Régulation Nécessité et mécanismes. Lorganisme se procure quelques composés, en synthétise la...

Régulation

Nécessité et mécanismes

L’organisme se procure quelques composés, en synthétise la majorité… La vitesse d’approvisionnement (FLUX à travers la voie métabolique) doit répondre à ses besoins.Pour y arriver, il va CONTROLER L’ACTIVITE des enzymes, et REGULER LA CONCENTRATION des métabolites intermédiaires.

FLUX:

Contrôle de l’activité enzymatique:

• Quantité: synthèse et dégradation

• Activité:

– Régulation covalente

– Régulation non covalente

Synthèse/dégradation

ctkEkk

tdEkk

Ed

dds

ds

'])[''ln(

)(][''

][

cEkk

EE t En

ds

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][][,0

0

0

tk

ds

ds

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deEkk

Ekk

EkktkEkk

'

0

0

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][Ekk

td

Edds

Synthèse-dégradation: cinétique

Aug

men

tatio

n de

l’ac

tivité

enz

ymat

ique

2.5 5 7.5 10

Pyruvate kinase (t1/2 24h)

Tryptophane 2-3, dioxygénase (t1/2 2.5h)

Ornithine décarboxylase (t1/2 0.3h)

Temps (heures)

tk

d

s

d

s deEk

k

Ek

k

E

E '

000

1]['

'

]['

'

][

][

Demi vies dans le foie de rat:(extrait de: Fundamentals of Enzymology (3rded) N.C. Price et L. StevensOxford University Press)Enzyme t1/2

Ornithine décarboxylase 20 min

5-aminolevulinate synthase (mitochindriale)

1.2h

RNA polymérase I 1.3 h

Tyrosine aminotransférase 1.5 h

Tryptophane 2,3 dioxygénase

2.0 h

Thymidine kinase 2.6 h

HMG Co-A réductase 4.0 h

Sérine déshydratase 5.2 h

PEP carboxykinase 8.0 h

Déhydro-orotase 12.0 h

RNA polymérase II 13.0 h

Glucose-6-P déshydrogénase 24.0 h= 1.0 j

glucokinase 1.3 j

catalase 1.4 j

Acétyl co-A carboxylase 2.1 j

GAP déshydrogénase 3.1 j

Pyruvate kinase 3.5 j

Arginase 4.5 j

Fructose bisphosphate aldolase 4.9 j

Lactate déshydrogénase 6.0 j

6-PFK 7.0 j

Membranes microsomales

t1/2 (heures)

Cytochrome b5 (out) 0.4

Cytochrome b5 reductase (out)

5.8

NADPH-cytochrome reductase (out)

2.9

NDPase (in) 1.3

Carboxylestérase (in) 4.0

HMG CoA réductase 0.2

NAD+ nucléotidase 18.0

Mitochondrie t1/2 (jours)

Carbamoyl Phosphate synthétase

7.7

Malate déshydrogénase 2.6

Glutamate déshydrogénase

1;0

Carnitine acétyl transférase

1.8

Ornithine amino transférase

1.9

Amine oxidase 2.8

Cytochrome c oxidase >8.0

Pyruvate déshydrogénase

4.5 à 5.6

Recyclage individuel des protéines!

Contrôle de la synthèse et de la dégradation:

• Transcription• Stabilité de l’ARNm (séquences « UA riche », etc)• Traduction• Dégradation de la protéine (séquences « PEST »,

ubiquitinylation, SUMOylation, mais aussi protéolyse régulée de la HMG CoA réductase, « down-regulation » des récepteurs, etc.)

Souvent: régulation coordonnée de toute la voie

Prokaryotes: opérons ( lac)

Eucaryotes: activité multi enzymatique, homologie promoteurs

Fatty acid synthase

Régulation covalente: autres• Phosphorylation: Ser/Thr

– (glycogène phosphorylase, glycogène synthase, Ac CoA carboxylase, F2,6 bis phosphatase/PFK2, GPCRs, etc, etc)

• Phosphorylation: Tyr– (voie de signalisation de l’insuline, de facteurs de

croissance)

• ADP-ribosylation – (protéines G, glutamine synthétase, RNA polymérase, etc)

• Adenylylation, uridylylation, etc– (glutamine synthétase E Coli, etc)

