TTHHÈÈSSEE

En vue de l'obtention du

DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE

Délivré par l'Université Paul Sabatier Toulouse III

Discipline ou spécialité : Innovation Pharmacologique

JURY Professeur Dominique Langin- Président

Docteur Anne-Marie Cassard Doulcier- Rapporteur

Docteur Annie Quignard-Boulangé- Rapporteur

Dr Anne Bouloumié-Directeur de thèse

Ecole doctorale Biologie Santé Biotechnologies Toulouse Unité de recherche INSERM U858

Directeur(s) de Thèse : Dr. Anne Bouloumié et Dr. Jean Galitzky

Présentée et soutenue par: Carine Duffaut

Le: 16 Juillet 2009

Les lymphocytes du tissu adipeux humain: caractérisation et rôles

Remerciements Je tiens à remercier les docteurs Anne-Marie Cassard Doulcié et Annie Quignard-Boulangé d’avoir accepté d’évaluer ce travail en tant que rapporteur. J’exprime également ma gratitude au professeur Dominique Langin pour avoir gentiment accepté de participer à ce jury de thèse. Je tiens à remercier tout particulièrement le Dr Anne Bouloumié, qui m’a encadrée durant cette thèse tu m’as donnée ma chance et j’ai beaucoup appris sous ta direction. Merci pour m’avoir poussé dans mes retranchements parfois, pour m’avoir communiqué ton enthousiasme pour la science et pour avoir vécu d’aussi près les diverses rédactions d’article. Je remercie le Dr Jean Galitzky pour ses conseils techniques et scientifiques très avisés et constructifs, t’es un peu le mac gyver du labo , merci de m’avoir appris toutes tes petites techniques qu’on ne retrouve pas dans les protocoles officiels, merci pour ta gentillesse qui fait que personne ne t’en veut même si ta paillasse est une zone de non droit, pour ta sensibilité, et ton humour. Je tiens également à remercier Max Lafontan, tous les gens vous ayant côtoyé garderont sûrement la même impression que moi, le plaisir de la discussion, j’ai appris de chacune de nos discussions aussi bien en terme de sciences que de politique ou d’économie, que ce soit au comptoir d’un bistrot ou autour du thé de 17h, merci pour vos conseils toujours avisés mais aussi pour votre gentillesse. Je remercie également l’ex équipe de Jules, Alec pour sa disponibilité et son franc-parler, tu sais tout faire, on a partagé quasiment le même bureau en bordel puis l’amour du FACs, ta bonne humeur, je te laisse mes bébés lymphocytes en toute confiance je sais que tu en prendras grand soin. Marie-Adeline pour m’avoir appris la lipolyse c’était pas gagné et m’avoir supportée ronchonner pendant toutes ces heures de manip mais aussi comment mettre un coup de casque à quelqu’un, comment tout dire avec le sourire, la recette du riz au lait au chocolat, parce que (presque) rien ne te met en colère, pour ta bonne humeur communicative et tes conseils. Michel (maintenant je n’oublierais jamais qui est Claude Bernard), Virginie pour son sens de l’écoute et sa sensibilité, Coralie pour ses conseils et son humour, Babeth qui nous manque parfois(!!), Marie pour les searchers girls, les apéros aux allées, les quiz (qu’on a jamais gagné) et autres délires doctoresques, Mathieu pour les pauses aux allées et les apéros, Pauline pour son aide à tous les instants, pour avoir été mes mains manquantes quand j’en ai eu besoin, pour les barquettes repas qu’on a partagé

pendant 3ans, pour son coté schtroumph grognon (même pas vrai que j’ai le même!!). David qui est là depuis moins longtemps mais je te remercie pour ton écoute et ton soutien, dans cette dernière année tu as toujours été là pour moi dans les nombreux moments difficiles et tu as aussi été ma deuxième paire de bras même pour les isolements jusqu’à 23h… Auré pour la psychorigidité partagée (mais pourquoi personne ne comprend que les cônes se prennent de droite à gauche et de bas en haut ?!), les nombreuses pauses cafés au labo et les nombreuses pauses bières en dehors, pour les longues conversations sur la vie, la recherche, l’amour, les heures improbables à passer au labo et les lendemains difficiles. Je remercie aussi Mattéo pour les soirées, les week ends et les jours fériés passés au labo, ça semble presque normal quand on n’est pas tout seul à galérer. Sans oublier «ceux de Rangueil» qui étaient là au tout début de l’aventure: Estelle, Marion, Sandy, Carine, Anne, Charlotte, Sandra, Danièle, Marie-Françoise Philippe et Jean Sébastien. Je remercie mes parents qui m’ont toujours encouragée dans mes études et dans mon projet professionnel, vous m’avez permis d’arriver là où j’en suis et quoi qu’il se passe par la suite, cette expérience aura été bénéfique pour moi. Merci de m’avoir laissé piller votre frigo quand je n’avais pas le temps d’aller faire les courses, de m’avoir laissé squatter votre WE en amoureux à Venise parce que j’avais besoin de vacances, merci de m’avoir rendu la vie plus facile pendant ces 4 années de thèse et avant aussi. Je remercie ma sœur préférée (comment ça j’en ai qu’une?!) Céline qui est toujours là pour moi (même si ces quatre dernières années, moi je n’étais pas trop là), pour la mise en page de mon manuscrit jusqu’à 2h du mat parce qu’on fait toujours tout au dernier moment, pour tout ce qu’on partage depuis 26ans que les mots ne sauraient décrire, les marmots Juliette et Valentin, je suis pas la tante idéale vu que je peux jamais les garder mais promis quand vous serez grands je vous emmènerais voir des concerts!! Sans oublier Erik, parce que même si on est jamais d’accord on partage certains gouts musicaux, l’amour de ma sœur adorée, du vin et de la bonne nourriture… Je remercie les expatriés qui m’ont gardé une place dans leur cœur et qui étaient là malgré tout le jour J, c’est bon de savoir qu’après des années on a pas tant changé: les thésardes parisiennes Karima tu ne peux pas savoir à quel point les délires sur facebook m’ont fait me sentir moins seule pendant la rédaction, et claire parce le temps n’affaiblit pas notre amitié, parce que c’est toujours un plaisir de se voir même si ce n’est qu’une fois par an , parce qu’un certain WE de Mars 2008 toi et Manu vous m’avez un peu sauvée, t’es au bout de tes peines toi aussi alors quand est-ce qu’on repart en vacances ensemble ??? Florence, courage le bout du tunnel se rapproche, la vie te fait souvent prendre les choses du bon

coté, faut faire pareil avec la thèse, merci pour les aprems shopping, les longues conversations téléphoniques à se plaindre, les grands débats sur grey’s anatomy et d’autres séries inavouables, Ludo, mon grand frère d’adoption parce qu’on se retrouve toujours avec plaisir même quand on se voit pas pendant des mois j’espère que ça durera, la grande Claire pour toutes ces soirées à écumer les bars toulousains, pour le super we qu’on a passé à Grenoble, pour les 11années d’amitié qui ne sauraient se résumer en quelques lignes, les pintades parisiennes Sophie et Agnès, le club loose c’est fini mais finalement les bancs de l’amphi et les soirées mojito sont pas si loins, merci d’être vous!! Je remercie aussi les présents tout au long du parcours Pierre, Mary, Niko, Marianne, Phillippe, Fred, Damien grâce à qui je ne suis pas la plus râleuse du groupe, pour m’avoir appris qu’on ne nait pas tous égaux devant l’alcool, pour toutes ces soirées chez Roger, toutes ces longues conversations sur le sens de la vie. Bien sur je remercie Fab toujours présent pour moi pendant ces trois dernières années , pour les soirées dvds, bières, pour les concerts où tu voulais pas aller, pour les WE à AX, pour m’avoir appris ce qu’était la peuf (ou puf ou puff bref…), pour m’avoir soutenue, épaulée sur la fin comme personne, pour avoir toujours cru en moi, et pour ta persévérance parce que tu savais que ça en valait la peine. A présent j’ai du temps à nous consacrer. Enfin je remercie Anne, on a vécu cette thèse ensemble depuis le début (même le concours!!) et un peu moins à la fin. On a englouti des km pour de sombres festivals, des concerts semi privés, des week ends ou des vacances à l’autre bout du monde, du marché st aubin au camden market, merci pour les fou rires et les crises de larmes, pour continuer à croire au prince charmant ;), pour penser que les pâtes et les pizzas sont le sommet de la gastronomie, pour m’avoir appris à apprécier les films nuls pour les filles, (je sais pas si je dois vraiment te remercier!), pour me supporter sur la plage (fait trop chaud et d’abord je m’ennuie), pour savoir à un de mes regards que ça ne va pas et parce que tout le monde cherche l’amitié parfaite…. Je remercie les beautés vulgaires pour le soutien musical (certes involontaire) apporté durant ces 3 années de labeur (fallait pas y aller….), la dame de la coccinelle pour ses brownies la cafet de l’hôpital qui a la bonne idée de faire des muffins en cas de coup dur, les bars de la ville rose qui ont épongé les mauvais coups et les bons! Greys anatomy et domino’s pizzas pour avoir agrémenté les soirées entre copines, Roger parce que le killarney est devenu comme une 2nde

maison et le bikini qui fait revire la scène musicale à Toulouse, sans concerts je ne serais pas allée au bout!

2

3

Sommaire

Liste des figures………………………………………………………………………………..6

Liste des tableaux………………………………………………………………………………7

Principales abréviations utilisées………………………………………………………………8

Avant-propos…………………………………………………………………………….…....10

Partie 1 Contexte scientifique et Problématique……………………………….…….12

I Le système immunitaire…………...…………………………………………………....13

I-1L’immunité innée………………………………………………………………...………14

I-1.1 Les cellules présentatrices d’antigènes ou CPAs……………………………….15

I-1.1 a Les macrophages……………………………...……………….………17

I-1.1 b Les cellules dendritiques………………………………………………19

I-1.2 Les cellules cytotoxiques…………………………………………………….….20

I-1.2.a Les cellules Natural Killer (NK)……………………………………....20

I-1.2.b Les cellules NKT……………………………………………………...22

I-1.3 Les lymphocytes γδ..............................................................................................22222222

I-2 L’immunité adaptative………………………………………………………………….23

I-2.1 La réponse immunitaire à médiation humorale…………………………………24

I-2.1.a Les lymphocytes B………………………………………………….…24

I-2.1.b Déroulement de la réponse B………………………………..………...25

I-2.2 La réponse immunitaire à médiation cellulaire ………………………………...26

I-2.1.a Les lymphocytes T…………………………………………………….26

I-2.2.b Induction de la réponse CD4+……………………………………...….28

I-2.2.c Induction de la réponse CD8+ ……………………………………..…..32

I-2.3 La mémoire immunitaire………………………………………………………..33

II Les relations entre le tissu adipeux et le système immunitaire…….………...37

I I-1 Les principales fonctions du tissu adipeux blanc ….………………………………...37

II-1.1 Le tissu adipeux blanc : organe de stockage énergétique………………………38

II-1.1 a La lipogenèse……….……………………….………………………..38

II-1.2 b La lipolyse……………………….……………………..…………….41

II-1.2. Le tissu adipeux blanc: Organe hétérogène…….…...….………………………….43

4

II-1.2 a L’adipocyte…………………………………………………………...43

II-1.2 b Les cellules progénitrices…………………...………………………..44

II-1.2 c L‘adipogenèse…………………………………..……………………44

II-1.2 d Les cellules endothéliales et le réseau vasculaire……..……………..46

II-2 La réponse immunitaire altère l’état métabolique…………………………………...46

II-2.1 Conséquences de la réponse de phase aiguë…………………………………...47

II-2.1 a Modifications du métabolisme lipidique……………………………..47

II-2.1 b Modifications de la sensibilité à l’insuline…………………………...48

III-1.2 Réponse de phase aiguë et anorexie…………………………………………...48

II 3 Impact du métabolisme sur le système immunitaire………………………………....49

II-3.1 L’état nutritionnel altère la réponse immune……………………………….….49

II-3.1 a Effets des acides gras…………………………………………………49

II-3.1 b Malnutritions et infections………………………………………........53

II-3.2 Les pathologies associées au tissu adipeux………………………………….....54

II-3.2 a L’obésité……………………………………………………………...54

II-3.2 b L’inflammation chronique du tissu adipeux liée à l’obésité………....55

II-3.2 c L’insulinorésistance………………………………………………..…57

II-3.2 d La leptine ………………………………………………………….....58

II 4 Interactions directes entre le tissu adipeux et le système immunitaire ….……..…..60

II-4.1 Le rôle nutritionnel du tissu adipeux pour le système immunitaire….……...…60

II-4.2 Les cellules immunitaires au sein du tissu adipeux…………………….....……61

� Les macrophages du tissu adipeux……………………………………………………61

� Les lymphocytes du tissu adipeux………………………………………...………….63

Revue: Les lymphocytes du tissu adipeux……………………………….……64

Objectifs …………………………………………………………………………..….65

Partie 2 Résultats……………………………………………………….……..66

I Caractérisation des lymphocytes du tissu adipeux humain et de leur rôle sur le

métabolisme et la différenciation adipocytaire……………….………………...67

5

Article 1 Interplay between human adipocytes and T lymphocytes in obesity:CCL20 as

an adipochemokine and T lymphocytes as lipogenic modulators.......................................69

Discussion de l’article 1............................................................................................................70

II Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux……………74

II 1 Facteurs potentiels impliqués dans la survie et/ou prolifération des lymphocytes T......74

II.2 Expression de marqueurs d’activation et influence de l’état d’obésité………………...79

II 3 Effets des lymphocytes sur les autres populations cellulaires du tissu adipeux humain 83

III Cinétique d’accumulation des lymphocytes au sein du tissu adipeux et rôles

sur le développement de l’obésité……………………………….……………...87

Article 2: Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the

onset of obesity........................................................................................................................87

Discussion de l’article 2:……………………….……………………………………………..88

Partie 3:Conclusion générale et perspectives……………………….……….….91

I Identification des lymphocytes du tissu adipeux humain…………….………………....92

II Accumulation des lymphocytes T dans le tissu adipeux humain……………….……...92

III Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux humain…….…….94

IV Rôle des lymphocytes dans le tissu adipeux……………………………………………95

V Spécificité des lymphocytes du tissu adipeux humain…………………………...……..96

VI Différences observées avec les modèles murins………………………………………..97

Partie 4: Références Bibliographiques…………………………..………….…100

Titre et résumé en anglais…………………………………………………………………114

6

Liste des Figures

Figure 1: Présentation des pathogènes intra et extra cellulaires par les CPAs

Figure 2: La différenciation en macrophage

Figure 3: Le procédé de missing self recognition

Figure 4: La réponse B thymo-dépendante

Figure 5: Schéma d’une molécule de TCR

Figure 6: La synapse immunologique

Figure 7: La différenciation des lymphocytes auxiliaires

Figure 8: Voies de différenciation des cellules mémoires

Figure 9: Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte

Figure 10: Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain

Figure 11: Représentation des mécanismes par lesquels une modification des acides gras

alimentaires peut influencer la réponse immune

Figure 12: Rôles des principaux éicosanoides dans la régulation de l’inflammation et de

l’immunité

Figure 13: Les sécrétions du tissu adipeux

Figure 14: Effets de la leptine sur le système immunitaire

Figure 15: Anatomie du tissu adipeux entourant les ganglions lymphatiques

Figure 16: Technique d’isolement des différentes populations cellulaires du tissu adipeux

humain

Figure 17: Caractérisation des lymphocytes isolés du tissu adipeux par cytométrie en flux

Figure 18: Expression d’IL-15 et IL-7 dans les différentes fractions du tissu adipeux

Figure 19: Expression de la leptine et de son récepteur dans les lymphocytes sanguins et isolés

du tissu adipeux de patients d’IMC croissants

Figure 20: Expression de marqueurs pro-inflammatoires dans les lymphocytes sanguins et

isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants

Figure 21: Expression d’IL-17 et de CCL20 dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu

adipeux

Figure 22: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur la

différenciation des précurseurs adipocytaires

Figure 23: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur les

régulations des transcrits macrophagiques

7

Liste des Tableaux

Tableau 1: Principales cellules du système immunitaire

Tableau 2: Récapitulatif des principaux marqueurs de différenciation utilisés

Tableau 3: Classification des IMC selon l’OMS et définition de l’obésité

Tableau 4: Périmètre abdominal par sexe et risque de complications métaboliques associées

chez les sujets de race blanche (selon l’OMS)

8

Principales abréviations utilisées

Ac Anticorps

Ag Antigène

AA Acide arachidonique

AGL Acide gras libre

AGNE Acide gras non estérifié

BCR B Cell Receptor (récepteur des cellules B)

CD Cluster de différenciation

CMH Complexe majeur d’histocompatibilité

CPA Cellules présentatrice d’antigène

CTL Cytotoxic T lymphocyte (lymphocyte T cytotoxique)

EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis (encéphalomyélite auto-

immune expériementale)

FAS Fatty acid synthase (synthase des acides gras)

FSV Fraction stroma vasculaire

HDL High density lipoprotein

HLA Human leucocyte antigen (Antigène des leucocytes humains)

Ig Immunoglobuline

IL Interleukine

IMC Indice de masse corporelle

INFγ Interferon γ

ITAM Immunoreceptor tyrosine based activation motif (motif d’activation à la

base des tyrosines des immunorécepteurs)

KIR Killer-cell Ig-like receptor (récepteur aux Ig des cellules tueuses)

LDL Low density lipoprotein (lipoprotéine de faible densité)

LHS Lipase hormono sensible

LPL Lipoprotéine lipase

LPS Lipopolysaccharide

LT Leucotriène

M-CSF Macrophage colony stimulating factor (facteur de croissance des

macrophages)

NK Natural Killer (tueur naturel)

9

NKT Natural Killer T cell

PAMP Pathogen associated molecular pattern (motif moléculaire associé aux

pathogènes)

PG Prostaglandine

PRR Pattern recognising receptor (récepteurs de reconnaissance des motifs

moléculaires)

TCR T cell receptor

TG Triglycéride

TGF Tumor growth factor

TLR Toll like receptor

TNFα Tumor necrosis factor

Treg Lymphocyte T régulateur

10

Avant-propos

Les systèmes métaboliques et immunitaires sont parmi les plus fondamentaux requis

pour la survie. Plusieurs réponses métaboliques et immunitaires ou systèmes sensibles aux

pathogènes et aux nutriments ont été conservés au cours de l’évolution à travers les espèces.

De ce fait, la réponse immune et la régulation métabolique sont hautement intégrées et la

fonction propre de chacune est dépendante de l’autre. Cette interface peut être vue comme un

mécanisme central homéostatique dont la dysfonction peut créer un ensemble de désordres

associés.

La malnutrition est une cause de déficit immunitaire sévère. L’excès de masse grasse à

l’origine de l’obésité va avoir des conséquences immunes en initiant une inflammation

chronique systémique ainsi qu’un état inflammatoire de bas niveau au sein du tissu adipeux.

Cet état inflammatoire est considéré pour être à l’origine des pathologies associées à l’obésité

telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires.

Dans l’introduction de ce manuscrit nous allons décrire le système immunitaire dans

une première partie puis les interactions entre la fonction immune et le métabolisme. Elles

seront abordées d’une part via les effets des cytokines et des hormones sécrétées et d’autre

part, par des contacts directs entre les dépôts de tissu adipeux et les cellules immunitaires.

L’essentiel de ce travail de thèse s’attache à caractériser les populations

lymphocytaires présentes au sein du tissu adipeux, l’évolution de leur nombre et de leur

phénotype lors de l’extension de la masse adipeuse, ainsi qu’avec la localisation anatomique

des dépôts adipeux. Cette caractérisation repose sur des études globales de la fraction stroma

vasculaire isolée de tissu adipeux de patients ayant eu recours à la chirurgie esthétique et de

patients obèses morbides avant une chirurgie bariatrique. Nous avons ensuite tenté de

comprendre les mécanismes de recrutement et/ou de prolifération de ces lymphocytes, ainsi

11

que leurs rôles potentiels sur le développement du tissu adipeux et sur le métabolisme des

adipocytes. Nous évaluerons également leur incidence sur les autres populations cellulaires

présentes au sein du tissu adipeux à l’aide d’expériences in vitro, par des méthodes originales

de sélection des cellules à partir de la fraction stroma vasculaire du tissu adipeux.

Enfin, l’emploi de modèles animaux nous a permis d’avoir une approche in vivo des

rôles potentiels des lymphocytes dans le développement de l’obésité. Nous avons pu suivre

l’évolution des cellules immunes dans le tissu adipeux au cours de l’installation de l’obésité et

étudier l’impact d’une déficience en lymphocytes sur la prise de poids.

12

Partie 1 : Contexte scientifique

et problématique

13

I Le système immunitaire

Le système immunitaire est chargé de la défense de notre organisme contre les

éléments extérieurs (virus, bactéries, parasites, champignons,..) et de l’élimination des

substances étrangères à l’organisme. Il consiste en un ensemble de moyens (organes, tissus,

cellules et molécules) permettant de répondre rapidement, de façon souvent spécifique et

efficace aux agressions de nombreux pathogènes auxquels nous sommes confrontés. En effet,

notre organisme est en contact permanent avec des pathogènes potentiels véhiculés par l’air,

les aliments, les contacts avec les autres ou à l’occasion de blessures. Les voies d’entrées sont

donc multiples: voie respiratoire, tractus digestif, peau, sang. Les épithéliums et les

substances qu’ils secrètent tels que le lysozyme par exemple, limitent considérablement

l’entrée de ces pathogènes. Toutefois, lorsque ces barrières physiques et chimiques sont

franchies, un ensemble de mécanismes complémentaires se met en place: la réponse

immunitaire. Il s’agit d’un système intégré mettant en jeu des cellules produites dans la

moelle osseuse et circulant dans notre sang ou résidant dans nos tissus. Ce système est

organisé en différentes lignes de défense que l’on peut définir comme l’immunité innée ou

naturelle et l’immunité acquise ou adaptative (Tableau 1). Ces deux réponses vont agir en

interaction permanente lors d’une réponse immunitaire et certaines cellules bien que définies

dans un type de réponse, jouent souvent un rôle dans les deux types d’immunité.

14

Tableau 1: Principales cellules du système immunitaire

I-1 L’immunité innée

C’est la première ligne de défense de l’organisme et la plus rapide, qui est mise jeu en

quelques heures. Constitutive, elle repose sur la dégradation non spécifique des pathogènes.

En effet les cellules de l’immunité innée n’ont pas de récepteur spécifique de l’antigène, mais

sont efficacement dirigées contre des motifs des pathogènes conservés au cours de

l’évolution: les PAMPs (Pathogen Associated Molecular Pattern), tels que l’ADN viral, le

LPS (lipopolysaccharide) ou encore le mannose (1). Les récepteurs à ces composants, les

PRRs (Pattern Recognising Receptor) sont présents essentiellement à la surface des cellules

� Immunité innée: min, heures non spécifique

� Cellules présentatrices d’antigène (macrophages, cellules dendritiques)

� Activation lymphocytes T � Production cytokines

� Cellules NK: � Destruction des cellules

infectées � Production IFNγ

� Cellules NKT : � cytokines IFNγ, TNFα, IL-4

� Lymphocytes Tγδ(cytotoxiques et immuno-régulateurs)

Immunité adaptative : jours spécifique

� Lymphocytes T CD4 auxiliaires:� Cytokines régulatrices : IL4,

IL10 � Cytokines effectrices : IFNγ

� Lymphocytes T CD8 cytotoxiques � Destruction des cellules cibles

� Lymphocytes B sécrétion d’Anticorps circulants

15

phagocytaires. Bien que non spécifique, la réponse innée présente l’avantage d’avoir à sa

disposition de façon immédiate un grand nombre de cellules portant les PRRs et donc prêtes à

combattre un pathogène et ce, sans l’avoir rencontré auparavant. D’une part, les monocytes,

les macrophages, les cellules dendritiques et les neutrophiles sont les phagocytes les plus

efficaces. D’autre part, les voies du complément ainsi que la lyse cellulaire par les cellules

cytotoxiques vont intervenir également dans cette réponse. Tous ces composants vont agir

d’une part en vue de la dégradation des pathogènes ou du non soi et d’autre part en stimulant

les voies de la réponse immune adaptative.

I-1.1 Les cellules présentatrices d’antigènes ou CPAs

Les CPAs telles que les macrophages et les cellules dendritiques ont la capacité

d’internaliser les pathogènes par endocytose, phagocytose ou pinocytose, de les dégrader puis

d’en présenter les antigènes à leur surface et de sécréter une grande variété de médiateurs

inflammatoires et de cytokines afin d’activer leurs partenaires cellulaires.

La phagocytose est l’internalisation de larges particules qui va être permise par la

détection de motifs PAMPs par les PRRs présents à la surface des CPAs. Au niveau du site

d’ingestion, il va y avoir une polymérisation du réseau d’actine qui va permettre

l’internalisation de la particule. Piégée dans la membrane plasmique, elle devient un

phagosome qui va subir une succession de fusions et de fissions avant de fusionner avec un ou

plusieurs lysozomes pour former un phagolysozome (2). Après dégradation, les peptides

antigéniques de la particule phagocytée vont se coupler à des molécules du complexe majeur

d’histocompatibilité ou CMH de classe II et être dirigés à la surface de la membrane pour être

présentés aux lymphocytes T auxiliaires. Les molécules du CMH désignent un ensemble de

glycoprotéines membranaires de structure comparable dont la fonction consiste à présenter

16

des antigènes aux lymphocytes T. Les molécules du CMH humain sont désignées par le

“système HLA (Human Leukocyte Antigen)”. Il en existe 2 grandes familles majeures:

� le CMH de classe I est présent à la surface de toutes nos cellules à l’exception des

globules rouges et des sites immuno-privilégiés (neurones, œil,..). Une fois associées à

des peptide antigéniques, ses molécules sont reconnues par les lymphocytes T

cytotoxiques CD8+ (3).

� le CMH de classe II est présent à la surface des CPAs, lorsqu’il s’associe à un peptide

antigénique, il est reconnu par les lymphocytes T auxiliaires CD4+ (3).

Les pathogènes intracellulaires se répliquant à l’intérieur des CPAs sont transportés dans le

réticulum endoplasmique et couplés à des protéines du CMH I afin d’être présentés à des

lymphocytes T cytotoxiques (4) (Figure1). Les CPAs ayant ingéré un pathogène sur un site

d’infection, s’activent et sont alors transportées par la lymphe afin de présenter les antigènes

aux lymphocytes naïfs circulants dans les organes lymphoïdes secondaires.

Voie endogène Voie exogène

Protéines virales

Virus

Noyau

Réticulum endoplasmique

Cross présentation?

CMH de classe I

CMH de classe II

TAP

Protéasome

Présentation des antigènes aux lymphocytes cytotoxiques

Pathogène extracellulaire

Phagosome

Présentation des antigènes aux lymphocytes auxiliaires

Voie endogène Voie exogène

Protéines virales

Virus

NoyauNoyau

Réticulum endoplasmique

Cross présentation?

CMH de classe I

CMH de classe II

TAP

Protéasome

Présentation des antigènes aux lymphocytes cytotoxiques

Pathogène extracellulaire

Phagosome

Présentation des antigènes aux lymphocytes auxiliaires

Figure 1: Présentation des pathogènes intra et extra cellulaires par les CPAs d’après Roy et

al.(4)

17

I-1.1 a Les macrophages

Les macrophages identifiés par le marqueur CD14 sont des cellules issues de la lignée

myéloïde. La stimulation des précurseurs macrophagiques par M-CSF (Macrophage

colony-stimulating factor) et GM-CSF (Granulocyte macrophage colony-stimulating

factor) va les conduire à se différencier en monocytes. Ces monocytes circulants vont, en

réponse à des stimuli inflammatoires, quitter la circulation et migrer vers les tissus, où ils

acquièrent les propriétés des macrophages. Les monocytes ne sont pas une population

homogène, ils peuvent être classés en deux types de populations : les monocytes

inflammatoires d’une part identifiés par les marquages CD14+ CD16- chez l’homme et

Gr1+ CX3CR1 (récepteur aux chimiokines CX3C de type 1 ou Ly6) faiblement positif

chez la souris, qui peuvent se différencier en cellules dendritiques inflammatoires et

repeupler les compartiments cellulaires de macrophages résidents (5). D’autre part, les

monocytes appelés « résidents » (CD14+ CD16+ chez l’homme et Gr1- CX3CR1+ chez la

souris) qui patrouillent dans les vaisseaux sanguins et vont permettre l’invasion rapide des

tissus en cas de dommages ou d’inflammation (6). Dans les tissus, deux grands types de

macrophages existent (Figure 2).

Les macrophages résidents se retrouvent dans le foie (cellules de Kupffer), dans la

peau (cellules de Langherans) et dans les conjonctifs associés au tractus digestif entre

autres. Le phénotype de ces cellules reste mal défini mais semble être très dépendant du

tissu et du microenvironnement dans lequel elles résident. Les macrophages résidents

cessent de proliférer mais leur synthèse d’ARNm et de protéines est très active (7).

Les macrophages recrutés au cours d’une inflammation sont à courte durée de vie. Ils

peuvent être activés de manière classique ou alternative en réponse à un antigène et

peuvent également s’activer de façon non spécifique d’un antigène en réponse à un corps

étranger ou à un agent inflammatoire stérile (7, 8).

