dans son pouvoir à mettre en évidence de minimes altérations de

la surface oculaire après exposition à des agents de toxicité faible ou modérée, et d‟étudier

leur réversibilité dans le temps.

La première étude toxicologique de ce type fut menée par Ichijima et al. (42), en s‟appuyant

sur le développement d‟un modèle de stress aigu de la surface oculaire pouvant mimer les

effets à long terme d‟un toxique de faible puissance instillé sur une courte période de temps.

Les auteurs étudièrent les changements induits par l‟application du BAC sur la cornée de

lapin en utilisant une méthode d‟investigation combinant le microscope confocal in vivo et la

microscopie électronique à balayage. L‟application de 15 gouttes de BAC à la concentration

de 2.10−2

%, 10−2

%, et 5.10−3

% à 5 minutes d‟intervalles entraînait la desquamation des

cellules les plus superficielles de l‟épithelium cornéen, visible au microscope confocal. Cette

16

desquamation augmentait avec la concentration de BAC instillée. De plus, une heure après la

dernière goutte appliquée, des cellules inflammatoires apparaissaient à la surface de la cornée.

Toutes ces données furent confirmées par l‟analyse en microscopie électronique, alors que

l‟application de collyres sans conservateur ne provoquait, quant à eux, aucune toxicité sur

l‟épithélium cornéen.

Notre équipe a également utilisé le modèle d‟oeil de lapin à des fins d‟investigation

toxicologique à l‟échelon histologique toujours par le biais de l‟utilisation du microscope

confocal in vivo. L‟apport du récent module cornéen adapté pour le tomographe rétinien de la

marque Heidelberg (Rostock Corneal Module of the Heidelberg Retina Tomograph -

HRT/RCM - Heidelberg Engineering, Heidelberg, Allemagne) (Figure1) a permis d‟obtenir

une résolution de près de 1 µm, et trouvant ainsi des applications dans un bon nombre de

pathologies humaines (43, 44, 45). En plus de l‟analyse des altérations cornéennes induites

par la toxicité du BAC, la microscopie confocale in vivo a permis d‟analyser la périphérie

cornéenne, le limbe et même la conjonctive, structures qui jusqu‟alors n‟étaient accessibles

sur le plan histologique que post-mortem.

Figure 1 : « Rostock Cornea Module »

(Baudouin et al. Apport de la microscopie confocale in vivo pour l‟exploration de la surface oculaire. 2006)

17

Les travaux récents de notre équipe ont abouti à la mise en évidence in vivo des post mortem

(conjunctiva-associated lymphoid tissue) et de leur infiltration inflammatoire après activation

par le BAC (46). Cette infiltration de cellules inflammatoires en transit dans le CALT

semblerait liée à la concentration de BAC appliquée, du fait de l‟absence de changement

observé au niveau du CALT après utilisation de collyres sans conservateur, alors qu‟une

importante infiltration de cellules inflammatoires au sein du CALT étaient observée,

augmentant avec la concentration de BAC utilisée.

Le modèle d‟œil de lapin est également un bon support pour l‟utilisation des empreintes

conjonctivales comme outils d‟étude de la surface oculaire (47). En effet, cette technique

permet d‟effectuer de multiples manipulations sur un même animal avant son sacrifice,

réduisant ainsi le nombre d‟animaux utilisés à des fins d‟expérimentations scientifiques.

Le modèle de rat est un modèle utile d‟étude de la surface oculaire car plus adapté pour la

manipulation et pour l‟hébergement que le lapin. Le modèle de rat a déjà été utilisé pour

démontrer la toxicité du BAC, en confirmant que l‟application de collyres antiglaucomateux

contenant du BAC provoquait des changements histologiques au niveau de la surface oculaire

des rats, même ceux qui étaient en bonne santé. Ces changements n‟étaient pas observés

lorsque le collyre sans conservateur était appliqué (26). Cependant, même si, sur un plan

purement pratique, l‟utilisation du rat paraît plus simple que celle du lapin, les modèles de rat

ne sont pas si souvent que cela utilisés pour les études de toxicologie oculaire, du fait de

l‟extrême variabilité de leur comportement oculaire et des modifications observables au

niveau de la surface oculaire de rat. L‟utilisation de la microscopie confocale in vivo a

toutefois permis d‟améliorer l‟utilité de ces modèles de rat en se couplant à l‟analyse

biomicroscopique et à l‟étude histologique post-mortem. Ainsi, notre équipe a réalisé une

série d‟investigations de la toxicité du BAC sur l‟œil de rat après instillations répétées et à des

concentrations croissantes. Les effets du BAC furent mesurés tout d‟abord cliniquement par

l‟utilisation du test de Draize, montrant une irritation cliniquement significative seulement

pour les concentrations de BAC les plus élevées (0.5% et 0.25%), puis confirmés par la

mesure des changements à l‟échelon histologique par l‟utilisation du microscope confocal

HRT-II, montrant une altération de la cornée de rat en relation dose-dépendante avec le BAC.

Les concentrations les plus élevées de BAC induisaient une totale désépithélialisation de la

cornée avec altération en profondeur du stroma cornéen jusqu‟à l‟infiltration inflammatoire, la

néovascularisation et la fibrose endothéliale de la cornée (48, 49). les plus faibles

concentrations de BAC n‟entraînaient des dommages que pour les zones les plus

superficielles de l‟épithélium cornéen. Ces dommages auraient pu passer inaperçus sans

18

l‟évaluation des critères les plus sensibles. C‟est ainsi que notre équipe a développé une grille

de cotation des altérations de la surface oculaire observées en microscopie confocale in vivo

après exposition à un toxique (50). Cette grille s‟appuyant sur l‟observation de différents

paramètres que sont la taille et la forme des cellules, leur mode de réflectivité, l‟inflammation,

la néovascularisation et la mesure de l‟épaisseur cornéenne. Son intérêt est de permettre la

standardisation de l‟évaluation de l‟atteinte cornéenne à l‟échelle cellulaire même après

exposition à des faibles doses d‟agents irritants.

2. Etudes Cliniques

Très peu d‟études prospectives se sont posées la question du rôle délétère de la présence d‟un

conservateur dans les collyres. Cela est principalement dû au manque actuel de solution

proposée parmi les collyres sans conservateur, et dans une plus large mesure dû au fait que la

surface oculaire subit trop rapidement les effets toxiques du conservateur après l‟instauration

du traitement. Cependant, une étude sur volontaires sains a trouvé que l‟instillation de timolol

conservé causait plus d‟instabilité du film lacrymal qu‟après instillation de timolol non

conservé (51). Notre équipe a trouvé des résultats similaires en mesurant le break-up time

chez des volontaires sains, le trouvant significativement plus court après instillation de

carteolol contenant du BAC (52). Il faut noter que ces deux études cliniques ont été réalisées

chez des volontaires sains, jeunes ayant une surface oculaire parfaitement normale au stade

initial. Cela permet de mieux comprendre pourquoi il est observé autant de manifestations de

sécheresse oculaire chez les patients glaucomateux, qui généralement accumulent de longues

années de traitement, traités par de multiples collyres, et ces patients sont donc beaucoup plus

sujets à présenter une surface oculaire altérée et affaiblie. Deux autres études prospectives ont

analysé les conséquences de l‟application de BAC chez le volontaire sain. La première

conclut que même de petites concentrations de BAC induisent une perte en cellules à mucus

ainsi qu‟une augmentation du rapport nucléo-cytoplasmique, qui sont deux caractéristiques du

syndrome sec oculaire (53). La deuxième montre une diminution significative du test de

Schirmer chez les volontaires ayant reçu des instillations BAC comparativement aux

volontaires n‟ayant pas reçu de traitement (54).

Plusieurs enquêtes comparatives observationnelles ont été menées récemment afin toujours

d‟évaluer le caractère toxique et délétère de la présence du conservateur dans les collyres anti-

glaucomateux. Yalvac et al. trouvèrent que le test de Schirmer et la mesure du Break up time

étaient significativement diminués dans le groupe traité versus le groupe placebo (55).

19

D‟autres auteurs montrèrent, en utilisant l‟analyse In vivo au microscope confocal de la

surface oculaire, une réduction de la densité en cellules épithéliales superficielles et une

augmentation de la densité des cellules basales avec activation kératocytaire stromale dans les

groupes traités par des collyres conservés quelle que soit leur classe (bêtabloquants,

prostaglandines ou association fixe de ces deux classes) en comparaison du groupe placebo

(56). Il a également été mis en évidence une diminution de la sensibilité cornéenne, basée sur

l‟étude de l‟esthésiométrie cornéenne, dans les tous groupes traités par les collyres conservés

par le BAC. En effet, il est connu que le BAC peut entraîner des manifestations de

dénervation dans d‟autres systèmes que le système oculaire, tels que le plexus soléaire gastro-

intestinal ou le tractus génito-urinaire (57). Ces propriétés toxiques du BAC sur les nerfs

cornéens, avec diminution de la sensibilité cornéenne, peuvent participer au « relatif » bon

confort qu‟éprouvent bon nombre de patients traités au long cours par des collyres contenant

du BAC. Mais en rapport avec cette notion de baisse de la sensibilité cornéenne, cela poserait

plutôt le problème de l‟aspect faussement bon de la tolérance de ces collyres.

Certains travaux ont pris le parti d‟analyser les conséquences du changement de traitement

pris par le patient afin de tenter de mettre en évidence une amélioration des symptômes

lorsque le BAC était exclu des formulations des collyres. Ainsi, Pisella et al. ont observé les

effets cliniques de la permutation du traitement de 349 patients qui présentaient des signes et

symptômes d‟irritation de la surface oculaire (tels que l‟allergie oculaire, la blépharite ou le

syndrome sec oculaire) et qui étaient traités par des collyres conservés. Après le quatrième

mois, une importante et significative diminution de tous les signes et symptômes fonctionnels

a été retrouvée (21). Une plus large étude à l‟échelon européen a confirmé ces résultats (22).

D‟autres travaux montrèrent, après le troisième mois de changement de traitement pour des

collyres anti-glaucomateux sans BAC, une nette diminution des symptômes d‟œil sec, de

sensation de corps étranger, d‟hyperhémie conjonctivale et de kératite ponctuée superficielle

(58). Campagna et al. ont corroboré ces données cliniques avec l‟étude à l‟échelon cellulaire

des conséquences de ce changement de traitement. Ils rapportent une diminution significative

des processus inflammatoires au niveau de la conjonctive par l‟analyse d‟empreintes

conjonctivales deux mois après le « switch », en observant principalement une augmentation

du nombre de cellules à mucus et de cellules épithéliales (59). Ces modifications à l‟échelon

cellulaire étaient corrélées à une amélioration clinque avec diminution de tout le cortège de

symptômes accompagnant l‟irritation de la surface oculaire.

20

3. Chez l‟homme

En théorie, le meilleur moyen d‟explorer la surface oculaire chez l‟homme est la biopsie

conjonctivale qui permet d‟obtenir des cellules stromales, épithéliales, inflammatoires et des

cellules à mucus ex vivo, accessibles en microscopie conventionnelle, confocale ou

électronique autorisant l‟utilisation de techniques d‟immunohistochimie ou de biologie

moléculaire. Elle peut ainsi permettre l‟identification et le comptage de cellules

inflammatoires, l‟analyse de marqueurs cellulaires membranaires, de molécules intra

cytoplasmiques ou de composants de la matrice extracellulaire. La biopsie est facilement

réalisable sous anesthésie locale, au niveau de la conjonctive bulbaire adjacente au limbe sans

qu‟aucune suture ne soit nécessaire. Malgré leur simplicité de réalisation apparente, les

biopsies conjonctivales sont des examens invasifs et doivent être réservées à des fins

diagnostiques ou thérapeutiques lorsqu‟un bénéfice est attendu pour le patient. La biopsie

conjonctivale est l'outil de choix pour le diagnostic de certaines maladies inflammatoires,

infectieuses auto-immunes dépendantes des anticorps et du complément au niveau de la

membrane basale conjonctivale. La réalisation de techniques d'immunomarquage sur les

biopsies conjonctivales permet par exemple de détecter des complexes immuns formés in situ

dans la conjonctive (60) au cours des maladies bulleuses auto-immunes comme la

pemphigoïde cicatricielle, l'épidermolyse huileuse acquise ou la pemphigoïde bulleuse, et de

différencier ces maladies des pseudopemphigoïdes iatrogènes, liées par exemple au BAC. Des

biopsies conjonctivales pratiquées chez des patients glaucomateux traités au long cours, lors

de leur intervention chirurgicale, ont également apporté beaucoup de renseignements sur l'état

inflammatoire des yeux glaucomateux multi traités (61,62,63,64).

Plus simples à réaliser et plus utiles pour le diagnostic des atteintes allergiques, les examens

de cytologie permettent l'examen des cellules conjonctivales desquamées et surtout

l'identification de cellules inflammatoires dont certaines sont parfois évocatrices du

diagnostic. Ces examens cytologiques sont appelés « brossages conjonctivaux » et les cellules

recueillies peuvent être analysées à l‟aide de techniques d‟immunomarquage et de cytométrie

de flux. Après instillation de collyres anesthésiants, les cellules conjonctivales sont récoltées

par grattage au niveau de la conjonctive bulbaire à l‟aide d‟une brosse puis remise en

suspension dans un tampon de PBS (« phosphate buffer saline ») (65). La présence

d'éosinophiles et de basophiles suggère ainsi une réaction allergique, mais n'est pas

spécifique, puisque ces cellules, bien qu'en nombre plus faible peuvent aussi être retrouvées

21

dans des syndromes purement toxiques (66). Des aspects de kératinisation et de

dégénérescence épithéliale, accompagnées d'infiltrats de lymphocytes et de polynucléaires

neutrophiles, sont plus évocateurs de causes toxiques, mais toutes les associations sont

possibles (67,68).