Régulation non covalente:

– Concentration adéquate de substrat, de cofacteur

– Accumulation du produit

– Inhibiteurs/activateurs allostériques

– Protéines inhibitrices (BPTI / trypsine,

protéine nucléaire / glycogène synthase,

glycogène phosphorylase a / glycogène synthase

phosphatase, etc)

Enzymes allostériques et enzymes coopératives

• Enzymes allostériques: – Enzymes régulées par des composés ne ressemblant ni au

substrat, ni au produit de la réactionExemples: inhibition de la phosphofructokinase par l’ATP, …

• Enzymes coopératives:– Enzymes multimériques, cinétique de forme « sigmoïde »

{ v = fct( [S]n) }

Remarque: PAS SYNONYMES!Même si la majorité des enzymes coopératives sont également allostériques, et si beaucoup d’enzymes allostériques sont également coopératives vis-à-vis d’au moins un substrat.

Enzyme coopérative, ou “de type K”:l’aspartate transcarbamoylase

Aspartate transcarbamoylase bactérienne:enzyme coopérative et allostérique

0 20 400

0.5

1

[SUBSTRAT] (mM)

VIT

ES

SE

0 5 100

0.5

1

[SUBSTRAT] (mM)

VIT

ES

SE

ZOOM:

+ATP

+CTP

Controle +ATP

+CTP

Controle

Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP; Inhibé lorsque les purines sont disponibles;activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles

Courbe sigmoïde: pourquoi?

0 2 4 6 8 100

0.5

1

Conformation RConformation TEnzyme allostérique (2sites)

L’enzyme coopérative existe en 2 conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine; les courbes v et T sont confondues à très petit [S]. Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la vitesse se rapproche de la courbe R

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.5

1

[S]

[S]

vitesse

vitesse

T

R

T

R

Monod, Jacob et Changeux:TR

SS

S S

SS

S S

nn

nn

n

n

T

R

cL

cLY

R

TL

K

Sc

K

S Si

)1()1(

)1()1( 11

Deux conformations préexistantes, changement coordonné.

Chaque ligand (substrat, activateur, inhibiteur) favorise une des deux conf.

Koshland, Néméthy et Filmer:

S

S

SS

S S

Deux conformations possibles pour chaque sous unité, chaque ligand peut induire une des deux conformations.

Les ligands n’affectent que la sous unité qu’ils occupent

La réalité: un mélange de ces deux modèles?

SS S

SS S

SS S

SS S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

R4 T4RT3R2T2R2T2R3T

Monod-Wyman-ChangeuxKoshland-Néméthy-Filmer

Régulation d’une enzyme coopérative par des régulateurs allostériques:

0 2 4 6 8 100

0.5

1

Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100)Enzyme allostérique activé (T/R = 10)Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000)

Inhibiteur stabilisant T

Activateur, stabilisant R

Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparemment pas grande différence au niveau des vitesses?

0 2 4 6 8 100

0.5

1

Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)

Mais…pas du tout le même effet sur le « Flux » à travers la voie métabolique:

{ orifice large à la base,

devient de plus en plus étroit }

{ Orifice étroit à la base, s’élargit,

puis redevient très étroit }

0 0.1 0.2 0.30

0.1

0.2

0.3


[Substrat]

vite

sse

Pourquoi? Zoom sur les petites concentrations de Substrat:

Enzyme Michaelienne:v varie moins que S

Flux augmente, mais moins que [S]

0 0.1 0.2 0.30

0.1

0.2

0.3


[Substrat]

vite

sse Enzyme coopérative:

v varie plus que S

Flux augmente, plus que [S]

Enzyme coopérative

Régulation d’une enzyme coopérative et allostérique:

Inhibiteur, stabilisant la conformation « T »,Activateur, stabilisant la conformation « R »

Régulation de voies métaboliques:

Coordonnée, à plusieurs niveaux.

Pourquoi?

Glucose

Régulation de la glycolyse et du cycle de Krebs:

Synthèse et de la dégradation du glycogène:

AMPc

GlycogèneGlucose P

(Glycogène +Pi) Glucose-P

UDP-glucose glycogène

Synthèse et de la dégradation du glycogène :

glucose

Questions:

On observe en règle générale plusieurs

mécanismes de contrôle dans une voie

métabolique.