18

Figure 2: La différenciation en macrophage d’après Gordon et al.(7)Des molécules d’adhésion contrôlent la migration des cellules sanguines à travers l’endothélium. Ces molécules incluent des intégrines (β1 et β2 entre autres), des molécules de la famille des immunoglobulines (comme CD31), des sélectines et des récepteurs de type facteur de croissance épidermique à 7 domaines transmembranaires comme (EGF-TM7).

On distingue classiquement deux voies d’activation des macrophages :

• Les macrophages M1 pro-inflammatoires induits par l’IFNγ (Interferonγ) et le

LPS qui vont exprimer le CD16: récepteur à la fraction constante des anticorps et

vont produire des cytokines pro-inflammatoires comme le TNFα (Tumor Necrosis

Factor), l’interleukine 23 (IL-23), l’IL-12, et l’IL-6. Leur mission sera la

destruction des pathogènes et des cellules tumorales.

• La seconde population de macrophages recrutés en réponse à des stimuli de type

IL-4/IL-13 sera plutôt anti-inflammatoire ou réparatrice. Ces macrophages M2

vont exprimer le récepteur au mannose CD206 et produire de faibles quantités de

cytokines pro-inflammatoires mais de grandes quantités d’anti-inflammatoires

comme IL-10, IL-6 et IL-1. Ces macrophages vont être impliqués dans les

Moelle osseuse Sang

Macrophages recrutés

Macrophages résidents

Cellules dendritiques myéloïdes

Ganglions lymphatiques

Cellule progénitrice myéloide

Monocytes

Voie d’activation antigénique classique

Voie d’activation antigénique alternative

Réponse non spécifique d’un antigène

M-CSF GM-CSF

Macrophages endothéliaux

Intégrines β1 et β2Membres de la famille des Immunoglobulines Sélectines Récepteurs EGF-TM7

Tissus

Cellules de Langherans (peau) Cellules de Kupfer (foie) Ostéoclastes (os) Microglia (SNC)

19

mécanismes d’allergie, d’immunorégulation et de remodelage de la matrice

extracellulaire et des tissus en fin de réaction immunitaire (9, 10).

Il est à noter que cette classification a été réalisée à partir de données obtenues dans des

modèles murins ou sur des lignées macrophagiques et/ou sur des monocytes sanguins

différenciés in vitro en macrophages. Chez l’homme on dispose de très peu de données sur les

macrophages tissulaires.

I-1.1 b Les cellules dendritiques

Identifiées par le marqueur CD11c, les cellules dendritiques constituent une

population très hétérogène de CPAs. Leur capacité principale et conservée dans tous les types

de cellules dendritiques est leur fonction de présentation d’antigène à des cellules T naïves

alors que les macrophages et les lymphocytes B ne peuvent activer que des cellules T pré-

activées. Les fonctions des cellules dendritiques sont hétérogènes, dépendent de leur

maturation, des interactions avec les autres cellules et de l’environnement cytokinique dans

lequel elles se trouvent. Elles jouent un rôle dans la polarisation des lymphocytes en Th1 ou

Th2. Selon leur maturité et leur modulation elles peuvent activer ou supprimer les réponses T

auxiliaires ou encore induire l’anergie des lymphocytes T (7).

Les cellules dendritiques immatures ont de faibles capacités à présenter l’antigène

après maturation (activation par les ligands des TLRs ou par les cytokines) elles vont migrer

dans les organes lymphoïdes, leur CMH II va être redistribué à la membrane et les molécules

de co stimulation vont être activées (11). Leur fonction peut être régulée par les cellules NK

qui peuvent soit tuer les cellules dendritiques immatures soit au contraire entrainer leur

activation et leur maturation via la synthèse d’IFNγ et de TNF (12). Les cellules dendritiques

sont très présentes dans certains tissus notamment l’intestin, où elles jouent un rôle aussi bien

20

dans la tolérance à la microflore commensale que dans la génération d’une immunité

protective contre les pathogènes (13).

I-1.2 Les cellules cytotoxiques

I-1.2 a Les cellules Natural Killer (NK)

Initialement décrites comme une population de lymphocytes tueurs spécialisés dans la

lutte contre les tumeurs, les cellules NK constituent une population hétérogène de cellules

lymphoïdes. Elles représentent 10 à 15% des lymphocytes du sang périphérique et sont

décrites comme de grands lymphocytes granuleux contenant des granules lytiques: perforine

et granzymes. Les cellules NK sont sélectionnées au cours du développement pour leur

réponse au CMH I. Elles peuvent ainsi distinguer une cellule normale, exprimant le CMH I,

d’une cellule stressée qui ne l’exprime plus, afin de détruire cette dernière. C’est le procédé de

«missing self recognition», il est assuré par une famille de récepteurs inhibiteurs: les KIRs

(Killer Cell Ig-like receptor) (Ly 49 chez la souris) qui vont inhiber l’activation des cellules

NK si elles entrent en interaction avec le CMH I d’une cellule (Figure 3) (14).

Les cellules NK sont également capables de détecter des antigènes de non soi

présentés par le CMH I à la surface de cellules infectées. Lorsqu’elles sont activées, les

cellules NK vont détruire la cellule cible à l’aide du système perforine/granzymes. La

perforine va s’insérer dans la membrane de la cellule cible et y créer des pores. La formation

de ces pores n’est pas suffisante pour tuer la cible mais va permettre l’entrée des granzymes

dans la cellule. Les granzymes sont des protéases qui vont cliver de nombreux substrats dans

la cellule cible et conduire à la mort de celle-ci (15).

21

Protection

Pas d’activation

Sensibilité

Activation

CMH de classe I CMH de classe ILigands d’activation

Ligands d’activation

KIR inhibiteur KIR inhibiteurRécepteurs activateurs

Récepteurs activateurs

Tolérance au soi

Surveillance immune

Protection

Pas d’activation

Sensibilité

Activation

CMH de classe I CMH de classe ILigands d’activation

Ligands d’activation

KIR inhibiteur KIR inhibiteurRécepteurs activateurs

Récepteurs activateurs

Tolérance au soi

Surveillance immune

Figure 3: Le procédé de «missing self recognition» d’après Vivier et al.(14)

Le marqueur CD56 (ou N-CAM pour Neural Cell Adhesion Molecule) va discriminer

deux populations de cellules NK différentes. Tout d’abord, les cellules exprimant faiblement

le CD56 et positives pour le CD16, sont les cellules majoritaires dans le sang. Elles expriment

des marqueurs d’adressage pour les sites d’inflammation que sont les récepteurs aux

chimiokines CXCR1 et CX3CR1 ainsi que de la perforine pour médier rapidement la

cytotoxicité. L’autre population de cellules NK exprimant fortement CD56 mais pas CD16,

est très majoritaire dans les organes lymphoïdes secondaires pour lesquels elle va exprimer les

molécules d’adressage CCR7, CD62-L et CXCR3. Cette seconde population est peu

cytotoxique mais va produire de hauts niveaux de cytokines: IFNγ, TNFβ, IL-10 et IL-13

(16).

22

I-1.2 b Les cellules NKT

Les cellules NKT sont des lymphocytes T possédant des fonctions de l’immunité

adaptative et des caractéristiques des cellules NK dont l’expression du marqueur CD56 chez

l’homme et NK1.1 chez la souris C57Bl6 (17). Ces cellules peuvent réagir avec des antigènes

glycolipidiques présentés sur des molécules de surface non classiques: les CD1 qui présentent

de fortes ressemblances avec les molécules du CMH mais dont les gènes non polymorphes

n’appartiennent pas au CMH. Plusieurs types de cellules NKT ont maintenant été identifiés

selon leur reconnaissance au CD1 et leurs marqueurs de surface associés (18). Ces cellules

sont impliquées dans les réponses immunes contre les agents infectieux, les tumeurs mais

aussi dans de nombreuses maladies auto-immunes et inflammatoires (19). Ce sont de grandes

productrices de cytokines immunorégulatrices comme l’IFNγ, le TNFα et l’IL-4 (17). Elles

représentent moins de 1% des cellules immunitaires présentes dans le sang chez l’homme et

chez la souris (20, 21) mais sont présentes de façon préférentielle dans certains tissus,

représentant 20 à 30% des cellules T dans le foie et la moelle osseuse et 10 à 20% des

thymocytes matures chez la souris (22).

I-1.3 Les lymphocytes γδ γδ γδ γδ

Les lymphocytes T γδ sont des cellules issues de la lignée lymphoïde qui expriment à

leur surface un TCR (T cell receptor) constitué d'un hétérodimère γδ associé à deux molécules

de CD3. Au moment du développement, les chaines γδ du TCR sont réarrangées à la place des

chaînes αβ classiques (cf I-2.2). Contrairement aux lymphocytes T αβ, les lymphocytes T γδ

ont un biais dans la distribution de leur répertoire et chaque réarrangement préférentiel au

niveau des gènes codant le TCR, constitue une sous population aux caractéristiques

fonctionnelles particulières. Le sous-type le plus décrit chez l’homme est le lymphocyte T γδ

exprimant un TCR Vγ9Vδ2 (23). Chez l'homme et la souris, les lymphocytes T γδ sont des

23

populations minoritaires par rapport aux lymphocytes T αβ. Les lymphocytes T γδ sont des

cellules cytotoxiques et/ou régulatrices dont la réactivité est multiple et très étendue. Ils

interviennent aussi bien dans l'élimination de cellules infectées par un pathogène

intracellulaire que dans la défense antitumorale. Ce sont des cellules effectrices

essentiellement cytotoxiques (24) qui lysent leur cible notamment grâce au système

perforine/granzymes. Les lymphocytes T γδ humains sécrètent aussi de nombreuses cytokines

le plus souvent de type Th1 (25). Chez l'homme, les lymphocytes T γδ reconnaissent dans la

majorité des cas leur antigène directement, sans molécules du CMH (26, 27). Ils ont aussi la

particularité de reconnaître des antigènes solubles non peptidiques que l’on nomme

phosphoantigènes (28). Enfin, ils se retrouvent préférentiellement dans les tissus en contact

direct avec le milieu extérieur comme la peau, les poumon (29) et l’épithélium intestinal et où

ils représentent 20% des lymphocytes intraépithéliaux. (30).

I-2 L’immunité adaptative

C’est la seconde ligne de défense de l’organisme, elle se met en place plus lentement

(4 à 8 jours) et repose sur la détection spécifique d’antigènes étrangers conduisant à des

mécanismes d’élimination des microorganismes portant ces antigènes tout en restant tolérant

aux antigènes du soi.

La réponse adaptative présente deux volets: la réponse humorale, basée sur la

production d’immunoglobulines par les plasmocytes issus de la différenciation des

lymphocytes B et la réponse cellulaire basée sur l’action des lymphocytes T qui coordonnent

les différents axes de la réponse immunitaire et détruisent les cellules infectées. La mise en

jeu de ces différentes cellules nécessite une organisation spatiale et temporelle particulière qui

implique des organes spécialisés dans la maturation des lymphocytes (les organes lymphoïdes

24

primaires), des organes spécialisés dans la rencontre entre les lymphocytes et leurs antigènes

(les organes lymphoïdes secondaires), des cellules spécialisées dans la présentation des

antigènes aux lymphocytes (les CPAs) et enfin une recirculation efficace des lymphocytes

dans l’ensemble des tissus. Les lymphocytes au repos qu’ils soient T ou B présentent tous la

même apparence; le seul moyen de les différencier est de se baser sur l’expression de leurs

protéines membranaires. Contrairement à la réponse innée, la réponse adaptative est différente

lors d’une primo-infection ou d’une réinfection. Lors d’une primo-infection, la réponse

primaire va permettre à un individu de développer un état de mémoire immunologique, qui, si

le même pathogène (ou un pathogène très proche) est rencontré à nouveau, déclenchera une

réponse secondaire plus rapide et de plus forte intensité.

I-2.1 La réponse immunitaire à médiation humorale

I-2.1.a Les lymphocytes B

Les lymphocytes B naissent et se développent dans la moelle osseuse. Au cours de ce

développement, ils acquièrent l’expression de leur récepteur spécifique: le BCR (B-cell

receptor) et du complexe moléculaire CD21/CD19. Le BCR reconnaît l’antigène dans son état

natif, c’est à dire non dégradé par une CPA, sous forme soluble ou lié à une membrane.

Chaque BCR fonctionnel (ou immunoglobuline membranaire: IgM), protéine ne possédant

pas de queue cytoplasmique donc pas de fonction de signalisation, est associé à un

hétérodimère immunoglobuline α-β transmembranaire portant les motifs ITAMs

(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) qui lanceront la cascade de transduction du

signal (31). Le complexe CD21/CD19 va assister la reconnaissance d’antigènes (32). Les

lymphocytes B sécrètent les immunoglobulines et exercent à ce titre une fonction importante

25

dans la réponse adaptative. Ils peuvent également internaliser un pathogène et le présenter sur

le CMH II. Cette fonction de CPA est indispensable aux lymphocytes B pour recevoir l'aide

des lymphocytes T (33).

I-2.1 b Déroulement de la réponse B

L’activation et la prolifération des lymphocytes B ont lieu dans les organes

lymphoïdes secondaires où des CPAs présentent l’antigène aux petits lymphocytes naïfs

circulants. Les cellules ainsi activées arrêtent alors leur migration, entrent en division et vont

former des clones qui vont se différencier en cellules effectrices, les plasmocytes, qui vont

migrer par chimiotactisme vers les sites d’infection grâce aux cytokines libérées dans les sites

inflammatoires. Après activation, l’expansion clonale dure 4 à 5 jours, ce qui explique le délai

nécessaire à une réponse adaptative pour être efficace. Les lymphocytes B assurent également

une fonction de mémoire: ils sont issus de lymphocytes B déjà sélectionnés qui ont subi

l’expansion clonale.

Dans de rares cas, l’interaction d’une cellule B naïve avec son antigène suffit à la

différenciation du lymphocyte B en plasmocyte (34). Cependant, le plus souvent, les

antigènes sont thymo-dépendants et l’activation des cellules B requiert la présence d’un

lymphocyte T. Dans ce cas, les lymphocytes B qui ont interagi avec l’antigène par

l’intermédiaire de leur BCR régulent positivement des molécules CD40 ainsi que de CMH de

classe II associées à des peptides antigéniques. Ces complexes peptide/CMH pourront être

reconnus par un lymphocyte T CD4+ et l’interaction entre les CD40L du lymphocyte T CD4

et les CD40 du lymphocyte B va constituer le signal de co-stimulation nécessaire aux cellules

B (33). Le lymphocyte B se différencie alors en effecteur capable de secréter des

immunoglobulines, de subir la commutation isotypique et la maturation d’affinité (Figure 4).

26

T CD4

Plasmocyte

Motif antigénique

CD40LCD40

Ly B

Cytokines

T CD4

Plasmocyte

Motif antigénique

CD40LCD40

Ly B

Cytokines

Figure 4 : La réponse B thymo-dépendante d’après Janeway et al. (1)

L’antigène qui se fixe au récepteur de la cellule B (LyB) la stimule tout en étant ingéré et apprêté en peptides qui vont activer les lymphocytes T auxiliaires armées. Les signaux provenant de l’antigène et de la cellule T CD4 vont déclenchent la prolifération et la différenciation de la cellule B en plasmocyte sécréteur d’anticorps spécifiques.

I-2.2 La réponse immune à médiation cellulaire

I-2.2 a Les lymphocytes T

Les lymphocytes T αβ sont les principaux lymphocytes T circulants. Ils désignent un

ensemble de cellules d’origine hématopoïétique dont la différenciation se déroule dans le

thymus. La reconnaissance spécifique des lymphocytes Tαβ se fait via son TCR (35),

récepteur à développement extracellulaire, constitué de deux chaînes: α et β. Les chaînes du

TCR sont associées à deux complexes multicaténaires, les CD3 (composés de deux chaînes

ε, deux ζ, une δ et une γ). Ces chaînes contiennent, dans leur région cytoplasmique, un ou

plusieurs motifs ITAMs (Figure 5). Ces régions (une sur chaque chaîne ε, δ et γ, et trois pour

chaque chaîne ζ) sont responsables de la transduction du signal dans les lymphocytes T en

induisant, après l’engagement du TCR, une cascade de phosphorylations aboutissant à

l’activation de la cellule.

Parmi les lymphocytes T, on distingue deux sous-populations importantes. Les

lymphocytes T auxiliaires exprimant le CD4 sont les cellules coordinatrices majeures du

système immunitaire. Les lymphocytes T cytotoxiques exprimant le CD8 participent

27

uniquement à la réponse cellulaire. Ces deux populations diffèrent de façon fondamentale

dans leurs modalités de reconnaissance de l’antigène et dans les fonctions régulatrices ou

effectrices qu’elles exercent.

Figure 5: Schéma d’une molécule de TCR d’après Schumacher et al.(36)

Dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes T explorent la surface des

CPAs afin d’analyser les peptides antigéniques présentés. La reconnaissance des antigènes

protéiques par les lymphocytes T nécessite leur apprêtement par les CPAs, sur les molécules

du CMH. Lorsqu’ils reconnaissent le complexe peptide/CMH dont ils sont spécifiques,

l’interaction se stabilise et il se forme alors une zone étroite de contact et d’échange entre les

deux cellules (la synapse immunologique voir Figure 6) où le lymphocyte T réorganise sa

membrane plasmique et son cytosquelette sous-jacent. L’activation du lymphocyte T est un

CD3ε CD3γ CD3δ CD3ε

TCRα TCRβ

(CD3ζ)2

ITAM

28

terme qui regroupe les évènements de la signalisation menant à la survie de la cellule, sa

prolifération, le réarrangement de son cytosquelette, l’augmentation de son métabolisme et la

variation de son profil d’expression génique. Elle nécessite l’enregistrement de deux signaux

distincts et synergiques: l’engagement du TCR (qui va déclencher la phosphorylation des

motifs ITAMs présents sur ses chaînes CD3 et ζ et provoquer le recrutement d’un ensemble

d’enzymes) et l’engagement des molécules de co-stimulation. Il existe de nombreux co-

stimulateurs et co-inhibiteurs; c’est la sommation de ces signaux et le passage d’un seuil qui

déclenchent ou non le deuxième signal (37).

Figure 6: La synapse immunologique d’après Boes et al.(38)

I-2.2 b Induction de la réponse CD4+

L’interaction d’un lymphocyte T CD4+ naïf et d’une CPA activée conduit à

l’expression par le lymphocyte de la molécule CD28 capable d’interagir avec B7

(CD80/CD86) sur la CPA et qui potentialise le signal. La surexpression de la molécule

CD40L va induire la mise en place de l’interaction CD40L/CD40 qui va maintenir la CPA

dans un état activé. Le lymphocyte naïf se différencie alors en lymphocyte effecteur, Th1 ou

Th2 (39, 40), capable de produire des cytokines spécifiques et de réguler la réponse

29

immunitaire. La décision de la différenciation en Th1 ou Th2 est multifactorielle et dépend du

contexte cytokinique, des molécules de co-stimulation exprimées par la CPA et de la

concentration de peptide/CMH. Ainsi, la nature du stimulus reconnu par les CPAs, en

modulant la production de cytokines, influence fortement la polarisation T. De nombreuses

études indiquent que la polarisation Th1/Th2 est influencée par les types de microorganismes

que reconnaissent les CPAs via les PRRs qu’elles expriment ainsi que par l’environnement

des CPAs (41, 42). Une vision simple de la dichotomie Th1/Th2 indique que les lymphocytes

Th1, auxiliaires des lymphocytes T CD8+, sont impliqués dans la réponse cytotoxique et les

lymphocytes Th2, auxiliaires des lymphocytes B, initient des réponses humorales (43). La

production d’un type de cytokines par les lymphocytes d’un type cellulaire inhibe le

développement de l’autre population. Il a été montré plus récemment qu’il existait une autre

voie de différenciation pour les lymphocytes T auxiliaires naïfs, la voie des Th17 (44). Ces

différentes sous-populations sont «sous le contrôle» d’un autre type de cellules T CD4+, les

lymphocytes T régulateurs (Treg). Les principales caractéristiques de ces différents types de

cellules auxiliaires sont résumées ci-dessous (Figure7).

Th1

Th2

Th17

IL-12

IL-2

IL-2

IL-2

TGFβ, IL-6 IL-23

IL-4

TregTreg

TregTreg

IL-2 IFNγTNFα

IL-17

IL-4 IL-5 IL-10 IL-13

Immunité à médiation cellulaire pathogènes intracellulaires

Auto-immunité organe spécifique

Bactéries de l’intestin

Arthrite Inflammation chronique

Immunité à médiation humorale

Allergies, Atopie

IL-10 TGFβ,

IL-10 TGFβ,

CD4+

CD4+

CD4+

CD4+

NaïveNaïve

Naïve

Naïve

Cellules T régulatrice CD4+ CD25+ Foxp3+

Th1Th1

Th2Th2

Th17Th17

IL-12

IL-2

IL-2

IL-2

TGFβ, IL-6 IL-23

IL-4

TregTregTregTregTregTregTreg

TregTregTregTregTregTregTreg

IL-2 IFNγTNFα

IL-17

IL-4 IL-5 IL-10 IL-13

Immunité à médiation cellulaire pathogènes intracellulaires

Auto-immunité organe spécifique

Bactéries de l’intestin

Arthrite Inflammation chronique

Immunité à médiation humorale

Allergies, Atopie

IL-10 TGFβ,

IL-10 TGFβ,

CD4+

CD4+

CD4+

CD4+

NaïveNaïve

Naïve

Naïve

Cellules T régulatrice CD4+ CD25+ Foxp3+

Figure 7: La différenciation des lymphocytes auxiliaires d’après Cooke et al (45)

30

� Lymphocytes Th1: Ce sont les pro-inflammatoires principaux. Ils sont induits dans

un contexte IL-12, ΙFΝγ (46, 47), produisent des cytokines inflammatoires comme

l’IL-2, l’IFN γ ou le TNFα (48) et induisent le déclenchement des réponses

immunitaires cellulaires mettant en jeu en particulier les T cytotoxiques. Ils recrutent

les macrophages dans les sites d’infection et les activent afin de détruire les

pathogènes internalisés (39). Ils se développent préférentiellement durant les

infections par les bactéries intra cellulaires et les maladies chroniques inflammatoires

et sont impliqués dans l’auto-immunité organe-spécifique (49). L’IFNγ qu’ils sécrètent

possède de nombreuses propriétés effectrices. D’une part, il stimule la capacité

microbicide des macrophages et des monocytes, d’autre part, il a des propriétés anti-

virales importantes. En effet, il stimule l’expression du CMH et la présentation des

antigènes, optimisant la reconnaissance des cellules infectées par les lymphocytes T.

� Lymphocytes Th2: Ils sont induits en présence d’IL-4 et produisent essentiellement

les interleukines 4, 5, 6, 10 et 13. Les cellules Th2 participent à l’immunité humorale

en apportant une aide aux lymphocytes B pour qu’ils se développent en cellules

productrices d’anticorps. Ils vont également activer les éosinophiles (granulocytes

cytotoxiques de l’immunité innée) en vue d’une réponse indépendante des phagocytes

(50). Ces lymphocytes prédominent dans les réponses aux allergènes (49).

� Lymphocytes Th17: Découverts en 2005 par l’équipe de Langrich dans un modèle

murin d’EAE (Experimental autoimmune encephalomyelitis), cette nouvelle classe de

lymphocytes auxiliaires se caractérise par la production d’IL-17 (51). Ces cellules se

développent en présence de TGFβ (Tumor growth factor) et d'IL-6 et nécessitent la

présence d’IL-23 pour leur expansion (52, 53). Elles sont très pro-inflammatoires et

31

peuvent jouer un rôle dans les maladies auto-immunes (54). Chez l’homme, une étude

récente a caractérisé les Th17 isolés de l’intestin de patients atteints de la maladie de

Crohn: ces lymphocytes Th17 expriment le récepteur de l’IL-23, CCR6 et le facteur de

transcription RORγt (55). Ces cellules Th17 sont impliquées dans des maladies auto-

immunes telles que l’arthrite induite par le collagène et l’encéphalite autoimmune

expérimentale entre autres. L’IL-17 promeut l’inflammation en induisant la production

de nombreuses cytokines et chimiokines, en recrutant les neutrophiles, en augmentant

la production d’anticorps et en activant les cellules T (56). Chez l’homme,

contrairement à la souris, il a été décrit l’existence de lymphocytes Th17 produisant de

l’IFN γ, dénommés Th17/Th1 (55). Le rôle de cette population partageant des

caractéristiques communes aux cellules Th1 et aux cellules Th17 est encore inconnu.

� Lymphocytes T régulateurs (Treg): Ils expriment CD25 (qui est le récepteur de l’IL-

2) et CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4) (57). Comme ces

marqueurs ne leur sont pas propres, le seul marqueur fiable des Treg est le facteur de

transcription Foxp3 dont l’invalidation va conduire à une absence totale du

développement de ce sous-type cellulaire (58, 59). Ils représentent 5 à 10% des

lymphocytes T CD4+ chez l’homme et la souris. Impliqués dans la tolérance, ils

peuvent être induits par des CPAs dites tolérogènes (60, 61), on parle alors de Treg

induits. Cependant, il existe également une population de Treg dits naturels qui se

développent directement à partir des précurseurs thymiques. Tous ces lymphocytes ne

sécrètent pas de cytokines pro-inflammatoires mais de l’IL-10 et du TGFβ (62). Ils

possèdent la capacité d’inhiber l’activation des cellules T soit par des mécanismes

directs de contact cellule/cellule, soit indirectement en modulant négativement

l’activation de la CPA (63).

32

I-2.2 c Induction de la réponse CD8+

L’induction de la réponse CD8 nécessite la présence d’un lymphocyte T CD4+ activé.

La CPA présente des antigènes simultanément par le CMH de classe I et de classe II aux

cellules T CD8+ et T CD4+ respectivement. La présence de la cellule CD4+ maintient un état

d’activation élevée de la CPA qui permet une co-stimulation efficace des cellules CD8+. A la

suite de cette interaction, le T CD8+ naïf se différencie en lymphocyte T Cytotoxique (CTL)

exprimant la perforine et les granzymes dans des vésicules intracellulaires et, capable de

produire des cytokines. Parfois, la CPA activée est suffisante à l’activation du lymphocyte T

CD8+, on parle alors de réponse CD8 indépendante des CD4. Cependant, il faut que la CPA

possède une très forte activité de co-stimulation intrinsèque pour induire la production d’IL-2

par les T CD8+ et provoquer la prolifération et la différenciation de ces derniers.

� La cytotoxicité des lymphocytes T: Les cellules T CD8+cytotoxiques ont la capacité

de lyser les cellules présentant l’antigène dont elles sont spécifiques. Cette cytotoxicité

nécessite un contact cellulaire entre le lymphocyte T et sa cible. Ce contact initié par

l’interaction du TCR avec le complexe peptide/CMH, est renforcé par l’interaction de

la molécule CD8 avec le TCR et également par des molécules d’adhésion cellulaire.

La lyse repose sur 3 grands mécanismes. Le plus rapide (quelques minutes) et souvent

le plus efficace met en jeu la perforine et les granzymes secrétés par le lymphocyte T

cytotoxique. Un second mécanisme met en jeu la protéine FasL membranaire ou

secrétée par le lymphocyte T, qui va se fixer sur un récepteur Fas situé sur la cible. La

liaison de FasL à Fas va déclencher la cascade des caspases, un programme

intracellulaire conduisant au suicide de la cible (15). Ce mode de lyse est plus lent

(plusieurs heures) et souvent moins efficace. Enfin, le TNFα secrété par le lymphocyte

T va pouvoir se fixer sur un récepteur au TNF conduisant aux mêmes types de

33

conséquences que l’interaction FasL/Fas (64). Dans tous les cas, la cellule cible meurt

par apoptose.

I-2.3 La mémoire immunitaire

Un des attributs cardinaux du système immunitaire adaptatif est le développement de

la mémoire immunitaire antigène spécifique. Les cellules mémoires sont celles qui survivent

après la phase de rétractation de la réponse immunitaire, c’est à dire après le moment où le

pathogène est éliminé et pendant lequel plus de 90% des cellules T effectrices meurent par

apoptose. Le compartiment mémoire T est constitué des T CD4+ et T CD8+ qui peuvent

acquérir rapidement des fonctions effectrices pour tuer les cellules infectées ou sécréter des

cytokines inflammatoires (65). Ce compartiment mémoire doit être au moins aussi diversifié

dans ses capacités fonctionnelles que le compartiment des effecteurs qui émergent après la

première exposition aux antigènes. Les lymphocytes T mémoires ont une grande capacité

migratoire (66). Ces cellules peuvent être classées en 2 types de cellules mémoires (Figure 8):

• les CM (central memory) expriment CCR7 et sont fortement positives au CD62-L.

Ces deux protéines ont des rôles précis. CCR7 (CC-chemokine receptor 7) va se lier à

CCL19 et CCL21 exprimés sur les cellules endothéliales dans les ganglions

lymphatiques. Il s’agit donc d’un marqueur d’adressage aux organes lymphoïdes.

CD62-L ou L-sélectine interagit avec PNAd (Peripheral-node adressin) sur les

veinules endothéliales qui favorisent l’attachement et le «rolling» des lymphocytes,

ce qui permet l’adressage aux tissus périphériques. Les cellules mémoires CM sont

retrouvées dans les organes lymphoïdes, la moelle osseuse, le sang et la rate mais

sont absentes des tissus non lymphoïdes (67). Ces cellules semblent être destinées à

34

activer les CPAs. Quand elles sont réactivées, elles peuvent repartir dans la

circulation, perdre le CCR7 et devenir des effecteurs mémoires (66, 68).