Les premières empreintes conjonctivales ont été réalisées vers la fin des années 1970

notamment dans le cadre de la sécheresse oculaire (69,70). L‟empreinte conjonctivale

représente un moyen simple, non traumatique, exsangue et indolore de recueil des cellules

épithéliales de la surface oculaire. Les renseignements obtenus diffèrent cependant de ceux

fournis par une biopsie conjonctivale car cette dernière permet également l‟étude du chorion

sous-jacent. Cependant, l‟empreinte conjonctivale présente deux avantages majeurs par

rapport aux brossages conjonctivaux ; d‟une part, elle permet de prélever un tapis cellulaire

homogène gardant son architecture et ses liaisons intercellulaires, et elle est pratiquement

indolore. L‟empreinte conjonctivale permet de réaliser un instantané photographique de

l‟épithélium conjonctival avec l‟identification des trois populations cellulaires qui le

composent : les cellules épithéliales, les cellules à mucus et les cellules immunocompétentes

représentées par les cellules de Langerhans. L‟étude de ces cellules par des colorations

histologiques standards a permis initialement d‟appréhender la souffrance conjonctivale dans

l‟œil sec dont la traduction principale est la diminution des cellules à mucus et la diminution

progressive du rapport nucléo-cytoplasmique des cellules épithéliales, jusqu‟à un état de

kératinisation étendue (71). D‟autre part, l‟utilisation de marqueurs d‟inflammation comme le

marqueur HLA-DR a permis de caractériser les cellules épithéliales positives pour de

l‟inflammation conjonctivale présente à un stade infraclinique dans certaines situations

pathologiques comme l‟œil sec ou la pathologie iatrogène (72,73). La technique de recueil

cellulaire par empreintes conjonctivales repose sur l‟application, après instillation d‟un

collyre anesthésiant, d‟un filtre opaque d‟acétate de cellulose (type MilliporeGSWP ou

Gellman Supor; diamètre 13 mm, pores de 0,2 µm) ou transparent (type Biopore),

préalablement coupé en deux à l‟aide d‟une pince, sur la conjonctive bulbaire supérieure ou la

conjonctive palpébrale, après avoir soulevé la paupière supérieure, en demandant au patient

de regarder vers le bas. Un simple contact de quelques secondes sans pression suffit. Le

devenir de cette membrane chargée de matériel cellulaire dépend alors de la technique

d‟analyse envisagée, la membrane pouvant être fixée dans du formol, de l‟éthanol ou du

paraformaldéhyde pour l‟utilisation de colorations cytologiques standards. L‟utilisation en

immunohistochimie nécessite un transfert des cellules sur support transparent, obtenu en

appliquant fermement la membrane sur une lame de verre. Récemment développée,

22

l‟utilisation de méthodes de quantification cellulaire, comme la cytométrie de flux, nécessite

le maintien des cellules recueillies sur leur support, en suspension liquide, avant technique

d‟extraction cellulaire. Les tubes sont alors conservés à 4°C et sont analysés dans la semaine

qui suit leur prélèvement. L‟extraction des cellules se fait manuellement par agitation pendant

20 minutes suivie d‟une centrifugation à 1600 tours/minutes pendant 5 minutes. Au total, les

cellules recueillies par empreintes conjonctivales peuvent être analysées de différentes

manières : soit en cytologie standard, qui consiste à colorer de façon classique les cellules

(avec l‟acide périodique Schiff, le bleu alcian, l‟hématoxyline, la coloration de Gill par

Papanicolaou ou le May-Grünwald-Giemsa) et à les examiner en microscopie

conventionnelle. Cela permet d‟analyser la taille, la forme des cellules épithéliales, leur

rapport nucléo-cytoplasmique, la densité des cellules à mucus ainsi que les modifications de

la chromatine (74, 75). Soit en immunofluorescence standard, permettant un marquage et un

examen direct des cellules, sans qu‟aucun transfert sur support ne soit nécessaire réduisant la

perte et la détérioration cellulaires (76). Cette technique s‟est beaucoup développée avec

l‟utilisation de la microscopie confocale, apportant des renseignements importants non plus

seulement sur la morphologie cellulaires mais également sur leur structure et leur

fonctionnement. Cependant, il n‟est pas possible, en immunofluorescence, de quantifier de

manière fiable et reproductible les différents marqueurs testés comme cela est possible avec la

cytométrie de flux (CMF). La CMF consiste à faire défiler en « file indienne » les cellules

isolées une par une devant un système d‟illumination. Le guidage des cellules en suspension

se fait à l‟aide d‟un flux laminaire assurant leur défilement. Le système de détection doit être

suffisamment performant pour permettre d‟effectuer l‟analyse d‟une cellule donnée dans un

temps très court, de l‟ordre de quelques millisecondes. L‟utilisation de la CMF pour l‟analyse

des cellules recueillies par empreintes conjonctivales a été développée dans les années 1990

(77). Cela nécessite l‟extraction manuelle des cellules préalablement fixées dans du

paraformaldéhyde (PFA). Les applications possibles de cette techniques sont, entre autres,

l‟étude de l‟apoptose avec des marqueurs tels que le pic SubG1, l‟Apo 2.7, ou la mise en

évidence et la quantification de marqueurs inflammatoires divers par les cellules épithéliales

tels que l‟expression de l‟antigène de classe II HLA-DR ou le marqueurs Fas (78). La dernière

façon d‟analyser les cellules d‟empreintes conjonctivales est d‟utiliser des techniques de

biologie moléculaire telle que la « reverse transcriptase polymerase chain reaction » (RT-

PCR) permettant d‟identifier certains marqueurs inflammatoires (Il-6, Il-8, HLA-DR, ICAM-

1…) entre autres.

23

4. Modèles cellulaires

De tous les moyens d‟étude de la surface oculaire que nous venons de décrire, la biopsie

conjonctivale est le meilleur car elle permet de recueillir tous les types cellulaires formant la

conjonctive (cellules stromales, épithéliales, inflammatoires et à mucus) sous un format « ex

vivo ». Cependant, le matériel humain étant difficile à obtenir et les prélèvements étant

invasifs, les brossages conjonctivaux et les empreintes conjonctivales ont été développés,

permettant de réaliser des études toxicologiques mais aussi immunologiques et

physiopathologiques de la surface oculaire. Malgré cela, le recueil de cellules conjonctivales

par ces deux méthodes étant très limité, les recherches sur la surface oculaire se sont tournées

vers l‟utilisation des cultures cellulaires, permettant d‟étudier de façon fiable et reproductible

l‟influence de divers métabolites, médiateurs inflammatoires ou thérapeutiques sur la

conjonctive ou la cornée In vitro.

a. Les cultures primaires

Le principe d‟une culture primaire de cellules conjonctivales consiste à prélever plusieurs

biopsies de 1 cm2 de conjonctive au niveau bulbaire chez des patients sains, puis de les

stocker dans un milieu spécifique. Les cellules conjonctivales de l‟explant seront dissociées

par incubation avec une protéase, puis recueillies, rincées et mises en culture dans des

flasques contenant un milieu spécifique changé tous les 2 ou 3 jours (79). ce type de culture

est un outils intéressant pour les études physiopathologiques de la surface oculaire en raison

de ses similitudes phénotypiques avec l‟épithélium conjonctival humain normal. Les

caractéristiques des cultures primaires de cellules conjonctivales sont répertoriées dans les

Tableaux 2 et 3. Cependant, bien que les cultures primaires se rapprochent

phénotypiquement parlant de la conjonctive normale, elles ne sont que peu utilisées en

pratique du fait de trois inconvénients majeurs : d‟une part ce type de biopsie nécessite la

réalisation d‟un large prélèvement conjonctival chez le patient, d‟autre part, la lourdeur des

techniques de culture et le nombre limité de passages cellulaires, et enfin l‟importante

variabilité de la qualité de la culture rendant aléatoire la probabilité d‟obtenir suffisamment de

cellules conjonctivales pour mettre en œuvre les expérimentations.

24

b. Les lignées cellulaires

Les lignées cellulaires sont très utilisées actuellement en toxicologie car peu coûteuses,

reproductibles, indépendantes de tout prélèvement oculaire avec une croissance cellulaire

rapide, fiable et stable dans le temps.

Toutes les lignées ne sont pas identiques et il est très important de bien connaître leurs

caractéristiques de croissance, leurs caractères phénotypiques et leurs propriétés

fonctionnelles pour pouvoir interpréter les résultats. Il faudra également tenir compte du

caractère plus ou moins indifférencié des cellules en lignées dépendant en partie du nombre

de passages cellulaires déjà effectués jusqu‟alors.

Certaines lignées cellulaires ont été immortalisées par transfection, telle que la lignée HC0597

(transformée par infection par un plasmide RSV-T codant pour l‟oncogène T de SV40, virus

simien) qui a déjà été utilisée pour l‟étude des effets de la thymosine bêta 4 sur

l‟inflammation oculaire et de l‟apoptose induite par le BAC, ou pour étudier les effets de TNF

et IFN sur la sécrétion de molécules chimiotactiques comme l‟IL-8 (80, 81).

Une autre lignée cellulaire conjonctivale, la lignée de WKD (Wong Kilbourne derivative) de

Chang, celle que nous avons utilisée pour nos travaux, a été issue de cellules conjonctivales

humaines, spontanément immortalisées. Cette lignée présente plusieurs caractéristiques

communes avec les cellules épithéliales conjonctivales comme la présence de desmosomes, le

développement de microvillosités, la présence du récepteur à l‟EGF et des marqueurs

muciniques (79). Cependant, elle présente également des différences morphologiques et

fonctionnelles en comparaison avec des cellules en culture primaires et des cellules

épithéliales de conjonctive (tableau 2 et 3). Par exemple, les cellules de Chang ont un aspect

plutôt fibroblastique, avec une expression élevée de vimentine sans expression de la

cytokératine 4 ni de la E-cadhérine, rendant compte d‟un aspect plus mésenchymateux

qu‟épithélial. Toutefois, les test de stimulations au TNF et à l‟IFN semblent les rendre

comparables aux cultures primaires et utilisables pour des études de toxicologie in vitro, mais

aussi pour des études fonctionnelles comme la production de cytokines en réponse à des stress

oxydant, d‟inflammation et d‟apoptose (82, 83).

25

Cultures

Primaires

Lignée de

Chang

Normal IFN gamma TNF alpha normal IFN gamma TNF alpha

HLA DR +/- - +/- -

CD40 ++ + =

CD44 ++ = +++ = =

ICAM-1 +++ +++

CD63 ++ ++ =

CD80 - - - - - -

CD86 - - - - - -

CD95/Fas + + =

E-Cadhérine + = = - - -

Pancytokératine +++ = = ++ = =

Cytokératine 4 ++ = = - - -

Vimentine ++ = = +++ =

Muc 1 ++ = + =

Muc 5 AC - NE NE - NE NE

Tableau 2 :

Effets de l’IFN et du TNF sur l’expression d’antigènes dans les cultures primaires

d’épithélium conjonctival ou sur les lignées de Chang *d‟après De Saint Jean M, et al. Exp Eye Res 2002

CD : Cluster de différenciation. HLA-DR : Human leukocyte antigen-D locus related protein. ICAM : Inter-

Cellular Adhesion Molecule. IFN Interferon. NE : non étudié. TNF : Tumor Necrosis Factor

c. Les modèles d‟épithéliums reconstitués en 3 dimensions

Il existe plusieurs types de modèles d‟épithéliums cornéens reconstitués en trois dimensions

(3D), le principal étant le modèle SkinEthic. Il est réalisé à partir de cellules épithéliales

cornéennes (lignées ou cultures primaires) qui, cultivées dans certaines conditions, peuvent se

26

stratifier et se différencier en des structures non kératinisées après ensemencement sur un

substrat spécifique.

L‟avantage des modèles 3D par rapport aux cultures cellulaires en deux dimensions est de

pouvoir reproduire, in vitro, les caractéristiques structurelles de la cornée. L‟effet du toxique

pourra être étudié sur toute l‟épaisseur de l‟épithélium. En revanche, cet outil est moins

accessible à des techniques nécessitant la dissociation des cellules comme pour la cytométrie

de flux.

27

IV. ETUDE DES INTERACTIONS CELLULAIRES DE CELLULES

CONJONCTIVALES EN LIGNEES AVEC DES LYMPHOCYTES ISSUS DU SANG

CIRCULANT (ANNEXE)

1. Introduction

Le BAC est le conservateur le plus couramment utilisé dans les collyres en ophtalmologie,

principalement pour le traitement de maladies oculaires chroniques telles que le glaucome, ou

l‟allergie oculaire. Au niveau oculaire, le renouvellement du BAC est très lent, et il a été

montré que des traces de BAC pouvaient être retrouvées jusqu‟à 7 jours après l‟instillation

d‟une seule goutte (84). La toxicité oculaire du BAC a été démontrée à plusieurs reprises par

de nombreux travaux de notre équipe et d‟autres auteurs, en utilisant des modèles in vivo et in

vitro (35, 85, 86, 87). Plusieurs études ont montré l‟implication du BAC dans de nombreuses

pathologies oculaires telles que l‟allergie, la fibrose, l‟inflammation et le syndrome sec

oculaire (88, 89, 90, 91, 92), ainsi que son rôle pro nécrotique, pro-apoptotique et pro-oxydant

sur les cellules conjonctivales in vitro et in vivo (93, 94, 95, 96). Cependant, la conjonctive

humaine n‟est pas seulement composée de cellules épithéliales conjonctivales, mais inclus

d‟autres types cellulaires tels qu‟une variété de cellules inflammatoires et de cellules à mucus,

en contact étroit avec les vaisseaux sanguins et donc les lymphocytes extra oculaires (97, 98,

99, 100). Tous ces types cellulaires participent au maintien physiologique de la surface

oculaire, et seraient impliqués directement dans la survenue d‟une pathologie inflammatoire

épithéliale de la surface oculaire (73, 82).