• Comment identifier l’enzyme qui contrôle

effectivement la voie?

• A quoi servent les autres contrôles?

• Pourquoi une telle multiplication des contrôles?

• Lorsqu’une même voie conduit à plusieurs

produits, comment l’organisme s’arrange-t-il pour

avoir en permanence une synthèse adéquate de

tous les produits?

• Une vitesse de réaction « Michaelienne » passe

de 10% à 90% du maximum lorsque la [S] passe

de 0.1 à 10 KM («la réponse se développe sur 2

logarithmes »).

– Comment obtenir une réponse « oui/non » (division

cellulaire, apoptose, …)

– au contraire, une réponse graduelle sur 7 à 8

logarithmes (vision)?

Flux, contrôle et régulation?

Le problème: comprendre comment l’organisme s’arrange pour obtenir ce dont il a besoin sans gaspillage:

Il doit pouvoir contrôler le Flux à travers chaque voie de synthèse ou de dégradation, tout en régulant la concentration des métabolites intermédiaires…

Flux, contrôle et régulation:• « Flux » : vitesse de production (et d’utilisation) des différents

métabolites dont l’organisme a besoin. (Par analogie: ventes et réapprovisionnement d’un supermarché)

• « Contrôle » : capacité du système à obtenir un flux adéquat

pour répondre à la demande. (Par analogie: bouton de réglage de la température d’un frigo.)

• « Régulation » : capacité de l’organisme à maintenir la

concentration des métabolites intermédiaires à un niveau plus ou

moins constant. (Par analogie: capacité du frigo à maintenir une température constante,

proche de la température demandée, quelque soit le nombre d’ouvertures

de la porte et la température demandée.)

Quelle est l’enzyme qui contrôle

la vitesse de la cascade de

réaction:

•La plus lente?

•La moins concentrée?

•Le lièvre, ou les tortues???

Enzyme « rate limiting »???

Quelle étape devrait on contrôler?

• A l’état stationnaire, toutes les réactions se

produisent à la même vitesse: c’est ce qu’on

appelle le « Flux » à travers la voie métabolique.

• Traditionnellement, on suppose que l’étape qui

contrôle le flux devrait être une réaction

irréversible, particulièrement lente.

• Mais: crédible?

Le « rate limiting step »: légende ou réalité?

A B C D E…

Supposons:

• Réaction B C (par exemple) particulièrement lente

• A et B ↑, et C ↓

• Si C ↓ vitesse réaction C D ralentie (loi d’action des

masses),

• Si A et B ↑ vitesse de transformation BC accélérée,

jusqu’à atteindre une vitesse équivalente à C D

Rappel: comment visualiser le flux?

Diminution d’une activité

enzymatique accumulation

des métabolites en amont,

déplétion des métabolites en

aval de.

Dangereux, voire même

toxique?

Risque d’emballement

d’autres voies?

Rappel: forme de « l’écluse » qui relie les canaux ?

Vmax/KM ou KS

Cascade de réactions irréversibles:

UDP-Glucose

Apport dans le premier bassin ↑,

niveau ( [S1] ) ↑ vitesse ↑, le niveau ([S2]) ↑, etc.

Difficulté : ↑ du flux suffisante, sans (trop) ↑ [métabolites intermédiaires]!

glycogène synthase

Glycémie (veine porte)

Glucose 1P

GLUT 4 / Glucokinase/

phosphoglucomutase

Repas

Glycogène

UDP-glucosepyrophosphorylase

Rôle de la régulation:• Régulation nécessaire pour maintenir

[métabolites] ≈ , quelle que soit la demande (par

exemple: régulation de la glycémie lors de

l’effort et du repos)

• Nécessité de contrôler le flux (vitesse de

production).

• Pour contrôler la vitesse de chaque réaction :

modifier KM, Vmax , [enzymes], proportion

d’enzyme en conformation active, etc…

Outils: Effet d’une augmentation / diminution de la quantité d ’enzyme ou de son activité (Vmax)?

vitesse

[S]

Effet d’une diminution de KM?

vitesse

[S]

Enzyme coopérative:

Ressemble à un tuyau: le « bas » de l’écluse s’évase.

Idéal pour conserver une concentration stable de substrat !