• les EM (effector memory) n’expriment pas CCR7 et sont faiblement positives au

CD62-L.

Présentes dans le sang, la rate et les tissus non lymphoïdes, ces cellules peuvent

répondre rapidement à l’antigène en produisant des molécules effectrices (68).

Contrairement aux cellules naïves, elles expriment de manière constitutive, de forts

taux d’ARNm de gènes codant pour l’IFNγ, ou la perforine et les granzymes. La

synthèse de ces protéines sera régulée de manière «on-off» par le contact avec

l’antigène et les protéines pourront être produites de façon beaucoup plus rapide que

par les cellules naïves (65).

La réponse mémoire est une réponse accélérée et plus agressive provoquant une

expansion locale de cellules T antigène-spécifiques à un niveau maximum et une expression

renouvelée de la plupart des fonctions associées à la réponse immune primaire initiale (66).

Les cellules mémoires sont maintenues pendant plusieurs années par un processus de

prolifération homéostatique qui maintient le nombre de cellules mémoires relativement

constant. Les cytokines qui régulent la prolifération des lymphocytes T CD8 sont l’IL-2, l’IL-

15 et l’IL-7 mais leurs rôles relatifs ne sont pas complètement définis (69). La survie des

lymphocytes T CD4+ quant à elle ne dépend pas des IL-2, IL-15 ou IL-4 mais seulement de

l’IL-7 (68). Cet ensemble de cellules mémoires CD4+ va diminuer lentement avec le temps.

35

Cellule T naïve Cellule effectrice « précoce »

Cellule effectrice « tardive »

Pas d’antigène Pas d’antigène

Cellule mémoire centrale (tissus lymphoïdes)

Cellule effectrice mémoire (tissus non lymphoïdes)

Pas d’antigène

+ antigène + antigène

CCR7-CCR7+

CD62Lfaible-CD62Lfort

Cellule T naïve Cellule effectrice « précoce »

Cellule effectrice « tardive »

Pas d’antigène Pas d’antigène

Cellule mémoire centrale (tissus lymphoïdes)

Cellule effectrice mémoire (tissus non lymphoïdes)

Pas d’antigène

+ antigène + antigène

CCR7-CCR7+

CD62Lfaible-CD62Lfort

Figure 8: Voies de différenciation des cellules mémoires d’après Kaech et al. (70)

36

Marqueur Fonction protéique Cellules qui expriment ce marqueur

CD3 Co-récepteur du TCR Lymphocytes T, cellules NKT

CD4 Reconnaissance de l’antigène présenté

sur le CMH de classe II

Lymphocytes T CD4

CD8 Reconnaissance de l’antigène présenté

sur le CMH de classe I

Lymphocytes T CD8

CD14 Récepteur au LPS Monocytes, macrophages granulocytes

(plus faiblement), neutrophiles

CD16 Récepteur à la fraction constante des

anticorps

NK, macrophages, mastocytes

CD19 Co-récepteur du BCR Lymphocytes B, cellules dendritiques

CD45 Protéine tyrosine phosphatase, régule

la transduction de signaux notamment

ceux du TCR et du BCR

Cellules hématopoïétiques sauf

érythrocytes, thymocytes

CD45RA Isoforme de CD45 contenant l’exon A Lymphocytes T naïfs, lymphocytes B,

monocytes

CD45RO Isoforme de CD45 ne contenant pas

les exons A, B et C

Lymphocytes B, lymphocytes T

mémoires, monocytes, macrophages,

cellules dendritiques, granulocytes

CD56 NCAM neural cell adhesion molecule

(NCAM)

NK, NKT, lymphocytes larges et

granulaires

CD62L L-sélectine (permet l’adressage des

lymphocytes aux tissus périphériques)

Lymphocytes T naïfs

CD127 Récepteur à l’IL-7 Lymphocytes T effecteurs et

mémoires

CD206 Récepteur au mannose Macrophages (type M2), cellules

dendritiques, cellules endothéliales

Tableau 2: Récapitulatif des principaux marqueurs de différenciation utilisés

37

II Les relations entre le tissu adipeux et le système immunitaire

Il existe une relation intime entre le système immunitaire et le système métabolique

qui présentent en termes d’évolution beaucoup de similitudes. Le développement parallèle des

tissus adipeux et lymphoïdes dans les fœtus et les nouveaux nés chez les mammifères a été

mis en évidence il y a plus de 50 ans (71).

L’unité fonctionnelle qui contrôle les clés du métabolisme et des fonctions immunes

dérive d’une structure commune ancestrale. Une de ces structures est le corps gras de la

drosophile qui incorpore les homologues mammifères du tissu hépatique, hématopoïétique et

immun. De manière intéressante, ce site est également reconnu comme représentant

l’équivalent du tissu adipeux des mammifères en partageant des voies de développement et de

fonctionnement similaires. Au cours de l’évolution, les organes ont été individualisés dans les

organismes plus évolués, le tissu adipeux, le foie et le système immunitaire se sont spécialisés

dans différentes fonctions, unités ou organes (72). Il n’est donc pas surprenant de retrouver

des cellules immunitaires dans le tissu adipeux, ou encore du tissu adipeux englobant les

ganglions lymphoïdes.

II-1 Les principales fonctions du tissu adipeux blanc

Le tissu adipeux blanc constitue le tissu adipeux principal chez l’homme adulte. Outre

son rôle d’isolant thermique et mécanique, c’est la principale réserve énergétique de

l’organisme. Chez l’homme moyen de 70kg, il va représenter 15kg soit 21% de sa masse

corporelle, ce pourcentage est augmenté chez la femme et au cours de l’obésité. Chez

l’homme, le tissu adipeux est localisé principalement en sous-cutané entre le derme et

l’aponévrose musculaire. Mais il existe également du tissu adipeux interne comprenant: le

38

tissu adipeux viscéral, (thoracique et abdominopelvien) et le non viscéral (paravertébral et

intramusculaire) (73, 74).

Le rôle du tissu adipeux blanc est de réguler la balance énergétique en stockant l’énergie

en surplus sous forme de triglycérides (TGs) qui restent mobilisables pour les autres tissus en

fonction des besoins métaboliques. Globalement la gestion de l’énergie se fait grâce à deux

voies métaboliques principales:

II-1.1 Le tissu adipeux blanc : Organe de stockage énergétique

II-1.1 a La lipogenèse

Le stockage des lipides dans l’adipocyte se fait par 2 voies (Figure 9). La première voie

correspond à la capture directe des TGs associées aux chylomicrons et aux lipoprotéines de

très faible densité (ou VLDL «very low density lipoprotein») circulants, provenant de

l’alimentation ou de la lipogenèse hépatique. La LPL (lipoprotéine lipase), produite et

sécrétée par les adipocytes, ancrée à la surface endothéliale va hydrolyser les lipoprotéines

(75). Les acides gras non estérifiés issus de ce clivage sont ensuite recaptés par l’adipocyte à

l’aide d’un transporteur (CD36/FAT «fatty acid translocase» (76), FATP «fatty acid transport

protein» (77), ou FABP «fatty acid binding protein») (78) puis transformés en acyl-CoA par

une acyl-coA synthétase. Ils seront ré-estérifiés en TGs en présence de glycérol.

La deuxième voie correspond à la lipogenèse de novo. Le terme de lipogenèse proprement

dit désigne la néosynthèse d’acides gras à partir du glucose. Après l’entrée du glucose dans

l’adipocyte, grâce à des transporteurs spécifiques (GLUT-1 et 4), le glucose est dégradé en

pyruvate par le processus de la glycolyse. A partir du pyruvate, l’acétyl-CoA carboxylase

(ACC) et la synthase des acides gras (FAS, « fatty acid synthase ») interviennent de façon

successive pour catalyser la formation des acides gras à longue chaîne saturée. L’action des

différentes désaturases permet de synthétiser des acides gras plus ou moins saturés. Comme

39

précédemment, ces acides gras sont ensuite ré-estérifiés pour donner les TGs. Il est nécessaire

de préciser que chez les rongeurs, la lipogenèse est réalisée dans le foie et le TA. En revanche,

chez l’homme, la lipogenèse est majoritairement hépatique et elle n’est qu’accessoire dans le

TA (79). L’insuline, les cathécholamines l’hormone de croissance et la leptine contrôlent de

manière extrêmement précise le métabolisme de l’adipocyte. L’insuline est l’hormone anti-

lipolytique par excellence. Elle exerce un rôle positif sur le stockage par plusieurs

mécanismes :

Elle stimule la synthèse de LPL et son exportation vers la face interne des capillaires

sanguins favorisant ainsi la captation adipocytaire des acides gras (80).

Elle contrôle positivement la translocation des transporteurs GLUT-4 des

compartiments intracellulaires vers la membrane plasmique, ce qui permet l’entrée de glucose

dans l’adipocyte et son catabolisme dans la glycolyse afin de fournir les substrats nécessaires

à la lipogenèse et à l’estérification (81).

Elle agit positivement sur la lipogenèse en contrôlant directement l’activité de

certaines enzymes comme par exemple l’ACC via des mécanismes de phophorylation-

déphosphorylation. L’insuline agit également au niveau de l’expression des gènes qui codent

pour les enzymes, par des mécanismes de régulation transcriptionelle. Le facteur de

transcription SREBP1c (sterol responsive binding element protein 1c) a été identifié comme

médiateur d’une grande partie des effets transcriptionnels de l’insuline dans l’adipocyte (82).

Les catécholamines s’opposent aux effets de l’insuline sur la LPL, à l’activation des

enzymes de la lipogenèse et à l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de SREBP-1c.

De façon intéressante, les effets inhibiteurs de la leptine et de l’hormone de croissance sur

le stockage des TGs passent par l’inhibition des effets stimulateurs de l’insuline (82).

40

Figure 9: Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte

GLUT: glucose transporter; DHAP: dihydroxyacétone phosphate; TG: triglycérides; ACC:

acétyl Coenzyme A (CoA) carboxylase; FAS: fatty acid synthase; AGNE: acide gras non

estérifié; LPL: lipoprotéine lipase; VLDL: very low density lipoprotein (83).

Glucose

41

II-1.1 b La lipolyse

La lipolyse assure la dégradation des TGs contenus dans les vacuoles lipidiques de

l’adipocyte, en glycérol et acides gras non estérifiés (AGNE). Plusieurs lipases interviennent

de façon séquentielle dans cette hydrolyse des réserves lipidiques. La lipase hormonosensible

(LHS) clive les TGs en diglycérides puis les diglycérides en monoglycérides, et constitue

l’enzyme limitante du processus lipolytique. La lipase des monoglycérides (LMG) dégrade

ensuite les monoglycérides en glycérol et acides gras non estérifiés. Cependant, la mise en

évidence d’une activité lipolytique diminuée mais toujours présente chez des souris invalidées

pour le gène de la LHS a laissé supposer l’existence d’au moins une autre lipase capable

d’hydrolyser les TGs dans les adipocytes (84). Trois laboratoires différents ont identifié une

nouvelle lipase dénommée « adipocyte triacyglycerol lipase » (ATGL) (85-87). L’ATGL

présente une spécificité de substrat pour les TGs dix fois supérieure à son affinité pour les

DGs ainsi qu’à l’affinité de la LHS pour les TGs (88). Elle joue un rôle limitant dans la

première étape de la lipolyse basale tandis que la LHS est limitante pour l’hydrolyse des DGs

(88).

Les mécanismes susceptibles de réguler l’activité de la LHS sont bien connus et sont

présentés dans la Figure 10 (89). L’activité de cette lipase dépend spécifiquement de sa

phosphorylation réversible par une kinase dépendante de l’AMPc (PKA) (90) ou du GMPc

(PKG) (91). La phosphorylation de la LHS active l’enzyme, en démasquant son site

catalytique. Par ailleurs, cette phosphorylation permet une redistribution de la lipase du

cytoplasme vers la vacuole lipidique. Les périlipines, protéines abondamment exprimées à la

surface des gouttelettes lipidiques, interviennent dans la localisation et la stabilisation de la

LHS à la surface des vacuoles. La phosphorylation des périlipines par la PKA et la PKG

réduit leur ancrage à la gouttelette lipidique et favorise ainsi l’accès de la LHS à ses substrats

lipidiques (92).

42

La régulation de l’ATGL est moins connue, elle est présente à la surface des vésicules

lipidiques à des quantités comparables à l’état basal comme activé (87), et son activité est

fortement augmentée par ABHD5/CGI58 (alpha, beta hydrolase domain containing protein 5/

comparative gene identification 58 (93). Il semble que lorsque les adipocytes ne sont pas

stimulés, CGI58 soit lié à la périlipine A et incapable d’activer l’ATGL. Lorsque les

adipocytes sont stimulés, les périlipines sont phosphorylées, entraînant la dissociation de

CGI58 qui va interagir avec l’ATGL et activer l’hydrolyse des TGs (94, 95).

Une fois dans la circulation, les acides gras libres (AGLs) vont être véhiculés par

l’albumine et vont servir de carburant pour les tissus métaboliquement actifs via leur

oxydation et la synthèse d’ATP. La βoxydation qui génère de l’ATP et des acétyl coenzyme

A à partir des acides gras est le procédé le plus important qu’utilisent les cellules pour obtenir

de l’énergie à partir des AGLs. Le glycérol généré par l’hydrolyse des AGLs est converti par

la glycérol kinase du foie et va ainsi fournir la fraction de glycérol nécessaire pour la synthèse

des TGs (96).

Figure 10: Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain d’après Lafontan et al.(97)

43

II-1.2 Le tissu adipeux blanc : organe hétérogène

Le tissu adipeux n’est pas composé uniquement d’adipocytes mais également d’une

fraction stroma-vasculaire (FSV) non adipocytaire. Il est aisé de séparer les adipocytes de la

FSV par digestion à la collagénase (98) ou à la libérase. Après centrifugation, les adipocytes

flottent à la surface et le culot contient les cellules de la FSV. Par une approche de cytométrie

en flux et le choix de marqueurs membranaires spécifiques, notre équipe a mis en évidence

différentes populations au sein de la FSV (99) (100) (101) du tissu adipeux blanc chez

l’homme; des cellules endothéliales microvasculaires (CD34+/CD31+); des cellules

progénitrices (CD34+/CD31-) et des macrophages (CD34-/CD31+/CD14+). Les travaux

menés sur la comparaison des capacités de production des adipokines, notamment les

chimiokines et les cytokines, entre les adipocytes et la FSV ont mis en évidence que ces

sécrétions étaient majoritairement dues aux cellules non adipocytaires (102).

II-1.2 a L’adipocyte

L’adipocyte mature est la cellule spécifique du tissu adipeux, grosse cellule sphérique

pouvant atteindre 100 à 200µm. Son cytoplasme est largement occupé par une vacuole

lipidique qui repousse le noyau en périphérie contre la membrane plasmique (96). L’adipocyte

présente deux fonctions principales, le stockage des lipides selon le processus de lipogenèse

ainsi que celui de la synthèse des TGs, et la mobilisation des lipides via le processus de

lipolyse. Ces activités métaboliques sont étroitement régulées par des signaux neuro-

humoraux. L’adipocyte mature est incapable de proliférer, l’augmentation du tissu adipeux

observée lors de l’obésité est due à une augmentation du volume (hypertrophie) et du nombre

de ces adipocytes (hyperplasie) par différenciation des préadipocytes présents en grande

quantité dans la FSV (103).

44

II-1.2 b Les cellules progénitrices

La présence de cellules progénitrices dans le tissu adipeux humain est reconnue depuis les

travaux de Bjorntop sur l’évolution de la cellularité de la masse adipeuse avec le

développement de l’obésité. Les travaux réalisés dans notre laboratoire ont montré que la FSV

du tissu adipeux humain contient des cellules caractérisées par l’expression du marqueur

CD34 et l’absence du marqueur CD31 qui, en conditions adipogéniques, vont exprimer des

transcrits spécifiques des adipocytes. De plus, ces cellules différenciées présentent des

activités fonctionnelles, métaboliques et sécrétoires des adipocytes matures (100). D’autre

part, ces cellules peuvent donner naissance à des cellules qui expriment des marqueurs

phénotypiques des cellules endothéliales lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux adaptés

(101). De nombreux laboratoires ont montré par la suite que les cellules de la FSV humaine

pouvaient également acquérir in vitro des marqueurs biochimiques caractéristiques de

lignages cellulaires variés: ostoégénique (104), chondrogénique (105), myogénique (106)

entre autres. De plus, l’analyse des capacités de différenciation des cellules dérivant d’une

cellule unique après de multiples passages, a montré que plusieurs clones cellulaires

pouvaient se différencier en plusieurs lignages. Ces résultats suggèrent la présence de cellules

souches adultes de type multipotentes au sein du tissu adipeux humain (107 , 108 , 109).

II-1.2 c L’adipogénèse

La différenciation adipocytaire proprement dite ou adipogenèse représente le passage du

préadipocyte à l’adipocyte mature au sein du tissu adipeux. Après une phase de croissance

exponentielle, le précurseur déterminé vers la lignée adipocytaire ou adipoblaste marque un

arrêt de croissance à confluence. Ces cellules deviennent alors des préadipocytes et

s’engagent dans l’adipogenèse proprement dite. Tout au long du processus d’adipogenèse,

vont se succéder différents événements morphologiques, biochimiques et moléculaires, que

45

l’on regroupe en deux catégories; on distingue les événements précoces et tardifs. Il est à

noter que les mécanismes de différenciation adipocytaire ont été déterminés principalement à

partir d’approches réalisées sur des modèles murins et sur des lignées préadipocytaires

murines issues de la lignée de fibroblastes 3T3.

Les événements précoces concernent en particulier le remodelage de la matrice

extracellulaire (MEC) et du cytosquelette. Au cours de la différenciation adipocytaire, la

composition de la MEC est fortement modifiée. D’une structure riche en fibronectine, sa

composition va évoluer vers une structure de type lame basale, composée essentiellement de

laminine, de collagène IV et d’entactine (110). Des changements dans la forme de la cellule

sont possibles par une réorganisation du réseau intracellulaire d’actine (111). L’ensemble de

ces remodelages matriciels, du cytosquelette et de la forme de la cellule permet alors aux

préadipocytes de subir une étape d’expansion clonale liée à une série de réplications de

l’ADN ou mitoses dites post-confluentes. A la suite de ces événements précoces, les

préadipocytes sont dits « engagés dans la différenciation adipocytaire ». Enfin, une étape de

maturation terminale permet d’obtenir les adipocytes matures. Les changements

morphologiques majeurs qui accompagnent la différenciation adipocytaire, tels que

l’arrondissement des cellules et l’accumulation progressive de vacuoles lipidiques dans le

cytoplasme, sont la conséquence de variations d’expression d’un très grand nombre de gènes.

Cette reprogrammation génétique profonde est sous le contrôle de facteurs de transcription

pro- ou anti-adipogéniques dont les principaux sont les facteurs PPARs (Peroxisome

proliferator-activated receptors), les C/EBPs (CCAAT/enhancer binding proteins) et le facteur

ADD1/SREBP-1c (Adipocyte determination and differentiation factor 1/sterol regulatory

element binding protein-1c) (112 , 113).

46

II-1.2 d Les cellules endothéliales et le réseau vasculaire

Les cellules endothéliales capillaires sanguines régulent les échanges de métabolites,

d’hormones et de cellules entre les compartiments adipeux et sanguins. Le développement du

tissu adipeux est dépendant de sa vascularisation (114). L’importance du réseau vasculaire

sanguin dans la croissance du tissu adipeux est soulignée par des expériences réalisées in vivo

chez la souris. Ces travaux montrent que l’inhibition du remodelage des vaisseaux sanguins

par l’utilisation de composés anti-angiogéniques (115, 116) ou proapoptotiques dirigés contre

la vasculature du tissu adipeux (117) conduit à une prévention du développement du tissu

adipeux et à une réversion de l’obésité. Chez l’homme, peu de données sont disponibles quant

à l’organisation des systèmes vasculaires sanguins du tissu adipeux humain, et leurs rôles

potentiels dans le développement du dépôt adipeux. Notre équipe a récemment montré que le

tissu sous-cutané humain possède un réseau capillaire très développé dont l’extension suit le

développement de la masse grasse lors de l’installation de l’obésité. Des analyses

d’expression génique au sein du laboratoire, ont permis de montrer que les cellules

endothéliales fraîchement isolées du tissu adipeux à l’aide des marqueurs de surface

CD34/CD31, sont dans un état d’activation angiogénique et légèrement inflammatoire

(données non publiées Villaret 2009).

II-2 La réponse immunitaire altère l’état métabolique

La réponse immunitaire, par ses fonctions de défense et de réparation des tissus, a pour

conséquence de réorienter les substrats énergétiques et azotés de la périphérie (muscles et

tissus adipeux) vers le foie et les tissus agressés. Ils induisent des modifications métaboliques,

endocriniennes et le syndrome inflammatoire. Les médiateurs de l’inflammation augmentent

la réponse catabolique

47

II-2.1 Conséquences de la réponse de phase aiguë

L’infection et l’inflammation induisent la réponse de phase aiguë (APR) conduisant à

de multiples altérations protéiques ainsi que du métabolisme des lipides et des lipoprotéines.

Les protéines de la phase aiguë: protéine C réactive (CRP), protéine amyloide sérique (SAA)

(118) et fibrinogène sont augmentées tandis qu’une diminution des protéines comme

l’albumine, la tranferrine ou l’alpha-fœto protéine est observée (119). Ces changements sont

dus à l’altération des taux de synthèse protéique hépatique (118) mais aussi extra hépatiques.

L’augmentation de ces protéines de phase aiguë va permettre la neutralisation des

microorganismes, la participation à la réponse immune ainsi qu’à la régénération des tissus et

le «remplacement» des protéines utilisées lors du processus inflammatoire. Les variations de

la synthèse des protéines de phase aiguë sont médiées par les cytokines (TNFα, TNFβ,

interleukines, IFN α, β et γ) produites en réponse à une variété de stimuli dans de multiples

types cellulaires (macrophages, monocytes, lymphocytes T et cellules endothéliales).

II 2 1 a Modifications du métabolisme lipidique

L’inflammation s’accompagne d’altérations du métabolisme des lipides et des

lipoprotéines induites par les cytokines.

Ainsi, une altération précoce et consistante du métabolisme se traduit par

l’augmentation des taux de triglycérides sériques (120), en réponse à une augmentation de la

production hépatique de TGs. Cette augmentation de production résulte d’une plus grande

disponibilité des d’acides gras non estérifiés (AGNE) relargués par la lipolyse stimulée dans

les dépôts adipeux sous l’action du TNFα, d’IL-1 et de l’IFNα, β et γ. Elle résulte également

d’une augmentation de la synthèse hépatique d’acides gras dans le foie en réponse au TNFα,

et β à l’IL-1 et 6 et à l’IFNα (121 , 122).

48

Les infections produisent également des altérations dans la composition et la fonction

des lipoprotéines, incluant des changements dans les concentrations en sphingolipides et une

augmentation de l’oxydation des lipides. On observe également une diminution des HDL, et

une variation des protéines associées au métabolisme des HDL (121, 122).

II 2 1 b Modifications de la sensibilité à l’insuline

Sous l’influence des cytokines pro-inflammatoires telles qu’ IL-1β, IL-6 et TNFα

apparaissent également une néoglucogenèse augmentée, une production d’hormones et une

diminution de la sensibilité à l’insuline. Paradoxalement, l’insensibilité à l’insuline qui peut

contribuer au processus des pathologies peut exercer un effet bénéfique au cours de la réponse

aux infections (123). La néoglucogenèse augmente sous l’influence des cytokines pro-

inflammatoires, ainsi que l’utilisation de glucose par les cellules immunes.

Le glucose et la glutamine sont les principales sources d’énergie pour les cellules du système

immun. La création d’un état d’insensibilité à l’insuline pourra réduire l’utilisation de glucose

par les tissus insulino-dépendants au profit des tissus pour lesquels le processus est insulino-

indépendant comme les cellules immunes (124-126).

II 2 2 Réponse de phase aiguë et anorexie

Enfin, l’anorexie qui apparaît au cours de l’infection est une part de la réponse de

phase aiguë. En effet, la suppression de la faim permet d’éliminer la dépense énergétique de

recherche de nourriture. De plus, l’anorexie réduit la disponibilité des micro-nutriments

provenant de la nourriture essentiels à la croissance des micro-organismes (127). Plusieurs

cytokines pro inflammatoires dont IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNFα, IFNα et IFNγ inhibent la

prise de nourriture après administration parentérale, ce qui suggère que l’augmentation de leur

49

production au cours de la réponse immune contribue à l’anorexie survenant au cours de

l’infection (128, 129).

II-3 Impact du métabolisme sur le système immunitaire.

II-3.1 L'état nutritionnel altère la réponse immunitaire

En dehors de tout état pathologique, la nutrition peut influencer le système

immunitaire. Les effets du glucose, des protéines et des vitamines sur le système immunitaire

ont été largement décrits mais au cours des quinze dernières années le rôle crucial des lipides

alimentaires a commencé à émerger. De nombreuses pathologies sont aujourd’hui connues

pour être dues aux effets immunomodulateurs des lipides, celles-ci incluent le diabète,

l’athérosclérose et le syndrome d’insulino-résistance. Ainsi, l’exposition augmentée du

système immun aux acides gras pourrait potentiellement altérer les réponses immunes innées

et acquises (130).

II-3.1 a Effets des acides gras

La composition en acides gras (quantité et nature) de la ration lipidique alimentaire

modifie la réponse immunitaire. Les phospholipides des cellules immunes contiennent 15 à

20% d’acides gras (131, 132). En modifiant la composition en acides gras de la nourriture, on

entraîne une modification de la composition en acides gras des cellules immunes: avec une

augmentation de l’apparition d’acides gras avec lesquels la nourriture a été enrichie (133,

134). Les acides gras ont plusieurs rôles dans la fonction des cellules immunes. Ils agissent

comme substrats énergétiques et composants des phospholipides des membranes en

contribuant à leurs propriétés physiques et fonctionnelles. Ils agissent aussi comme

50

modificateurs des structures protéiques en influençant la structure et la fonction de ces

protéines. Enfin, ce sont des régulateurs de l’expression génique par des effets sur l’activité

des récepteurs nucléaires et ils interfèrent avec les voies de transduction du signal

intracellulaire ou la transcription des facteurs d’activation.

Altérations des membranes Rafts, ordre, circulation

Altérations des acides gras de l’alimentation

Altérations de la composition des phospholipides des cellules immunes

Voies de transduction du signal/

Expression génique

Médiateurs lipidiques

Altérations des fonctions des cellules immuns

Altérations de la réponse immune

Altérations des membranes Rafts, ordre, circulation

Altérations des membranes Rafts, ordre, circulation

Altérations des acides gras de l’alimentationAltérations des acides gras de l’alimentation

Altérations de la composition des phospholipides des cellules immunes

Altérations de la composition des phospholipides des cellules immunes

Voies de transduction du signal/

Expression génique

Voies de transduction du signal/

Expression génique

Médiateurs lipidiques Médiateurs lipidiques

Altérations des fonctions des cellules immuns

Altérations des fonctions des cellules immuns

Altérations de la réponse immune

Altérations de la réponse immune

Figure11: Représentation des mécanismes par lesquels une modification des acides

gras alimentaires peut influencer la réponse immune d’apreès Calder et al.(135)

� Acides gras poly-insaturés

Les acides gras poly-insaturés l’acide dihomo-γ-linolenique (DGLA; 20:3n-6), l’acide

arachidonique (AA; 20:4n-6), l’acide docosahexexaénoique (DHA; 22:6n-3) et l’acide

51

eicosapentanoique (EPA 20:5n-3) sont des précurseurs de la synthèse des éicosanoides (135).

Ils sont relargués des membranes par l’action de la phospholipase A2 activée en réponse à des

stimuli cellulaires. Comme les membranes de la plupart des cellules immunes contiennent des

grandes quantités d’AA (n-6), c’est en général le principal précurseur de la synthèse des

éicosanoides. Ils incluent la prostaglandine (PG), les thromboxanes, les leucotriènes (LT), les

lipoxines. Les effets principaux de la prostaglandine et des leucotriènes sont résumés dans la

figure 12.

Figure 12 : Rôles des principaux éicosanoides dans la régulation de l’inflammation et

de l’immunité d’après Calder et al (135)

PGE = prostaglandine E

Acide arachidonique

Leucotriènes

-Vasoconstriction

-Perméabilité vasculaire

-Chimiotactisme des

leucocytes

-Activité des neutrophiles

-Production de TNFα, IL-1

et IL-6

-Production de cytokines de

type Th1

-Prolifération des

lymphocytes

-Activité des cellules NK

+ -

PGE2

-Fièvre

-Douleur

-Vasodilatation

-Perméabilité vasculaire

-Production de TNFα,

IL-1 et IL-6

-Production de cytokines

de type Th1

-Production d’IgE par les

cellules B

-Prolifération des

lymphocytes

-Activité des cellules NK

-Expression du CMH II

+ -

52

Ainsi les dérivés de l’AA principalement pro-inflammatoires, peuvent également

exercer des effets anti-inflammatoires et être impliqués dans la résolution de l’inflammation.

L’effet physiologique final sera gouverné par la concentration locale de ces médiateurs, leur

délai de production et la sensibilité des cellules cibles à leurs effets.