Pour évaluer la toxicité du BAC ou d‟autres xénobiotiques sur l‟épithélium conjonctival, la

méthode la plus courante est basée sur l‟utilisation de modèles in vitro offrant la possibilité

d‟étudier l‟influence de métabolites, médiateurs ou médicaments, tout cela se faisant dans un

environnement contrôlé, stable et fiable. Actuellement sont disponibles deux principales

lignées de cellules épithéliales conjonctivales, continues, non transfectées, qui sont les

cellules de « Wong-Kilbourne derivative of Chang » (WKD) (101) et les cellules « IOBA-

NHC » (102). La lignée de cellules WKD a été isolée à partir d‟un épithélium conjonctival

humain normal, puis spontanément immortalisée (103). Mais cette lignée diffère de

l‟épithélium conjonctival normal et d‟une culture primaire de cellules épithéliales

conjonctivales par ces caractéristiques phénotypiques ainsi que ses réponses à certaines

cytokines pro inflammatoire (79) et, généralement, la réserve émise pour valider l‟utilisation

d‟une lignée cellulaire comme un équivalent de tissu humain est la ressemblance

28

phénotypique de cette lignée avec son homologue précurseur non transformé. Les cellules

WKD sont ainsi largement utilisées comme modèle in vitro unicellulaire fiable d‟étude de la

surface oculaire, et ont déjà permis à de nombreux travaux de prouver les effets toxiques du

BAC (78, 104), mais toutes ces études in vitro se sont basées sur l‟utilisation des cellules

WKD prises isolement, sans tenir compte de la composante inflammatoire qui existe en

permanence au niveau de l‟épithélium conjonctival normal. Des interactions cellulaires in

vitro entre des cellules épithéliales et des cellules inflammatoires ont déjà été analysées dans

des modèles de peau ou de poumon (105, 106, 107, 108). De tels travaux de coculture ont été

menés également au niveau conjonctival en mettant en interaction une culture primaire de

cellules épithéliales de conjonctive avec des lymphocytes issus du sang circulant (Peripheral

Blood Lymphocytes, PBL), retrouvant des modifications de caractéristiques à la fois sur les

lymphocytes et sur les cellules épithéliales (109). En effet, les auteurs ont montré

principalement que le contact direct, ou par le biais de médiateurs solubles, entre ces deux

types cellulaires permettait l‟expression du marqueur HML-1/CD103 à la surface des

lymphocytes après sept jours de coculture, rendant compte de leurs interactions in vitro et des

conséquences moléculaires qui en découlent. Mais, en comparaison avec une culture primaire,

une lignée cellulaire telles que les cellules WKD offre une meilleure reproductibilité, une

acquisition plus rapide des résultats et est indépendante de la disponibilité ou non des cellules

épithéliales issues des biopsies conjonctivales. C‟est pourquoi les cellules de WKD ont été

choisies à de nombreuses reprises par le passé pour effectuer des études de toxicologie sur la

surface oculaire (78, 94, 104). Une nouvelle étape serait donc d‟associer cette lignée cellulaire

avec des cellules inflammatoires et d‟étudier ainsi leurs interactions. Ainsi, pour mieux

répondre aux travaux de Gomes et al. (109), nous avons commencé par associer la lignée de

cellules WKD, déjà validée sur le plan toxicologique, avec des PBL. Par conséquent,

l‟objectif de cette étude fut d‟évaluer les interactions entre les cellules WKD et les PBL en

vue de développer et de valider in vitro le potentiel du nouveau modèle dans le but d‟étudier

les pathologies de la surface oculaire et d‟avancer plus loin dans la recherche toxicologique.

2. Matériels et Méthodes

a. La lignée de cellules conjonctivales :

Les cellules conjonctivales de WKD (clone 1 to 5c-4 American Type Culture Collection

[ATCC, Manassas, VA]-certified cell line [CCL], 20.2) ont été cultivées selon un protocole

29

standardisé, avec des conditions normalisées (atmosphère humidifiée à 37 °C avec 5% de

CO2), en flasque de 75 cm2, dans un milieu de culture “Dulbecco” minimum essentiel à leur

croissance (Dulbecco‟s minimum essential medium, DMEM) supplémenté en serum de veau

foetal à 10% (fetal bovine serum, FBS), en glutamine à 1%, avec 50 UI/ml de pénicilline et 50

UI/ml de streptomycine.

Les cellules étaient repiquées une à deux fois par semaine par trypsination. Le développement

normal des cellules était contrôlé quotidiennement avec un microscope inversé a contraste de

phase (Leica, DMIRB). Ainsi, après trypsination à confluence et comptage, pour les test de

cytométrie de flux, les cellules étaient incubées dans des plaques 6 puits (Corning, Schiphol-

Rijk, the Netherlands) et sur des lamelles (Lab-Tek™ II chambered coverglass; Nunc

International, Naperville, IL) pour l‟analyse en immunofluorescence standard et en

microscopie confocale. Les cultures cellulaires étaient maintenues en incubation à 37°C

pendant 24 heures puis, à sub-confluence (une fois que 70% de la surface du puit de culture

était couverte), étaient exposées à différentes concentration de BAC.

b. Les lymphocytes issus du sang périphérique :

En partenariat avec l‟agence française du sang (AFS), les lymphocytes étaient obtenus à partir

du sang périphérique de donneurs sanguin anonymes et volontaires sains. L‟AFS réalisait

l‟extraction plaquettaire de l‟échantillon de sang de ces donneurs puis nous fournissait les

reliquats de cette procédure, à savoir le culot de cytaphérèse, dans l‟objectif que nous

séparions les lymphocytes périphériques des globules rouges. Ces deux types cellulaires,

contenus dans les culots de cytaphérèse étaient séparés par centrifugation à 400g pendant 30

minutes selon la technique du gradient de Ficoll (Sigma Chemical Inc, St Louis, MO, USA)

permettant d‟isoler les cellules mononuclées. Les PBL étaient lavés dans un tampon de

solution phosphate salée (phosphate buffer saline, PBS), puis centrifugés à nouveau à 300g

pendant 15 minutes, lavés dans du PBS, puis centrifugés une dernière fois à 200g pendant 10

minutes. Les PBL ainsi isolés étaient maintenus en suspension dans un milieu RPMI 1640

(Roswell Park Memorial Institute medium) supplémenté en FBS à 10% puis mis en culture

selon des conditions standard (atmosphère humidifié avec 5% de CO2 et à 37 °C) pendant 12

heures dans des flasques de 75 cm2. Le surnageant était prélevé et lavé deux fois.

c. Les traitements cellulaires :

30

Pour les expériences d‟activation lymphocytaire in vitro, les lymphocytes étaient incubés dans

leur milieu standard de RPMI 1640 avec 2.5 ng/ml de phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA,

Sigma, St Louis, MO, USA) et 250 ng/ml de Ionomycine (Sigma) à 37°C. Après stimulation,

les cellules étaient lavées trois fois dans du RPMI 1640. Les cellules de WKD étaient traitées

avec de la Trichostatine A (Trichostatin A, Ready Made Solution 5mM in DMSO [0.2μm-

filtered], from Streptomyces sp., Sigma

) à 0.33M pendant 24 heures sous conditions

standards, dans un milieu de culture “Dulbecco” minimum essentiel à leur croissance

(Dulbecco‟s minimum essential medium, DMEM) supplémenté en serum de veau feotal à

10% (fetal bovine serum, FBS), en glutamine à 1%, avec 50 UI/ml de pénicilline et 50 UI/ml

de streptomycine, avec pour objectif de faire exprimer la E-Cadhérine à la surface des WKD

(110).

En accord avec de précédents travaux sur cette même lignée cellulaire (94), les cellules de

WKD, une fois arrivées à sub-confluence (surface de plaque couverte à 70%) étaient alors

exposées à différentes concentrations de BAC (10−2

%, 5.10−3

%, 10−3

%, 10−4

%, et 10−5

%) ou

de PBS pendant 15 minutes, suivi de 24 heures de récupération en milieu complet, afin

d‟évaluer la viabilité cellulaire et les effets toxiques du BAC sur ce modèle. Les

concentrations de BAC choisies sont équivalentes ou inférieures à celles rencontrées dans la

plupart des collyres disponibles actuellement sur le marché. Les concentrations de 10−1

% et

supérieures n‟ont pas été testé car de toxicité trop importante sur les cellules conjonctivales in

vitro entraînant une lyse cellulaire immédiatement après l‟application du traitement. Le temps

d‟incubation du traitement appliqué aux cellules de WKD (et lors de leur coculture avec les

PBL) était de 15 minutes suivi de 24 heures de récupération. Cette période de 24 heures de

récupération a été testé en vue de s‟approcher au plus près des conditions cliniques au cours

desquelles la conjonctive peut être protégée généralement après l‟instillation de la goutte de

collyre.

d. La coculture :

1 ml de PBL, à la concentration de 106

cellules/ml, était mis en coculture avec des cellules de

WKD arrivées à confluence. Les PBL étaient disposés, soit en contact direct avec les cellules

épithéliales, soit séparés des cellules de WKD par le biais d‟une membrane poreuse appelée

Transwell (Cell culture inserts, translucent PET membrane, 0.4m, BD Falcon, BD

Biosciences), qui permettait d‟éviter tous contacts direct entre les types cellulaires, mais

laissait librement la place aux échanges entre les deux milieux de culture. Après 1 ou 7 jours

31

de coculture, les lymphocytes étaient collectés et remis en suspension dans 2 ml de milieu

standard (RPMI 1640 supplémenté avec du FBS à 10%), puis analysés en cytométrie de flux.

e. La Cytométrie de flux :

Le marqueur d‟inflammation HLA DR (Human leucocyte Antigen Class II), le récepteur lié à

l‟apoptose Fas (APO-1, CD95), le marqueur de co-stimulation CD86, l‟antigène HML-1

(Human Leucocyte Antigen-1) et la molécule d‟adhésion E-cadhérine ont été testé sur les

cellules conjonctivales de WKD. Toutes ces mesures se sont déroulées en utilisant le

cytomètre Cytomics FC500-CXP (Beckman Coulter, Miami, FL), équipé d‟un laser Argon

émettant à 488 nm. L‟anticorps anti-IgG de souris conjugué au FITC/PC5 a été utilisé comme

contrôle négatif pour estimer la fluorescence de fond non spécifique.

La dégradation de l‟ADN cellulaire a été mesurée à l‟aide de la détermination du pic sub-G1

en cytométrie de flux par le biais d‟un histogramme avec pic en avant du pic sub-G1, sur l‟axe

des intensités de fluorescence, qui caractérise le processus d‟apoptose tardive. Après avoir été

mis en coculture, les PBL et les cellules de WKD, préalablement traitées par le BAC ou le

PBS, ont été récupérés en utilisant de l‟acide ethylenediaminetetraacetique (EDTA) à la

concentration de 1mM, puis mis en suspension dans 1ml de PBS et, enfin, fixés dans du

paraformaldehyde (PFA) à 0.5% pour une conservation à 4 °C pendant 24 heures. Finalement,

les échantillons sont lavés dans du PBS froid et les cellules perméabilisées grâce à la saponine

à la concentration de 0.1%, colorées avec 50μg/ml de iodure de propidium (PI, Interchim,

Montluçon, France), et analysées au cytomètre.

f. La microtitration cytofluorimétrique adaptée aux microplaques :

Pour la réalisation de nos tests de cytotoxicité par cytofluorimétrie en microplaques, nous

avons utilisé un spectrofluorimètre Safire (Tecan Instruments, Lyon, France), composé de

deux monochromateurs pouvant chacun balayer une bande spectrale de 250 À 1000 nm. Ce

spectrophotomètre permet d‟enregistrer des spectres de fluorescence en excitation et en

émission. Au total, la microtitration cytofluorimétrique est une technique sensible (pg-fg/ml),

reproductible et spécifique permettant la mise au point de méthodes standardisées d‟analyse

de la cytotoxicité et du stress oxydant, préconisée notamment lors d‟études multicentriques

pour l‟évaluation de méthodes alternatives en toxicologie cellulaire (111, 112, 113).

32

Le colorant Hoechst33342 a été utilisé pour évaluer l‟apoptose de cellules de WKD, et le

colorant rouge neutre (Neutral Red, NR, Fluka, Ronkonkoma, NY) a été utilisé pour évaluer

leur intégrité membranaire, paramètre de très près corrélé à la viabilité cellulaire. Dans toutes

ces expériences, le PBS a été manipulé comme contrôle. Les résultats de microtitration

cytofluorimétrique adaptée aux microplaques ont été exprimés en unité de fluorescence

comme un pourcentage par rapport au contrôle du PBS. Les résultats de la coloration au

Hoechst33342 ont été rapportés aux résultats de la coloration par le rouge neutre afin de

corréler ces derniers à la viabilité cellulaire.

g. Analyse de la morphologie cellulaire :

Nous avons réalisé des expériences d‟immunofluorescence standard en utilisant différentes

substances fluorescentes telles que la phalloïdine (F-actin detection, 200U/ml; Alexa Fluor

488 Phalloidin, Sigma, St Louis, MO, USA), le PKH67 et le PKH26, deux colorants

lipophiles émettant dans le vert et le rouge respectivement. Ces colorations ont été analysées

au microscope confocal à épifluorescence (E800, PCM 2000; Nikon, Tokyo, Japan) dans le

but d‟évaluer les modifications morphologiques des deux types cellulaires étudiés lors de la

coculture. Après 30 minutes d‟incubation avec la phalloïdine, les cellules sont lavées dans du

PBS avant d‟être colorées au iodure de propidium puis examinées directement au microscope.

Les cellules de WKD ont été colorées avec le PKH67 (Green Fluorescent Cell Linker Kit,

Sigma), et les PBL avec le PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma). Pour la

coloration avec ces substances, les cellules de WKD et les PBL (20 millions de cellules pour

chaque type) ont été lavés soit dans du milieu DMEM supplémenté en glutamine à 1% avec

50 UI/ml de pénicilline et 50 UI/ml de streptomycine sans FBS pour les cellules de WKD,

soit dans un milieu de RPMI 1640 pour les PBL, à 400g pendant 5 minutes puis mis en

contact avec le colorant PKH à la concentration de 4M pendant 4 minutes. Pour finir, les

cellules colorées ont été lavées 3 fois dans le PBS puis remises en suspension dans leur propre

milieu de culture complet.

h. La microscopie électronique à balayage :

La microscopie électronique à balayage a été spécifiquement utilisée pour évaluer les

interactions cellulaires entre les cellules de WKD et les PBL. Pour ce faire, les cellules ont

d‟abord été fixées dans le glutaraldehyde à 2.5% (Electron Microscopy Science, Hatfield,

33

USA) pendant 45 minutes, puis dans l‟osmium OsO4 réduit à la concentration de 2%

(Electron Microscopy Science, Hatfield, USA) pendant 45 minutes également. Après ces deux

étapes de fixation, les cellules ont été déshydratées dans l‟éthanol, nettoyées à l‟oxyde de

propylène et saturées par l‟Hexamethyldisilane (Sigma). Puis, une fois passé le dernier

processus de saturation avec le gold-palladium à l‟aide du saturateur JEOL FINE COAT ion

sputter JFC-1100, les cellules ont été examinées avec le microscope électronique à balayage

JEOL 35CF (Hitachi

, Japan).

i. Les réactifs :

Le iodure de propidium, le PBS, les colorants PKH26 et PKH67 ont été obtenus auprès de

Sigma (St Louis, MO, USA).

L‟anticorps monoclonal de souris anti-CD103 humain (Mucosa Lymphocyte Antigen, clone

Ber-ACT8, FITC-conjugated), l‟anticorps de chèvre conjugué au FITC anti-souris et

l‟anticorps de lapin conjugué au phycoérythrine (PE) anti-souris ont été fournis par DAKO

(Glostrup, Denmark).

Les anticorps monoclonaux de souris anti-HLA-DR humain (Clone Immu-357, FITC-

conjugated), anti-CD86 (Clone HA5.2B7, PE-conjugated) et anti-CD95 (Clone 7C11, PE-

conjugated) ont été fournis par la société Coulter (Miami, FL, USA).

Les anticorps de contrôle (IgG1 de souris purifié et conjugué au FITC) ont été acquis auprès

d‟Immunotech (Marseille, France).

La phalloïdine (Alexa Fluor 488-conjugated) a été obtenu auprès de la société Molecular

Probes (Leiden, The Netherlands).