Inhibition d’une enzyme coopérative et

allostérique (composé favorisant la conformation T)

Inhibiteur favorise TActivateur favorise R

inhibition / activation surtout aux faibles [S]

« Metabolic Control Analysis »:

Formalisme mathématique, permet la description quantitative du contrôle du flux à travers une voie métabolique, et de sa régulation par les différents mécanismes qui ont étés identifiés par les biochimistes.

Intérêt:

• Permet de valider les « impressions » qualitatives sur

l’importance des différents mécanismes de contrôle

observés

• Permet (en théorie) de contrôler qu’on a bien identifié

tous les mécanismes de régulation, et d’en évaluer

l’importance relative

• Explique pourquoi on observe en général des

changements « coordonnés » de la concentration de

tous les enzymes impliqués dans une voie métabolique

Dans le but de quantifier l’effet de chaque mode de

régulation, Kacser et Burns puis Heinrich et

Rapoport ont défini trois fonctions:

• Elasticité, εsv : mesure la variation de la vitesse de

chaque réaction prise séparément.

• Coefficients de contrôle du flux, CEJ : mesure la variation

du flux (càd. à travers l’ensemble de la voie) lorsque E

change.

• Coefficients de contrôle de métabolite, CEM : mesure la

variation de chaque [métabolite] (à l’état stationnaire)

lorsque Ej change.

Élasticité:De quel pourcentage varie la vitesse lorsque la concentration

de substrat augmente? se traduit en termes mathématiques par:

( )( ) [ ]

?([ ] ([ ])

[ ]

vv Sv

S S vS

D

SD

N

SNS

D

SDN

D

SN

N

DS

S

D

N

N

DS

D

Navec F ?

S

F

F

S

FS

FS

2

1[ ]

1[ ]

[ ] [ ]v

[ ] [ ] [ ]1

alors

1

[ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ] [ ]1

1

1 11

S PS S

S P IM M i

S Sv S

PS M

S S PS S

S P IM M i

eq

P

vS

eqeq

S

K S K PS P I

K K K

K KS S

K S K P S P IK K K

K

K

K S

K S

K

PEEPESES

équilibrel à Réaction

/

:'

Mesure le déséquilibre substrats / produits

Fraction de E occupé par S

Habituellement: ε >0 si métabolite = substrat, ε <0 si le métabolite = produit de la réaction.

│ ε │ ↑ lorsque l’équilibre produit/substrat est presque atteint (Γ/K

≈1): le flux à travers l’enzyme est très faible (la réaction est en

fait aussi rapide dans les deux directions).

ε ↓ lorsque occupation par le métabolite élevée: lorsque l’enzyme

est déjà saturé, augmenter la concentration du métabolite n’a pas

d’effet…

Elasticité: % de variation de la vitesse par % d’augmentation de [M]:

KS

Sv

v

eq

vS

11

1propriété « locale » de l’enzyme

- mesure in vitro - peu d’infos sur le flux (voie métabolique)

équilibre)l' de près absoluevaleur en augmente ; produitpar

activation si saufnégative, nt(normaleme K

K

définir peut on même, De

eq

eqvP

11

réactionla pas catalyse ne E si 0 réactionla catalyse E si v

E1

réactifs) non

sinhibiteur lespour négative (toujours vI

1

Elasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions irréversibles:

• Si réaction irréversible, si [S]/KM

est très petit: vitesse de la

réaction ↑ avec [S]:

ε ≈ 1.

• [S] saturant: v ≈ Vmax, donc (en

valeur relative), d(v)/v tend vers

0.

Elasticité maximale ( ≈ 1) en

[S]/KM petit, 0 en [S]/KM

grand…

•

Elasticité d'une réaction Michaelienne irréversible:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101

[S]

Ela

stic

ité

• Réaction réversible: vitesse

résiduelle (v(SP) - v(PS)) ≈0.

Près de l’équilibre :

faible modification de [S] ou [P]

forte modification de la

vitesse résiduelle :

en valeur absolue,

│ε │ ∞ en v 0.

Elasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions réversibles:

Elasticité d'une réaction Michaelienne réversible:

-30

-20

-10

0

10

20

30

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101

[S]El

astic

ité Equ

ilibr

e

Cœfficients de contrôle:

; S substratdu ionconcentratla contrôler à i"" réactionla

catalysant enzymel' de capacitéla mesure

EE

SS

C

;J"" flux le controler à i"" réactionla

catalysant enzymel' de capacitéla mesure

EE

JJ

C

j

i

i

j

j

SE

i

i

JE

j

i

i

][][

Beaucoup plus difficiles à évaluer mathématiquement que les élasticités:

chaque cœfficient de contrôle dépend des autres enzymes!

Signification:• Les cœfficients de contrôle de flux : effet de ↑ [enzyme]

sur le « flux », à l’état stationnaire, à travers la voie métabolique dans son ensemble;

• Les cœfficients de contrôle de concentration effet de ↑ [enzyme] sur la [métabolites], à l’état stationnaire, lorsque la voie enzymatique complète est considérée;

• Les élasticités mesurent l’effet de chaque métabolite sur la vitesse de chaque réaction enzymatique (régulations

allostériques, rapport [S]/KM, etc)

Évaluation des cœfficients de contrôle?

• Mathématique:– Relations entre élasticités et cœfficients de contrôle…

• Expérimentale:– Ajoute d’une enzyme? (système acellulaire)

– Augmentation / diminution d’expression d’une enzyme (mutation

du promoteur, transfection stable ou transitoire, siRNA, cellules

polynuclées, etc.)?

– Augmentation / diminution d’activité d’une enzyme: effet

d’inhibiteurs? D’activateurs? De mutations?

– « Top down » analysis: analyse de groupes de réaction

Glycolyze: ajoute d’enzyme

Hexokinase

PFKase

Respiration mitochondriale: inhibiteur

Compl.IV

Respiration mito.

Expérimentalement:

Hétérokaryons: Neurospora (synthèse Arg)

JEC

Remarque: le contrôle du flux (pente de la tangente à

la courbe) diminue lorsque la [Enzyme] augmente!

Approche « top down »:

)(

)(

)(

)(

14.000.0

29.0

70.085.030.015.0

ATP

fuite NADH ecosGlu

ATP

fuite ecosGlu

NADH ecosGlu

0.49

0.22

H0.30-0.15

0.49

0.22

H

Diviser la voie en un nombre limité de « blocs » et en étudier le contrôle:

« n » enzymes et « (n-1) » métabolites intermédiaires, donc:

– « n » coéfficients de contrôle de Flux (1 par enzyme E i)

– « n (n-1) » coéfficients de contrôle de [Sj] par Ei,

(1 par enzyme et par métabolite),

Soit: n + n (n-1) = (n + n2 – n) = n2 inconnues

JEi

C

j

i

SEC

Mathématique:

PSSSSSA nEn

EEEE )1(4321 ...4321

Nombre d’inconnues?

Il faut donc trouver (n)2 équations pour déterminer les n2 coéfficients de contrôle inconnus à partir des

élasticités, « connues »…

Théorème des sommes

Théorèmes de connectivité

1. Théorèmes des sommes:

Supposons

1. que nous augmentons « un tout petit peu » la concentration de tous les

enzymes de la voie,

2. que la vitesse de chaque réaction est proportionnelle à la concentration de

l’enzyme qui la catalyse.

....)3()3(

)()2(

)2(

)()1(

)1(

)()( Ed

E

JEd

E

JEd

E

JJd

L’effet total sur le flux va correspondre à la somme des effets de chacune des

augmentations sur le flux:

....)3()3(

)()2(

)2(

)()1(

)1(

)()( Ed

E

JEd

E

JEd

E

JJd

...3

)3(

3/)3(

/)(

2

)2(

2/)2(

/)(

1

)1(

1/)1(

/)()(

E

Ed

EE

JJ

E

Ed

EE

JJ

E

Ed

EE

JJ

J

Jd

obtient On

".E / E"par droiteà

terme chaque multiplier J;par termes deux les Diviser

ii

...3

)3(

2

)2(

1

)1()(321

E

EdC

E

EdC

E

EdC

J

Jd JE

JE

JE

Supposons que toutes les concentrations d’enzymes augmentent du même facteur d(E)/E = α. Cela revient au même que de changer d’échelle de temps : le flux (nombre de moles formées par unité de temps) va augmenter d’un facteur d(J)/J = α.

1

...1

...