Les acides polyinsaturés n-3 (EPA, DHA) quant à eux, vont s’incorporer dans les

membranes de manière temps et dose dépendante au détriment de l’AA et des acides gras n-6.

Leurs propriétés anti-inflammatoires sont dues à l’inhibition de la production des éicsoanoides

dérivés de l’AA et à la production de familles alternatives d’éicosanoides de type anti-

inflammatoire comme les résolvines et PGE3 (136). D’autre part, EPA et DHA peuvent

inhiber la production de cytokines pro-inflammatoires (TNFα, IL-1β, IL-6 et IL-8) par les

monocytes, les macrophages et les cellules endothéliales. Ces inhibitions semblent passer par

des altérations de l’activité des facteurs de transcription NF-ΚB et PPARγ. Enfin, l’activation

de PPARγ par les acides gras n-3 a été décrite entre autre pour avoir un rôle dans la

prévention du développement de l’insulino-résistance (137).

� Acides gras saturés

Les acides gras saturés sont impliqués dans l’inflammation et dans le développement

de l’insulinorésistance dans le tissu adipeux et le muscle. Ils activent les TLR dans les

adipocytes et les macrophages murins provoquant ainsi l’activation et de NF-κB et de JNK et

la production de cytokines. Les acides gras saturés augmentent également l’inflammation et

l’apoptose dans le tissu adipeux blanc via le stress du réticulum endoplasmique, la génération

de céramides et d’espèces réactives de l’oxygène. De plus, ils inhibent la voie de signalisation

de l’insuline en diminuant l’activation de IRS1, PIK3 et Akt et sont donc des facteurs

potentiels de développement de l’ insulinorésistance (138).

53

II 3 1 b Malnutrition et infections

La malnutrition est une cause commune de déficit immunitaire secondaire et de

susceptibilité aux infections chez l’humain. Les malnutritions sévères affectent le

développement du thymus conduisant à son involution qui se répercute en périphérie par une

plus grande proportion de lymphocytes immatures circulants associée à une diminution du

nombre de lymphocytes T matures. Ces modifications sont sous contrôle neuroendocrine. En

effet, il a été montré que l’atrophie du thymus était associée à une augmentation des taux de

circulants de glucocorticoïdes ainsi qu’à une diminution de ceux de leptine. L’importance de

celle-ci a été confirmée car son injection limite l’atrophie du thymus et diminue les taux de

glucocorticoïdes en parallèle (139). L’immunodéficience représente un facteur clé dans la

susceptibilité aux infections. Chez les patients atteints de malnutrition sévère les fonctions de

l’immunité innée sont également touchées. Les composés du complément, notamment la

fraction C3, sont moins disponibles affectant le processus de phagocytose (140). Chez la

souris, on observe une diminution de la capacité des macrophages à phagocyter et à produire

des espèces réactives de l’oxygène ainsi qu’une altération de la capacité des cellules

dendritiques à présenter des antigènes aux cellules T. Le nombre de cellules au sein de la

population lymphocytaire CD4 est globalement réduit (141). D’autre part, on observe aussi

des altérations des capacités de migration et d’extravasion des lymphocytes T qui vont

présenter un phénotype intermédiaire (CD45RO faible CD45RA faible) plutôt qu’un

phénotype de cellules mémoires (142). De plus, ces cellules sont orientées vers un phénotype

de type Th2 avec une moindre sécrétion d’IFNγ/IL-2 et une augmentation d’IL-4/IL-10 (143).

54

II-3.2 Les pathologies associées au tissu adipeux

II-3.2.a L’obésité

L’obésité correspond à une surcharge pondérale résultant du développement excessif

du tissu adipeux. Elle est définie par l’indice de masse corporelle IMC (voir tableau 3). Cet

indice n’est pas correct pour les enfants, les sportifs et n’est pas indicatif de la quantité de

masse grasse mais cette classification reste néanmoins la plus utilisée car la plus simple à

déterminer. D’autres paramètres peuvent également être pris en compte pour définir

l’augmentation de la masse grasse viscérale :

• Le rapport taille /hanche: seront considérés obèses les hommes ayant un rapport >

1,0 et les femmes > 0,85

• Le périmètre abdominal mesuré seul à mi-distance de la cage thoracique et de la

crête illiaque (voir tableau 4)

Classification IMC (kg/m 2)

Sous-poids

Poids normal

< 18,5

18,5-24,99

Surpoids 25,00-29,99

Obésité ≥ 30,00

Obésité de classe I 30,00-34,99

Obésité de classe II 35,00-39,99

Obésité de classe III ≥ 40,00

Tableau 3: Classification des IMC et définition de l’obésité selon l’OMS (144)

55

Périmètre abdominal (cm) Risques de complications métaboliques

Hommes Femmes

≥ 94 ≥ 80 Augmenté

Sensiblement augmenté ≥ 102 ≥ 88

Tableau 4: Périmètre abdominal par sexe et risque de complications métaboliques associées

chez les sujets de race blanche (selon l’OMS) (144)

L’incidence de l’obésité a dramatiquement augmenté durant ces dernières décennies

de sorte que l’obésité et les désordres métaboliques qui lui sont associés constituent une

menace sérieuse pour la population mondiale. L’OMS estime que plus d’un milliard d’adultes

sont en surpoids et parmi eux 300 millions sont cliniquement obèses (Rapport OMS 2002).

L’obésité prédispose les individus à une augmentation des risques de développer de

nombreuses maladies comme l’athérosclérose, le diabète de type 2, la stéatose hépatique non

alcoolique, certains cancers et des désordres médiés par le système immunitaire comme

l’asthme (145).

II-3.2 b L’inflammation chronique du tissu adipeux liée à l’obésité

L’obésité est associée à une réponse inflammatoire chronique définie comme une

réponse inflammatoire qui n’est pas classique mais plutôt un état inflammatoire dit de bas

bruit qui serait à l’origine des pathologies associées à l’obésité (72). Le premier lien établi

entre l’inflammation et l’obésité est la découverte de la surproduction de TNFα par le tissu

adipeux des modèles de rongeurs obèses (146). Comme c’est le cas chez les rongeurs, le

TNFα est également produit en importante quantité dans le tissu adipeux humain des

56

personnes obèses (147, 148). On peut noter que certaines études n’ont pas retrouvé

d’augmentation de la production de TNFα chez l’homme (149). Le TNFα est décrit pour

altérer la fonction de transduction du signal du récepteur à l’insuline (150). Il inhibe

également la LPL et stimule la lipolyse dans les adipocytes. D’autre part, l’administration de

TNFα à des préadipocytes murins différenciés ou à des modèles animaux diminue l’effet de

l’insuline alors que les modèles de souris obèses déficientes pour le TNFα ou ses récepteurs

ont une sensibilité à l’insuline améliorée par rapport à leurs contrôles (151). Enfin, le tissu

adipeux des sujets obèses produit une quantité élevée de cytokines comme le TNFα, l’IL-6,

l’IL-1β , le MCP-1 et il est le siège d’une accumulation de cellules immunes (voir chapitre II

4). Dans le tissu adipeux viscéral décrit pour être le tissu adipeux le plus impliqué dans les

complications métaboliques, l’expression de certaines cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL-

1β, IL-8 et MCP-1 ainsi que des gènes relatifs à l’inflammation est augmentée (152).

Tissu adipeux blanc

Métabolisme

Inflammation

Différenciation adipocytaire

IL-1/IL-1Ra, IL-6, TNFα, MCP-1

Régulation de la prise alimentaire Homéostasie énegétique

Contrôle du poids

Leptine , IL-6, IL-1/IL-1Ra

Sensibilité à l’insuline

TNFα, IL-6, IL-1/IL-1Ra, Adiponectine, Leptine , Résistine

Contrôle de l’inflammationIL-1/IL-1Ra, TNFα,IL-6, IL-8,

MCP-1, RANTES, IP-10

Inflammation vasculaire?

IL-8, MCP-1, RANTES, IP-10, Résistine

Protection cardiovasculaire

Adiponectine, IL-1Ra, IL-10

Tissu adipeux blanc

Métabolisme

Inflammation

Différenciation adipocytaire

IL-1/IL-1Ra, IL-6, TNFα, MCP-1

Régulation de la prise alimentaire Homéostasie énegétique

Contrôle du poids

Leptine , IL-6, IL-1/IL-1Ra

Sensibilité à l’insuline

TNFα, IL-6, IL-1/IL-1Ra, Adiponectine, Leptine , Résistine

Contrôle de l’inflammationIL-1/IL-1Ra, TNFα,IL-6, IL-8,

MCP-1, RANTES, IP-10

Inflammation vasculaire?

IL-8, MCP-1, RANTES, IP-10, Résistine

Protection cardiovasculaire

Adiponectine, IL-1Ra, IL-10

Figure 13: Les sécrétions du tissu adipeux (d’après Juge-Aubry (153))

57

L’état inflammatoire chez les sujets obèses se caractérise par une plus forte

concentration plasmatique des protéines de la phase aiguë de l’inflammation telles que le

fibrinogène, la CRP (154), la SAA, le PAI-1, l’angiotensinogène, le facteur tissulaire, l’alpha-

1 glycoprotéine acide, l’antagoniste du récepteur de l’IL1 (IL1Ra). On notera également une

élévation des taux plasmatiques de cytokines pro-inflammatoires MCP-1, IL-6, IL-8, leptine,

TNFα et des formes solubles des récepteurs aux cytokines comme les TNF-R ou l’IL1R ainsi

que des molécules d’adhésion E-sélectine, ICAM1 et VCAM1 (155, 156). Les données

épidémiologiques supportent l’idée que l’obésité est associée à des altérations de la fonction

immune (157) (158) (159). Dans la circulation des sujets obèses, a été rapportée une

augmentation du nombre de leucocytes, de monocytes et des lymphocytes T et B mais sans

variation de cellules NK (157). Les CD4+ sont décrits pour être augmentés et les CD8+

augmentent seulement chez les obèses morbides (159). Cependant, ces données sont

controversées et décrites pour être plus liées au syndrome métabolique qu’à l’obésité (158).

De plus, d’autres études décrivent une lymphopénie associée à l’obésité chez l’homme (160).

Cette lymphopénie s’observe également chez l’animal et se caractérise par une diminution de

la population de cellules B et une suppression de l’activité NK (161, 162).

II-3.2 c L’insulinorésistance

L’insulinorésistance est définie comme une diminution de la réponse des tissus

périphériques à l’action de l’insuline. Les individus insulinorésistants sont prédisposés à

développer un diabète de type 2. L’augmentation de l’insulinorésistance a été reconnue

comme un élément à part entière du syndrome métabolique qui inclut l’intolérance au

glucose, la résistance à l’insuline, l’obésité, l’hypertension, un taux faible de HDL, une

hypertriglycéridémie et une accélération de l’athérosclérose. Il a été montré qu’il y avait une

58

relation de cause à effet entre l’inflammation, l’insulinorésistance et le diabète de type 2

(163). L’inflammation systémique chronique est proposée comme ayant un rôle important

dans la genèse de l’insulinorésistance associée à l’obésité. Les bio-marqueurs de

l’inflammation comme le TNFα, la CRP ou l’IL-6 sont présents à des taux croissants chez les

patients obèses et insulino-résistants et ces bio-marqueurs prédisent le développement du

diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires (153).

II-3.2 d La leptine

La leptine est à l’interface du système métabolique et immun. Principalement produite

par le tissu adipeux, elle régule la fonction neuroendocrine, l’homéostasie énergétique,

l’hématopoïèse et l’angiogenèse mais cette adipocytokine est aussi un médiateur important

des processus inflammatoires (164).

En effet, les souris déficientes en leptine (ob/ob) ou en leptine récepteur (db/db)

présentent un panel d’anomalies immunitaires (165). Les souris ob/ob ont un thymus involué,

des défauts dans la réponse des cellules T (166, 167) ainsi qu’une capacité réduite des cellules

dendritiques à présenter l’antigène aux cellules T (168, 169). De plus, chez l’homme la

déficience congénitale en leptine entraînant l’obésité, est associée à une lymphopénie et une

diminution de la réponse T (170). Elle agit sur le système immunitaire aussi bien inné

qu’adaptatif (Figure 14). Au niveau de l’immunité innée, elle est susceptible de réguler

l’activation des neutrophiles en augmentant le chimiotactisme et l’activation des cellules

présentatrices d’antigène par l’expression accrue des molécules du CMH, et des molécules

d’adhésion de la phagocytose. D’autre part, elle va moduler la production macrophagique de

cytokines pro-inflammatoires comme TNFα, IL-1 et IL-6 et jouer un rôle sur la cytotoxicité

en augmentant la production de perforine par les cellules NK (171, 172).

59

Au niveau de l’immunité adaptative, la leptine régule la prolifération des cellules T

notamment naïves et inhibe leur apoptose. Elle peut aussi influencer la réponse Th1/Th2 en

stimulant la production de cytokines Th1 (IFNγ, IL-2) et en inhibant la production de

cytokines Th2 (IL-4) (173). Enfin, les lymphocytes T et B expriment constitutivement de

faibles taux du récepteur à la leptine. Cette expression est régulée de manière positive (en

terme de pourcentage de cellules positives et de densité du récepteur) en réponse à l’activation

des cellules B, T et des macrophages (165). De plus, les souris db/db montrent une capacité

proliférative des CD4+ réduite comparées aux hétérozygotes, ce qui suggère que le récepteur

à la leptine est important pour la prolifération et l’expansion des CD4+ lors de la stimulation

médiée par le TCR. Cependant, malgré les données in vitro, les résultats sur les modèles

animaux et l’évidence d’un effet pro-inflammatoire, la manière dont la leptine influence les

réactions inflammatoires chez l’homme reste encore à élucider (145).

Effets anti-apoptotiques sur les cellules T et les précurseurs hématopoïétiques

Stimulation cellules Th1 Switch IgG2-a Aide aux cellules CD8+

Activation macrophages

Homéostasie thymique nombre deethymocytescellules CD4+ CD8+

cellules CD4+ CD8-

apoptose

Activation des neutrophiles Chimiotactisme

Induction des cytokines par les monocytes/macrophagesréponse de la phase aigue anorexie inflammatoire fièvre

Activation des CPAsmolécule du CMH molécules d’adhésion Phagocytose

Cytotoxicité

Perforine

Leptine

Immunité innée Immunité adaptative

Th1

Th2

IL-2

Macrophage

Leucotriène B4

Cyclo-oxygenase 2

NK

TNF IL-6IL-1

H2O2

O2-

TNF IL-2

ProliférationCellules T naïves

leptineTNF

IFNγ

Stimulation cellules Th2 Switch IgG1

IL-10 IL-4

Effets anti-apoptotiques sur les cellules T et les précurseurs hématopoïétiques

Stimulation cellules Th1 Switch IgG2-a Aide aux cellules CD8+

Activation macrophages

Homéostasie thymique nombre deethymocytescellules CD4+ CD8+

cellules CD4+ CD8-

apoptose

Activation des neutrophiles Chimiotactisme

Induction des cytokines par les monocytes/macrophagesréponse de la phase aigue anorexie inflammatoire fièvre

Activation des CPAsmolécule du CMH molécules d’adhésion Phagocytose

Cytotoxicité

Perforine

Leptine

Immunité innée Immunité adaptative

Th1Th1

Th2Th2

IL-2

Macrophage

Leucotriène B4

Cyclo-oxygenase 2

NK

TNF IL-6IL-1

H2O2

O2-

TNF IL-2

ProliférationCellules T naïves

leptineTNF

IFNγ

Stimulation cellules Th2 Switch IgG1

IL-10 IL-4

Figure 14: Effets de la leptine sur le système immunitaire d’après La Cava et al. (164)

60

II-4 Interactions directes entre le tissu adipeux et le système immunitaire

II-4 1 Le rôle nutritionnel du tissu adipeux pour le système immunitaire

Tous les immunologistes expérimentaux le savent: les ganglions lymphatiques sont

intégrés dans du tissu adipeux. Les tissus adipeux péri ganglionnaires sont une caractéristique

anatomique conservée uniquement chez les mammifères. (174)

Les adipocytes qui sont anatomiquement associés aux ganglions lymphatiques

présentent des propriétés particulières qui leur permettent d’interagir localement avec les

cellules lymphoïdes. Généralement plus petits que la moyenne, ils accumulent et stockent de

façon sélective certains acides gras notamment des polyinsaturés (175), précurseurs essentiels

des eicosanoides et des docosanoides et les relarguent en réponse à des signaux lipolytiques

locaux. D’autre part, ces tissus adipeux répondent beaucoup mieux que les non péri

ganglionnaires aux stimulations lipolytiques des cellules immunes (176). Les acides gras et le

glycérol ainsi produits vont être une ressource nutritive pour les ganglions et les cellules

immunes qu’ils contiennent: lymphocytes et cellules dendritiques. Le contrôle paracrine de la

lipolyse par les cellules lymphoïdes réduit la compétition pour l’utilisation de l’énergie avec

les autres tissus (177). Cet approvisionnement énergétique local des tissus lymphoïdes

affranchit partiellement la fonction immune de changements dans la quantité et la

composition de la nourriture (Figure 15) (178).

Les vaisseaux des ganglions lymphatiques sont organisés en réseau très fin de sorte

que la surface de contact avec le tissu adipeux soit importante pour récupérer les produits

lipolytiques relargués par les adipocytes adjacents dans l’espace extracellulaire. Dans le tissu

adipeux viscéral et dans la moelle osseuse, les tissus lymphoïdes sont également en contact

direct avec les adipocytes. Les expérimentations animales démontrent que l’inflammation

chronique peut entraîner une altération de la composition en acides gras et une hypertrophie

61

des tissus adjacents particulièrement l’omentum et le mésentérique (179). Mais ces

interactions paracrines restent difficiles à déterminer/observer chez l’humain, étant donné

qu’elles n’ont pas de répercutions sanguines. Cependant, elles jouent certainement un rôle

dans certains changements de distribution des tissus adipeux associés à l’inflammation

chronique (174).

Vaisseau lymphatique afférent

Adipokines

Adipocytes

Capsule

Sinus

Cortex

Ganglion lymphatique

Cellules souches

Cellules dendritiquesTissu adipeux péri ganglionnaire

Vaisseau lymphatique afférent

Adipokines

Adipocytes

Capsule

Sinus

Cortex

Ganglion lymphatique

Cellules souches

Cellules dendritiquesTissu adipeux péri ganglionnaire

Figure15: Anatomie du tissu adipeux entourant les ganglions lymphatiques d’après Knight et

al. (178)

II-4.2 Les cellules immunitaires au sein du tissu adipeux

� Les macrophages du tissu adipeux

Il est décrit dans la littérature que des macrophages sont présents dans le tissu adipeux,

depuis 2003, où il a été montré une augmentation de l’expression des gènes relatifs aux

macrophages dans le tissu adipeux de divers modèles animaux obèses (163, 180) tandis que

62

des expériences d’immunohistochimie révélaient des corrélations positives entre les

marqueurs F4/80 et CD68 et le poids et la taille des adipocytes chez la souris et chez l’homme

(180). Ces résultats ont été confirmés chez l’homme (99, 181, 182) en microscopie et par des

expériences de cytométrie en flux révélant qu’environ 10% de la FSV du tissu adipeux de

l’homme était constituée de macrophages CD14+ (99) et qu’ils étaient positivement corrélés

avec l’IMC. Les expériences d’immunohistochimie ont montré que les macrophages étaient

localisés en couronne autour des adipocytes (180).

Les récentes études menées chez la souris sur la caractérisation des macrophages du tissu

adipeux ont montré qu’il existait des macrophages M1 recrutés ainsi que des M2 résidents

impliqués respectivement dans la promotion et l’atténuation de l’insulinorésistance. Dans

plusieurs modèles de souris obèses, il a été montré que les macrophages recrutés M1 étaient

dans un état plus pro-inflammatoire que la population résidente M2 observée chez les souris

contrôles. De plus, ces macrophages recrutés expriment les marqueurs de surface F4/80,

CD11b et CD11c et sont organisés en agrégats entourant les adipocytes nécrotiques tandis que

les résidents sont plus interstitiels (183, 184).

Les résultats de notre équipe montrent que les macrophages du tissu adipeux humain

expriment des marqueurs M1 et M2, et que seuls les macrophages M2 résidents

(CD14+CD206+CD16-) s’accumulent avec l’obésité. De plus, avec l’augmentation de l’IMC

les macrophages diminuent leur expression de marqueurs M1 au profit de marqueurs M2

(185). Ces résultats sont en accord avec les travaux de Zeyda et al. qui montrent que les

macrophages du tissu adipeux (CD14+CD206+) sont dans un état anti-inflammatoire tout en

étant capables de produire des médiateurs pro-inflammatoires (186). Dans le tissu adipeux

viscéral, cette accumulation de macrophages est augmentée et positivement corrélée avec les

paramètres cliniques de comorbidité de l’obésité (152, 182). Ces travaux montrent que la

polarisation des macrophages dans le tissu adipeux humain n’est pas clairement orientée dans

63

une voie. Ainsi les phénotypes observés diffèrent entre les modèles animaux et l’homme. Il

est important de rester critique quant à l’obésité génétique chez l’animal ou celle induite par

un régime gras. Il se peut qu’elle ne soit pas toujours un modèle représentatif de l’obésité et

de l’état inflammatoire chronique associé qui se sont installés au cours des ans chez les

patients obèses.

� Les lymphocytes du tissu adipeux

Bien que les macrophages aient fait l’objet de nombreuses études, leurs principaux

partenaires cellulaires au cours d’une réaction immunitaire c’est à dire les lymphocytes n’ont

été que partiellement étudiés chez l’animal et très peu chez l’homme. Les récentes données

sur le sujet sont décrites dans la revue suivante.

64

Revue: Les lymphocytes du tissu adipeux (soumis)

1

Les lymphocytes T du tissu adipeux

The adipose tissue T lymphocytes

Carine Duffaut, Virginie Bourlier et Anne Bouloumié

Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France

Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe

n°1 AVENIR, IFR31, Toulouse, France

2

Résumé

L’obésité et plus spécifiquement l’accumulation de tissu adipeux dans les localisations

viscérale et sous-cutanée abdominale est un facteur de risque majeur pour le développement

de pathologies cardiovasculaires dont l’hypertension et l’athérosclérose, et de désordres

métaboliques tels que le diabète de type 2. Au cours de ces dernières années, le concept

d’inflammation métabolique a émergé comme un processus clé impliqué dans l’ensemble de

ces conditions pathologiques. Le tissu adipeux apparaît comme un acteur clé en tant que

source et site de l’inflammation. Les macrophages ont été clairement impliqué dans la genèse

de l’état inflammatoire du tissu adipeux mais récemment certaines données mettent en

lumière une autre population cellulaire immune : les lymphocytes T. Cette revue décrit les

observations relatives aux relations entre adipocytes et lymphocytes T, présente les données

montrant une accumulation des lymphocytes dans le tissu adipeux avec l’obésité et propose

des mécanismes impliqués dans cette accumulation. Le rôle potentiel des lymphocytes du

tissu adipeux dans la genèse des pathologies associées à l’obésité est décrit.

3

Abstract

Obesity and more specifically the accumulation of adipose tissue in the visceral and

abdominal subcutaneous locations is a well defined risk factor for cardiovascular pathologies

such as hypertension and atherosclerosis and metabolic disorders such as type 2 diabetes. In

the last few years, the concept of metabolic triggered inflammation has emerged as a major

process responsible for the clustering of these conditions. The adipose tissue appears as a key

player as site and source of inflammation. The macrophages have clearly been involved in the

genesis of the inflammatory state of the fat mass. However recently, evidences have shed new

light on another immune cell population, i.e. the adipose tissue T lymphocytes. The present

review describes the observations that are relative to the inter-relation between adipocytes and

T lymphocytes, to the accumulation of T lymphocytes within the adipose tissue with obesity

and the mechanisms underlying such a process as well as the potential pathogenic role of the

adipose tissue T lymphocytes.

4

Introduction

L’obésité et plus spécifiquement l’accumulation de tissu adipeux dans les localisations

viscérale et sous-cutanée abdominale est un facteur de risque majeur pour le développement

de pathologies cardiovasculaires dont l’hypertension et l’athérosclérose, et de désordres

métaboliques tels que le diabète de type 2. Au cours de ces dernières années, le concept

d’inflammation métabolique a émergé comme un processus clé impliqué dans l’ensemble de

ces conditions pathologiques [1]. Alors que divers organes métaboliquement actifs tels que le

foie, le muscle et plus récemment l’intestin et la flore intestinale jouent certainement un rôle

dans la genèse et l’entretien de cet état inflammatoire chronique de bas niveau associé à

l’obésité, le tissu adipeux apparaît comme un acteur clé en tant que source et site de

l’inflammation [2]. L’accumulation de macrophages dans le tissu adipeux a été bien décrite

dans les conditions d’obésité dans des modèles murins et chez l’homme. De plus,

l’acquisition d’un phénotype inflammatoire par les macrophages du tissu adipeux a été

directement impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline systémique chez la

souris. Finalement, le lien causal entre l’inflammation et la résistance à l’insuline a été mis en

évidence par l’utilisation de modèles murins invalidés spécifiquement dans les cellules

progénitrices myéloides pour des gènes impliqués dans la transduction du signal

intracellulaire de la réponse inflammatoire [1]. Récemment, certains travaux suggèrent que les

cellules de l’immunité adaptative et plus particulièrement les lymphocytes T pourraient

également jouer un rôle dans l’établissement de l’état inflammatoire associé à l’obésité et

dans la genèse des pathologies qui lui sont associées [3].

Les lymphocytes et le tissu adipeux

Les relations entre tissu adipeux et lymphocytes sont décrites depuis les travaux de C Pond

concernant les interactions entre ganglions lymphatiques et tissu adipeux [4]. En effet d’un

point de vue anatomique; les ganglions lymphatiques sont intégrés dans le tissu adipeux,

5

caractéristique conservée uniquement chez les mammifères. Le tissu adipeux péri-

ganglionaire est considéré comme une réserve énergétique dédiée au fonctionnement du

ganglion lymphatique. Les adipocytes péri-ganglionnaires ont été montrés comme accumulant

de façon sélective certains acides gras notamment poly insaturés, précurseurs essentiels des

eicosanoïdes et des docosanoïdes, second messagers majeurs des cellules immunes. De plus,

ces adipocytes sont sensibles aux stimulations lipolytiques du tumor necrosis factor alpha

(TNFα) et d’interleukine 6 (IL-6) sécrétés par les cellules immunes. Ainsi les échanges

locaux entre adipocytes et lymphocytes permettraient d’affranchir partiellement la fonction

immune des changements quantitatif et qualitatif nutritionnels [5]. En retour, la leptine,

adipokine majeure produite spécifiquement par les adipocytes de façon dépendante de leur

taille, exerce des effets puissants sur les lymphocytes [6]. Les souris déficientes en leptine

(ob/ob) ou en récepteur à la leptine (db/db) présentent de nombreuses anormalités au niveau

de leurs systèmes lymphocytaires [7] dont une involution du thymus et une hypo activation

des lymphocytes T. Chez l’homme, la déficience congénitale en leptine est associée avec une

lymphopénie et une diminution de la réponse T [8]. La leptine serait ainsi impliquée dans le

contrôle de la prolifération, de la différenciation et de l’activation des lymphocytes T de type

Th1 [6].

Accumulation de lymphocytes T dans le tissu adipeux avec l’obésité

Les lymphocytes constituent une famille étendue de types cellulaires distincts impliqués dans

l’immunité adaptative et innée. La présence de lymphocytes résidents dans le stroma de tissu

adipeux de rongeurs a été montrée par des analyses en cytométrie en flux sur la fraction

stroma-vasculaire de dépôts adipeux sous-cutanés et épidydimaires [9]. De façon intéressante,

les dépôts adipeux présentent une répartition différente des populations de lymphocytes selon

leur localisation, avec une prédominance des lymphocytes du système inné (lymphocytes

γδ, les cellules natural killer (NK) et NKT) dans les dépôts épididymaires alors que les dépôts

6

sous-cutanés montrent une majorité de lymphocytes du système adaptatif (lymphocytes B et

T) [9]. Le développement de l’obésité chez la souris soumise à un régime enrichi en lipides ou

dans des modèles d’obésité génétique s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T

(CD3+) présents dans le tissu adipeux qui s’organisent en clusters autour de certains

adipocytes [10,11, 12]. Toutefois ces données restent controversées [9, 13]. De plus, la nature

même des lymphocytes T qui s’accumulent avec l’obésité reste à être clairement définie

puisque certaines données suggèrent un effet spécifique aux lymphocytes T auxiliaires CD4+

[11] alors que d’autres travaux décrivent l’accumulation conjointe de lymphocytes T

auxiliaires et cytotoxiques CD8+ [12, 14]. Les différentes méthodes d’identification des types

cellulaires par immunohistochimie, cytométrie en flux et/ou expression génique de marqueurs

spécifiques lymphocytaires associées à une expression des résultats normalisée par surface

adipocytaire, par gramme de tissu et/ou par dépôt entier peuvent être à l’origine des résultats

divergents. Le fond génétique des souris mais également le type de régime hyperlipidique et

la période de mise sous régime peut également influencer l’accumulation de lymphocytes

dans le tissu adipeux. Nos résultats montrent que sous un fond génétique C57Bl6 avec un

régime composé à 40% de lipides; les lymphocytes T et B, identifiés par cytométrie en flux et

dont le nombre est exprimé par dépôt épidydimaire entier, présentent un trafic cellulaire dans

le tissu adipeux qui est fonction de la période de mise sous régime [15]. Enfin des différences

sexuelles et territoriales ont été mises en évidence avec une infiltration lymphocytaire plus

marquée chez les mâles que chez les femelles [10] et plus importante dans les tissus péri-

gonadiques que sous-cutanés [16]. Concernant les études chez l’homme, une accumulation de

lymphocytes CD3+ a été mise en évidence par des analyses d’expression géniques de

marqueurs de lymphocytes T [11] et des analyses d’immunohistochimie [17] [18] dans les

tissus adipeux sous-cutanés et viscéraux de patients obèses par rapport à des patients normo-

pondérés.