Tous les réactifs ont été utilisés selon les recommandations du fournisseur.

3. Résultats

a. Les interactions cellulaires :

Des échanges de membranes plasmiques entre les deux types cellulaires ont été observés

après un jour de coculture entre les cellules de WKD et les PBL en contact direct (Figure 2).

Cette intégration de membrane plasmique lymphocytaire au sein des cellules épithéliales de

WKD débute rapidement lors de la mise en contact des deux types cellulaires. Un pic a été

obtenu après 90 minutes de coculture (figure 3). Ces contacts rapprochés relevés entre les

34

cellules épithéliales et les lymphocytes, ressemblant à une fusion de membrane cellulaire, ont

également été observés en microscopie électronique à balayage (Figure 4), et ce phénomène

pourrait s‟apparenter à une forme de pinocytose. Les PBL, lors de la coculture avec les

cellules épithéliales, se sont disposés entre les tapis de cellules de WKD (Figure 5) en

montrant, après coloration avec la phalloïdine et analyse au microscope à fluorescence, la

formation d‟expansions membranaires cytoplasmiques (Figure 6).

b. L‟apoptose :

Les résultats de mort cellulaire ont été exprimés en pourcentage de survenue de l‟évènement

sub-G1 rapporté au nombre total de la population cellulaire. Après un jour de coculture,

l‟apoptose des cellules WKD cultivées en coculture avec des PBL non activés ne variait pas.

D‟un autre côté, comme attendu, l‟apoptose des cellules de WKD a augmenté lorsqu‟elles

étaient en contact avec des PBL activés par le PMA et l‟Ionomycine. Ces résultats de

cytotoxicité de la présence des PBL activés sur les cellules de WKD, après un jour de

coculture, étaient similaires que la coculture soient réalisée en contact direct ou que les deux

types cellulaires soient séparés l‟un de l‟autre lors de la coculture par une membrane poreuse

(appelée Transwell). Ensuite, une altération du contenu en ADN cellulaire des cellules de

WKD, préalablement traitées pendant 15 minutes avec du BAC à la concentration de 5.10-3

%,

suivies de 24 heures de récupération, a été observée lorsque cette période de récupération a

été accompagnée par la présence dans le milieu de culture de PBL non activés (Figure 7)

Cette potentialisation de l‟effet cytotoxique de la présence des PBL non activés n‟a pas

seulement été notée lorsque la coculture était en contact direct mais également lorsque les

deux types cellulaires étaient séparés par un Transwell. La concentration de BAC à 5.10-3

%

que nous avons utilisée, telle qu‟elle a déjà été décrite (114), correspond à la concentration

seuil de BAC induisant une toxicité significative sur les cellules de WKD. En effet, plus la

concentration de BAC augmente, plus l‟intégrité des membranes cellulaires des cellules de

WKD diminue. La cytotoxicité la plus importante était observée pour les concentrations de

BAC les plus élevées, supérieures à 5.10-3

%. Et cette concentration seuil de BAC est la

concentration inférieure ou égale à celle retrouvée dans la grande majorité des collyres utilisés

en ophtalmologie.

c. Modifications des cellules épithéliales :

35

Que ce soit de façon constitutive ou après coculture avec des PBL, nous n‟avons jamais pu

retrouver l‟expression membranaire de la E-Cadhérine à la surface des cellules de WKD,

après analyses faites en cytométrie de flux et en immunofluorescence standard. Cependant, le

traitement des cellules de WKD par la Trichostatine A (TSA) a induit une faible expression

membranaire de l‟E-Cadhérine, détectée en cytométrie de flux (Figure 8) et en

immunofluorescence standard (Figure 9).

Le marqueur d‟inflammation HLA-DR a vu son expression augmenter sur les cellules de

WKD après 1 jour de coculture en contact direct avec des PBL non activés, ainsi qu‟après 7

jours de coculture sans contact direct (cellules séparées par un Transwell) avec des PBL

activés (Figure 10).

Le marqueur d‟apoptose CD95/Fas ainsi que le marqueur de costimulation CD86 ont été

exprimés sur les cellules de WKD après 1 jour de coculture en contact direct avec des PBL

activés. De plus, il a été retrouvé un aspect spiculé des cellules de WKD, compatible avec une

souffrance cellulaire, augmentant avec le temps de la coculture, sur un marquage à la

phalloïdine et une coloration au iodure de propidium.

d. Modifications des cellules lymphocytaires :

Dans notre étude, nous n‟avons pas pu mettre en évidence d‟expression du marqueur

CD103/HML-1 après coculture entre les PBL et les cellules de WKD. Cependant, la

réalisation d‟une coculture entre des cellules de WKD prétraitées par la TSA avec les PBL a

montré une expression modérée mais significative du marqueur CD103 à la surface des PBL

(Figure 11).

e. Test toxicologique sur le modèle :

L‟apoptose des cellules de WKD traitées 15 minutes par le BAC augmente avec la

concentration du BAC, échelonnée de 5.10-4

% à 5.10-2

%, sans rapport avec la présence de

PBL dans le milieu de culture pendant les 24 heures de récupération post-traitement.

Cependant, pour les concentrations de BAC les plus faibles (inférieures à 10-2

%), nous avons

pu constater un effet potentialisant sur l‟apoptose des cellules de WKD de la présence des

PBL en contact direct dans le milieu de récupération, corroborant les résultats trouvés lors des

tests d‟apoptose au sub-G1. A l‟inverse, nous avons noté que pour les concentrations de BAC

36

les plus élevées (supérieures à 5.10-3

%), la présence des PBL en contact direct dans le milieu

de récupération induisait une diminution de l‟apoptose de cellules de WKD (Figure 12).

37

Figure 2.

Analyse de la morphologie cellulaire et des interactions cellulaires au cours d‟une coculture

entre des cellules de WKD et des PBL. Les cellules de WKD sont colorées en vert par le

PKH67 et les PBL sont colorés en rouge par le PKH26. Les photos A et B représentent la

même zone photographiée au microscope à fluorescence, soit en utilisant un filtre vert soit en

utilisant un filtre rouge. Les cellules de WKD ont été cultivées en coculture avec des PBL en

contact direct pendant 24 heures. Des échanges de membranes plasmiques entre les deux

types cellulaires ont été observés après un jour de coculture exclusivement si les cellules de

WKD étaient en contact direct avec les lymphocytes. Nous pouvons noter ici que les cellules

de WKD apparaissent à la fois vertes et rouge, signifiant qu‟un transfert de colorant entre les

deux types cellulaires s‟est produit. Les expériences contrôles (photos non fournies) faites

avec soit les cellules de WKD cultivées seules soit avec les cellules de WKD cultivées en

coculture avec des PBL mais séparées par une membrane PET translucide présentant des

pores de 0.4m de diamètre (pouvant laisser passer les colorant PKH), montre des cellules de

WKD restant exclusivement verte, sans aucun transfert de colorant rouge par les PBL. Ici, sur

les photos, l‟aspect de coloration jaune est lié à une surexposition à la fluorescence du

microscope.

A B

38

Figure 3.

Analyse de la morphologie cellulaire et des interactions cellulaires au cours d‟une coculture

entre des cellules de WKD et des PBL. Les cellules de WKD sont colorées en vert par le

PKH67 et les PBL sont colorés en rouge par le PKH26. Les photos A et C représentent la

même zone photographiée au microscope confocal, soit en utilisant un filtre vert (A) soit en

utilisant un filtre rouge (C). B et D représentent la même zone selon une coupe vertical (2

têtes de flèche). Les cellules de WKD ont été cultivées en coculture avec des PBL pendant 90

minutes. Des échanges de membranes plasmiques entre les deux types cellulaires ont été

observés dès 90 minutes de coculture, avec des cellules de WKD en contact direct avec les

PBL. En effet, nous pouvons noter ici l‟apparition de mottes de coloration rouge au sein des

cellules de WKD (flèches).

A

B

C

D

39

Figure 4.

Analyse en microscopie électronique à balayage de la morphologie cellulaire et des

interactions cellulaires au cours d‟une coculture entre des cellules de WKD et des PBL. Nous

pouvons noter ici les connections rapprochées entre les PBL (petite flèche) et les cellules de

WKD, ressemblant à une fusion de membranes cellulaires (grandes flèches).

Figure 5.

Analyse de la morphologie cellulaire et des interactions cellulaires au cours d‟une coculture

entre des cellules de WKD et des PBL. Les cellules de WKD sont colorées en vert par le

PKH67 et les PBL sont colorés en rouge par le PKH26. Les photos A, B et C représentent la

même zone photographiée au microscope confocal, soit en utilisant un filtre vert (A) soit en

utilisant un filtre rouge (C) soit en utilisant la fonction de « fusion » des deux images

précédentes. Les cellules de WKD ont été cultivées en coculture avec des PBL en contact

direct pendant 24 heures. Nous pouvons noter ici que les PBL prennent place entre les cellules

de WKD, dans le but probable de former des connections rapprochées avec ces dernières.

40

Figure 6.

Analyses au microscope à fluorescence de la morphologie cellulaire après coloration à la

phalloïdine des cellules de WKD et des PBL. Les deux types cellulaires ont été cultivé

ensemble en coculture pendant 24 heures. Le cytosquelette (F-actine) est coloré en vert par la

phalloïdine. Nous pouvons noter ici que les PBL développent des expansions membranaires

cytoplasmiques, en connections rapprochées avec les cellules de WKD.

41

Figure 7.

Analyse de l‟altération du contenu en ADN des cellules de WKD. L‟altération de l‟ADN

cellulaire a été mesurée par l‟étude en cytométrie de flux du pic sub-G1 sur les cellules de

WKD. Successivement, les cellules de WKD ont été cultivées seules dans du milieu standard

complet, puis en coculture pendant 24 heures avec des PBL séparées par un Transwell, puis

avec des PBL en coculture en contact direct. Ensuite, les mêmes expériences furent réalisées

en traitant au préalable les cellules de WKD par du BAC à la concentration de 5.10-3

%

pendant 15 minutes suivi de 24 heures de récupération seules, ou en présence sans contact de

PBL, ou en présence en contact direct de PBL. Nous pouvons noter ici la potentialisation de

l‟effet toxique des PBL en contact direct sur les cellules de WKD (flèche, p<0.001).

42

Figure 8.

Ce graphique représente l‟étude en cytométrie de flux de l‟expression de l‟E-Cadhérine

membranaire sur les cellules de WKD à l‟état basal et après traitement par la TSA à la

concentration de 0.33M pendant 24 heures dans un milieu standard complet. Nous pouvons

noter ici une expression positive de l‟E-Cadhérine membranaire à la surface des cellules de

WKD (flèche, p<0.001).

43

Figure 9.

Analyse en immunomarquage au microscope confocal de l‟expression d‟E-Cadhérine à la

surface des cellules de WKD. Les noyaux ont été contre colorés au DAPI. Sur la photo de

gauche, les cellules de WKD sont à leur état basal et sur la photo de droite, les cellules de

WKD ont été traitées pendant 24 heures avec la TSA. Nous pouvons noter ici une expression

positive d‟E-Cadhérine après traitement par le TSA (flèche).

44

Figure 10.

Ce graphique représente l‟étude en cytométrie de flux de l‟expression du marqueur

d‟inflammation HLA-DR sur la membrane des cellules de WKD à l‟état basal et après 1 ou 7

jours de coculture, en contact direct ou séparés par un Transwell, avec des PBL, activés par le

PMA et l‟Ionomycine (B) ou non (A). Les moyennes d‟intensité de fluorescence ont été

relevées et les résultats ont été exprimés en pourcentage par rapport au contrôle. Les PBL

activés ont été incubés avec 2.5 ng/ml de PMA et 250 ng/ml of Ionomycine à 37°C pendant 2

heures. Nous pouvons noter ici une expression positive du marqueur HLA-DR sur les cellules

de WKD après 24 heures de coculture en contact direct avec des PBL non activés, et après 7

jours de coculture sans contact direct avec des PBL activés (flèche, p<0.03).

45

Figure 11.

Ce graphique représente l‟étude en cytométrie de flux de l‟expression du marqueur CD103

sur la membrane des PBL après coculture avec les cellules de WKD prétraitées ou non par la

TSA. Nous avons quantifié les moyennes des intensités de fluorescence et les résultats ont été

exprimés en pourcentage de fluorescence. Nous pouvons noter ici une expression positive du

marqueur CD103 à la surface des PBL avec 24 heures de coculture avec des cellules de WKD

prétraitées par la TSA (flèche, p<0.001).

46

Figure 12.

Ce graphique représente les tests d‟évaluation de la toxicité du BAC sur les cellules de WKD,

mesurée à l‟aide des test HOESCHT et Rouge neutre en cytofluorimétrie sur microplaques.

Les résultats ont été exprimés par le rapport du test d‟apoptose HOESCHT au test

d‟évaluation de l‟intégrité des membranes cellulaires à l‟aide du Rouge neutre . Les cellules

de WKD ont été traitées par différentes concentration de BAC allant de 5.10-4

% à 5.10-2

%

pendant 15 minutes suivies de 24 heures de récupération dans un milieu complet, seules ou en

coculture avec des PBL non activés. Nous pouvons noter ici que pour les plus fortes

concentrations de BAC (supérieures à 5.10-3

%), la présence des PBL en contact direct dans le

milieu de récupération induisait une diminution de l‟apoptose de cellules de WKD, en

comparaison avec l‟apoptose induite par le BAC sur les cellules WKD seules (flèches,

p<0.001).