7

Les chimiokines et leurs récepteurs représentent un élément critique dans le trafic cellulaire

immun. Le tissu adipeux produit de nombreuses chimiokines dont la production est modulée

par le degré d’obésité. RANTES (Regulated upon activation normal T cell express sequence)

et SDF1α (Stromal derived factor 1) ont été suggéré comme pouvant jouer un rôle dans

l’adressage des lymphocytes au tissu adipeux. En effet, les expressions de RANTES et de son

récepteur CCR5 sont augmentées avec l’obésité dans des modèles murins et chez l’homme

[10]. La chimiokine SDF-1α est exprimée dans les cellules de la fraction stroma-vasculaire

chez l’homme [11, 19] et via son interaction avec son récepteur CXCR4 pourrait favoriser

l’accumulation de lymphocytes dans le tissu adipeux [11]. Récemment, la production par des

préadipocytes murins différenciés de deux chimiokines spécifiques des lymphocytes, IP-10 et

MIG, ont été décrites en réponse à des stimulations par des facteurs lymphocytaires [12].

Ainsi, les lymphocytes du tissu adipeux pourraient participer à une boucle d’auto-recrutement

via leurs effets stimulateurs sur les adipocytes. Enfin, une molécule d’adhésion exprimée à la

surface endothéliale VAP1/SSAO semble jouer un rôle déterminant dans l’infiltration des

lymphocytes dans le tissu adipeux puisque la souris invalidée pour ce gène présente une

accumulation réduite des lymphocytes dans le tissu adipeux avec l’obésité [20].

Phénotype et rôles des lymphocytes T du tissu adipeux

Les lymphocytes T effecteurs sont considérés comme des éléments clés dans le contrôle de

l’évolution de la cascade inflammatoire selon le type de cytokines prédominantes qu’ils

produisent. De façon classique, les lymphocytes T de type Th1 vont orienter la réponse vers

une immunité à médiation cellulaire stimulant les cellules présentatrices d’antigènes dont les

macrophages alors que les lymphocytes T de type Th2 dirigent une réponse à médiation

humorale en stimulant la production d’anticorps par les lymphocytes B. La démonstration de

la production plus importante d’interféron gamma (IFNγ), cytokine marqueur d’un état Th1,

par les lymphocytes T activés de tissu adipeux de souris obèses par rapport aux souris

8

contrôles [12] suggère que les lymphocytes T du tissu adipeux obèse présentent un phénotype

de type Th1. Chez l’homme, aucune étude directe n’a été réalisée, cependant une corrélation

positive entre l’expression de l’ IFNγ et l’index d’adiposité (tour de taille) a été montrée [11].

Le rôle des lymphocytes du tissu adipeux reste à être clairement établi, notamment lorsque

l’on considère que leur nombre dans le tissu adipeux est très inférieur à celui des

macrophages. Cependant certaines observations ont suggéré leur implication en tant que

orchestrateur de la réponse inflammatoire associée à l’obésité. En effet, des études cinétiques

réalisées chez la souris soumises à un régime hyperlipidique montrent que l’accumulation des

lymphocytes précède celle des macrophages [11,15]. De plus, les souris invalidées pour

l’IFN γ présentent une inflammation réduite du tissu adipeux et une meilleure sensibilité à

l’insuline. L’IFNγ stimule sur les lignées préadipocytaire murine l’expression de diverses

chimiokines dont MCP-1 [11,12]. En plus de ces effets médiés par des facteurs solubles, les

lymphocytes interagissent avec les adipocytes via des contacts cellules/cellules impliquant le

couple CD40 ligand/CD40 exprimé par les adipocytes humains [17]. Ainsi, les lymphocytes

pourraient, par la stimulation de la production de chimiokines adipocytaires, être à l’origine

de l’infiltration macrophagique du tissu adipeux, macrophages eux-mêmes impliqués dans le

développement de la résistance à l’insuline. Les travaux récents réalisés sur des souris

présentant une hyperlipidémie due à un fond ApoE-/- associée à une suractivation du type

Th1 des lymphocytes dus à la perte du contrôle exercé par le TGFβ (CD4dnTbR) apportent

quelques éléments en faveur d’une telle hypothèse. En effet, les souris maigres CD4dnTbR

ApoE-/- présentent une inflammation marquée dans le tissu adipeux similaires à celle

d’animaux obèses [21]. Il est toutefois à noter que la sensibilité à l’insuline n’est pas modifiée

dans ce modèle. Il serait donc intéressant d’étudier ce modèle placé en régime hyperlipidique

afin de définir réellement l’impact des lymphocytes activés Th1 sur la résistance à l’insuline

induite pas l’obésité. Afin de définir le rôle potentiel des lymphocytes dans l’accumulation

macrophagique du tissu adipeux, les souris invalidées pour le gène RAG2 (conduisant à une

9

absence de maturité des lymphocytes T et B) ont été placées en régime hyperlipidique. Les

souris immunodéficientes développent une obésité et une résistance à l’insuline similaire à

celles des souris sauvages [15]. Par contre, une augmentation drastique des cellules NK,

autres cellules productrices d’interféron gamma, et des macrophages est observée dans le tissu

adipeux des souris RAG2-/- [15]. Donc les lymphocytes T ne sont pas les seules cellules

causales de l’inflammation associées avec l’obésité. Leur absence pourrait être compensée par

une accumulation des cellules NK. De plus, ces résultats suggèrent que les lymphocytes

pourraient être des éléments protecteurs contre le développement d’une réaction

inflammatoire innée excessive dans le tissu adipeux lors de l’obésité induite par un régime

hyperlipidique.

Enfin une étude a suggéré que le tissu adipeux péri-vasculaire est un réservoir pour les

cellules T effectrices activées qui pourraient en retour promouvoir une dysfonction vasculaire

et l’hypertension [22]. Ainsi des interactions locales entre adipocytes et lymphocytes T

pourraient également participer à la genèse des pathologies vasculaires.

Conclusion

L’ensemble des travaux récents réalisés sur différents modèles murins mettent en lumière

l’implication potentielle des cellules de l’immunité adaptative et plus particulièrement des

lymphocytes T dans le développement de l’inflammation du tissu adipeux associée à l’obésité

et dans la genèse des pathologies associées à l’obésité. Le développement du tissu adipeux

dans les modèles murins d’obésité induite par un régime hyperlipidique ou génétique

s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T qui présentent une activation de type

Th1. Par leur production de facteurs solubles pro-inflammatoires et via des contacts

cellules/cellules, les lymphocytes T pourraient moduler le phénotype inflammatoire des

adipocytes et participer au développement des pathologies associées à l’obésité (Figure).

Cependant les différences de fond génétique, du type et de la période de régime doivent être

10

prises en compte afin de mieux définir le rôle de cette population cellulaire dans

l’établissement de l’obésité et des pathologies associées. Les données obtenues chez l’homme

sont moins nombreuses et nécessitent d’être approfondies. Les résultats obtenus sur les

macrophages du tissu adipeux montrent que ces cellules immunes ne présentent pas le même

phénotype dans les modèles murins et chez l’homme. En effet, le phénotype des macrophages

du tissu adipeux murin obèse est très clairement polarisé M1 inflammatoire [23] alors que

chez l’homme leurs caractéristiques sont celles de cellules impliquées dans des réactions

inflammatoires chroniques (phénotype mixte inflammatoire et pro-angiogénique) [24]. Ainsi

la définition du phénotype des lymphocytes qui s’accumulent dans le tissu adipeux humain,

les mécanismes responsables de cette accumulation, i.e. recrutement actif et/ou prolifération

locale, et leurs rôles restent à être clairement définis.

11

Références

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12

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Lymphocytes CD3+CD4+ Th1 / CD8+?

MacrophagesProlifération

locale?

RANTES,SDF1α,IP-10, MIG

IFNγ,autres?

Récepteurs d’adressage?

Interactions croisées locales?

?

CD3+ Monocytes Sang

Tissu adipeux

Cellules endothéliales

Adipocytes

VAP1/SSA0, SDF-1α

Les lymphocytes du tissu adipeux: mécanismes d’adressage et rôles.

65

Objectifs

Les données de la littérature suggèrent de très fortes interactions entre le système

métabolique et le système immunitaire au niveau des réponses inflammatoires aussi bien que

dans la régulation du métabolisme. Le tissu adipeux est lui-même le siège d’une réponse

inflammatoire de bas niveau et de l’accumulation de cellules immunes. La présence de

lymphocytes dans le tissu adipeux humain a été très peu étudiée et les phénotypes précis ainsi

que l’état inflammatoire de ces lymphocytes n’est pas décrit. Comme nous l’avons vu en

introduction, les populations de l’immunité adaptative sont variées et les marqueurs qu’elles

expriment sont indicateurs de leurs fonctions.

Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes attachés à caractériser

précisément les lymphocytes présents dans le tissu adipeux de manière qualitative et

quantitative. Les types de cellules nous informent sur l’état d’activation inflammatoire dans

lequel ils se trouvent au sein du tissu adipeux humain et nous permettent d’émettre des

hypothèses quant à leur rôle potentiel sur le métabolisme et dans le développement de

l’obésité. Nous avons également étudié ces variations de phénotype en fonction de l’IMC et

de la localisation du tissu adipeux (viscéral versus sous cutané) sur un grand nombre de

patients. De plus, nous avons tenté d’apporter des précisions sur leurs rôles potentiels au sein

du tissu adipeux via des effets des sécrétions de ces cellules sur les autres cellules du tissu

adipeux (les macrophages, les cellules progénitrices et les adipocytes).

L’utilisation de modèles animaux en régime enrichi en lipides pendant des temps

variables nous a permis d’étudier les lymphocytes mais aussi les autres populations immunes

dans le développement précoce de l’obésité. Enfin, l’étude de modèles déficients en

lymphocytes nous renseigne sur le rôle potentiel des lymphocytes sur le développement de

l’obésité et sur le recrutement des autres cellules immunitaires dans le tissu adipeux.

66

Partie 2: Résultats

67

I Caractérisation des lymphocytes du tissu adipeux humain et de leur rôle sur le

métabolisme et la différenciation adipocytaire

Nous avons tout d’abord étudié la présence de lymphocytes dans le tissu adipeux d’un

grand nombre de patients d’indice de masse corporelle (IMC) variés ayant eu recours à la

lipoaspiration ou à la dermolipectomie abdominale, par des expériences de cytométrie en flux

et d’immunohistofluorescence.

Ces expériences nous permettent de déterminer la localisation des lymphocytes au sein

du tissu, les sous-populations de lymphocytes présents dans le tissu adipeux ainsi que les

modulations de leurs nombres avec l’index d’adiposité (défini par l’IMC).

D’autre part, un second groupe de patients obèses morbides ayant eu recours à la

chirurgie bariatrique nous donne accès à des prélèvements pairés de tissu sous-cutanés et

viscéraux. Ainsi nous avons pu explorer si la localisation viscérale reconnue pour être plus

délétère en terme de syndrome métabolique (187) affecte le nombre ainsi que les

caractéristiques des lymphocytes présents au sein du tissu adipeux.

Afin de compléter cette caractérisation, des analyses des transcrits exprimés par les

lymphocytes isolés du tissu adipeux humain par une technique d’immunosélection/déplétion

comparés à des lymphocytes sanguins, nous renseignent sur l’état inflammatoire et la

polarisation des lymphocytes présents dans le tissu adipeux, ainsi que sur les variations de ces

paramètres avec l’index d’adiposité.

Une fois cette caractérisation achevée, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel

des lymphocytes dans le tissu adipeux en terme de régulation de la différenciation et du

métabolisme adipocytaire en étudiant les effets de facteurs solubles des lymphocytes du tissu

adipeux humain sur l’adipogenèse des cellules progénitrices CD34+/CD31-, sur la lipolyse et

la lipogenèse des adipocytes matures.

68

Enfin nous avons étudié les cytokines et les chimiokines sécrétées par les adipocytes

humains matures et les autres cellules de la fraction stroma-vasculaire (cellules progénitrices,

macrophages, cellules endothéliales) qui pourraient interagir avec les lymphocytes afin de

tenter d’expliquer le recrutement et la prolifération des lymphocytes au sein du tissu adipeux.

69

Article 1 Interplay between human adipocytes and T lymphocytes in obesity: CCL20 as

an adipochemokine and T lymphocytes as lipogenic modulators

Dans ce manuscrit, nous avons caractérisé les lymphocytes dans le tissu adipeux humain sous-

cutané de patients avec des indices de masse corporelle variables et nous avons regardé

l’impact de la localisation viscérale et sous-cutanée du tissu adipeux de patients obèses

morbides sur leur nombre et sous-types. Puis nous avons étudié l’effet des facteurs solubles

issus des lymphocytes T du tissu adipeux humain sur la lipolyse et sur la lipogenèse des

adipocytes matures humains d’une part, et défini d’autre part, une voie potentielle de

recrutement des lymphocytes via le système CCL20-CCR6.

ISSN: 1524-4636 Copyright © 2009 American Heart Association. All rights reserved. Print ISSN: 1079-5642. Online

7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 72514Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology is published by the American Heart Association.

DOI: 10.1161/ATVBAHA.109.1925832009;

2009;29;1608-1614; originally published online Jul 30,Arterioscler Thromb Vasc BiolAnne Bouloumié

Maumus, Patrick Chiotasso, Coralie Sengenès, Max Lafontan, Jean Galitzky and Carine Duffaut, Alexia Zakaroff-Girard, Virginie Bourlier, Pauline Decaunes, Marie

an Adipochemokine and T Lymphocytes as Lipogenic ModulatorsInterplay Between Human Adipocytes and T Lymphocytes in Obesity: CCL20 as

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Fax:Kluwer Health, 351 West Camden Street, Baltimore, MD 21202-2436. Phone: 410-528-4050. Permissions: Permissions & Rights Desk, Lippincott Williams & Wilkins, a division of Wolters http://atvb.ahajournals.org/subscriptions/Biology is online at Subscriptions: Information about subscribing to Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

Interplay Between Human Adipocytes and T Lymphocytesin Obesity

CCL20 as an Adipochemokine and T Lymphocytes asLipogenic Modulators

Carine Duffaut, Alexia Zakaroff-Girard, Virginie Bourlier, Pauline Decaunes, Marie Maumus,Patrick Chiotasso, Coralie Sengenes, Max Lafontan, Jean Galitzky, Anne Bouloumie

Objective—Adipose tissue (AT) plays a major role in the low-grade inflammatory state associated with obesity. The aim of the

present study was to characterize the human AT lymphocytes (ATLs) and to analyze their interactions with adipocytes.

Methods and Results—Human ATL subsets were characterized by flow cytometry in subcutaneous ATs from 92

individuals with body mass index (BMI) ranging from 19 to 43 kg/m2 and in paired biopsies of subcutaneous and

visceral AT from 45 class II/III obese patients. CD3� ATLs were composed of effector and memory CD4� helper and

CD8� cytotoxic T cells. The number of ATLs correlated positively with BMI and was higher in visceral than

subcutaneous AT. Mature adipocytes stimulated the migration of ATLs and released the chemokine CCL20, the receptor

of which (CCR6) was expressed in ATLs. The expression of adipocyte CCL20 was positively correlated with BMI and

increased in visceral compared to subcutaneous adipocytes. ATLs expressed inflammatory markers and released

interferon gamma (IFN�). Progenitor and adipocyte treatment with ATL-conditioned media reduced the insulin-

mediated upregulation of lipogenic enzymes, an effect involving IFN�.

Conclusions—Therefore, crosstalk occurs between adipocytes and lymphocytes within human AT involving T cell chemoat-

traction by adipocytes and modulation of lipogenesis by ATLs. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29:1608-1614.)

Key Words: inflammation � visceral fat � macrophages � T lymphocyte subsets � CCR6

Adipocytes are the site of metabolic activity of adipose

tissue (AT) ie, lipogenesis that corresponds to lipid

storage and lipolysis that is responsible for triglyceride

hydrolysis). In humans, lipogenesis is promoted by insulin,

whereas lipolysis is mainly under the control of catechol-

amines.1 Besides their metabolic activity, adipocytes produce

a wide range of factors grouped under the term adipokines.

Obesity is associated with alterations of the metabolic and

secretory activities of adipocytes and is characterized by a

chronic low-grade inflammatory state.2 Chronic inflammation

within the fat mass itself has been suspected to play a major

role in systemic inflammation. Initial studies, focused on the

myeloid cells (monocytes, macrophages and dendritic cells),

have shown AT accumulation of these cells in obese condi-

tions in both mice and humans.3–5 In mice, acquisition of a

proinflammatory phenotype by the AT macrophages (ATMs)

has been linked to the development of insulin resistance.6 In

human obesity, however, ATMs appeared less polarized with

proangiogenic abilities, hallmarks of cells involved in chronic

nonresolved inflammatory processes.7

Murine fat depots contain lymphoid cells from the innate

(natural killer [NK] cells, NKT cells and ��T cells) and the

adaptive (��T and B cells) immune systems.8 Recent studies

have described the accumulation of CD3� T lymphocytes in the

AT of obese mice9–12 and patients.13 However, there are no data

on the subsets and activation state of lymphocytes present in

human AT. Chemokine secretion by adipocytes may promote

lymphocyte homing within AT. Although T cell chemoattrac-

tants such as CCL5 and CXCL12 have been described to be

expressed within AT,9,13 their cellular origin as well as the

modulation of their expression according to adiposity are still

unclear. The work of Pond et al has stressed the close interac-

tions between lymphoid cells in lymph nodes and the surround-

ing AT in rodents.14 Recently, in mice models, lymphocytes

have been involved in the regulation of the inflammatory

response and insulin resistance associated with obesity through

their production of interferon gamma.11 The present study was

undertaken to characterize human ATLs in term of subsets and

activation state and relate this with the degree of adiposity and

anatomic location in human AT. The interrelation between

Received March 11, 2009; revision accepted July 22, 2009.From the Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM), U858, Toulouse, France, Universite Toulouse III Paul Sabatier, Institut

de Medecine Moleculaire de Rangueil, Equipe n°1 AVENIR (C.D., A.Z.-G., V.B., P.D., M.M., C.S., M.L., J.G., A.B.), Chirurgie generale et digestive(P.C.), CHU Purpan, Toulouse, France.

Correspondence to Anne Bouloumie, Equipe 1 AVENIR/INSERM U858, Hopital Rangueil Bat L4, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 04, France.E-mail anne.bouloumie@inserm.fr

© 2009 American Heart Association, Inc.

Arterioscler Thromb Vasc Biol is available at http://atvb.ahajournals.org DOI: 10.1161/ATVBAHA.109.192583

1608 by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

human ATLs and mature adipocytes was studied in terms of

adipocyte-derived T cell chemoattractant and ATL-mediated

metabolic effects.

Materials and Methods

MaterialsChemicals were purchased from Sigma. Collagenase NB4 was

purchased from Serva. Selection kits for CD34�, CD14�, and CD3�

cells were purchased from StemCell Technologies, and magnetic

microbeads coupled with anti-CD31 antibodies were purchased from

Dynal Biotech (Invitrogen). Culture media were from purchased

Promocell. Antibodies for flow cytometry analysis were purchased

from BD Biosciences.

Isolation of the Stroma-Vascular Fraction (SVF)

and Mature AdipocytesHuman subcutaneous adipose tissue (AT) was obtained from healthy

women undergoing elective procedures of fat removal for esthetic

purposes. Their body mass index (BMI) ranged from 19 to 43 kg/m2

(n�92, mean BMI�27.2�0.6kg/m2, mean age�42.6�1.2 years). In

addition, paired human omental and subcutaneous tissues were

obtained from a group of class II/III obese nondiabetic patients

undergoing bariatric surgery (n�45, 41 women/4 men, mean

BMI�43�1kg/m2, mean age�42�1 years). The protocols of fat

collection were approved by the Institutional Research Board of

INSERM and Toulouse University Hospital Ethics committee. The

cells from the stroma-vascular fraction (SVF) and mature adipocytes

from human AT were obtained after collagenase digestion as

previously described.5

Isolation of Human Adipose Tissue LymphocytesThe cells of the human AT-SVF were isolated using an immunoselec-

tion/depletion protocol as previously described5,15 with modifications to

isolate the CD3� ATLs. Briefly, after depletion of the progenitor cells

(CD34�/CD31�) and AT macrophages (ATMs; CD34�/CD14�) from

the AT-SVF, the CD34�/CD14� cells were incubated with a CD3�

Stem Cell System positive cocktail (Grenoble;15 minutes at room

temperature). After the addition of nanoparticles, cells were recovered

by successive magnetic sorting steps. Freshly isolated CD34�/CD14�/

CD3� defined as ATLs were counted, and either lysed (Qiagen) and

stored at �20°C until mRNA extraction, analyzed by flow cytometry, or

cultured. Conditioned media (CM) from ATLs and ATMs were col-

lected after 24-hour plating of the cells (200 000 to 250 000 cells/cm2)

in basal medium (ECBM/0.5% bovine serum albumin free fatty acids-

free [FFA-free BSA]), centrifuged (20 000g, 3 minutes, room temper-

ature), and the media was stored at �20°C until further use. To isolate

human blood CD3� cells, peripheral blood was collected in heparinized

tubes from 5 donors (3 women/2 men; mean BMI�20.7�0.6kg/m2;

mean age�35�4 years). After isolation of blood mononuclear cells and

removal of platelets by successive centrifugations, macrophages were

depleted using magnetic CD14� beads (Myltenyi Biotec), and the

CD3� cells were selected on the CD14 negative cell fraction with the

same protocol described for the AT CD3� cells. The blood CD3� cells

were then lysed (Qiagen) and stored at �20°C until mRNA extraction.

Flow Cytometry AnalysisHuman SVF cells, ATLs, or blood cells (100 000 cells) were

incubated with FITC- (CD4, ��TCR, CD25, CD62L) PerCP-

(CD45), PECy7- (CD45-RO), PE- (CD3, CD14, CD45-RA), APC-

(CD8, CD19, CD56) conjugated antibodies or respective isotype

controls. For IFN� intracellular staining, ATLs were incubated in the

presence or absence of brefeldin-A (BD Biosciences) and stained

with FITC-CD4, PECy7-IFN� and APC-CD8 antibodies or respec-

tive isotype controls. Analyses were performed using a FACSCalibur

flow cytometer and CellQuest Pro software (BD Bioscience).

Confocal Fluorescence Microscopy AnalysesAfter 1-hour fixation in 4% paraformaldehyde and extensive wash-

ing steps in PBS, pieces of human subcutaneous AT was incubated

for 30 minutes at room temperature in PBS/2% BSA followed by a

2-hour incubation with the rabbit polyclonal antibody directed

against human CD3 (Dako) (1:20). After washing (PBS/0.2% Tween

and PBS) and 1-hour incubation with anti-rabbit antibody coupled to

AlexaFluor488 (Invitrogen) (1:200), the tissues were placed on

slides and a 3-dimensional reconstruction was performed using a

Zeiss LSM 510 META confocal microscope.

Lipolysis and Modulation of Lipogenic EnzymeExpression in Mature Adipocytes andProgenitor CellsFor lipolysis measurement, mature adipocytes obtained after colla-

genase digestion of subcutaneous AT were plated in fibrin gels as

previously described.5 After gel polymerization, basal medium,

ATM-CM, or ATL-CM were added. After 24-hour incubation

pharmacological agents (0.1 �mol/L isoprotenerol [ISO] or

10 �mol/L noradrenaline [NA]) were added to the media for 90

minutes at 37°C. At the end of the incubation period, aliquots of the

media were taken for glycerol and FFA determination (Sigma-Al-

drich and Wako Unipath, respectively). Total lipid content was

determined gravimetrically after solvent extraction. For gene expres-

sion analysis, mature adipocytes in fibrin gels were treated with basal

medium in the presence or absence of 50 ng/mL human recombinant

IFN� or with ATL-CM in the presence or absence of 2 �g/mL

neutralizing antihuman IFN� antibody or its isotype control (BD

Bioscience) or with ATM-CM. After overnight incubation,

0.1 �mol/L insulin was or not added for 24 hours. Media was then

removed and adipocytes were lysed in Qiazol (Qiagen) (v/v) for

mRNA extractions.

Freshly harvested AT-progenitor cells (CD34�/CD31�) were

plated at a density of 120 000 cells/cm2 in ECBM supplemented with

10% fetal calf serum (FSC) for 24 hours at 37°C in an atmosphere of

5% CO2. Adipogenic differentiation was induced in defined medium

(ECBM supplemented with 66 nmol/L Insulin, 10 �g/mL Trans-

ferrin, 1 nmol/L Triiodothyronine, 1 �g/mL Rosiglitazone, and 100

nmol/L cortisol). Cells were cultured either in a mixture (v/v) of 2�

defined medium and ATL-CM or in a mixture (v/v) of 2� defined

medium and ECBM/0.1% BSA (control). Media were changed every

4 days. At day 8, cells were lysed by sonication in PBS/0.2% Tween,

and the triglyceride content was determined (GPO-trinder kit, Sigma,

respectively), or lysed in Qiazol for mRNA extraction.

Migration AssaysHuman ATL migration was assessed on 3 �m-pore HTS FluoroBlock

inserts (Falcon). After labeling for 60 minutes with 10 �mol/L

Calcein AM, ATLs (20 000 cells in 300 �L ECBM/0.1%BSA) were

incubated in the upper side of the insert and 800 �L mature

adipocyte-conditioned media, or conditioned media without cells

(control) was added to the companion plate under the insert. ATL

migration was evaluated by counting the number of labeled lympho-

cytes attached to the lower surface of the wells after 4 hours.

Cytokine DetectionThe RayBio Human Cytokine antibody Array V (RayBiotech Inc,

Cliniscience) provides antibody array membranes to detect expres-

sion of 79 cytokines. The experiment was performed according to the

manufacturer’s instructions. Briefly, 1 mL of conditioned medium by

human mature adipocytes originating (n�6) maintained in fibrin gels

for 24 hours was added to the antibody-coated membrane and

incubated on a plate shaker at 4°C overnight. After incubation with

biotinylated antibodies and labeled streptavidin, the signal was

detected from the membrane by chemiluminescence using Chemi-

smart 3000 (Vilbert LourmatFrance). Data analysis was performed

using Bio1D software (Vilbert Lourma). Positive controls were used

to normalize the results from different membranes.

Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells 1609

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

RNA Extraction and Real-Time PCRTotal RNA was extracted from ATLs, adipocytes. and progenitor cellsusing the RNeasy kit (Qiagen). The RNA concentration was measuredeither by a spectrophotometer nanodrop� ND-1000 (Labtech) or byfluorimetric assay (Ribogreen, Invitrogen). The RNA was reverse-transcribed using the “Superscript II” kit (Invitrogen). Reverse transcrip-tion was also performed without the superscript enzyme on RNAsamples to ensure the absence of contaminating genomic DNA. Primersfor tumor necrosis factor � (TNF-�), IFN�, RANTES (CCL5), CCL20,(CCR6), interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-6, perforin-1 (PRF-1), phospho-inositide-3-kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1), fatty acidsynthase (FAS), lipoprotein lipase (LPL), and leptin receptor (Leptin-R)were from Applied Biosystems (Hs00174128_m1, Hs00174143_m1,Hs00174575_m1, Hs00171125_m1, Hs00171121_m1, Hs00174114_m1,Hs00174122_m1, Hs00174131_m1, Hs00169473_m1, Hs00381459_m1,Hs00188012_m1, Hs00173425_m1, Hs00174497_m1, respectively). Theamplification reaction was done in duplicate on 15 ng of the cDNAsamples in a final volume of 20 �L in 96-well reaction plates (AppliedBiosystems) in a GeneAmp 7500 detection system (Applied Biosys-tems). All reactions were performed under the same conditions: 50°Cfor 2 minutes, 95°C for 10 minutes, 40 cycles of 95°C for 15 seconds,and 60°C for 1 minute. Results were analyzed with the GeneAmp 7500software and all the values were normalized to the levels of 18S rRNA.

Statistical AnalysisValues are given as mean�SEM for (n) separate experiments.Correlations were performed using a Spearman rank correlation.Comparisons between groups were analyzed by ANOVA for exper-iments with more than 2 subgroups followed by post hoc tests andthe nonparametric Mann–Whitney test or using the Student t test,when appropriate (Prism 4, GraphPad Software, USA). Differenceswere considered significant when P�0.05.

Results

Characterization of the Lymphocyte Subsets in theHuman Subcutaneous Adipose TissueFlow cytometry analysis performed on the stroma-vascular

fraction (SVF) obtained after collagenase digestion of

human subcutaneous adipose tissue (AT) (n�92, mean

BMI�27.2�0.6kg/m2) showed 2 main CD45� leukocyte pop-

ulations. A predominant CD14� macrophage population

(19�1% of total SVF cells) was identified. The lymphocyte

population was mainly composed of CD3� T lymphocytes

(6�0.5% of total SVF cells), a minor CD56� NK cell popula-

tion (1.5�0.1% of total SVF cells), and few CD19�

B-lymphocytes (Figure 1A). Three dimensional reconstitution of

confocal fluorescence microscopy analyses using anti-CD3 an-

tibody revealed the presence of CD3� cells organized in clusters

around adipocytes (Figure 1B). Some individual CD3� cells

were identified in the stroma and few in the capillaries (data not

shown). Flow cytometry analyses performed under the same

conditions on the AT-SVF and peripheral blood showed that the

CD3� cells identified in the AT exhibited a lower size but a

higher granularity than the blood CD3� cells (supplemental

Figure IA). Moreover, the expressions of the homing receptor

CD62L and the naıve T cells CD45RA markers were markedly

lower in the AT SVF CD3� cells compared to peripheral blood

(supplemental Figure IB). To analyze the subsets of human AT

CD3� T lymphocytes, CD3� cells were immunoselected from

freshly-harvested SVF after depletion of the CD34 (progenitor

and capillary endothelial cells) and CD14 (macrophages) posi-

tive cells. Helper CD4� and cytotoxic CD8� T cells were the

major CD3� T-lymphocyte subsets (Figure 1C). A minor subset

of NKT cells (CD3�/CD56�) and few, if any, regulatory

CD25� and immature ��T lymphocytes were detected (data not

shown). The helper CD4� T cells were mainly memory

(CD45RO�) as well as effector T cells (CD45RO�/RA�),

whereas the CD8� cells were mainly effector cells (Figure 1D).

Influence of the Degree of Adiposity and Fat

Anatomic Location on the Number of Human

Adipose Tissue T LymphocytesThe number of AT lymphocytes (ATLs) determined by flow

cytometry analysis of the SVF of the subcutaneous AT

(n�92) increased with the degree of adiposity. Indeed, a

statistically significant correlation was detected between the

number of AT CD3�, CD4�, as well as CD8� cells and the

BMI of the individuals (data not shown). The patients were

grouped according to BMI, and obese patients (BMI �30)

exhibited a statistically significant higher numbers of AT

CD3�, CD4�, and CD8� than lean patients (BMI �25;

Figure 2A through 2C). The number of CD56�-NK cells

within the subcutaneous AT remained constant whatever the

BMI (data not shown). The analysis of the SVFs of paired

biopsies of subcutaneous and visceral ATs from class II/III

obese patients (n�45, mean BMI�43�1kg/m2) showed that

the number of CD14� cells (adipose tissue macrophages,

ATMs) was slightly higher in visceral compared with subcu-

taneous AT (1.2-fold, P�0.05, Figure 3A). The number of

AT CD3� cells showed a marked increase in the visceral

depot (3-fold, P�0.001, Figure 3A), because of a clear

enhanced effector CD8� cell number and a moderate increase

in memory CD4� cell numbers (Figure 3B through 3D).

Figure 1. Characterization of the lymphocyte subsets in thehuman subcutaneous adipose tissue. A, Multicolour FACS anal-yses were performed on the SVF of subcutaneous AT usingCD14–PE, CD3-PE, CD56-APC, and CD19-PerCP-Cy5.5 anti-bodies. Results are means�SEM (n�92 for CD14, CD3, andCD56; n�41 for CD19). B, Three-dimensional reconstitution ofconfocal fluorescence microscopy analyses of human adiposetissue with an antibody directed against CD3. The upper andlower views of CD3� cell clusters surrounding three adipocytesare shown. C, Multicolor FACS analyses were performed onimmunoselected AT CD3� cells using CD4-FITC and CD8-APCantibodies. A representative dot plot is shown. D, MulticolorFACS analyses were performed on immunoselected AT CD3�

cells with CD4-FITC/CD8-APC/CD45RO-PeCy7/CD45RA-PEantibodies. Results are means�SEM (n�9).

1610 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

Adipocyte Expression of the T Cell

Chemoattractant CCL20To assess whether adipocytes attracted ATLs, we studied the

effects of the adipocyte-derived factors contained in the media

from human mature adipocytes of subcutaneous AT included in

fibrin gel for 24 hours on the migration of ATLs. As depicted in

Figure 4A, ATLs exhibited a marked migratory responsiveness

to human mature conditioned media (5.5-fold increase,

P�0.01). The human mature conditioned media were analyzed

on protein arrays allowing the simultaneous detection of 79

proteins (Figure 4B). As expected, strong positive signals were

detected for the adipokine leptin and the cytokines and growth

factors IL-6, vascular endothelial growth factor (VEGF), tumor

growth factor beta 2 (TGF�2), oncostatin M (OSM), as well as

tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP-1). Con-

cerning chemokines, positive signals were obtained for chemo-

kines active on neutrophils (CXCL1, CXCL2, and CXCL8), for

MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5, and MCP-4/CCL13. Interest-

ingly, the lymphocyte chemoattractant chemokine CCL20 was

also identified. Notably, no signals above the baseline were

detected for CCL1, CCL8, CCL17, CCL18, CXCL5, CXCL6,

CXCL9, CXCL10, CXCL12, and CXCL13. To further charac-

terize the adipocyte-derived CCL20, real-time RT-PCR analyses

were performed on mature adipocytes from subcutaneous AT

(n�18 women, age�44�2 years, BMI�27�1 kg/m2) and from

subcutaneous and visceral AT from class II/III obese women

(n�12, age�41�3 years, BMI�44.7�1.3kg/m2). The levels of

CCL20 transcripts in adipocytes from subcutaneous AT corre-

lated with the adiposity degree assessed by the BMI (Spearman

r�0.5, P�0.05) but not with age. Adipocytes originated from

obese individuals exhibited 7-fold more CCL20 transcripts than

adipocytes from lean individuals (Figure 4C). The effects of

conditioned media (CM) originating from native immunos-

elected human ATLs and ATMs on adipocyte CCL20 expres-

sion were studied. Although treatment of adipocytes with

ATL-CM or IFN� did not modify CCL20 expression, ATM-CM

induced a marked increase in the levels of CCL20 transcript

(3.8-fold increase, P�0.05, Figure 4D). In class II/III obese

women, the expression of CCL20 in visceral adipocytes was

higher than in the paired subcutaneous adipocytes (5-fold in-

crease, P�0.05, Figure 4E).

Phenotype of the Human AdiposeTissue LymphocytesReal-time RT-PCR analysis was performed on the native

immunoselected ATLs and compared to immunoselected

CD3� cells from peripheral blood from different donors. The

study was restricted to subcutaneous AT because the amount

of cells recovered from the paired biopsies of subcutaneous

and visceral AT of obese patients was too low. ATLs

exhibited a marked higher transcript level for IFN�, TNF�,

Figure 2. Influence of the degree of adiposity on the number oflymphocytes in the subcutaneous adipose tissue. The number ofAT lymphocytes (normalized per gram of AT) was determined inthe subcutaneous AT-SVF by flow cytometry analyses using (A)CD3-PE, (B) CD3-PE/CD4–FITC, (C) CD3-PE/CD8-APC antibodiesin lean (open bars, n�41), overweight (hatched bars, n�26), andobese (filled bars, n�25) patients. *P�0.05, **P�0.01 obese vslean.

Figure 3. Influence of fat mass location on the number of lym-phocytes in class II/III patients. Multicolor FACS analyses wereperformed on the SVF obtained from paired biopsies from sub-cutaneous (open bars) and visceral (filled bars) AT of class II/IIIobese patients using CD14-PE, CD3-PE, CD4-FITC, CD8-APC,CD45RO-PeCy7, and CD45RA-PE antibodies. A, Number ofATMs (CD14�) and ATLs (CD3�; n�45). B, Numbers of CD4�

and CD8� ATLs (n�45; C and D) Number of memory(CD45RO�), naıve (CD45RA�), and effector (CD45RO-/RA-)CD4� and CD8� ATLs (n�19). Results are means�SEM.*P�0.05, **P�0.01 visceral vs subcutaneous.

Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells 1611

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

RANTES, IL-2, as well as perforin-1 (PRF-1) when com-

pared with blood T lymphocytes (Table). The expression of

IL-4 was not detected in ATLs. Interestingly, the expression

of the CCL20 receptor CCR6 as well as the expression of the

leptin receptor (Leptin-R) were markedly upregulated in

human ATLs. The production of IFN� by ATLs was further

analyzed by flow cytometry (Figure 5A). Both CD4� and

CD8� cells produced IFN� (data not shown).

Specific Paracrine Effects of ATLs on HumanMature AdipocytesThe effects of conditioned media (CM) originating from

native immunoselected human ATLs and ATMs on adipocyte

metabolism were studied. Pretreatment of human mature

adipocytes with ATL-CM or ATM-CM did not alter either

basal lipolysis or the lipolytic activity stimulated with isopro-

tenerol (ISO) or noradrenaline (NA), as assessed by the

release of glycerol (data not shown) and free fatty acids

(Figure 5B). Pretreatment of human mature adipocytes with

ATL-CM altered the insulin responsiveness of the lipogenic

enzymes fatty acid synthase (FAS) and lipoprotein lipase

(LPL). Indeed, although ATL- and ATM-CMs did not alter

Figure 4. Production and expression of the T cell chemoattractantCCL20 by human mature adipocytes. A, Migration of human ATLsto human adipocyte-conditioned media. Results are expressed aspercentage of control (media without cells) and are means�SEMof n�6. B, Representative photomicrograph of a cytokine antibodyarray membrane performed on conditioned media from pooledhuman mature adipocytes (n�6). C, mRNA levels of CCL20 deter-mined by real-time RT-PCR analyses on mature adipocytes fromsubcutaneous AT of 6 lean and 6 obese patients. Results aremeans�SEM. **P�0.01. D, mRNA levels of CCL20 determined byreal-time RT-PCR analyses in adipocytes (n�4) treated or not(Control) with ATL-CM (n�4), 50 ng/mL IFN�, or ATM-CM (n�12).Results are expressed as percentage of control and are means�

SEM. *P�0.05 vs control. E, mRNA levels of CCL20 determined byreal-time RT-PCR analyses on mature adipocytes isolated frompaired biopsies of subcutaneous and visceral AT of class II/IIIobese patients (n�12). **P�0.01.

Table. Gene Expression in Blood and Adipose Tissue T Cells

Gene Blood CD3� Cells Adipose CD3� Cells

IFN� 0.1�0.02 2.3�0.4*

TNF� 0.2�0.06 8.1�1.3*

CCL5 12�2 47�6*

CCR6 5�10�3�1�10�3 47�10�3

�6�10�3**

Leptin-R 7�10�3�2�10�3 73�10�3

�10�10�3*

IL-2 1�10�3�0.2�10�3 8�10�3

�0.3�10�3*

IL-4 1.6�10�5�0.7�10�5 Nondetectable

PRF-1 2�0.2 5.8�0.8*

Gene expression was determined by real-time RT-PCR. Results were

normalized to the levels of 18S rRNA and expressed as 2�CT�10 000, blood

CD3� cells (n�5); adipose CD3� cells (n�30 for IFN�, TNF�, CCL5, PRF-1,

n�18 for CCR6 and Leptin-R, n�7 for IL-2 and IL-4), Results are mean�SEM.

*P�0.05, **P�0.01.

Figure 5. IFN� production by adipose tissue T lymphocytes andpararine effects on adipocyte metabolism. IFN� production byimmunoselected ATLs was determined by multicolour FACS analy-ses using CD4�FITC/CD8-APC/IFN�-PeCy7 antibodies. A, A repre-sentative dot plot is shown obtained on gated IFN� positive cells.B, FFA released by human mature adipocytes pretreated or not(open bars) by conditioned media from ATLs (filled bars, n�6) orfrom ATMs (hatched filled bars, n�6) and stimulated or not (basal)by 0.1 �mol/L isoprotenerol (ISO) or 10 �mol/L noradrenaline (NA).Results are expressed as percentage of the values obtained for thecontrol nonstimulated adipocytes (basal) and are means�SEM. ThemRNA levels of fatty acid synthase (FAS; C), lipoprotein lipase (LPL;D), phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1; E)were determined by real-time RT-PCR analyses in adipocytes (n�4)treated or not (Control, filled bars) for 36 hours with ATL-CM in thepresence (�Ab, hatched bars, n�4) or absence (open bars, n�12) of2 �g/mL neutralizing antihuman IFN� antibody or 50 ng/mL IFN� orATM-CM (hatched filled bars, n�12), in the presence or absence ofinsulin for 24 hours. Results are means�SEM and are expressed aspercentage of cells without insulin. *P�0.05, **P�0.01 vs control�insulin. F, The mRNA levels of FAS and LPL as well as the triglycer-ide content (TG) of human progenitor cells treated or not with ATL-CMs. Results are expressed as percentage of the control and aremeans�SEM of n�3.

1612 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

the basal expression of FAS and LPL in human mature

adipocytes (data not shown), ATL-CMs strongly inhibited the

insulin-mediated upregulation of FAS and LPL transcript

levels (Figure 5C and 5D). Furthermore, it was associated

with the downregulation of a key component of the insulin-

dependent intracellular pathway, the phosphoinositide-3-

kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1; Figure 5E). Such

an ATL-mediated inhibitory effect on FAS, LPL, and

PIK3R1 expression was reversed by a neutralizing IFN�

antibody and mimicked by 50 ng/mL IFN� treatment.

ATM-CM did not modulate the insulin responsiveness of the

adipocyte under the same conditions (Figure 5C, 5D, and 5E).

Human AT progenitor cells (CD34�/CD31� cells) were

treated with human ATL-conditioned media under adipo-

genic culture conditions. Human ATL-conditioned media led

to a marked decrease of the expression of FAS and LPL that

was associated with a lower triglyceride content (Figure 5F).

DiscussionThe present study demonstrates that, in humans, the degree of

adiposity is positively correlated with the accumulation of

adipose tissue lymphocytes (ATLs). Flow cytometry analyses

of the subcutaneous AT-SVF showed the presence of CD3�

T lymphocytes but few CD19� B lymphocytes and innate

lymphocytes (NK, NKT, and ��T-cells). These results clearly

show that human AT and murine AT are different in terms of

relative proportion of T lymphocyte subsets within the

SVF.8,16 Among the T lymphocytes, CD4� and CD8� cells

were characterized as memory (CD45RO�) and effector

(CD45RO�/RA�) cells. Compared to the blood cells, few

naıve CD45RA� as well as CD62L T cells were identified in

the human adipose tissue. Moreover, the mean size of the

tissue lymphocytes was lower than the blood CD3� cells,

whereas the higher granularity of the ATLs compared to the

blood suggested distinct activation states. The direct compar-

ison in the expression of several activation markers in the

immunoselected blood and AT CD3� cells confirmed that

human ATLs exhibited higher expression of inflammatory

markers. Taken together, the low levels of B cells and of

CD62L and naıve T cells together with the high proportion of

effector T cells demonstrate that the human ATLs exhibit a

specific and distinct profile than the one found in peripheral

blood. ATLs are therefore mostly infiltrated or resident cells.

This was confirmed by confocal analyses that revealed that

ATLs were localized in the stroma and more specifically

surrounding some adipocytes. However, we cannot rule out

the presence of a minor contamination from blood. Increased

adiposity, assessed by BMI, was associated with a specific

accumulation of CD4� as well as CD8� ATLs in subcutane-

ous AT, whereas the number of NK cells was not modulated.

In addition to an adiposity-dependent increase of ATL num-

bers, an AT location-dependent pattern of ATLs was ob-

served. Indeed, in paired biopsies from subcutaneous and

visceral AT of classII/III obese patients, a marked increase in

ATLs together with a modest increase in the number of

adipose tissue macrophages (ATMs) was observed in visceral

ATs. In mice, the AT infiltration of T lymphocytes during a

high-fat diet has been speculated to involve several chemo-

kines such as stromal-derived factor 1 alpha/CXCL1213 and

RANTES/CCL5.9 In the present study, ATLs exhibited an

enhanced migration in response to adipocyte-conditioned

media. Protein arrays performed on conditioned media from

human native mature adipocytes showed no adipocyte pro-

duction of CXCL12. Both CCL5 and CCL20 were detected in

the adipocyte conditioned media. Because CCL20 release by

adipocytes has not been reported previously, we further

analyzed the adipocyte expression of CCL20. Mature adipo-

cytes from subcutaneous AT of obese individuals expressed

higher levels of CCL20 than adipocytes from lean individu-

als. In class II/III obese patients, adipocytes from visceral AT

expressed higher levels of CCL20 than subcutaneous adipo-

cytes. Moreover, ATLs expressed the CCL20 receptor,

CCR6. The ligand-receptor pair CCL20-CCR6 has been

described to be responsible for the chemoattraction of effec-

tor/memory T-cells in skin and mucosal surfaces under

homeostatic and inflammatory conditions, as well as in

pathology, including cancer and rheumatoid arthritis.17 The

present results suggest that the adipocyte CCL20 may also

play a major role in the accumulation of T lymphocytes

within the AT. Interestingly, CCL20 expression in adipocytes

was increased in the presence of soluble factors originated

from human ATMs, suggesting that ATMs may contribute

via the stimulation of CCL20 expression in adipocytes to the

accumulation of ATLs. Freshly immunoselected ATLs exhib-

ited a proinflammatory profile of activation, with clear

expression of TNF�, IFN�, and RANTES, whereas the

expression of IL-4 (the TH2-type cytokine) was not detected.

The mechanisms involved in the promotion of the ATL

phenotype remain to be established. However, because ATLs

were found to express high transcript levels of the leptin

receptor and considering that leptin is well described to

promote TH1 activation,18 we propose that leptin locally

produced by human mature adipocyte may be involved in the

activation of ATLs. The lack of B cells together with the

accumulation of Th1 type effector T cells and the previously

reported characterization of human ATMs that were strongly

positive for MHC-II,7 suggest that a cell-mediated immune

reaction takes place in the AT with obesity. However,

additional experiments are clearly needed to define whether

the T lymphocytes of human adipose tissue are selected

toward specific antigens.

Because the lymphocyte clusters identified by immunohis-

tochemistry were localized in the vicinity of adipocytes,

paracrine effects of ATLs on adipocyte metabolism were

investigated and compared to that of human ATMs. Although

ATL- as well as ATM-derived secretory products did not

affect lipolysis, soluble factors originated from ATLs mark-

edly inhibited the insulin-mediated upregulation of both

lipogenic enzymes FAS and LPL. Such an effect was asso-

ciated with the lower expression of PIK3R1 (encoding the

85kD regulatory subunit of PIK), a key component in the

insulin-stimulated pathway.19,20 Moreover, the effect was

specific to lymphocyte-derived products because conditioned

media from human ATMs had no effect. Because human

ATLs were shown to produce IFN�, adipocytes were treated

by IFN�. IFN�, as ATL-conditioned media, reduced the

insulin sensitivity of FAS, LPL, and PIK3R1 and its neutral-

ization in ATL-conditioned media reversed the effects.

Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells 1613

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

Therefore, IFN� produced by ATLs is a paracrine mediator of

the T-cells on adipocyte metabolism. The experiments per-

formed on the human progenitor cells confirmed the effects

of ATLs on the expression of both LPL and FAS. Moreover,

because a decreased triglyceride accumulation was also

observed, it is suggested that ATLs interact with the insulin-

mediated promotion of triglyceride storage. Accumulation of

visceral AT is now well recognized to be associated with an

increased risk of developing type 2 diabetes. Visceral AT

exhibits marked differences compared with subcutaneous AT

in terms of metabolic and secretory activities,21 and increased

local inflammation has been suspected to underlie such

differences.22,23 It is therefore tempting to speculate that the

increased accumulation of ATLs in human visceral AT

participate in the pathogenic potential of the visceral AT via

local paracrine effects on insulin-mediated lipogenesis.

To conclude, the present study focused on a large number

of normal weight, overweight, and obese patients and showed

that the accumulation of helper CD4� and cytotoxic CD8�

ATLs increases in parallel with adiposity and has a location-

dependent pattern. We report a new adipochemokine, CCL20,

the expression of which is modulated by the degree of

adiposity and the anatomic location of AT. We also show that

ATLs are potent local regulators of adipocyte metabolism and

more specifically insulin-mediated lipogenesis.

AcknowledgmentsThe authors thank Dr Dylan Thompson (University of Bath, UK) for hiscritical reading of the manuscript and Marie-Adeline Marques(INSERM U858, Team 4) for her technical support for the lipolysisexperiments. We are grateful to the excellent technical support andadvice of Bruno Payre (IFR31, Toulouse, France) for the confocalmicroscopy.

Sources of FundingThis study was supported by grants from INSERM (AVENIR), theAgence Nationale de la Recherche (ANR “RIOMA”), the EuropeanUnion (FP7 ADAPT HEALTH-F2-2008-2010), and Pierre FabreLaboratories. This work was sponsored by the University Hospital ofToulouse for regulatory and ethic submission (No. 06 029 03).

DisclosuresNone.

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1614 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

Blood AT50

55

60

*

CD

3+ c

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(Mea

n F

SC

)Blood AT

911131517

*

CD

3+ c

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Blood AT Blood AT0

20

40

60

80

100

** **

CD62L CD45RA

% C

D3+

cel

lsA

B

Figure S1

by on September 17, 2009 atvb.ahajournals.orgDownloaded from

70

Discussion de l’article 1

Dans cette étude, nous avons caractérisé les lymphocytes du tissu adipeux humain sur

un grand nombre de prélèvements issus de lipoaspirations et de dermolipectomies

abdominales. Nous avons montré que des lymphocytes T (CD3+) sont présents dans le tissu

adipeux humain et qu’ils constituent environ 7% de la fraction stroma vasculaire (FSV).

Le nombre de lymphocytes T est positivement corrélé avec l’indice de masse

corporelle (IMC). Ils sont constitués de cellules effectrices et mémoires auxiliaires CD4+ et

cytotoxiques CD8+. Ils augmentent dans le tissu adipeux viscéral par rapport au tissu sous-

cutané de patients obèses morbides et plus particulièrement les lymphocytes cytotoxiques. Les

lymphocytes B sont absents et les cellules NK et NKT, identifiées en faibles quantités, ne sont

pas augmentées avec l’IMC. D’autre part, les expériences d’immunohistochimie, visualisées

en microscopie confocale, montrent que les lymphocytes T se trouvent à l’extérieur des

vaisseaux et organisés en amas de cellules immunes et en proche contact avec certains

adipocytes. Cette organisation particulière nécessite d’être étudiée plus avant. Toutefois, la

description récente de l’expression de CD40 par les adipocytes et l’observation d’interactions

CD40/CD40 ligand entre adipocytes et lymphocytes d’origine sanguine pourrait expliquer

cette association (188).

La suite des nos études s’est focalisée sur les lymphocytes T. Après isolement par une

technique d’immunosélection/déplétion à l’aide de nanobilles couplés à des anticorps anti

CD3 (Figure 16), nous montrons que ces cellules présentent un phénotype d’activation pro-

inflammatoire associé à une augmentation de l’expression de tous les marqueurs pro-

inflammatoires étudiés par rapport aux lymphocytes sanguins, excepté pour l’IL-4. Ces

analyses nous renseignent sur la polarisation des lymphocytes. En effet, l’absence

d’expression d’IL-4 exclut la possibilité d’avoir des lymphocytes Th2 au sein du tissu adipeux

et la présence d’IFNγ et d’IL-2 va dans le sens d’une polarisation Th1.

71

Les études de production de cytokines par les adipocytes humains matures maintenus

en gel de fibrine mettent en évidence pour la première fois à notre connaissance une

production de CCL20 par les adipocytes. Nous confirmons de plus la production de RANTES

et de MCP-1 parmi les autres chimiokines ainsi que de leptine et d’IL-6 entre autres.

L’expression de CCL20 déterminée par PCR en temps réel dans les adipocytes matures est

augmentée avec l’IMC et la localisation viscérale. Les lymphocytes du tissu adipeux humain

expriment CCR6, qui est le récepteur exclusif de CCL20. La stricte sélectivité de CCL20 pour

CCR6 est une des exceptions à la règle générale de la proximité des chimiokines et de leurs

récepteurs (189). CCR6 a été décrit comme étant exprimé notamment par les lymphocytes T

effecteurs/mémoires (CD45RO+CCR7-) (190). CCL20 quant à lui, joue un rôle important

dans l’arrêt du flux de cellules T au niveau des cellules endothéliales (191). Enfin,

l’interaction CCR6/CCL20 est reconnue comme influençant le recrutement des lymphocytes

dans les tissus au cours de nombreuses inflammations (192-194). De plus, nos données

montrent que l’expression de CCL20 par les adipocytes est augmentée lorsqu’ils sont traités

par des milieux conditionnés par les macrophages du tissu adipeux suggérant ainsi une boucle

de régulation entre les macrophages et les lymphocytes via les adipocytes afin de favoriser le

recrutement lymphocytaire.

Afin d’analyser le rôle des lymphocytes au sein du tissu adipeux, nous avons évalué

les effets des sécrétions des lymphocytes comparés aux macrophages, via des milieux

conditionnés par les CD3+ et/ou les CD14+ (macrophages) isolés du tissu adipeux sur les

adipocytes en culture primaire. Les résultats obtenus en ce qui concerne la lipolyse montrent

d’une part que les milieux conditionnés par ces deux types cellulaires n’affectent pas

l’expression des enzymes de la lipolyse (ATGL et LHS). D’autre part ils montrent que le

prétraitement des adipocytes matures de manière aigue (1h30) ou chronique (24h), par ces

milieux conditionnés ne modifie ni la lipolyse basale, ni l’activité lipolytique stimulée par

72

l’isoprotenerol, le peptide natriurétique, la noradrenaline ou encore l’adénosine déaminase et

déterminée par le dosage du glycérol et des acides gras libres dans les milieux (certaines de

ces données ne sont pas montrées).

Nous montrons également que seuls les milieux conditionnés des lymphocytes

bloquent les effets de l’insuline sur certaines des principales enzymes de la lipogenèse: la

lipase des lipoprotéines (LPL pour lipoprotein lipase) et la synthase des acides gras (FAS pour

Fatty acid synthase). Ces effets sont associés à une diminution de l’expression de PIK3R1

(codant pour la sous-unité p85 de PIK, composant clé de la réponse à l’insuline) (195, 196) et

sont en partie inhibés en présence d’anticorps neutralisant anti-IFNγ. Ainsi l’IFNγ semble

être un médiateur potentiel des effets de lymphocytes sur le contrôle du métabolisme

adipocytaire et pourrait participer au développement de l’insulino-résistance via ses effets

inhibiteurs sur la régulation de la lipogenèse par l’insuline.

En résumé, cet article démontre que les lymphocytes présents dans le tissu adipeux

sont des lymphocytes T auxiliaires et cytotoxiques effecteurs et mémoires principalement

dont le nombre augmente avec l’obésité ainsi qu’avec la localisation viscérale. Ces

lymphocytes pourraient être recrutés au moyen de l’interaction CCL20/CCR6 et leur état pro-

inflammatoire via la production d’IFNγ, inhiberait la stimulation de la lipogenèse par

l’insuline. Ainsi, les lymphocytes pourraient participer au développement de l’insulino-

résistance liée à l’état inflammatoire chronique du tissu adipeux lors de l’obésité et ils

pourraient également jouer un rôle limitant dans le développement de la masse grasse.

73

Figure 16: Technique d’isolement des différentes populations cellulaires du tissu adipeux

humain

Digestion collagénase

SVF Adipocytes matures

TA

CD34+ Progéniteurs

Cellules capillaires

endothéliales

Billes anti-CD34

CD34-

Billes anti-CD14

CD14+

Macrophages

CD14 -

CD3+

Lymphocytes T

Billes anti-CD3

74

II Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux

II 1 Facteurs potentiels impliqués dans la survie et/ou prolifération des

lymphocytes T

Afin de caractériser plus précisément le statut des lymphocytes T présents dans le

tissu adipeux, nous avons complété la caractérisation phénotypique par des expériences de

cytométrie en flux (Figure 17). L’analyse des marqueurs CD62L (L-sélectine permet

l’adressage aux tissus périphériques) et CCR7 (se lie à CCL19 et CCL21 (197) sur les cellules

endothéliales des ganglions lymphatiques (198, 199)) montre que moins de 10% de ces

lymphocytes sont positifs pour CD62L donc dans un état naïf (200) confirmant ainsi nos

précédents résultats obtenus avec le marqueur CD45RA. De plus, ces deux marqueurs nous

permettent de préciser le statut des cellules mémoires. Ce phénotype CD62L faible et CCR7-

correspond à des cellules effecteurs mémoires (TEM) qui sont infiltrées dans les tissus alors

que les lymphocytes mémoires centraux (TCM) sont CD62L+/CCR7+ (68).

Comme L’IL-7 est impliquée dans l’induction du phénotype mémoire, dans la survie

et la prolifération des lymphocytes T (201), nous nous sommes intéressés à l’expression de

son récepteur CD127 dans le tissu adipeux. En fait, plus de 50% des lymphocytes sont positifs

pour CD127, dont 15% sont CD8+CD127+. Les combinaisons d’anticorps utilisés pour la

cytométrie en flux ne nous ont pas permis d’utiliser les anticorps anti-CD4 en combinaison

avec CD127, CD8 et CD3. Toutefois, le nombre de cellules NKT étant très faible dans le tissu

adipeux humain, on peut penser que les 35% restants de CD3+ positifs pour CD127

représentent les cellules CD4+. Les travaux de Maury et al. ont récemment montré la présence

de l’IL-7 dans le tissu adipeux humain ainsi que son augmentation avec l’obésité (202). Nous

avons donc précisé sa spécificité d’expression par les autres cellules du tissu adipeux (Figure

18). Notre analyse montre que toutes les fractions cellulaires du tissu adipeux, excepté les

adipocytes, expriment l’IL-7.