47

4. Discussion

In vivo, la conjonctive joue un rôle central dans le système immunitaire de la surface oculaire

et peut être basiquement décrite comme une étroite coopération de différents types cellulaires

comprenant les cellules immunitaires (telles que les cellules dendritiques, les lymphocytes…)

et les cellules épithéliales, toutes ces cellules participant de façon active à tous les processus

inflammatoires se déclenchant au niveau de la surface oculaire (115). Une forme

d‟investigation des pathologies de la surface oculaire et de la conjonctive en particulier est

l‟utilisation de modèles animaux. Cependant, les cultures cellulaires sont considérées comme

une parfaite alternative à l‟utilisation d‟animaux pour les expérimentations de recherche en

physiopathologie humaine. Les cellules épithéliales jouent le rôle central dans le

fonctionnement de la surface oculaire, et de précédents travaux réalisés par notre équipe se

sont déjà portés sur l‟utilisation de différentes lignées cellulaires pour étudier, par exemple,

les relations entre apoptose et processus inflammatoires dans le cadre d‟investigations en

toxicologie oculaire (73, 82, 95, 96). La culture cellulaire, et plus spécifiquement les lignées

cellulaires permettent de réaliser une croissance en cellules rapide et peu coûteuse en

comparaison avec les cultures primaires de cellules épithéliales conjonctivales. De plus,

reproductibilité et stabilité sont les deux autres avantages majeurs de l‟utilisation des lignées

cellulaires comme outils d‟étude de la surface oculaire. En effet, la lignée cellulaire de WKD,

la première lignée continue, non transfectée issue de cellules épithéliales de conjonctive

humaine, a déjà été très fréquemment utilisée pour des travaux d‟expérimentations portant

principalement sur l‟évaluation de la toxicité des conservateurs utilisés dans les collyres anti-

glaucomateux et anti-allergiques. Mais nous savons que la muqueuse conjonctivale fait

également partie du « système immunitaire muqueux » (116, 117, 118). Cette notion est

validée par la présence, au sein de la conjonctive et de son chorion, de « tissus lymphoïde

associé à la conjonctive » (conjunctiva-associated lymphoid tissue, CALT) composé d‟un

agglomérat de cellules lymphatiques, permettant au CALT de participer à l‟induction de la

production par les lymphocytes B d‟IgA spécifiquement dirigées contre des antigènes

exogènes à la conjonctive (119). Pourtant, cette « part » immunitaire de la conjonctive n‟a

jamais été prise en compte lors de tous les précédents travaux de toxicologie oculaire réalisés

in vitro, ces derniers se focalisant exclusivement sur les cellules conjonctivales seules. En

effet, les modèles in vitro utilisés jusqu‟alors se basaient simplement sur un système binaire

incluant les cellules épithéliales conjonctivales d‟une part et le médicament potentiellement

cytotoxique de l‟autre. Malheureusement, en dépit de leur utilité et de leur simplicité, ces

48

modèles ne semblent pas être entièrement adaptés aux études toxicologiques in vitro, car pas

assez proches de la réalité in vivo de la surface oculaire.

Différentes études par le passé se sont portées sur la coculture de lymphocytes et de cellules

cornéennes, donc en incluant cette part immunitaire de la conjonctive, pour les relations

possibles entre les différents types cellulaires (120, 121). Iwata et al. (122) utilisèrent des PBL

en coculture avec des cellules épithéliales de cornées humaines (human corneal epithelial

cells, HCE cells) pour déterminer le rôle de l‟épithélium dans l‟induction de la reaction

allogénique et dans le processus d‟activation lymphocytaire. Ils démontrèrent qu‟un

traitement préalable par l‟Interferon gamma entraînait l‟expression de l‟antigène HLA de

classe II sur les cellules de HCE, produisant une activation des lymphocytes allogéniques

fraîchement isolés. De plus, Gomes et al. (109) ont décrit un intéressant nouveau modèle de

coculture consistant en la mise en interaction de cellules épithéliales de conjonctive ou de

cornée en culture primaire avec des lymphocytes issus du sang périphérique. Ils étudièrent sur

ce modèle l‟expression du marqueur HML-1/CD103 à la surface des PBL après contact direct

ou indirect avec les cellules épithéliales de la surface oculaire, et ils montrèrent que

l‟expression du marqueur HML-1 à la surface des lymphocytes CD8+ n‟était pas corrélée au

statut d‟activation lymphocytaire.

Partant de là, notre objectif fut d‟étudier les interactions cellulaires entre des cellules

épithéliales en lignée et des lymphocytes issus du sang circulant, dans le cadre d‟un modèle

de coculture in vitro, puis de valider ce modèle comme une tentative de produire un meilleur

modèle d‟étude toxicologique que les cellules épithéliales en monocouche. Ce travail rentre

dans le cadre de la recherche et du développement d‟alternative aux modèles animaux. Cet

important champs de recherche est justifié dans le cadre tant du programme REACH

(Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of chemical substances, REACH,

2006) que du 7ième amendement de 1976 portant sur les directives “cosmétiques”, qui

baniera d‟ici 2013 tous les tests d‟ingrédients cosmétiques sur les animaux (123).

Dans notre étude, nous avons d‟abord mis en évidence la survenue d‟interactions rapprochées

in vitro entre les cellules de WKD et les PBL, telles que des échanges de membranes, une

fusion de membranes cellulaires pouvant s‟apparenter à une forme de macropinocytose. La

macropinocytose est un processus qui permet la capture d‟une grande quantité de matériel,

ressemblant à une forme d‟endocytose, et pouvant réguler, au sein de la cellule, l‟exocytose

ou d‟autres propriétés membranaires. Dans de précédents travaux, il a été montré que la

macropinocytose pouvait être soit un phénomène constitutif de la cellule, comme pour les

cellules phagocytaires professionnels, telles que les cellules dendritiques ou les macrophages

49

(124), soit un phénomène induit comme pour les cellules épithéliales lorsqu‟elles sont

stimulées par des facteurs de croissance (125). Dans notre travail, les cellules de WKD ont

englouti et digéré des fragments de lymphocytes selon un mode temps-dépendent similaire à

ce qui pourrait être observé chez les phagocytes professionnels. Mais ces macropinosomes

n‟ont pas été redirigé vers la fusion avec les lysosomes comme cela aurait pu être le cas, au

regard de la façon dont ces pinosomes sont traités dans les macrophages. En effet, le matériel

internalisé, dans nos travaux, a été recyclé à la membrane, en moins de 24 heures. Au niveau

des muqueuses, une telle activité de macropinocytose des cellules épithéliales a déjà été

décrite comme support de la fonction de nettoyage des phagocytes résidents professionnels.

En effet, il a été démontré que la macropinocytose induite par l‟EGF au sein des cellules

épithéliales permettait la capture et l‟internalisation de matériel qui était alors très rapidement

recyclé en retour, à la membrane de la cellule (126, 127). Ce phénomène met en lumière un

des rôles possibles de traitement et de présentation d‟antigène endogènes et exogènes de la

cellule épithéliale au sein du système immunitaire muqueux. De plus, dans notre modèle de

coculture, les interactions très rapprochées entre les deux types cellulaires ont conduit à la

fusion des membranes cellulaires.

De nombreuses hypothèses concernant la physiopathologie des principaux troubles de la

surface oculaire ont été émises suites à des travaux réalisés in vitro sur une monocouche de

cellules épithéliales en lignée de WKD. Principalement, il a été démontré que l‟Interferon

gamma induisait le programme de mort cellulaire et entraînait une surexpression du marqueur

HLA-DR et de l‟antigène CD95/Fas à la surface des cellules épithéliales (83). Dans notre

étude, l‟expression de HLA-DR sur les cellules de WKD était augmentée après 7 jours de

coculture soit en contact direct avec des PBL non activés, soit sans contact direct (séparés par

un Transwell) avec des PBL activés. Le marqueur d‟apoptose CD95/Fas était exprimé sur les

cellules de WKD seulement après 1 jour de coculture en contact direct avec des PBL activés.

En rapport avec ses résultats, nous pouvons émettre l‟hypothèse que dans notre système de

coculture, en présence de PBL, l‟activation cellulaire, l‟inflammation et l‟apoptose pourraient

éventuellement être médiées par le ou les mêmes stimuli et les mêmes voies de transduction,

liés à des interactions rapprochées entre les deux types cellulaires, via un contact cellulaire

direct ou par le biais de médiateurs solubles. La stimulation allogénique qui s‟en suit peut

alors parfaitement résulter initialement de la libération d‟Interferon gamma. Par exemple,

L‟interferon gamma pourrait permettre l‟expression du marqueur HLA-DR sur les cellules

épithéliales, et par la suite induire la réponse allogénique lymphocytaire par le biais du

complexe majeur d‟histocompatibilité (121). Cependant, dans d‟autres modèles de réactions

50

primaires lymphocytaires, la réaction allogénique des lymphocytes ne fut pas

systématiquement induite même en la présence de l‟Interferon gamma ou du marqueur HLA-

DR (128, 129), pour des raisons qui demeurent encore actuellement obscures. Il a été suggéré

que l‟expression d‟HLA-DR était alors nécessaire mais pas forcement suffisante. De plus,

Gomes et al. (130) ont étudié les changements induits sur l‟expression des antigènes de

surface des lymphocytes activés et non activés provenant des mêmes donneurs mis en

coculture avec des cellules épithéliales de cornée provenant de donneurs différents. Ils ont

observé que la réaction allogénique causée par la présentation d‟antigènes par les cellules

épithéliales entraînait une expression très variable du marqueur d‟activation CD25 à la surface

des lymphocytes, en concluant que l‟utilisation de lymphocytes allo réactifs dans un modèle

de coculture avec des cellules épithéliales n‟influencerait pas particulièrement l‟expression

d‟antigène de surface sur les deux types cellulaires. L‟absence d‟utilisation de l‟Interferon

gamma au cours de leurs expérimentations pourrait expliquer la variabilité d‟expression du

marqueur d‟activation lymphocytaire. En transposant le même raisonnement à nos résultats, la

surexpression des marqueurs HLA-DR et CD95/Fas induite par la présence des PBL n‟a très

probablement pas été influencée par la réaction allogénique. La surexpression de HLA-DR a

plutôt été induite par un effet pro inflammatoire sur les cellules de WKD lié à la présence de

cellules immunitaires.

Le système immunitaire muqueux inclus de façon traditionnelle la présence de lymphocytes

intra épithéliaux (Intra Epithelial Lymphocytes, IEL) qui sont représentés en majorité par une

sous population spécialisées de lymphocytes T CD8+ présentant un récepteur T αβ positif

(131, 132, 133). Plus de 90% de ces IEL expriment le récepteur HML-1/CD103, contre

seulement 2% des PBL (134, 135). Cette population de lymphocytes T pourrait jouer un rôle

spécial de défense immunologique au niveau de la surface oculaire. Le marqueur HML-

1/CD103 est une molécule d‟adhésion appartenant à la famille des intégrines, composée d‟une

sous unité 7 en association avec une sous unité E (136), permettant une adhésion

spécifique des IEL avec les cellules épithéliales muqueuses. Cette adhésion des IEL aux

cellules épithéliales se fait grâce au récepteur HML-1/CD103 sur les IEL se liant à une

molécule d‟adhésion de distribution non ubiquitaire appelée E-Cadhérine (137, 138, 139,

140). Les cadhérines constituent une famille de molécules d‟adhésion de surface impliquées

dans l‟adhésion cellulaire via une interaction moléculaire spécifique homophilique calcium-

dépendante (139). L‟E-cadhérine est nécessaire pour la formation des jonctions adhérentes

entre les cellules épithéliales. Gomes et al. (109) ont retrouvé une expression de l‟intégrine

E7 (CD103/HML-1) sur les PBL après sept jours de coculture avec des cellules épithéliales

51

en culture primaire, indiquant un probable changement de phénotypes de PBL en IEL. Sept

jours de coculture étaient le délai d‟incubation qui semblait optimal pour l‟expression du

marqueur HML-1 sur les lymphocytes activés (140). Dans notre étude, l‟expression du

marqueur CD103/HML-1 n‟a pas été induite sur les PBL après 1 ou 7 jours de coculture avec

des cellules de WKD. La principale différence entre les cellules épithéliales en culture

primaire et la lignée de cellules de WKD réside dans la perte de l‟expression de l‟E-cadhérine

à la surface des cellules de WKD (79). D‟ailleurs, bien que la plus fréquente des réserves

émises sur les lignées cellulaires pour les accepter en tant qu‟équivalent de tissu humain fiable

soit la ressemblance phénotypique de la lignée immortalisée avec son homologue précurseur

non transformé, les cellules de WKD partageraient de nombreuses caractéristiques

morphologiques et fonctionnelles communes avec les cellules épithéliales humaines in vivo.

Par exemple, Les cellules de WKD montrent un développement de microvilli, la présence

d‟un récepteur à l‟EGF, des desmosomes, une sécrétion de mucine… A l‟inverse, les cellules

de WKD présentent également des caractéristiques qui font d‟elles des cellules immortalisées,

dédifférenciées avec un phénotype mésenchymateux d‟apparence fibroblastique, telles que

l‟expression élevée de la vimentine, la perte de la E-cadhérine, l‟expression de la cytokératine

4 et la présence d‟anomalies caryotypiques (79, 101, 103). Toutefois, l‟utilisation de la

Trichostatine A (TSA), un inhibiteur des histones désacétylases (HDCACs inhibitor) nous a

permis de retrouver une expression faible mais positive d‟E-Cadhérine à la surface des

cellules de WKD. En effet, selon des travaux antérieurs, il avait été montré que la régulation

négative à long terme de l‟expression d‟E-Cadhérine était liée à un processus transcriptionnel,

utilisant des facteurs répresseurs de la transcription tels que les protéines en “doigt de zinc” et

les histones désacétylases (141, 142, 143). Nous avons donc choisi d‟utiliser un inhibiteur des

histones désacétylases afin de permettre la suppression de la répression de transcription de

l‟E-cadhérine au sein des cellules de WKD. Ainsi, dans notre travail, nous avons pu observer

une fine expression du marqueur CD103/HML-1 à la surface des PBL après 1 et 7 jours de

coculture avec des cellules de WKD positives pour l‟E-cadhérine, c‟est à dire ayant été

prétraitées par la TSA. D‟autres expérimentations seraient tout de même maintenant

nécessaires afin de définitivement confirmer la possibilité de la transformation des PBL en un

phénotype d‟IEL au contact de cellules épithéliales positives pour l‟E-cadhérine.

D‟anciennes études toxicologiques utilisant le Hoechst33342 et le rouge neutre en

cytofluorimétrie sur microplaques avaient évalué les effets proapoptotiques et pronécrotiques

du BAC sur les cellules de WKD. Cet effet toxique du BAC augmentait avec la concentration

de ce dernier (114). Dans notre modèle, les PBL semblent montrer un rôle protecteur sur les

52

cellules de WKD pour les concentrations de BAC les plus élevées (celles supérieures à 5.10-

3%), concentration de BAC pour lesquelles l‟apoptose des cellules épithéliales est maximale,

comme si une mort excessive des cellules épithéliales pouvaient alors envoyer un message de

demande de survie aux PBL. A l‟inverse, pour les plus faibles concentrations de BAC (celles

inférieures à 10-3

%), les PBL semblent alors avoir un rôle pro-apoptotique sur les cellules de

WKD. Des expériences complémentaires sont donc nécessaires dans un premier temps pour

confirmer définitivement cet effet bipolaire de la présence de PBL sur les cellules de WKD en

fonction de la concentration de BAC, puis dans un second temps pour définitivement valider

ce modèle séduisant mais complexe pour de nouvelles études toxicologiques. Quoi qu'il en

soit, ces résultats permettent déjà la mise en lumière des interactions entre les cellules

immunitaires et les cellules épithéliales de la surface oculaire.

En conclusion, cette étude constitue une première étape pour mieux comprendre les relations

et les interactions dans un modèle in vitro entre des cellules épithéliales de la conjonctive et

des lymphocytes. Des connexions rapprochées et des interactions cellulaires par le biais de

médiateurs solubles ou par contact direct entre les deux types de cellules ont été observées

dans ce modèle, avec des effets proinflammatoires et proapoptotiques, en rapport avec

l‟expression des marqueurs HLA-DR et CD95/Fas ou le profil du pic sub-G1. Une réaction

allogénique entre une lignée cellulaire d‟un donneur et des cellules immunitaires issues d‟un

autre donneur ne pourrait expliquer à elle seule tous ces résultats. Une voie alternative de

recherche serait de collecter les cellules conjonctivales d‟un patient, de les cultiver, selon la

méthode de culture primaire, et de renouveler la procédure de coculture avec les PBL issus de

ce même patient. Mais cette manœuvre semble très compliquée à mettre en oeuvre et

techniquement très difficile, manquant de reproductibilité du fait d‟une grande variabilité liée

aux cultures primaires de l‟épithélium conjonctival et des quantités extrêmement faiblesde

tissu disponible auprès des donneurs vivants. Une expression de la E-cadhérine sur les

cellules de WKD a été observée dans notre étude suite au traitement par la TSA, avec en

retour une discrète expression du marqueur CD103/HML-1 sur les PBL, démontrant un

potentiel réel de commutation des PBL en un phénotype intra épithélial lié à la coculture. En

outre, un double effet, à savoir de protection et pro-apoptotique, de la présence des PBL sur

les cellules de WKD en fonction de la concentration de BAC appliquée au préalable sur les

cellules de WKD a été trouvé, apportant des éléments prometteurs à la compréhension du

comportement des xénobiotiques sur la surface oculaire ainsi que sur les interactions entre les

cellules immunitaires, les cellules épithéliales dans le carde d‟un stress environnemental. Ces

résultats nous amènent à croire que ce modèle pourrait effectivement constituer un pas en

53

avant, comme une nouvelle perspective d‟étude de la physiopathologie et de la toxicologie in

vitro dans le cadre des affections de la surface oculaire. La prochaine étape pourrait consister

à utiliser une approche similaire pour explorer davantage l'interaction entre la lignée de

cellules de WKD et des populations spécifiques immunitaire, telle qu‟une sous population de

lymphocytes ou une population de cellules dendritiques. Nous utiliserions un système de

coculture in vitro, mettant en contact des lignées cellulaires établies à la fois de cellules

épithéliales et de monocytes / macrophages afin de définitivement surmonter les problèmes de

variabilité extrinsèque liée aux cultures primaires et de variabilité intrinsèque liée aux

donateurs individuels.

54

V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

La lignée de cellules conjonctivales de Chang, première lignée spontanément immortalisée, a

été beaucoup utilisée au cours de ces dix dernières années dans le cadre d‟études

toxicologiques pour illustrer les effets toxiques des conservateurs utilisés dans les collyres, en

particulier le rôle du chlorure de benzalkonium, soulignant que l‟enjeu actuel de la

pharmacopée en ophtalmologie est de pouvoir développer des collyres qui n‟en contiennent

pas. En effet, la lignée de Chang présente les avantages d‟être facile à cultiver, d‟être stables

et peu coûteuses. Cependant, utiliser cette lignée dans un système monocellulaire pour tester

la toxicité d‟un conservateur ou d‟un collyre, revient à considérer la conjonctive comme étant

constituée exclusivement de cellules conjonctivales. Cependant, les mécanismes complexes

impliqués dans la toxicité de la surface oculaire font intervenir d‟autres types cellulaires

comme les mucocytes et les cellules inflammatoires (lymphocytes, monocytes, cellules

dendritiques) avec de nombreuses interactions entre ces différents types cellulaires. Une

approche pertinente et innovante pour la compréhension de la physiopathologie de la

conjonctive est donc de développer un modèle de coculture faisant intervenir des cellules

épithéliales (culture primaire ou lignées) et des cellules inflammatoires (lymphocytes par

exemple) afin de se rapprocher de la réalité anatomique et physiologique de la conjonctive.

Basés à la fois sur l‟expérience de notre équipe dans l‟utilisation de la lignée de cellules

épithéliales de Chang, et sur un travail publié mettant en coculture des lymphocytes

périphériques avec des cellules conjonctivales et cornéennes en culture primaire, nous avons

décidé d‟étudier les interactions entre les cellules de Chang et les lymphocytes périphériques,

et d‟éprouver ce modèle de coculture comme outils d‟étude de la surface oculaire sur le plan

toxicologique. Les interactions manifestes entre les deux types cellulaires et les conséquences

de ces interactions en termes d‟inflammation, d‟apoptose, de mort et de survie cellulaire, que

nous avons mis en évidence, n‟occultent cependant pas le fait que la reaction allogénique

déclenchée par le contact direct ou par le biais de médiateurs solubles entre des cellules

épithéliales et des lymphocytes alloréactifs doit être considérée dans l‟interprétation des

résultats et dans leur reproductibilité. Par ailleurs, certains paramètres de dédifférenciation des

cellules de la lignée de Chang, comme la perte de l‟E-cadhérine, pourraient être un obstacle

aux bonnes interactions cellules épithéliales/cellules inflammatoires qui caractérisent ce tissu

complexe qu‟est la conjonctive. La suite intéressante à donner à ce travail serait donc

d‟étudier les interactions entre des cellules épithéliales d‟un donneur et des cellules

dendritiques, obtenues à partir de lymphocytes périphériques provenant du même donneur,

55

réduisant au maximum les effets collatéraux d‟une éventuelle réaction allogénique et laissant

libre cours aux interactions cellulaires.

56

VI. ANNEXE

In vitro interactions between peripheral blood lymphocytes and Wong-Kilbourne

Derivative of Chang conjunctival cells

A. Chassignol 1,2

, E. Brasnu 1,2

, C. Baudouin 1,2,4

, L. Riancho 2,3

, J.-M. Warnet 2,3

, and F.

Brignole-Baudouin 2,3

.

1- Department of Ophthalmology III, Quinze-Vingts National Ophthalmology Hospital, Paris, France.

2- INSERM, U968, - UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, CNRS, UMR_7210

Paris F-75012, France.

3- Department of Toxicology, Faculty of Biological and Pharmacological Sciences, Paris, France.

4- Ambroise Paré Hospital, APHP, University of Versailles, France.

Correspondence to: Christophe Baudouin, Department of Ophthalmology III, Quinze-Vingts National

Ophthalmology, Hospital, 28 rue de Charenton, 75012, Paris, France; Phone: 33 1 40 02 13 01; FAX:

33 1 40 02 13 99; email: baudouin@quinze-vingts.fr

ABSTRACT The Chang cells (WKD) are used as a monocellular in vitro model to assess the toxic effects of

Benzalkonium Chloride. However, conjunctival epithelium is composed with epithelial cells but

includes also inflammatory cells. We therefore assessed the interactions between WKD cells and

lymphocytes (PBL) to validate in vitro this new model. PBL were cocultured with WKD cells using

cell-contact or transwell cultures. Morphological analyses were performed using plasma membrane

staining. Sub-G1 peak, HLA DR, E-cadherin and CD103 expression on cell types were assessed using

flow cytometry (FCM). BAC effects were assessed by microplate cytofluorometer assays. Coculture

allowed membrane exchanges, increased HLA DR on WKD, and CD103 on PBL and seemed to

reduce apoptosis after BAC treatment. Such results lead us to believe that this model of WKD / PBL

coculture could actually constitute a step forward, as a new prospect for toxicological in vitro studies

on the ocular surface.

INTRODUCTION Benzalkonium Chloride (BAC) is the main preservative used in ophthalmic solutions such as

antiglaucoma or anti-allergic eye drops. In the eye, BAC turnover is very low, and this molecule was

shown to be retained in ocular tissues up to 7 days after a single drop administration (1). Its ocular

cytotoxicity was demonstrated in many in vivo and in vitro models (2). Several studies showed the role

of BAC in ocular surface inflammation, allergy, fibrosis, and dry eye syndrome (3), and its

pronecrotic, pro-apoptotic and pro-oxidative effects on conjunctival cells in vitro and in vivo (4).

However, human conjunctival epithelium is not only composed with conjunctival epithelial cells, but

includes other cell types such as a variety of inflammatory cells and goblet cells, in close connections

with blood vessels and extraocular lymphocytes (5). All these cell types contribute to maintain a

healthy ocular surface, and there is a large body of evidence on the direct role of the conjunctival

epithelium in inflammatory diseases of the ocular surface (6, 7).

To assess BAC and other xenobiotic toxicity on the conjunctival epithelium, one of the mostly used

methods was based on in vitro systems that offer the possibility of studying the influence of

metabolites, mediators or drugs in a controlled stable and reliable environment. There are currently

two main continuous, untransfected epithelial cell lines available, the Wong-Kilbourne derivative of

Chang cells, WKD (8) and the IOBA-NHC cells (9). The WKD cell line has been immortalized

spontaneously from normal human conjunctival epithelial cells (10) but differs from normal tissue and

primary cultures in its phenotypic characteristics and in its response to inflammatory cytokines (11),

and one reserve for accepting cell lines as an equivalent of human tissue is their phenotypic

resemblance with their non-transformed precursors. WKD cell line, spent as a monocellular and

reliable nonclinical model, has been already used in several studies to assess the cytotoxic effects of

57

BAC (12, 13), but all these in vitro studies used epithelial cell lines isolated without taking into

account the inflammatory components existing in the normal human conjunctiva. In vitro interactions

between both inflammatory and epithelial cell types have already been studied in skin and lung models

(14-17). Such a study has been performed on conjunctiva as well, using a coculture model between

human primary cultured conjunctival cells and human peripheral blood lymphocytes (PBL), that

showed modifications of both T cells' and epithelial cells‟ characteristics (18). But in comparison with

primary cultures, an established cell line like the WKD cell line offers better reproducibility and

rapidity for acquiring data and has the advantage of being independent from conjunctival biopsy

availability. This is why this cell line was chosen as model for previous toxicological studies tackling

the ocular surface (4, 12, 13). A further step forward was hence to associate this cell line with

inflammatory cells and study between-cell interactions. To best fit the study by Gomes et al. (18), we

started by mixing our well-validated epithelial cell line with PBL. Therefore, the aim of this study was

to assess the interactions between WKD and PBL in order to develop and validate in vitro the potential

of such new model for investigating ocular surface disorders and further extend toxicological research.

RESULTS Cellular interactions:

Plasma membrane exchanges between both cell types were observed after 1 day of coculture in the

direct-contact coculture model between epithelial cells and PBL (Figure 1). An obvious integration of

lymphocyte membranes in epithelial cellular membrane rapidly occurred, in a time-dependent manner.

A peak was obtained after 90 minutes of coculture (Figure 2). These tight connections between both

cell types, resembling cell membrane fusion, have been observed in SEM as well (Figure 3), and this

phenomenon seemed to be similar to pinocytosis. Lymphocytes that were disposed between epithelial

cell layers (Data not shown) showed cytoplasmic expansions after phalloidin staining and fluorescence

microscopy analysis (Figure 4).

Figure 1

Figure 2

A B

A

B

C

D

58

Figure 3

Figure 4

Apoptosis:

Results were expressed in percentage of sub-G1 events compared to the total cell population. After a

1-day coculture, apoptosis of WKD cocultured with non-activated PBL remained unchanged. On the

other hand, as expected, apoptosis of WKD increased when PBL were activated by PMA and

ionomycin. These cytotoxicity profiles obtained on WKD after 1 day of coculture with activated PBL

were similarly obtained in direct contact or when cells were separately cultured using a Transwell.

Then, alteration of DNA content of WKD pre-treated with 5.10-3

% BAC for 15 min followed by 24 h

of cell recovery was observed in the presence of non-activated PBL (Figure 5). This potentiated

cytotoxic effect by the presence of PBL was noted only when WKD were cocultured in direct contact

with PBL, but not when they were separated by a Transwell. We used, as previously described (19),

the 5.10-3

% BAC threshold concentration that induced a significant toxicity on WKD. Indeed,

membrane integrity decreased in a BAC concentration-dependent manner. The highest cytotoxicity

was observed with BAC concentrations higher than 5.10-3

%. This BAC concentration is equivalent to

or lower than the concentrations of most available eye drops.

Figure 5

59

Epithelial cell behavior:

Either constitutively or after coculture with PBL, no E-cadherin expression on WKD was observed in

flow cytometry and in standard immunofluorescence. Nevertheless, the Trichostatin A pre-treatment

of WKD induced a weak E-cadherin expression detected with flow cytometry (Figure 6) and standard

immunofluorescence staining (Figure 7). HLA DR expression increased on WKD after 1 day of direct-

contact coculture with non-activated PBL, and after 7 days of non-contact coculture with activated

PBL (Figure 8). CD95/Fas antigen was expressed on WKD after 1 day of direct-contact coculture with

activated PBL. Surprisingly, the CD86 costimulating marker was expressed on WKD after 1 day of

coculture with activated PBL. Furthermore, WKD shrinkage increased in a similar manner after 1 or 7

days of coculture using phalloidin and propidium iodide stainings (data not shown).

Figure 6

Figure 7

Figure 8

60

Lymphocyte behavior:

In our study, no CD103 lymphocyte expression was obtained after WKD / PBL coculture. However,

TSA pre-treated WKD / PBL coculture showed a slight increase of CD103 expression on PBL (Figure

9).

Figure 9

Cytotoxicity evaluation:

WKD cells‟ apoptosis increased in a BAC concentration-dependent manner (from 5.10-4

% to 5.10-2

%),

no matter of the presence of PBL during the recovery time. Furthermore, for the BAC lowest

concentrations (less than 10-2

%), the presence of PBL, in coculture during the recovery time, increased

apoptosis after 1 day of direct contact, as a potentiating of the apoptotic effect of BAC, consistent with

the results obtained on subG1peak with a 5.10-3

% concentration. Conversely, for higher concentration

of BAC (more than 5.10-3

%), the presence of PBL in direct contact coculture during the 24h recovery

time induced a decrease of apoptosis (Figure 10).

Figure 10

DISCUSSION

In vivo, conjunctiva plays a central role in the immune system of the ocular surface and is basically

characterized by a tight cooperation between immune cells, like dendritic cells, lymphocytes, and

epithelial cells, all cell types actively participating in inflammatory processes (20). One way to

investigate ocular surface and conjunctiva is to use animal models. Nonetheless, cell cultures are

generally considered to be a good alternative to animal studies for investigating the pathophysiology

of human diseases. Epithelial cells play a central role in ocular surface functioning, and previous

studies of our team concerned toxicological investigations and assessment of relationship between

apoptosis and inflammatory process in epithelial cells using various cell lines (4, 6, 7). Cell cultures,

and especially cell lines, allow quick and cheap cell growth in comparison with primary cultures.