75

L’IL-15 a été impliquée dans la survie et la prolifération des lymphocytes CD8+ (69,

203). Les résultats d’analyses de transcrits (Figure 18) montrent que ce sont les macrophages

qui expriment le plus d’IL-15 dans le tissu adipeux humain, en moyenne 7 fois plus que les

adipocytes matures et 9 fois plus que les cellules progénitrices. Les lymphocytes l’expriment

aussi en quantité moindre. Ces résultats pourraient donc partiellement expliquer la survie des

lymphocytes T CD4+ par l’IL-7 et CD8+ par l’IL-15. De plus, nos données révèlent aussi un

rôle potentiel des macrophages ainsi que des autres des cellules de la FSV dans la survie des

lymphocytes, suggérant l’existence d’interactions entre ces types cellulaires.

Il a été vu en introduction que la leptine avait des effets anti apoptotiques et pro-

proliférants sur les cellules immunitaires (164). Nous nous sommes donc intéressés à

l’expression génique de cette cytokine et de son récepteur. Nos résultats montrent que le

récepteur à la leptine est exprimé dans les lymphocytes T du tissu adipeux. Son expression est

augmentée avec l’obésité. De plus, les lymphocytes T isolés du tissu adipeux expriment la

leptine qui est régulée de manière positive avec l’IMC croissant (Figure 19). Ainsi la leptine

d’origine adipocytaire et dont la production augmente avec l’obésité pourrait maintenir les

lymphocytes T du tissu adipeux dans un état prolifératif. De plus, l’expression de leptine

décrite dans les Th1 (164) et que nous retrouvons dans cette étude pourrait réguler cette

activation et cette production de manière autocrine. Il est cependant à noter que l’expression

de la leptine par les lymphocytes du tissu adipeux est très inférieure à celle détectée dans les

adipocytes matures. Ces résultats sont à confirmer par des études de production de leptine par

les lymphocytes du tissu adipeux humain et par des approches in vitro sur le rôle de la leptine

dans le contrôle de la prolifération des lymphocytes.

76

CD127CD8/127CD62L CCR70

10

20

30

40

50

60%

de

cellu

les

CD

3+

Figure 17: Caractérisation des lymphocytes isolés du tissu adipeux humain par cytométrie en

flux

Les lymphocytes du tissu adipeux de patients d’IMC variés ont été isolés comme décrit dans

la figure 16, ils sont ensuite marqués à l’aide d’ anticorps couplés à des fluorochromes (FITC

antiCD127 et antiCD62L; PECy7 antiCCR7; APC antiCD8). Les résultats sont exprimés en

pourcentage de cellules positives ± SEM.

77

Figure 18: Expression d’IL-15 et d’IL-7 dans les différentes fractions du tissu adipeux humain

L’analyse des transcrits est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats

sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. L’IL-15 et l’IL-7 sont

analysées dans les adipocytes matures (AM n=5 et 4 respectivement), les cellules

endothéliales sanguines (CES n=5), les macrophages (MO n=15 et 5 respectivement), les

lymphocytes (LY n=5) et les cellules progénitrices (PROG n=4) fraîchement isolés du tissu

adipeux. Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM.

AM CES MO LY PROG0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Exp

ress

ion

IL-7

(UA

)

AM CES MO LY PROG0.000

0.005

0.010

0.015

Exp

ress

ion

IL 1

5(U

A)

A B

78

Figure 19: Expression de la leptine et de son récepteur dans les lymphocytes sanguins et isolés

du tissu adipeux de patients d’IMC croissants

L’expression génique est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats

sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Les lymphocytes isolés

du tissu adipeux (histogrammes noirs) sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés

(IMC≤25kg/m2 NP), surpoids (25≤IMC≤30kg/m2, SP) et obèses (IMC ≥30kg/m2, Ob). Les

lymphocytes isolés du sang sont représentés en blanc n=5.

Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM. Pour la leptine NP, n=12; SP, n=5 et Ob,

n=12, pour le récepteur à la leptine (Leptin-R) NP, n=5; SP, n=7 et Ob, n=11

* P<0.05 ** P<0.01 CD3+ du tissu adipeux versus sang.

Sang NP SP Ob0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

*

**

Exp

ress

ion

de

Lept

ine

(UA

)

Sang NP SP Ob0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35**

Exp

ress

ion

de L

eptin

-R(U

A)

A B

79

II.2 Expression de marqueurs d’activation et influence de l’état d’obésité

L’étude de l’effet de l’IMC sur la caractérisation phénotypique des lymphocytes T

isolés par immunosélection/déplétion à partir de tissu adipeux sous-cutané, montre des

résultats assez inattendus en terme de marqueurs pro-inflammatoires, (Figure 20). En effet, le

profil d’expression de TNFα, IFNγ, PRF-1 et RANTES présente une augmentation dans les

lymphocytes de tissus adipeux de patients en surpoids et présente chez les sujets obèses des

valeurs comparables aux sujets normopondérés. Ces données suggèrent l’existence d’un

processus inflammatoire classique de type Th1 qui présente un état maximal chez les sujets en

surpoids. Les lymphocytes T des sujets obèses, malgré leur accumulation plus forte,

expriment moins de marqueurs de polarisation Th1. Ces résultats démontrent que l’indice

d’adiposité module le phénotype des cellules T et suggère que les patients en surpoids

présenteraient une activation inflammatoire plus marquée que les patients obèses. Ces

résultats sont à confirmer sur des études regroupant plus de patients mais on peut émettre

l’hypothèse que l’obésité installée s’accompagne d’une inflammation chronique du tissu

adipeux et d’un phénotype particulier des cellules immunes. Cette particularité a déjà été

observée pour les macrophages du tissu adipeux dans notre laboratoire (185) (données non

publiées). Des études réalisées sur des cohortes de patients bien caractérisés en terme

d’historique de leur obésité et de leurs surpoids devraient permettre de relier durée de

l’obésité et/ou du surpoids et phénotype inflammatoire aigu ou chronique des cellules

immunes de leurs tissus adipeux. De façon intéressante, des données récentes montrent que

les tissus où siège une inflammation chronique sont hautement infiltrés par des lymphocytes

Th17 qui expriment des taux élevés de CCR6 à leur surface (204). Nos résultats montrent que

l’IL-17, cytokine principalement produite par les Th17 (52), est augmentée dans les

lymphocytes T isolés du tissu adipeux de patients obèses (Figure 21). Ces résultats nous

autorisent à penser qu’une partie des lymphocytes T du tissu adipeux des patients obèses

80

pourrait être constituée de lymphocytes Th17. Afin de déterminer réellement la présence d’un

phénotype Th17, l’expression d’autres marqueurs Th17 comme le facteur de transcription

RORγt (205) et l’IL-22 (204), pourrait être étudiée. On peut ainsi suggérer que le tissu

adipeux des patients en surpoids présentent des lymphocytes T majoritairement polarisés Th1

et donc pro-inflammatoires alors que le tissu adipeux des patients obèses expriment des

lymphocytes T de type Th17, moins inflammatoires mais marqueurs d’une inflammation

chronique. Les facteurs responsables d’une telle modulation du phénotype des lymphocytes T

du tissu adipeux avec l’index d’adiposité restent à être caractérisés.

81

Figure 20: Expression de marqueurs pro-inflammatoires dans les lymphocytes sanguins et

isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants

L’expression génique est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats

sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Les lymphocytes isolés

du tissu adipeux (histogrammes noirs) sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés

(NP n=12), surpoids (SP, n=7) et obèses (Ob, n=13). Les lymphocytes isolés du sang sont

représentés en blanc n=5.

Sang NP SP Ob0

5

10

15

20

*

*

**

Exp

ress

ion

de T

NF α

(UA

)

Sang NP SP Ob0

1

2

3

4

5

6**

* *

Exp

ress

ion

d'IF

N γ (

UA

)

Sang NP SP Ob0123456789 *

Exp

ress

ion

de P

RF

-1(U

A)

Sang NP SP Ob0

20

40

60

80

100

120

140

**

Exp

ress

ion

de R

AN

TE

S(U

A)

A

D

B

C

82

Figure21: Expression d’IL17 et de CCL20 dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu

adipeux

Les expressions géniques d’IL-17 et de CCL20 sont déterminées par RT-PCR quantitative en

temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme

2∆CT×10000. Pour IL-17, les lymphocytes isolés du tissu adipeux (LY histogrammes noirs)

sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés (NP, n=11), surpoids (SP, n=7) et

obèses (Ob, n=14). Pour CCL20 les lymphocytes sont isolés de tissu adipeux (histogrammes

noirs) de patients d’IMC variés (n=14).

Les lymphocytes isolés du sang sont représentés en blanc n=5.

Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM. * P<0.05 ** P<0.01 LY versus lymphocytes

sanguins

Sang LY0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.45 **

Exp

ress

ion

CC

L20

(AU

)

A B

Sang NP SP Ob0.000

0.025

0.050

0.075

0.100

0.125

0.150

**

**

Exp

ress

ion

IL-1

7 (

UA

)

83

II 3 Effets des lymphocytes sur les autres populations cellulaires du tissu

adipeux humain

Nous avons étudié les effets des facteurs solubles issus des lymphocytes sur les autres

partenaires cellulaires présents dans la fraction stroma-vasculaire plus particulièrement sur

l’adipogenèse des cellules progénitrices CD34+/CD31- natives du tissu adipeux humain

(Figure 22), ainsi que sur la régulation des transcrits macrophagiques. (Figure 23). Pour cela

les cellules fraîchement isolées du tissu adipeux par la méthode d’immunosélection/déplétion

décrite en figure 16 ont été traitées par des milieux conditionnés par les lymphocytes isolés du

tissu adipeux humain.

Nos résultats montrent que les milieux conditionnés par les lymphocytes du

tissu adipeux ont un effet anti adipogénique sur la différenciation des cellules progénitrices

(Figure 22). En effet, après 8 jours de traitement en milieu adipogénique, on observe une

diminution du contenu en triglycérides ainsi qu’une diminution de la quantité d’ADN des

cellules progénitrices dus à un effet anti-proliférant ou apopototique des sécrétions

lymphocytaires. De plus, l’expression des enzymes de la lipogenèse (LPL et FAS) est

également diminuée par ce traitement, ce qui suggère un effet anti-adipogénique des

lymphocytes sur les précurseurs des adipocytes. Ces résultats confirment ceux décrits sur la

lignée murine de préadipocytes 3T3-L1 (206). Il est maintenant nécessaire de déterminer si

cet effet anti-adipogénique est également médié par l’IFNγ comme cela a été décrit sur les

préadipocytes de rongeurs (207). Il serait donc intéressant de traiter directement des cellules

progénitrices en présence d’IFNγ et/ou par des milieux conditionnés en présence d’anticorps

neutralisant. Toutefois, sachant que l’insuline est nécessaire à la différenciation adipocytaire,

il est tentant de spéculer que les effets anti-adipogéniques des produits lymphocytaires

pourraient être reliés à une altération de la voie de signalisation de l’insuline. Ainsi, les

lymphocytes via leurs effets inhibiteurs sur la lipogenèse et l’adipogenèse pourraient

84

contribuer à la limitation de l’extension du tissu adipeux sous-cutané en diminuant ses

capacités de stockage et contribuer ainsi à la genèse des pathologies associées à l’obésité.

Enfin, les facteurs solubles produits par les lymphocytes isolés du tissu adipeux

augmentent de façon significative l’expression des marqueurs M1 (IL-23) comme M2 (IL-10)

et ont tendance à augmenter les marqueurs M1 (IL-6 et IL-1β) et le TGFβ (M1) dans les

macrophages du tissu adipeux (Figure 23). De manière intéressante, l’IL-23 et l’IL-1β ont été

décrites comme induisant «in vitro» un phénotype Th17 dans les lymphocytes humains, de

même que le TGFβ qui régule indirectement la voie Th17 en inhibant la polarisation en Th1

et/ouTh2 (208). Les milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux n’induisent

donc pas de phénotype M1 ou M2 particulier chez les macrophages du tissu adipeux.

Toutefois, il semble que ces macrophages «activés» par les sécrétions lymphocytaires

produisent un contexte cytokinique favorable à l’induction de cellules Th17 impliquées dans

l’inflammation chronique.

85

Figure 22: Effet des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur la

différenciation des précurseurs adipocytaires

Photos représentatives des cellules progénitrices humaines (CD34+/CD31-) issues du tissu

adipeux cultivées pendant 8jours en conditions adipogéniques (A) en absence ou en (B)

présence de milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux humain (MC-LY). (C)

Les quantités de triglycérides (TG) et d’ADN ainsi que (D) les taux de transcrit de FAS et de

LPL des cellules progénitrices du tissu adipeux humain sont exprimées en moyennes ± SEM

des pourcentages du contrôle à J8 de traitement en conditions adipogéniques sans MC-LY

pour 3 expériences différentes avec 3 MC différents par expérience. Les différences sont

considérées comme significatives pour * P< 0.05, ** P < 0.01 versus contrôle.

A B

C D

TG ADN0

25

50

75

100

** *

% d

u co

ntrô

le

FAS LPL0

25

50

75

100

** **E

xpre

ssio

n gé

niqu

e(%

du

cont

rôle

)

86

Cont IL-6 IL-23 TGFβ IL-10 IL1β0

255075

100125150175200225 **

*

MC-LY

Exp

ress

ion

des

cyto

kine

s pa

r le

s M

O(%

du

cont

rôle

)

Figure 23: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur les

régulations de transcrits des macrophages isolés du tissu adipeux

Les macrophages isolés du tissu adipeux sont traités pendant 24h avec des milieux contrôles

(Cont) ou bien conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux (MC-LY). Les taux de

transcrits des marqueurs M1 (IL-6 et IL-23) et M2 (IL-1β, IL-10 et TGFβ) sont ensuite

analysés par RT-PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et

exprimés comme 2∆CT×10000. Ils sont exprimés en moyennes ± SEM des pourcentages des

cellules traitées par les milieux contrôles de 4 expériences distinctes. * P< 0.05, ** P < 0.01

versus contrôle.

87

III Cinétique d’accumulation des lymphocytes au sein du tissu adipeux et rôles

sur le développement de l’obésité

Article 2 : Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the

onset of obesity

Dans cet article, nous nous sommes intéressés au rôle des lymphocytes dans le

développement du tissu adipeux au cours de l’obésité. Dans un premier temps, nous avons

regardé comment évoluent les différentes cellules immunes au cours de l’induction de

l’obésité en débutant les observations à un stade très précoce de prise de poids. Dans un

second temps, nous avons regardé l’effet d’une déficience globale en lymphocytes sur le

développement de l’obésité. Pour cela, nous avons travaillé sur un modèle de souris

B6/RAG2(-/-) qui sont déficientes pour la RAG2 (Recombination activating gene 2), ces

souris n’ont pas la capacité d’initier la recombinaison VDJ et n’ont donc pas de lymphocytes

T et B matures (209). Ce modèle nous a permis d’étudier la prise de poids et le statut

métabolique de souris déficientes en lymphocytes et d’étudier les autres populations immunes

présentes dans le tissu adipeux.

Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue

during the onset of obesity

Carine Duffaut *, Jean Galitzky, Max Lafontan, Anne Bouloumié

Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France

Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe n�1 AVENIR, IFR31, Toulouse, France

a r t i c l e i n f o

Article history:

Received 30 April 2009

Available online xxxx

Keywords:

Lymphocytes

Macrophages

NK cells

Immunodeficient mice

High fat diet

Insulin resistance

Innate cells

Adaptive cells

a b s t r a c t

The primary inflammatory events occurring in the adipose tissue (AT) during high fat diet (HFD)-induced

obesity are poorly defined. The present study was undertaken to characterize, in wild-type(+/+) and

lymphocyte deficient RAG2(�/�) mice under HFD, the changes in AT immune cells by flow cytometry

analyses. In (+/+) mice, early accumulation of AT B-cells was observed, followed by increased AT T-cell

numbers and finally by the appearance of insulin resistance and AT macrophage accumulation. Lack of

lymphocytes in the RAG2(�/�) mice did not affect the onset of obesity and the state of insulin resistance.

However, a striking accumulation of AT NK cells and activated macrophages was detected. The present

study demonstrates that AT is the site of an unexpected dynamic in innate and adaptive cells during

diet-induced obesity and insulin resistance. Moreover it appears that early AT lymphocyte infiltration

could be considered a protective process to temper adipose tissue inflammation.

� 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

Introduction

Inflammation is now considered a common link between obes-

ity and type 2 diabetes [1]. Several studies performed on a mouse

model of diet-induced or genetic obesity as well as in humans have

demonstrated that increased adipose tissue mass is associated

with a moderate elevation in the plasma levels of several markers

of inflammation. Moreover, in the obese state, adipose tissue pro-

duces more chemokines as well as pro-inflammatory cytokines

that are known to interfere with insulin signaling [2]. Finally, in

mice models of obesity as well as in humans, macrophages accu-

mulation within the adipose tissue itself has been demonstrated

together with the recently described increase in adipose tissue

T-lymphocytes [3]. Altogether, these observations have led to the

concept that the inflammatory process occurring within the adi-

pose tissue may contribute to the settlement of a systemic and

chronic low-grade inflammatory state responsible for insulin resis-

tance and ultimately type 2 diabetes [4]. However, few data are

available concerning the early primary inflammatory events occur-

ring within the fat depots during the onset of diet-induced obesity.

The present study was undertaken to characterize the changes in

the major immune cells (macrophages, T- and B-lymphocytes

and NK cells) in adipose tissue of wild-type C57BL/6 mice under

a high fat diet (HFD) during the onset of obesity and insulin resis-

tance. To further define the possible role of lymphocytes in the

initiation of the obesity-associated inflammation, mice with no

B- and T-lymphocytes due to RAG-2 deficiency (B6RAG2 �/�) were

investigated under normal diet (ND) and HFD.

Material and methods

Materials. Chemicals were purchased from Sigma (Saint-Quen-

tin Fallavier, France). Collagenase worthington was purchased from

Serlabo Technologies (Entraigues, France). Antibodies for flow

cytometry analysis were purchased from BD Biosciences (Le Pont

de Claix, France) or AbD serotec (Oxford UK).

Animals. Animals were handled in accordance with the princi-

ples and guidelines established by the National Institute of Medical

Research. C57BL6/J mice were obtained from Charles River Labora-

tory (l’Arbresle, France). Mice deficient in RAG2 (B6RAG2(�/�))

were kindly provided by Dr. Van Meerwijk (U563 INSERM, Tou-

louse, France). Mice were housed conventionally in a constant tem-

perature (20–22 �C) and humidity (50–60%) animal room, with a

12/12 h light/dark cycle (lights on at 8:00 am) and free access to

food and water. Mice were assigned to ND (C57BL6/J n = 16,

RAG2(�/�) n = 11) and HFD (C57BL6/J n = 15, RAG2(�/�) n = 11)

(DIO Research diet, Jackson Laboratory, Brogaarden, Denmark) for

3, 6 and/or 12 weeks. Due to the weak fertility of RAG2(�/�) mice,

0006-291X/$ - see front matter � 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002

* Corresponding author. Address: Equipe AVENIR/INSERM, U858, Hôpital Rangueil

Bat L4, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 04, France. Fax: +33 (0) 5 61 32 56 21.

E-mail address: Carine.Duffaut@inserm.fr (C. Duffaut).

Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx

Contents lists available at ScienceDirect

Biochemical and Biophysical Research Communications

journal homepage: www.elsevier .com/locate /ybbrc

ARTICLE IN PRESS

Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem.

Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002

the animals were studied only after 12 weeks of diet. Energy con-

tents of the specific diets were (% kcals): 20% protein, 70% carbohy-

drate, and 10% fat for ND; 20% protein, 35% carbohydrate, and 45%

fat for HFD. At 3, 6 and 12 weeks of either diet, an intra-peritoneal

glucose tolerance test (1 g glucose/kg body weight) was performed

after the deprivation of food overnight and the time course of gly-

cemia was measured in the tail vein for 240 min with a glucometer

(Accu-Chek� Roche France). At 3, 6 and 12 weeks, the body compo-

sition was determined by quantitative magnetic resonance using

an EchoMRI-100TM 3 in 1 (Echo Medical Systems, Houston TX).

At 3, 6 and/or 12 week of either diet, mice were sacrified by cervi-

cal dislocation and epididymal adipose tissues were taken and

weighed.

Isolation of the stroma-vascular fraction (SVF) from adipose tissue

(AT) and flow cytometry analyses. The SVF cells were obtained by

collagenase digestion of the adipose tissue as previously described

[5]. After digestion, the suspension was filtered 150 lm filter and

centrifuged (100g, 10 s) to collect the infranatant containing the

SVF. The lower phase was centrifugated at 400g for 10 min and

the pellet containing the SVF was incubated for 10 min in erythro-

cyte-lysing buffer (155 mM NH4Cl, 5.7 mM K2HPO4 and 0.1 mM

EDTA), filtered through 40 lm filters and centrifugated again

(400g, 10 min). The pellet was then resuspended in PBS containing

2 mM EDTA and 0.5% bovine serum albumin and the total number

of cells was counted using trypan blue (Gibco, Courbevoie, France)

and a neubauer hematocytometer (Poly Labo, Paul Block & Cie,

Starsbourg, France). The cell count was confirmed by DNA determi-

nation using fluorimetric assay (Picogreen, Invitrogen Cergy

Pontoise, France). 100 000 cells of the SVF were incubated with

FITC-conjugated antibodies (CD4, F4/80), PE-conjugated antibody

CD3, PerCP conjugated antibody CD45, PerCP–Cy5.5 conjugated

antibody CD11b, APC-conjugated antibody (CD8, CD19 and

NK-1.1) and respective isotype control. Analyses were performed

using a FACSCalibur flow cytometer and the CellQuest Pro software

(BD Bioscience). The total number of each leukocyte population

present in the AT depot was calculated as a product of the percent-

age of each cell type determined by the flow cytometry analyses

and the total number of SVF cells.

Statistical analysis. Values are given as mean ± SEM for (n) sep-

arate experiments. Comparisons between groups were analysed

by ANOVA for experiments with more than two subgroups

followed by post hoc tests and the non-parametric Mann–Whit-

ney test or Student’s t test, when appropriate (Prism 4, GraphPad

Software, USA). Differences were considered significant when

P < 0.05.

Results

Lack of lymphocytes does not alter the onset of obesity and insulin

resistance

Wild-type and RAG2(�/�) male mice fed under normal or high

fat diet for 12 weeks exhibited similar weight gain (Fig. 1A). In

wild-type mice, the total body fat mass assessed by EchoMRI sta-

tistically increased after 6 weeks HFD (2-fold-increase, Fig. 1B).

After 12 weeks, both wild-type and RAG2(�/�) exhibited a similar

increase in total body fat mass when fed under HFD compared to

ND (3.3-fold increase, Fig. 1B). The epidydimal adipose tissues of

wild-type mice exhibited a marked increase in weight after

6 weeks HFD that was further enhanced after 12 weeks and was

identical to that observed in RAG2(�/�) mice (Fig. 1C). Glucose tol-

erance tests clearly showed the progressive development of insulin

resistance in wild-type mice under HFD (Fig. 2). Indeed, the area

under the curve of the glycemia concentration exhibited a time-

dependent increase in mice under a high fat diet that was statisti-

cally significant compared to animals fed with normal chow after

0 2 4 6 8 10 120.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

RAG2-/- ND+/+ ND

+/+ HFDRAG2-/- HFD

Time (weeks)

Body w

eight

gai

n (

g)

0

1000

2000

3000

3 6 12

Weeks

*

**

**

+/+ RAG2-/-+/+ +/+

Epid

ydim

al d

epot

(mg)

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

3 6 12

Weeks

*

**

**

+/+ RAG2-/-+/+ +/+

Bo

dy

fat

mas

s (g

)

A

B

C

Fig. 1. Onset of diet-induced obesity in wild-type and RAG2(�/�) mice under high

fat diet. (A) Body weight gain of wild-type(+/+) and RAG2(�/�) mice under high fat

diet (HFD filled symbol) or normal diet (ND open symbol) for 12 weeks. Values are

means ± SEM ((+/+) n = 15; RAG2(�/�) n = 11). (B) Body fat mass determined by

quantitative magnetic resonance and (C) epidydimal fat pad weight of wild-type fed

under normal (ND, open bars) and HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5),

and of RAG2(�/�) mice after 12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars,

respectively, n = 11). Values are means ± SEM, *P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND.

0

5.0×10 3

1.0×10 4

1.5×10 4

2.0×10 4

2.5×10 4

3 6 12

Weeks

*

+/+ RAG2-/-+/+ +/+

*

Gly

cem

ia

Are

a under

the

curv

e

Fig. 2. Glucose tolerance in wild-type and RAG2(�/�) mice under high fat diet.

Intra peritoneal glucose tolerance tests were performed in wild-type mice fed under

normal (ND, open bars) and HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5), and in

RAG2(�/�) mice after 12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars,

respectively, n = 9). *P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND.

2 C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx

ARTICLE IN PRESS

Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem.

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12 weeks. The RAG2(�/�) mice fed for 12 weeks under HFD exhib-

ited similar insulin resistance than the wild-type mice (Fig. 2).

Lack of lymphocytes is associated with the promotion of the

accumulation of innate cells within the adipose tissue

Flow cytometry analyses were performed on the stroma-vascu-

lar fraction (SVF) obtained after collagenase digestion of adipose

tissues using CD19 as B-lymphocyte marker, both CD45 and CD3

to identify T-lymphocytes, the combination of CD11b and F4/80

as markers of activated macrophages and NK1.1 as a specific mar-

ker of natural killer cells. Adaptive immune B and T cells repre-

sented the minor populations of immune cells present in the fat

depots of wild-type mice. B-lymphocytes increased after 3 weeks

of HFD (3-fold increase in epidydimal compared to ND) and

remained at similar levels for the next 9 weeks of HFD (Fig. 3A).

T-lymphocyte numbers were enhanced after 6 weeks HFD (3-fold

increase in epidydimal compared to ND) but decreased in the fol-

lowing 6 weeks of HFD (Fig. 3B). The numbers of macrophages

were not modified during the first 6 weeks of diet but were mark-

edly increased after 12 weeks HFD compared to ND (1.8-fold in-

crease, Fig. 3C). The numbers of NK cells were not statistically

modified by the diet (Fig. 3D).

In RAG2(�/�) mice, flow cytometry analyses demonstrated as

expected the absence of B and T-lymphocytes within the SVF of

the fat depots (Fig. 3A and B). A marked accumulation of activated

macrophages was observed under HFD (3.6-fold increase com-

pared to ND, Fig. 3C). Moreover RAG2(�/�) mice under HFD exhib-

ited a 4-fold increase in AT macrophage number compared to

12 weeks HFD wild-type mice (Fig. 3C). The number of NK cells

was strongly increased under HFD (4.4-fold increase compared to

ND, Fig. 3D). Moreover, RAG2(�/�) mice under HFD exhibited a

9-fold increase in AT NK number compared to 12 weeks HFD

wild-type mice (Fig. 3D).

Discussion

Studies on the inflammatory process in obesity and insulin

resistance have mainly focused on the cells from the innate system

andmore specifically on macrophages. Indeed, mostly by the use of

immunohistochemical analyses and macrophage-specific tran-

script expression analyses, it has been established that long-term

HFD diet (20 weeks or more) is associated with an accumulation

of proinflammatory macrophages within adipose tissue and insulin

resistance [6,7]. Our studies performed in humans using flow

cytometry showed a body mass index-dependent increase in mac-

rophage number within the subcutaneous [5] as well as visceral [8]

adipose tissues. Since treatments with anti-diabetic drugs [6] and

mice deficient in chemokines or chemokine receptors [9,10] in-

volved in the recruitment of blood monocyte into tissues were

shown to affect both adipose tissue macrophage inflammatory

phenotype and insulin sensitivity, it was concluded that the accu-

mulation of adipose tissue inflammatory macrophages in the obese

state was a major event involved in insulin resistance. These re-

sults were also supported by a decreased number of inflammatory

cells after weight loss and parallel improvement in metabolic

parameters observed in humans [11]. Several recent studies shed

new light on another immune cell subset belonging to the adapta-

tive immune system, namely the T-lymphocytes. Indeed, the stud-

ies of Caspar-Bauguil et al. [12] have clearly described the distinct

lymphocytes subtypes present in fat depots. Recently, the work of

Kintscher et al. [3] have shown mostly by the use of immunohisto-

chemistry and gene expression analyses that T-lymphocyte spe-

cific markers are increased in mice fed under HFD. This precedes

the appearance of enhanced macrophage-specific markers and

was concomitant with the development of glucose intolerance. In

agreement with such observations, the results obtained in the

present study show that the accumulation of T-lymphocytes, iden-

tified by flow cytometry analyses, occurs after 6 weeks of HFD in

mice exhibiting a slight glucose intolerance. The T-lymphocyte

accumulation preceded the increase in macrophages detected after

0

1.5×10 4

3.0×10 4

4.5×10 4

3 6 12

Weeks

*

+/+ RAG2-/-+/+ +/+

*

AT

B l

ym

ph

ocy

tes

(Nu

mb

er/d

epo

t)

0

3.0×10 4

6.0×10 4

9.0×10 4

3 6 12

Weeks

+/+ RAG2-/-+/+ +/+

*

AT

T l

ym

ph

ocy

tes

(Nu

mb

er/d

epo

t)

0

2.5×10 5

5.0×10 5

7.5×10 5

1.0×10 6

3 6 12

Weeks

+/+ RAG2-/-+/+ +/+

*

**

*

AT

mac

rop

hag

es

(Nu

mb

er/d

epo

t)

0

3.0×105

6.0×105

9.0×105

3 6 12

Weeks

+/+ RAG2-/-+/+ +/+

**

**

AT

NK

cel

ls

(Nu

mb

er/d

epo

t)

A

B

C

D

Fig. 3. Immune cells present in adipose tissues in wild-type and RAG2(�/�) mice

under high fat diet. Multicolour FACS analyses were performed on the AT stroma-

vascular fraction (SVF) from wild-type(+/+) fed under normal (ND, open bars) and

HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5), and in RAG2(�/�) mice after

12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars, respectively, n = 9). (A) Numbers

of AT CD19+ B-lymphocytes, (B) number of AT CD45+/CD3+ T-lymphocytes, (C)

number of F4/80+/CD11b+ AT macrophages and (D) number of AT NK1.1+ NK cells.*P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND; RAG2(�/�) versus +/+.