Moreover, reproducibility and stability are two main advantages of the utilization of cell lines for

investigating the ocular surface. Indeed, the Wong-Kilbourne derivative of Chang conjunctival

61

(WKD) cell line, the first established continuous, untransfected epithelial cell line from normal human

conjunctiva, has been widely used in previous experiments, particularly for the assessment of the

toxicity of preservatives and preserved antiglaucoma or anti-allergic eye drops. But we know that the

conjunctival mucosa is also part of the mucosal immune system (21, 22). This is supported by the

presence of conjunctiva-associated lymphoid tissue (CALT) composed of aggregated lymphatic cells,

as CALT participates to the induction of an antigen-specific IgA production by B cells, against

exogenous antigen to conjunctiva (23). Thus, this immune counterpart of the conjunctiva was not

considered in previous in vitro toxicological ocular surface studies performed on conjunctival cells

alone. Indeed, these studies were performed using a binary system including epithelial conjunctiva

cells on one side and a potentially cytotoxic drug on the other side. Unfortunately, despite its

usefulness and easiness, this model seems to be not fully suitable for toxicological in vitro studies,

because not close enough to the in vivo reality.

Previous experimental models involving coculture of lymphocytes and corneal cells, therefore

including the immune part of conjunctiva, have been used to study such relations (24, 25). Iwata et al.

(26) used PBL cocultured with human corneal epithelial (HCE) cells to determine the role of

epithelium and allogeneic lymphocyte interaction on the lymphocytic activation process. They

demonstrated that IFN-gamma-treated, HLA class II-bearing HCE cells stimulated freshly isolated

allogeneic lymphocytes. Moreover, Gomes et al. (18) described a new interesting coculture model

consisting of primary cultures of human corneal or conjunctival epithelial cells with peripheral blood

lymphocytes. They studied HML-1 expression on PBL induced by direct and indirect interactions with

ocular surface epithelial cells, showing that this HML-1 expression on CD8+ lymphocytes was not

correlated to the PBL activation status.

Hence, our purpose was to study epithelial cell-lymphocyte interactions in an in vitro coculture model

using a conjunctival epithelial cell line, and then to validate this model for toxicological investigations

of the ocular surface, as an attempt to provide a better toxicological model than single epithelial

monolayers. This work is part of the development of alternative methods to animal testing. This

important field of research is justified in the context of both the REACH program (Registration,

Evaluation, Authorisation and Restriction of chemical substances, REACH, 2006) and the 7th

amendment to the 1976 cosmetics directive, which will ban testing of cosmetic ingredients on animals

by 2013 (27).

First, we observed tight in vitro interactions between WKD and PBL, such as membrane exchanges,

cellular membrane fusion and macropinocytosis, a process that allows the capture of large material, as

a form of endocytosis, which could regulate exocytosis and other membrane properties. In previous

studies, it has been shown that macropinocytosis can be either constitutive, as in professional

phagocytes, like dendritic cells or macrophages (28), or induced as in epithelial cells when stimulated

by growth factors (29). In our study, WKD engulfed and digested fragments of lymphocytes in a time-

dependent manner similar to that of professional phagocytes. But, these macropinosomes did not

undergo fusion with lysosomes like they used to do in macrophages. Indeed, the internalized material

was recycled back to the cell membrane, in less than 24 hours. In mucosal tissues, such an activity in

epithelial cells has been reported as a support for the scavenging activity of resident macrophages.

Indeed, it has been shown that EGF-induced macropinocytosis in epithelial cells allowed the capture

and internalization of the material that was, however, rapidly recycled back to the cell surface (30, 31).

This phenomenon shed in light a possible role in processing and presenting self and foreign antigens

by epithelial cells to the mucosal immune system. Moreover, in our coculture model, tight in vitro

interactions between both cell types also led to cell membrane fusion that was observed using SEM.

Many hypotheses about pathophysiology of ocular surface disorders have been raised from WKD in

vitro studies conducted in a monolayer system. Principally, it has been demonstrated that IFN-gamma

induced programmed cell death and a dose-dependent up-regulation of HLA DR and CD95/Fas

antigens (32). In our study, HLA DR expression increased on WKD after 7 days of coculture either in

direct-contact with non-activated PBL, or without any contact but with activated PBL. The apoptosis-

related marker CD95/Fas was expressed on WKD after only 1 day of direct-contact coculture with

activated PBL. According to these results, we can hypothesize that, in our system in presence of PBL,

cell activation and apoptosis could possibly be mediated by the same stimuli and the same

transduction pathways, with tight between-cell interactions, through direct cell contact or via soluble

mediators. An allogeneic stimulation could also be hypothesized, through IFN-gamma. For example,

62

IFN-gamma could lead to HLA DR antigen expression on epithelial cells, so as to induce allogeneic

lymphocyte responses by MHC-dependent mechanism (25). Nevertheless, in other models of primary

mixed lymphocyte reactions, allogeneic lymphocytes were not always induced, even in presence of

IFN-gamma or HLA DR expression (33,34) for reasons that remain unclear. It has been suggested that

HLA DR expression is necessary but may not be hardly sufficient. Moreover, Gomes et al. (35)

studied the changes induced on surface antigens of non-activated lymphocytes from the same donors

cocultured with corneal epithelial cells from different donors. They observed that any allogeneic

response caused by antigen presentation resulted in a variability of CD25 activation on PBL and they

concluded that using allogeneic lymphocytes for coculture with epithelial cells did not particularly

influence the expression of surface antigens on both cell types. This could be explained by the lack of

IFN-gamma in their experiments. In the same way, in the present study, the up-regulation of HLA DR

and CD95/Fas on WKD induced by the presence of PBL was unlikely to have been influenced by an

allogeneic reaction. The up-regulation of HLA DR may have been rather induced by a

proinflammatory effect on WKD related to the presence of immune cells.

The mucosal immune system traditionally includes intraepithelial lymphocytes (IELs) that are

predominantly a specialized subpopulation of CD8+T cells with a αβ positive T-cell receptor

(36,37,38). More than 90% of these IEL express the human mucosal lymphocyte antigen (HML-1,

CD103), against only 2% of PBL (39, 40). This T-cell population might play a special role in

immunological defense of the ocular surface. The HML-1 is an adhesion molecule belonging to the

integrin family, composed of the 7 subunit in association with the E subunit (41) and it mediates

specific interaction between IEL and mucosal epithelial cells thanks to a tissue-restricted adhesion

molecule named E-cadherin (40, 41, 42, 43). Cadherins constitute a family of cell surface adhesion

molecules that are involved in calcium-dependent homophilic cell-to-cell adhesion (44). E-cadherin is

required for the formation of adherent junctions between epithelial cells. Gomes et al. (18) found an

expression of the integrin E7 (CD103/HML-1) on PBL after 7 days of coculture with epithelial

cells in primary culture indicating a transformation of PBL into IEL. Seven days seemed to be the

optimal incubation time for HML-1 expression on activated lymphocytes (45). In our study,

CD103/HML-1 expression was not induced on PBL after 1 to 7 days of coculture with WKD. The

main difference between epithelial cells in primary culture and WKD is the loss of E-cadherin

expression on WKD surface (11). Although, one of the most frequent reserve for accepting the cell

line as a valuable equivalent of human tissue is the phenotypic resemblance of immortalized cells with

regard to their non-transformed precursors, WKD share common morphological and functional

characteristics with human conjunctival cells in vivo, such as the development of microvilli, the

presence of EGF receptor and desmosomes or mucin secretion. Conversely, WKD also show

characteristics related to an immortalized, dedifferentiated and mesenchymal cell phenotype with

fibroblastic appearance, vimentin-high expression, loss of E-cadherin, cytokeratine-4 expression, and

presence of kariotypic abnormalities (8, 10, 11). Nevertheless, using Trichostatin A, a histone

deacetylase (HDCACs) inhibitor, we observed a weak E-cadherin expression on WKD. Indeed,

according to previous studies, it has been shown that long-term E-cadherin down-regulation could be

transcriptional, using « zinc-finger » protein repressor factors and HDCACs (46, 47, 48). Thus, in our

study, a slight CD103/HML-1 expression was observed on PBL after 1 to 7 days of coculture with E-

cadherin-positive WKD. Further experiments are thus required to definitively assess the ability of PBL

to develop an IEL phenotype after coculture with WKD.

Previous toxicological studies using the Hoechst33342 and Neutral Red assays have shown the

proapoptotic and pronecrotic effects of BAC on WKD with a BAC concentration-dependent increase

(19). In this model, PBL tended to show a protective effect on WKD against BAC for the highest BAC

concentrations (more than 5.10-3

% BAC), concentrations where WKD apoptosis was maximal, as if

excessive epithelial cell death would send a survival signal to PBL. Conversely, for lower

concentrations of BAC, PBL seemed to have a pro-apoptotic role on WKD. Further experiments are

therefore needed to definitively confirm such bipolar effects of the presence of PBL on WKD

depending on the BAC concentration, and then definitively validate this appealing but complex model

for further toxicological studies. Anyway, these results already shed light on the interactions between

immune and epithelial cells in the ocular surface.

In conclusion, this study is a first step for better understanding the relationships and interactions

between conjunctival epithelial cells and lymphocytes in an in vitro model. Tight connections and cell

63

interactions through soluble mediators or through direct cell contact have been observed in this model,

with pro-inflammatory and pro-apoptotic effects, according to HLA DR expression, CD95/Fas or sub-

G1 profile. This might not be explained only by the allogeneic reaction between cell lines from one

donor and immune cells issued from another one. An alternative way of research might be to collect

and culture conjunctival cells, for primary culture, and peripheral blood cells from the same person,

but it appears highly challenging and technically difficult, lacking reproducibility, due to the high

variability of primary cultures of conjunctival epithelium and the tiny amounts of tissues usually

available from a live donor. Expression of E-cadherin on WKD was observed in our model, with a

trend toward CD103/HML-1 expression on PBL demonstrating a potential switch to an intra-epithelial

phenotype. Moreover, a dual, namely protective or proapoptotic, effect of PBL on WKD depending on

the BAC concentrations, was found, opening up very promising findings on the effects of xenobiotics

on the ocular surface and possible interactions between immune cells, epithelial cells and

environmental stresses. Such evidence leads us to believe that this model could actually constitute a

step forward, as a new prospect for pathophysiological and toxicological in vitro studies on the ocular

surface. The next step could be to use a similar approach to further explore the interaction between

conjunctival cell lines and specific immune populations like lymphocyte subpopulations or dendritic

cells in an in vitro coculture system, using established cell lines of both epithelial and

monocyte/macrophage lineages, in order to definitively overcome the issues of primary cultures and

variability intrinsic to individual donors.

METHODS

Conjunctival cell line:

The Wong-Kilbourne derivative of Chang conjunctival cells (clone 1 to 5c-4 American Type Culture

Collection [ATCC, Manassas, VA]-certified cell line [CCL], 20.2) were cultured under standard

conditions (humidified atmosphere of 5% CO2 at 37 °C) in Dulbecco‟s minimum essential medium

(DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% glutamine, 50 UI/ml penicillin, and

50 UI/ml streptomycin.

Cells were removed by gentle trypsin incubation at confluence and counted. Then, they were seeded

into 6-well cell culture plates (Corning, Schiphol-Rijk, the Netherlands) for cytometric analysis, and

on slides (Lab-Tek™ II chambered coverglass; Nunc International, Naperville, IL) for standard

immunofluorescence and confocal microscopy. Cultures were kept at 37 °C for 24 h. Subconfluent

cells (culture surface covering nearly 70%) were then exposed to the different BAC concentrations.

Peripheral blood lymphocytes (PBL):

In partnership with the French Blood Agency (FBA), lymphocytes were obtained from the peripheral

blood of healthy blood donors. FBA performed plateletpheresis on these donors and the remains of

this procedure (cytapheresis concentrate) were used in order to separate peripheral blood lymphocytes

from red blood cells. These two cellular types were separated by centrifugation at 400g for 30 minutes

on a Ficoll density gradient (Sigma Chemical Inc, St Louis, MO, USA) to isolate mononuclear cells.

PBL were washed in phosphate buffer saline (PBS), centrifuged at 300g for 15 minutes, and washed

again in PBS, then centrifuged at 200g for 10 minutes. PBL were maintained in RPMI (Roswell Park

Memorial Institute medium) 1640 medium supplemented with 10% FBS and cultured under standard

conditions (humidified atmosphere of 5% CO2 at 37 °C) for 12 hours. Supernatant was removed and

washed twice.

Cell treatments:

For the in vitro activation experiments, lymphocytes were incubated with 2.5ng/ml of phorbol 12-

myristate 13-acetate (PMA, Sigma, St Louis, MO, USA) and 250ng/ml of Ionomycin (Sigma) at 37°C

for 2 hours. After stimulation, cells were washed three times with RPMI. WKD were treated with

Trichostatin A (Trichostatin A, Ready Made Solution 5mM in DMSO [0.2μm-filtered], from

Streptomyces sp., Sigma) at 0.33M during 24 hours under standard conditions (humidified

atmosphere of 5% CO2 at 37°C) in complete culture medium (DMEM supplemented with 10% FBS,

1% glutamine, 50 UI/ml penicillin, and 50 UI/ml streptomycin) in order to induce E-cadherin

expression on WKD cells (49).

According to previous toxicological studies in the same cell line (50), subconfluent cells (culture

surface covering nearly 70%) were then exposed to five different concentrations of BAC (10−2

%,

5.10−3

%, 10−3

%, 10−4

%, and 10−5

%) or PBS during 15 minutes followed by 24 hours of cell recovery

64

in complete culture medium for evaluation of cell viability and cytotoxic effect of BAC in the

coculture model. These BAC concentrations are equivalent to or lower than the concentrations of most

available eye drops. Concentrations of 10−1

% and higher were not tested as they are known to be

excessively cytotoxic on conjunctival cells in vitro, inducing cell lysis immediately after treatment.

The incubation time applied to the WKD (or in coculture with PBL) was 15 min followed by 24 h of

cell recovery in complete medium. The 24-h cell recovery period was tested to approach the clinical

conditions in which the conjunctival tissue may be covered after eye drop instillation.

Coculture:

PBL (1ml of 106cells/ml) were cocultured with confluent epithelial WKD. PBL were cultured either in

direct contact with the epithelial WKD or separated from the epithelial cells by a Transwell (Cell

culture inserts, translucent PET membrane, 0.4m, BD Falcon, BD Biosciences), which prevents

direct contact between cells but allows free interchanges of culture media between the epithelial cells'

and lymphocytes' compartments. On day 1 and 7, the lymphocytes were collected and suspended in

2ml of culture medium (RPMI supplemented with 10% FBS) and analyzed by flow cytometry.

Flow cytometry:

The inflammatory marker HLA DR (Human Leucocyte Antigen Class II antigen), the apoptosis-

related receptor Fas (APO-1, CD95), the co-stimulating marker CD86, the HML-1/CD103 lymphocyte

antigen and the adhesion molecule E-cadherin were tested on Chang conjunctival cells. All

experiments were performed using a Cytomics FC500-CXP flow cytometer (Beckman Coulter,

Miami, FL) equipped with an argon laser emitting at 488 nm. Isotype matched IgG mouse conjugated

to FITC/PE/PC5 were used as negative control on human leucocytes to determine non-specific

fluorescence background.

Alteration of DNA content was measured through the sub-G1 peak flow cytometric analysis on a FL4-

fluorescence histogram to characterize the late apoptosis process. After coculture between

lymphocytes and epithelial cells pre-treated by either BAC or PBS (phosphate buffer saline), cells

were collected using ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) at 1mM, collected, and suspended in

1ml PBS, then fixed with 0.5% paraformaldehyde (PFA) in PBS at 4 °C for 24 h. Then, samples were

washed with cold PBS, permeabilized in 0.1% saponin, stained with 50μg/ml propidium iodide (PI,

Interchim, Montluçon, France), and analyzed on the flow cytometer. The sub-G1 region was

determined by a cursor defined in the controls.

Microplate cytofluorometry:

Microplate cytofluorometry was performed on a Safire® microplate cytometer (Tecan Instruments,

Lyon, France). Hoechst33342 dye was used to evaluate WKD apoptosis, and Neutral Red (NR) dye

(Fluka, Ronkonkoma, NY) was used to evaluate membrane integrity, closely correlated with cellular

viability. In all experiments, sterile PBS was used as the control. Microplate cytofluorometry results

were obtained in fluorescence units and were expressed as a percentage of the control PBS.

Hoechst33342 results were expressed as a ratio of the results of this assay to those of the NR assay in

order to correlate them to cellular viability.

Cell morphology analyses:

Standard immunofluorescence using fluorescent phalloidin (F-actin detection, 200U/ml; Alexa Fluor

488 Phalloidin, Sigma, St Louis, MO, USA) and lipophilic green-emitting dye PKH67 and lipophilic

red-emitting dye PKH26 stainings under a confocal epifluorescence microscope (E800, PCM 2000;

Nikon, Tokyo, Japan) were performed to assess morphologic patterns of cells. After 30-min

incubation with phalloidin, cells were washed in PBS before PI staining and microscopy examination.

WKD were stained with PKH67 (Green Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma), and PBL with PKH26

(Red Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma). For PKH stainings, WKD and PBL (20 millions each) were

washed either in DMEM supplemented 1% glutamine, 50 UI/ml penicillin, and 50 UI/ml streptomycin

culture medium without FBS for WKD cells, or in RPMI1640 for PBL, at 400g for 5 minutes and then

stained during 4 minutes with PKH at 4M. Then, stained cells were washed 3 times in D-PBS and

maintained in their own complete culture medium.

Scanning Electron Microscopy:

A specific method was performed to assess cellular interactions using Scanning Electron Microscopy

(SEM). Cells were fixed in 2.5% glutaraldehyde (Electron Microscopy Science, Hatfield, USA) for 45

minutes, then in 2% reduced osmium OsO4 (Electron Microscopy Science, Hatfield, USA) for 45

minutes as well. After the two fixation processes, cells were dehydrated in ethanol, cleared in

65

propylene oxide and embedded in Hexamethyldisilane (Sigma). Then, cells were sputter-coated with

gold-palladium using JEOL FINE COAT ion sputter JFC-1100 and were examined with a JEOL 35CF

Scanning Electron Microscope (Hitachi

, Japan).

Reagents:

Propidium iodide, PBS, PKH26 and 67 stainings were provided by Sigma (St Louis, MO, USA).

Monoclonal mouse anti-human CD103 (Mucosa Lymphocyte Antigen, clone Ber-ACT8, FITC-

conjugated), FITC-conjugated goat anti-mouse and phycoerythrin (PE)-conjugated rabbit anti-mouse

antibodies were obtained from DAKO (Glostrup, Denmark).

Monoclonal mouse anti-HLA-DR (Clone Immu-357, FITC-conjugated) and monoclonal mouse anti-

CD86 (Clone HA5.2B7, IgG2b purified) were provided by Coulter Corporation (Miami, FL, USA).

Control antibodies (purified and FITC-conjugated mouse IgG1) were purchased from Immunotech

(Marseilles, France).

The fluorescent probe phalloidin Alexa Fluor 488-conjugated was provided by Molecular Probes

(Leiden, The Netherlands).

All reagents were used as recommended by suppliers.

DISCLOSURE

A.Chassignol, none; E. Brasnu, none, ;C. Baudouin, none ; L. Riancho, none ;J.-M. Warnet, none

and F. Brignole-Baudouin, none.

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FIGURE LEGENDS

Figure 1. Cellular morphology and interaction analyses in cocultures using cell membrane staining.

Epithelial cells were stained in green with PKH67 and lymphocytes in red with PKH26. This figure

shows the same area using either green filter or red filter under fluorescence microscopy. WKD cells

were cocultured with PBL in direct contact during 24 hours. Plasmic membrane exchanges between

both cell types were observed after 1 day of coculture only if epithelial cells were in direct contact

with peripheral blood lymphocytes, because we noted that WKD cells appeared green and red,

meaning a staining transfer between both cellular types occurred. Controls (data not shown), either

WKD cells alone or WKD cells cocultured with PBL separated by a 0.4m hole translucent PET

membrane, show WKD cells exclusively green, without any transfer of red staining by PBL to WKD

cells. Yellow staining is due to an overexposure to fluorescence microscopy. WKD, Wong Kilbourne-

Derivative of Chang; PBL, Peripheral Blood Lymphocytes.

Figure 2. Cellular morphology and interaction analyses in coculture using cell membrane staining.

Epithelial cells were stained with PKH67 and lymphocytes with PKH26. This figure shows the same

area (A and C) using either green filter (A) or red filter (C) under Confocal microscopy. B and D show

the same area in a vertical section (Two-head arrow). WKD cells were cocultured with PBL in direct

contact during 90 minutes. Plasmic membrane exchanges between both cell types were observed after

90 minutes coculture while epithelial cells were in direct contact with peripheral blood lymphocytes.

Indeed, note that red staining started to appear in WKD cells (arrows).

Figure 3. Cellular morphology and interaction analyses in coculture using scanning electron

microscopy. Note that tight connections between PBL (little arrow) and WKD cells looked like cell

membrane fusion (arrows).

Figure 4. Cell morphology analysis in coculture using cell membrane staining. Standard

immunofluorescence staining on WKD cells and PBL cells. Phalloidin staining shows the morphology

68

of the two cell types after 24 hours coculture. Cytoskeleton (F-actin) was stained in green by

phalloidin. Note that PBL showed cytoplasmic expansions (arrow), in contact with WKD cells.

Figure 5. Alteration of DNA content analysis on WKD cells. The alteration of DNA content was

measured through the sub-G1 peak flow analysis (flow cytometry) on WKD cells. Successively, WKD

cells were cultured alone in normal complete medium, then cocultured 24 hours with PBL separated

by a Transwell, and with PBL in direct contact. Next, WKD cells pre-treated with 5.10-3% BAC for

15 minutes followed by 24 h of cell recovery were cultured alone in normal complete medium, then

cocultured 24 hours with PBL separated by a Transwell or in direct contact. Note the potentiated

apoptotic effect of contact with PBL on pre-treated WKD cells (arrow : P < 0.001).

Figure 6. Graph representing a flow cytometric analysis of expression of E-cadherin at baseline and

after Trichostatin-A treatment. Mean fluorescence intensities were quantified and expressed as % of

fluorescence. WKD cells were treated by Trichostatin A (TSA) at 0.33M during 24 hours under

standard conditions in complete culture medium. Note a positive expression of E-cadherin on WKD

cells after TSA treatment ( arrow : P < 0.001).

Figure 7. Laser scanning confocal micrographs showing immunolabeling pattern for E-cadherin on

WKD cells. Nuclei were counterstained with DAPI. (photo on left) WKD cells at baseline cultured in

normal medium. (photo on right) Trichostatin-A Pre-treated WKD cells. Note the increased expression

of E-cadherin on TSA pre-treated WKD cells (arrow).

Figure 8. Graph representing a flow cytometric analysis of expression of HLA-DR inflammatory

marker on WKD cells at baseline and after 24 hours or 7 days of coculture with PBL, pre treated by

PMA and Ionomycin (B) or not (A), and by Transwell or in direct contact. Mean fluorescence

intensities were quantified and expressed as % of fluorescence report to control. Lymphocytes were

incubated with 2.5 ng/ml of PMA and 250 ng/ml of Ionomycin at 37°C for 2 hours. Note the

significantly positive expression of HLA-DR on WKD cells after 24 hours coculture with non-

activated PBL in direct contact and after 7 days coculture with activated PBL in Transwell ( arrow : P

< 0.03). PMA, phorbol 12-myristate 13-acetatein.

Figure 9. Graph representing a flow cytometric analysis of expression of CD103 on PBL after 24

hours coculture with WKD cells, pre-treated by TSA or not. Mean fluorescenceintensities were quan

tified and expressed as % of fluorescence. Note the trend to a positive expression of CD 103 on PBL

after 24 hours coculture with TSA pre-treated WKD cells ( arrow : P < 0.001).

Figure 10. Toxicity evaluation using HOECHST and neutral red tests on WKD cells. This figure

shows the toxicity evaluation using the apoptotic test HOECHST report to the integrity membrane

evaluation test called neutral red test (microplate cytofluorometry) on WKD cells after 15 min of

treatment with different BAC concentrations followed by 24 h of cell recovery in complete medium or

in coculture with non activated PBL. Note that toxicity increased on WKD cells in coculture with PBL

for lower concentration of BAC (less than 10-2

%) and decreased on WKD cells in coculture with PBL

for higher concentrations of BAC, in comparison with toxicity on WKD cells cultured alone (arrow : P

< 0.001).

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82

VIII. TITRE ET RESUME EN ANGLAIS.

In vitro interactions between peripheral blood lymphocytes and Wong-Kilbourne

Derivative of Chang conjunctival cells. Towards a model of study of the ocular surface,

immunological and toxicological assessment.

During the past ten years, the effects of the toxicant in eye drops have been the subject of

many toxicological studies on ocular surface. The leader of these products is the

benzalkonium chloride (BAC), belonging to the quaternary ammonium family, used as a

preservative in eye drops for its bactericidal properties. But the BAC is also responsible in the

occurrence of clinical symptoms such as allergy or dry eye syndrom when used chronically,

such as in glaucoma disease. Several in vivo and in vitro tools are relevant in this aera of

knowledge. Up to now, the main in vitro studies used the Chang conjunctiva cell line as a

monocellular model that does not yet match perfectly the in vivo reality, in which

inflammatory cells are also involved. In the work that is reported here, we studied the cellular

interactions between Chang cells and peripheral blood lymphocytes, then used this model for

toxicological assessment. Cell morphology, apoptosis, inflammation and BAC-induced cell

death have been studied using standard immunofluorescence, microplate cytofluorometry and

flow cytometry, showing cells‟ fusion, increase of inflammation and epithelial cells apoptosis

due to the presence of lymphocytes, and sometimes decrease of epithelial cells apoptosis

under certain conditions. However, the allogeneic reaction induced by this coculture model

could compromise a reliable interpretation of the results. Thus, new cells model like coculture

of epithelial cells and dendritic cells taking from the same donor may be extremely relevant

for understanding and studying the ocular surface physiopathology.

83

ANNEE : 2010

Thèse soutenue le 22 Octobre 2010 par Monsieur Alexis CHASSIGNOL

PRESIDENT : Monsieur le Professeur LAROCHE

DIRECTEUR : Monsieur le Professeur BAUDOUIN

INTERACTIONS CELLULAIRES IN VITRO DE CELLULES

CONJONCTIVALES EN LIGNEE ET DE LYMPHOCYTES ISSUS DU

SANG CIRCULANT. MODELE D’ETUDE DE LA SURFACE

OCULAIRE, IMMUNOLOGIE ET TOXICOLOGIE.

Ces dernières années, les effets des toxiques contenus dans les collyres ont fait l‟objet de

nombreuses études toxicologiques de la surface oculaire. Le chef de file de ces produits

toxiques est le chlorure de benzalkonium (BAC), agent de la famille des ammoniums

quaternaires, utilisé comme conservateur dans les collyres pour ces propriétés bactéricides.

Mais le BAC est aussi responsable d‟un cortège de symptômes cliniques tels que l‟allergie ou

le syndrome sec oculaires lorsqu‟il est utilisé de façon chronique, comme chez les patients

glaucomateux. Plusieurs outils in vivo et in vitro sont utilisables dans ce domaine pour mettre

en évidence l‟effet toxique du conservateur. Les principales études in vitro réalisées jusqu‟à

présent utilisaient comme modèle la lignée de cellules conjonctivales de Chang, dans un

système unicellulaire qui ne reproduisait pas les conditions du vivo, au sein duquel

interviennent également des cellules inflammatoires. Au cours de ce travail, nous avons étudié

les interactions cellulaires entre des cellules de Chang et des lymphocytes issus du sang

circulant, puis tester ce modèle sur le plan toxicologique. Morphologie cellulaire, apoptose,

inflammation et mort cellulaire induite par le BAC ont été étudiées en utilisant des techniques

d‟immunofluorescence standard, de microtitration fluorimétrique en microplaques, et de

cytométrie de flux, mettant en évidence des phénomènes de fusion cellulaire, de

potentialisation de l‟inflammation et de l‟apoptose des cellulaires épithéliales liée à la

présence des lymphocytes, et parfois de survie des cellules épithéliales dans certaines

conditions. Cependant, la reaction allogénique induite par ce modèle de coculture peut

parasiter l‟interprétation des résultats. Ceci ouvre la voie vers un autre axe de recherche qui

serait le développement d‟un modèle de coculture entre des cellules épithéliales et des cellules

dendritiques provenant du même donneur permettant de progresser vers la constitution d‟un

modèle d‟étude de la surface oculaire au plus près du vivo.

MOTS CLES :

Benzalkonium, composés, Alternatives à l'utilisation d'animaux - Lignées cellulaires,

Techniques de coculture, Conjonctive.

DISCIPLINE ;

Médecine (Spécialité OPHTALMOLOGIE)

UFR :

Université Paris Est Créteil

8 rue de général Sarrail

94010 CRETEIL