C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx 3

ARTICLE IN PRESS

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Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002

12 weeks of HFD. Whereas the initial accumulation of T-lympho-

cytes was due to an active recruitment, enhanced retention and/

or increased proliferation of T-lymphocytes within the adipose tis-

sue remains to be clearly established. However, the other major

cell population involved in adaptive immune response, i.e. the B

cells, was found to accumulate into the fat pads as early as 3 weeks

after initiation of HFD, before any statistical modulation of fat

mass. The presence of B cells in the murine fat depots has already

been documented [12] but no study has been dedicated to the po-

tential early changes in adipose tissue B cells with HFD. It is thus

tempting to speculate that the HFD per se in mice induces an initial

early adaptive cell-mediated immune reaction within the adipose

tissue that is, once resolved and/or exceeded as a consequence of

the chronic HFD treatment, followed by the activation of the innate

system.

Two recent studies have suggested that adipose tissue T-lym-

phocytes might be involved in the recruitment of adipose tissue

macrophages through their production of interferonc (IFNc), a typ-

ical Th1 type cytokine [3,13]. Therefore, to further analyse the

respective contribution of adipose tissue lymphocytes in macro-

phage accumulation and genesis of insulin resistance, we studied

mice deficient in functional T-and B-lymphocytes, i.e. RAG2(�/�)

mice. After 12 weeks HFD, the RAG2(�/�) mice exhibited a similar

gain in total fat and adipose mass and insulin resistant state than

the wild-type mice. It is therefore suggested that the adaptive cells

alone are not necessary for the initiation of obesity-associated

insulin resistance, in agreement with the recent study published

during the preparation of the paper [14]. Interestingly, the lack of

T-and B-lymphocytes was associated with a dramatic increase of

cells from the innate system, both NK cells and macrophages, with-

in the adipose tissue. Though primarily considered as an integral

part of the innate immune response with potent cytotoxic effector

functions, NK cells also produce chemokines and cytokines such as

IFNc and TNFa [15]. Such products might thus be involved in mac-

rophage recruitment and genesis of insulin resistance. Although

the exact role of the NK cells in macrophage recruitment and the

mechanisms responsible for accumulation of NK cells under HFD

remain to be defined, the present results demonstrate that the lack

of B- and T-lymphocytes promotes a marked innate immune reac-

tion within the adipose tissue. A study performed in various strains

of immunodeficient mice, including RAG mice, has shown that the

lack of lymphocytes was associated with an over reaction of innate

immunity and, more particularly, NK cells [16]. Based on these

observations, it was suggested that lymphocytes may act as nega-

tive regulator of the innate system to control for an unwanted

excessive inflammatory response. It is thus tempting to speculate

that the early lymphocyte infiltration within the adipose tissue

that was observed in wild-type mice might be considered a protec-

tive and specific process to temper the HFD-induced adipose tissue

inflammation, rather than a positive reinforcement to the innate

response.

In conclusion, the present study demonstrates that the adipose

tissue is the site of an unexpected dynamic in immune cell traffick-

ing during the onset of diet-induced obesity and insulin resistance.

It involves both adaptive B and T immune cells as well as innate NK

cells and macrophages. Therefore, the settlement of the inflamma-

tory profile described during the onset of diet-induced obesity and

the relative roles of the adaptive and innate cells are certainly more

complex and dynamic than previously suspected. Moreover, the

clear delineations between early and late inflammatory events tak-

ing place within the adipose tissue as a consequence of acute and

chronic changes of diet, obesity and/or insulin resistance are re-

quired to definitively understand the relative role of adipose tissue

immune cells.

Acknowledgments

This study was supported by grants from the INSERM (AVENIR),

Agence Nationale de la Recherche (ANR ‘‘RIOMA”), Seventh Frame-

work Programme of the European Community (EC) for research

(FP7 ADAPT) and Pierre Fabre Laboratories. We thank the staff of

the animal facilities (IFR31, Toulouse, France) and the functional

exploration team (S. Le Gonidec, IFR31, Toulouse, France). The

authors thank Dr. Dylan Thompson (University of Bath, UK) for

his critical reading of the paper.

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4 C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx

ARTICLE IN PRESS

Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem.

Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002

88

Discussion de l’article 2:

Les résultats obtenus montrent une dynamique assez complexe des cellules immunes

dans le tissu adipeux des souris au cours de la prise de poids. L’accumulation des

lymphocytes T a été décrite pour être un évènement précoce dans le développement de

l’obésité qui précède l’entrée des macrophages et correspond à l’installation de

l’insulinorésistance (210). Dans notre étude, nous mettons en évidence une accumulation plus

précoce des lymphocytes B à 3 semaines de régime enrichi en lipides qui précède celle des

lymphocytes T à 6 semaines. A 12 semaines, lorsque l’obésité et l’insulinorésistance sont

présentes, ce sont les macrophages qui augmentent dans le tissu adipeux épididymaire tandis

que les cellules NK ne varient pas de manière significative. Ces résultats ne confirment pas

exactement les premières études de cytométrie sur les lymphocytes dans le tissu adipeux dans

lesquelles 12 semaines de régime enrichi en lipides ne modifiaient pas les pourcentages de

lymphocytes T et diminuaient le pourcentage de cellules NK (211). Cependant, notre manière

d’exprimer les données n’est pas similaire. En effet, dans cette étude, les auteurs exprimaient

leurs résultats en pourcentage des cellules de la fraction stroma-vasculaire alors que nous

exprimons les nôtres en nombre par dépôt entier. Nous pensons en effet qu’il est plus

représentatif de ramener les pourcentages obtenus au nombre total de cellules de la fraction

stroma-vasculaire par dépôt adipeux entier. Ceci permet d’évaluer dans le dépôt, la

dynamique des cellules immunes indépendamment des autres cellules de la fraction stroma-

vasculaire, cellules endothéliales et cellules progénitrices et indépendamment de l’état

d’hypertrophie et/ou d’hyperplasie adipocytaire. Les résultats que nous avons obtenus

suggèrent donc que le trafic des cellules immunes dans le tissu adipeux lors de l’établissement

de l’obésité induite par un régime hyperlipidique est plus complexe que celui décrit. Il reste à

déterminer si ces modulations de nombre de cellules sont dues à un recrutement actif et/ou

prolifération et/ou apoptose et/ou une émigration cellulaire et à déterminer les mécanismes

89

impliqués. De plus, il conviendra de déterminer si ces modulations cellulaires sont liées à

l’obésité per se et/ ou au régime. En effet, des études récentes suggèrent que le LPS associé au

régime enrichi en lipide pourrait être à l’origine d’une inflammation du tissu adipeux (212).

Les études de Kintscher et al. ont proposé l’hypothèse d’un rôle primaire des

lymphocytes dans l’établissement de l’état inflammatoire du tissu adipeux avec l’obésité

(210). De plus, les études de Rocha et al. ont suggéré que les lymphocytes via leur production

d’IFNγ stimuleraient la production de facteurs chemoattractants des macrophages par les

adipocytes et les préadipocytes (213). Afin d’étudier le rôle potentiel des lymphocytes sur le

recrutement des macrophages dans le tissu adipeux avec l’obésité, nous avons évalué l’effet

de la déficience en lymphocytes, chez les souris B6/RAG2(-/-), sur le développement de

l’inflammation dans le tissu adipeux au cours de la mise en place de l’obésité et de la

résistance à l’insuline. Les souris déficientes en lymphocytes ont à 12 semaines de régime

enrichi en lipides, une prise de poids et une tolérance au glucose comparables à leurs

homologues sauvages. Cependant, la déficience en lymphocytes, confirmée par cytométrie en

flux, dans le tissu adipeux s’accompagne d’une augmentation massive de cellules NK et de

macrophages. Ces résultats suggèrent donc que la présence des lymphocytes n’est pas

nécessaire à l’installation de l’obésité et de l’insulinorésistance et sont en accord avec les

travaux récents de Sultan et al. (214). Cependant, des mesures complémentaires seraient

nécessaires, plus particulièrement sur l’expression de facteurs inflammatoires dans le tissu

adipeux des souris RAG2(-/-) et des souris sauvages en régime hyperlipidique afin de

déterminer si l’augmentation marquée du nombre des cellules du système inné s’accompagne

ou non d’un développement plus marqué d’un phénotype inflammatoire associé à l’obésité

comparé à celui des animaux sauvages. De plus, une étude permettant de suivre plus

longtemps les animaux en régime hyperlipidique, devrait permettre de déterminer si cette

90

augmentation des cellules innées dans le tissu adipeux s’associe avec une apparition plus

rapide d’un diabète de type 2.

Enfin, le rôle des cellules NK reste à définir. Deux hypothèses peuvent être posées:

• Les cellules NK compensent la déficience en lymphocytes. En effet, il a été

décrit que la déficience en lymphocytes dans différents modèles murins (215,

216) s’accompagne d’une compensation par les cellules NK qui seraient

capables de jouer le rôle de lymphocytes mémoires et à reconnaissance

spécifique en répondant à une stimulation antigénique plus classique (215). De

plus, les cellules NK sont capables de produire des cytokines pro-

inflammatoires, comme les lymphocytes T activés, telles que l’IFNγ et le

TNFα (217). Il serait donc intéressant d’analyser la présence potentielle de

macrophages dans le tissu adipeux de souris déficientes en cellules NK afin de

déterminer si les cellules NK ont un rôle dans le recrutement des

macrophages. De plus l’analyse du nombre et de la taille des adipocytes

matures isolés de ces souris ainsi que de leurs capacités lipolytiques et

lipogéniques pourrait nous indiquer si l’absence de cellules NK provoque une

altération du métabolisme adipoctyaire.

• Les lymphocytes ont un rôle freinateur sur la réponse innée et en leur absence

une réponse innée excessive se développe. Cette hypothèse a été posée par

l’équipe de Kim et al. à partir d’observations réalisées sur des modèles de

souris immunodéficientes. Dans ces souris, en l’absence de lymphocytes, se

développe une réaction innée excessive due à la production massive de

cytokines par les cellules NK et dendritiques (218). Ainsi dans nos modèles,

RAG2(-/-) en régime hyperlipidique, la réponse innée non tempérée par la

réponse adaptative pourrait se développer de manière excessive.

91

Partie 3 : Conclusion générale

et perspectives

92

I Identification des lymphocytes du tissu adipeux humain

Ce travail de thèse avait pour premier objectif de caractériser les lymphocytes du tissu

adipeux humain. Ces travaux ont mis en évidence que les populations de lymphocytes

présentes dans le tissu adipeux humain sont principalement des lymphocytes T (CD3+)

auxiliaires (CD4+) et cytotoxiques (CD8+). Les lymphocytes B, identifiés par le marqueur

CD19, et les cellules NKT (CD3+/CD56+) sont détectés à de très faibles niveaux dans le tissu

adipeux. Quant aux lymphocytes de l’immunité innée, NK et γδ, ils sont également présents

dans de faibles proportions. Les lymphocytes T sont des effecteurs (CD45RO-RA-) et des

mémoires (CD45RO+). Nous avons également montré que les nombres de lymphocytes T

CD4+ et CD8+ du tissu adipeux sont positivement corrélés avec l’indice de masse corporelle

(IMC) comme index d’adiposité. En revanche, cet indice n’est pas associé à une modification

du nombre de cellules NK et NKT au sein du tissu adipeux. Le nombre de lymphocytes T est

également augmenté dans le tissu adipeux viscéral par rapport au tissu sous-cutané chez les

obèses morbides. Les CD4+ mémoires ainsi que les CD8+ effecteurs et mémoires

s’accumulent préférentiellement dans le tissu adipeux interne.

Enfin il serait intéressant d’étudier l’influence de l’index d’adiposité des patients sur le

nombre de lymphocytes T et de sous-types de cellules mémoires et effectrices.

II Accumulation des lymphocytes T dans le tissu adipeux humain

L’accumulation des lymphocytes au cours de l’obésité pourrait s’expliquer par un

recrutement, une prolifération ou une anti-apoptose des lymphocytes dans le tissu adipeux.

Nous avons montré que le tissu adipeux produit des chimiokines de lymphocytes comme

CCL20 ou encore RANTES qui sont connues pour influencer le recrutement des lymphocytes

93

aux lieux d’infection (192-194, 206). CCL20, via son interaction avec son récepteur CCR6,

dont nous avons montré l’expression spécifique par les lymphocytes du tissu adipeux humain,

pourrait influencer le recrutement actif des lymphocytes au sein du tissu adipeux. En effet,

son expression dans l’adipocyte mature est augmentée chez les patients obèses par rapport aux

patients normo-pondérés et est plus forte dans les adipocytes viscéraux que sous-cutanés. Il

est cependant nécessaire de confirmer ces résultats avec des approches permettant de

quantifier les protéines correspondantes à l’aide d’ELISA sur des milieux conditionnés par les

adipocytes matures et d’analyses par cytométrie en flux sur les lymphocytes isolés du tissu

adipeux. De plus, nos résultats montrent que les macrophages du tissu adipeux pourraient

augmenter l’expression de CCL20 dans l’adipocyte et suggèrent donc que les macrophages

pourraient indirectement participer au recrutement des lymphocytes.

Par ailleurs, l’accumulation de lymphocytes pourrait être due à une prolifération active

des lymphocytes résidents dans le tissu. De fait, nous avons montré que les cellules de la

fraction stroma-vasculaire expriment de l’IL-7 qui est impliquée dans l’induction du

phénotype mémoire, dans la survie et la prolifération des lymphocytes T (201). De plus, nos

résultats de cytométrie en flux montrent que plus de 50% des lymphocytes du tissu adipeux

humain expriment le récepteur à l’IL-7. Nous avons également montré que les macrophages

expriment également de l’IL-15 qui favorise la prolifération et la différenciation des

lymphocytes T CD8+ (69). Pour finir, le tissu adipeux est le site principal de production de la

leptine dont les propriétés pro-proliférantes sur certains types de lymphocytes et anti-

apoptotiques ont été décrites (164). Ainsi, les lymphocytes du tissu adipeux humain sont donc

dans un contexte cytokinique favorisant leur prolifération et limitant leur apoptose qui

pourrait participer à l’expansion de cette population.

Des test de prolifération in vitro sur les lymphocytes isolés du tissu adipeux nous

renseigneraient de manière plus précise sur l’effet in situ des ces différentes cytokines.

94

III Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux humain

L’approfondissement du phénotype des lymphocytes auxiliaires montre qu’ils ne sont

pas Th2, l’absence d’expression d’IL-4 excluant cette voie. Ces lymphocytes sont plutôt

engagés dans une voie Th1 (ils expriment IL-2 et IFNγ et produisent IFNγ) qui semble

prédominante chez les patients en surpoids. Chez les obèses un nouveau phénotype Th17

pourrait apparaître puisque certains de ces lymphocytes expriment de l’IL-17. Il aurait été

intéressant d’étudier les variations de phénotype liées à la localisation, malheureusement les

très faibles quantités de lymphocytes isolés de tissu adipeux sous-cutané et viscéraux des

patients obèses morbides n’ont pas permis cette étude.

Les polarisations en Th1 et Th17 dépendent, comme nous l’avons vu en introduction,

d’un contexte cytokinique très précis (45). Les autres cellules présentes au sein du tissu

adipeux peuvent donc influencer ces polarisations. Nos résultats montrent que les

macrophages du tissu adipeux traités par les sécrétions lymphocytaires expriment de l’IL-23

et de l’IL-1β reconnus pour stimuler chez l’homme la voie Th17 (219), et du TGFβ qui

participe à l’initiation la voie Th17 de manière indirecte en inhibant les autres types de

polarisation (208).

Des travaux complémentaires sont nécessaires afin de préciser par détection

intracellulaire la production d’IL-17 en cytométrie en flux et d’analyser les effets de milieux

conditionnés par les macrophages mais également par les adipocytes sur le phénotype des

lymphocytes.

95

IV Rôle des lymphocytes dans le tissu adipeux

Au niveau histo-morphologique, les lymphocytes sont organisés dans le tissu adipeux

en amas de cellules immunes à proximité des macrophages et des adipocytes comme le

suggèrent nos résultats d’immunohistofluorescence ainsi que la littérature (188, 210). Ces

contacts étroits au sein du tissu adipeux nous ont conduits à regarder les effets des

lymphocytes sur les adipocytes et les macrophages via leur production de facteurs solubles.

Nous avons montré que les lymphocytes influençaient l’expression de marqueurs

macrophagiques M1 (IL-23) comme M2 (IL-10), on peut donc supposer qu’ils ne jouent pas

un rôle direct sur la polarisation des macrophages mais plutôt un rôle indirect sur leur propre

polarisation via l’expression de cytokines qui pourrait les induire dans une voie plutôt qu’une

autre.

Ces produits solubles affectent également les cellules progénitrices en inhibant leur

différenciation. Ces observations sont en accord avec les études de Wu et al. montrant que la

différenciation des précurseurs adipocytaires murins 3T3-L1 était inhibée en présence de

lymphocytes T activés (206). Enfin, les sécrétions lymphocytaires ont un effet anti-

lipogénique via l’inhibition de l’effet de l’insuline sur les enzymes de la lipogenèse. Cet effet,

reversé par un anticorps neutralisant anti-IFNγ, semble du à l’IFNγ sécrété par les

lymphocytes. Ces résultats nous autorisent à penser que les lymphocytes dans le tissu adipeux

pourraient, en inhibant des voies métaboliques dépendantes de l’insuline, participer au

développement de l’insulinorésistance associée à l’état inflammatoire du tissu adipeux.

Il n’est pas exclu que les effets des lymphocytes puissent impliquer des interactions

cellule/cellule au sein des amas cellulaires. De fait, les adipocytes expriment le CD40 et son

activation par le CD40L exprimé par les lymphocytes altère le métabolisme de l’adipocyte en

inhibant l’expression des gènes de la lipogenèse et en activant la lipolyse (188).

96

Nos expériences de microscopie révèlent que ces amas de cellules immunes sont

localisés au contact de certains adipocytes dans le tissu adipeux. Ce résultat est en accord avec

les études histo-morphologiques de Cinti et al. qui avaient déjà révélé que les macrophages se

localisaient en couronne autour des adipocytes nécrotiques (220).

Nous pouvons donc nous interroger sur l’initiation de ces contacts cellulaires. Les

lymphocytes ne sont-ils localisés qu’à proximité des adipocytes en souffrance? Les adipocytes

expriment-ils à leur surface un facteur spécifique qui va attirer les lymphocytes directement

ou indirectement via l’attraction des macrophages qui pourraient recruter à leur tour les

lymphocytes?

V Spécificité des lymphocytes du tissu adipeux humain

La présence des lymphocytes au sein du tissu adipeux et son augmentation par

l’obésité pose la question de savoir si le recrutement est potentiellement un phénomène actif

médié par une réaction immune spécifique dans laquelle les lymphocytes seraient impliqués.

La présence de lymphocytes avec un phénotype particulier à l’intérieur du tissu

adipeux trace le schéma d’une réaction immune classique où les CPAs pourraient présenter un

antigène spécifique aux lymphocytes du tissu adipeux. Ce phénomène pourrait expliquer leur

recrutement et leur prolifération au sein du tissu adipeux. Cet antigène pourrait être de nature

peptidique présenté de manière classique par le CMH II présent sur les macrophages du tissu

adipeux (185). La présentation d’un antigène peptidique requiert des CPAs qui sont présentes

en grand nombre dans le tissu adipeux et dont le pourcentage est augmenté avec le

développement de la masse grasse. Cette hypothèse est actuellement en cours d’étude dans le

laboratoire par une analyse du répertoire TCR des lymphocytes isolés du tissu adipeux. En

effet, il est possible d’analyser le répertoire TCRβ en utilisant des anticorps dirigés contre le

domaine Vβ des molécules du TCRαβ qui couvrent 65-70% des domaines Vβ présents dans

97

les lymphocytes T circulants (221, 222). De plus, la découverte d’un antigène spécifique relié

à l’activation et à la prolifération des lymphocytes au sein du tissu adipeux permettrait de

cibler spécifiquement cette population dans un but thérapeutique, soit afin d’activer les

lymphocytes de façon à permettre à la réaction immune de se mettre en place, soit au contraire

de les inhiber afin de limiter leur entrée dans le tissu adipeux. Cette question sur la nécessité

de les inhiber afin de freiner le développement de l’insulinorésistance ou bien au contraire de

les activer afin de limiter l’extension de la masse grasse reste ouverte à ce niveau de nos

investigations.

VI Différences observées avec les modèles murins

Les études menées sur les animaux nous ont permis de mettre en évidence que les

populations cellulaires immunes du tissu adipeux étaient en partie différentes de celles

présentes chez l’homme. On retrouve dans le tissu adipeux de souris soumises à un régime

hyperlipidique des lymphocytes B, des cellules de l’immunité innée NK et NKT en plus des

lymphocytes T et des macrophages. Ces différences montrent qu’il faut rester prudent

lorsqu’on étudie l’obésité sur les modèles animaux qui ne sont pas toujours représentatifs des

observations faites chez l’homme. De plus les temps de régime chez la souris nous permettent

d’observer le développement de l’obésité et le début de son installation, mais ne sont pas

indicateurs des évènements qui ont lieu dans le tissu adipeux humain lorsque l’état d’obésité

s’est installé.

Les résultats d’analyses des cellules de la fraction stroma vasculaire par cytométrie en

flux chez la souris montrent une inflammation qui se développe très précocement avec la prise

de poids, les premières cellules immunes ie les lymphocytes B augmentent dès 3 semaines de

régime, suivis par les lymphocytes T à 6 semaines puis par les macrophages à 12 semaines.

Ces résultats sont «en accord» avec le phénotype très inflammatoire observé chez les

98

lymphocytes isolés de patients en surpoids. L’absence d’informations précises sur l’historique

de nos patients nous empêche de tirer des conclusions. Toutefois, chez l’homme, l’ensemble

de nos résultats tend à montrer que le phénotype Th1, pro-inflammatoire des cellules T lors du

développement de l’obésité, pourrait évoluer en phénotype chronique Th17 lorsque l’obésité

est installée. Il serait intéressant de travailler sur des patients dont on connaît précisément

l’historique de prise et de perte de poids ainsi que le nombre d’années d’obésité. Un modèle

animal plus représentatif de l’homme serait de visualiser «l’effet yoyo» chez les souris en les

mettant en alternance de régime gras et de régime normal. La méthode permettrait d’analyser

l’effet de la prise et de la perte de poids successives sur les populations immunes du tissu

adipeux. Enfin, l’utilisation de modèles animaux plus âgés, en régime enrichi en lipides

pendant plusieurs mois, nous permettrait probablement d’accéder à des tissus dans lesquels

une inflammation chronique a lieu.

Pour finir nous avons tenté, dans un modèle animal déficient en lymphocytes,

d’étudier le rôle précis des lymphocytes. Nos résultats sur ces souris semblent indiquer que

l’absence de lymphocytes n’altère pas le développement de l’obésité, ni de l’insulino-

résistance. Cependant, après 12 semaines de régime enrichi en lipides, les NK et les

macrophages s’accumulent dans le tissu adipeux des souris RAG2(-/-). Ces résultats

permettent de s’interroger sur le rôle des lymphocytes dans l’initiation de cet état

inflammatoire chez l’animal. Il est possible que les lymphocytes soient des modérateurs d’une

immunité innée qui réagit de manière (trop?) importante au développement du tissu adipeux.

Il est également envisageable que les lymphocytes et les cellules NK jouent le même type de

rôle pro-inflammatoire au sein du tissu adipeux et qu’une population soit capable de

compenser l’autre lors d’invalidations génétiques. En effet il a été montré que les cellules NK

pouvaient, dans certains cas d’immunodéficience, prendre le relais des lymphocytes et

99

répondre à une stimulation antigénique plus classique (215). Cette hypothèse est renforcée par

les travaux menés chez l’homme qui ne présentent pas d’augmentation des cellules NK avec

l’IMC. Afin de répondre à ces questions, il serait nécessaire de travailler sur des modèles de

souris déficientes en cellules NK, par déplétion spécifique des cellules NK in vivo à l’aide

d’anticorps dirigés contre NK1.1 ou encore AGM1 (223, 224) afin d’étudier leur réponse au

régime en terme de métabolisme et de recrutement des autres partenaires immunitaires.

100

Partie 4 : Références

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Titre et résumé en anglais

Human adipose tissue lymphocytes: characterization and roles.

Obesity is associated to a low level systemic inflammatory state and to an excessive

production of pro-inflammatory cytokines in adipose tissue. These cytokines are mainly

produced by macrophages, previously described to accumulate in adipose tissue (AT) during

obesity. My PhD work has been focussed on characterizing and analyzing the potential role of

lymphocytes, immune partners of macrophages. Our results show that the number of

lymphocytes presents in AT increases with the body mass index (BMI) and with the visceral

AT location. Human AT lymphocytes are mainly effector and memory CD3+ CD4+ and

CD3+ CD8+ T cells. A study on AT CD3+ lymphocyte-conditioned media allowed us to

demonstrate an anti-adipogenic effect of lymphocytes on AT progenitor cells. In addition,

these media inhibit the insulin-mediated effect on the expression of lipogenic enzymes from

mature adipocytes. Murine models show a complex traffic of immune cells in adipose tissues

during the onset of obesity and a marked accumulation of natural killer cells and macrophages

in AT from immunodeficient mice. All these results allowed us to characterize the

lymphocyte populations of the human AT and to demonstrate that their productions can

modulate both the metabolism and the adipocyte differentiation. The data obtained on murine

models suggest that adipose tissue lymphocytes could have a protective role limiting the

development of an excessive innate inflammatory reaction.

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Auteur : Carine DUFFAUT

Titre : Les lymphocytes du tissu adipeux humain : caractérisation et rôles

Directeur de thèse : Dr Anne BOULOUMIE et Dr Jean GALITZKY

Lieu et date de soutenance : Toulouse, le 16 Juillet 2009

Résumé : L’obésité est associée à un état inflammatoire systémique de bas niveau et à

une production excessive de cytokines pro-inflammatoires dans le tissu adipeux (TA). La

principale source cellulaire de ces cytokines est le macrophage qui a été décrit pour

s’accumuler dans le TA au cours de l’obésité. Ces travaux de thèse ont pour but de

caractériser et d’analyser le rôle potentiel des partenaires immunitaires des macrophages, les

lymphocytes dans le TA. Nos travaux montrent que le nombre de lymphocytes présents dans

le TA humain augmente avec l’indice de masse corporelle (IMC) des patients ainsi qu’avec la

localisation viscérale du TA. Les lymphocytes du TA humain sont majoritairement des

cellules TCD3+, CD4+ et CD8+, effecteurs et mémoires. Nos études sur les milieux

conditionnés par les lymphocytes CD3+ isolés du TA ont permis de démontrer que les

lymphocytes ont un effet anti-adipogénique sur les cellules progénitrices. Sur les adipocytes

matures, ils inhibent l’effet de l’insuline sur l’expression des enzymes de la lipogenèse. Les

modèles animaux montrent une cinétique complexe de trafic des cellules immunes dans le TA

au cours du développement de l’obésité et une accumulation forte de cellules natural killer et

de macrophages dans le TA de souris immunodéficientes. L’ensemble de ce travail a permis

de caractériser les populations lymphocytaires présentes dans le TA humain et de montrer que

leurs productions peuvent moduler le métabolisme mais également la différenciation

adipocytaire humaine. Les résultats obtenus sur les modèles murins suggèrent que les

lymphocytes du TA pourraient exercer un rôle protecteur en limitant le développement d’une

réaction inflammatoire innée excessive.

Mots clés : lymphocytes, obésité, inflammation, tissu adipeux, lipogenèse

Discipline : Innovation pharmacologique

Intitulé et adresse du laboratoire : Equipe 1 - Réseau vasculaire, cellules progénitrices et

cellules immunitaires du tissu adipeux- INSERM U858/I2MR, Bat L4 Hôpital de Rangueil, 1

avenue Jean Poulhès 31059 Toulouse