:

...3

)3(

2

)2(

1

)1()(

321

321

321

JEi

JE

JE

JE

JE

JE

JE

JE

JE

JE

iC

CCC

CCC

donc devient

E

EdC

E

EdC

E

EdC

J

Jd

Le contrôle du flux est « partagé » par tous les enzymes qui constituent la voie métabolique.

Conséquences:

• On ne peut que très rarement

identifier « UNE » enzyme

limitante, en règle générale le

contrôle est partagé;

• Lorsqu’on augmente l’activité

d’une des enzymes limitantes,

son coéfficient de contrôle

diminue;

• Pour augmenter la production

d’un composé intéressant, il

faudra augmenter la

concentration de toutes les

enzymes de la voie!

Lactate

glucose:

Coéff. contrôle fluxBasale + glucagon

Transport pyruvate

0.00 0.01

Pyruvate carboxylase

0.51 0.83

Transport OAA

0.02 0.04

PEP-CK

(induite)

0.05 0.08

Pyr Kinase (« fuite »)

-0.17 0.00

Enolase + PGK

0.29 0.00

TIM+FbPase 0.27 0.03

PGI+G6Pase 0.02 0.00

On peut faire le même raisonnement pour les coéfficients de

contrôle de concentration:

A l’état stationnaire, changer d’échelle de temps n’affecte

pas les concentrations des différents métabolites (niveau

dans les bassins intermédiaires), donc

0 SjEi i

C

Conclusion: si on augmente la concentration de TOUS les enzymes d’une voie métabolique, la concentration des métabolites intermédiaires ne variera pas.

« Méthode Universelle » de Kacser…

Augmentation de la synthèse du Trp?

Gène surexprimé <Augmentation>

de [E]

Augmentation

du flux, JTRP2 TRP4 TRP1 TRP3 TRP5

- - - - - 1 1.0

- - + + - 58 2.0

+ + - + - 35 2.4

µ - + + - 34 1.2

µ + + + - 30 2.1

+ + - + + 19 8.2

µ + + + + 23 8.8µ : surexpression d’un allèle muté, résistant à la rétroinhibition par le Trp

Niederberger et al., Biochem. J. 287:473-9, 1992

2. Théorèmes de connectivité:

j

jvS

i

i

j

jvS

i

i

i

i

S

Sd

E

Ed

S

Sd

E

Ed

v

vd

i

j

i

j

)()(

0)()()(

Imaginons qu’on modifie simultanément la concentration d’une enzyme quelconque « Ei » ET celle du substrat « Sj », de telle

façon que la vitesse de la réaction catalysée par Ei ne change

pas:

Si la vitesse de chaque réaction ne change pas, le flux ne change pas:

0...)()()(

3

3

2

2

1

1

j

jvS

JE

j

jvS

JE

j

jvS

JE

S

SdC

S

SdC

S

SdC

jjj

S

SdC

S

SdC

S

SdC

J

Jd

devient

j

jvS

JE

j

jvS

JE

j

jvS

JE jjj

0...)()()()(

:

3

3

2

2

1

1

0...)()()()(

3

3

2

2

1

1321

E

EdC

E

EdC

E

EdC

J

Jd JE

JE

JE

i

vS

JE

i

jiC 0:

S

d(S ommeC

j

j 0)

i

vS

SE

j

jvS

SE

j

jvS

SE

j

jvS

SE

j

j

SE

SE

SE

j

j

C donc

S

SdC

S

SdC

S

SdC

S

Sd

devient

E

EdC

E

EdC

E

EdC

S

Sd

i

j

j

i

j

j

j

j

j

j

jjj

1

...)()()()(

:

...)()()()(

3

3

2

2

1

1

321

3

3

2

2

1

1

La concentration du substrat « j » a changé: donc

i

vS

SE

j

jvS

SE

j

jvS

SE

j

jvS

SE

k

k

SE

SE

SE

k

k

jk si C donc

S

SdC

S

SdC

S

SdC

S

Sd

devient

E

EdC

E

EdC

E

EdC

S

Sd

i

j

k

i

j

k

j

k

j

k

kkk

0

...)()()()(

:

...)()()(

0)(

3

3

2

2

1

1

321

3

3

2

2

1

1

La concentration des autres substrats n’ a pas changé:

Au total = n2 équations?• 1 somme de coéfficients de contrôle du flux par Ei:

• (n-1) sommes de coéfficients de contrôle des substrats par Ei (1 par métabolite):

• (n-1) équations de connectivité entre le contrôle du flux par chaque enzyme et l’élasticité

de chaque vitesse en réponse aux (n-1) métabolites;

• (n-1)2 équations de connectivité entre le contrôle de la concentration de chaque (n-1)

métabolite par chaque enzyme et l’élasticité de chaque vitesse en réponse aux (n-1)

métabolites:

• Soit: 1 + (n-1) + (n-1) + (n-1)2 = 1 + 2n – 2 + (n2 -2n +1) = n2 équations

i

JE C

i1

i

vS

JE 0 C i

ji

i

vS

SE

j kpour 0jkpour

C i

j

k

i

1

i

SE

j

iC 0

Intérêt de ces relations?

• n2 équations à n2 inconnues… Il « suffit » d’évaluer tous les coéfficients d’élasticité in vitro, aux

conc. physiologiques de substrat, pour calculer les coéfficients de

contrôle de concentration et de flux;

• Permettent de répondre aux questions

– « quelles conditions faut-il remplir pour que l’enzyme contrôle

efficacement le flux? »

– « quelles conditions faut-il remplir pour maintenir les

concentrations des métabolites à peu près constantes? »

Quelles conditions faut-il remplir pour que l’enzyme contrôle efficacement le flux?

La somme des coéfficients de contrôle de flux = 1:

le contrôle est partagé par tous les enzymes de la voie

i

JE C

i1

Cascade de réactions irréversibles:

A

B

C

Enzyme 2

Enzyme 3

Enzyme 1

Pour accélérer le flux à travers toute la cascade: l’idéal: augmenter simultanément toutes les activités enzymatiques!

Voie comportant deux enzymes:

Quelles conditions faut-il remplir pour que la demande (E2) contrôle efficacement le flux?

Valeurs des coéfficients de contrôle?

demandeoffre EEM

0 Mdemande

Moffre CC

1 demandeM

Mdemande

offreM

Moffre CC

0 demandeM

Jdemande

offreM

Joffre CC

1 Jdemande

Joffre CC

(3)

(4)

(2)

(1)4 inconnues

( CJfourniture et CJ

demande,

CMfourniture et CM

demande )

donc: 4 équations?

2 équations de sommes

(ΣCJ et Σ CM) et deux

équations de connectivité

(Σ CJεM et Σ CM εM)

demandeM

offreM

offreMJ

demande

demandeM

offreM

Jdemande

offreM

demandeM

offreM

Jdemande

offreM

demandeM

Jdemande

offreM

Jdemande

C

C

C

CC

0

01

Jdemande

Joffre

Jdemande

Joffre CC CC 11

0 demandeM

Jdemande

offreM

Joffre CC (1)

(2)

Le contrôle exclusivement par un des deux blocs est-il possible?

offreM

demandeMdemande

MoffreM

Joffre si C

:même De

1

1

1

Pour que le flux soit contrôlé « uniquement » par la demande,

il faudrait que son élasticité, |εM|, soit nulle et l’élasticité de

l’offre, « infinie »: c’est l’enzyme ou le bloc d’enzymes qui a la plus petite élasticité qui contrôle le flux.

siC demande

MoffreMdemande

MoffreM

demandeM

offreMJ

demande

1

1

Pourquoi?L’élasticité mesure l’effet de [M] sur la vitesse des 2 réactions (offre et

demande). Imaginons que l’augmentation de M inhibe énormément l’offre

(grande élasticité de l’offre):

• Si on augmente la concentration des enzymes qui synthétisent M (offre):

dès que M augmente il va inhiber les enzymes qui le produisent: la vitesse

ne changera pas…

• Imaginons au contraire qu’on augmente la concentration des enzymes qui

utilisent M (demande): dès que M diminue, son inhibition sur les enzymes

de synthèse sera levée, et la vitesse de production de M augmentera.

• Le flux est donc bien contrôlé par la demande si l’élasticité de l’offre, en

valeur absolue, est très grande et l’élasticité de la demande, très petite!

Rappel: élasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions irréversibles:

• Si la réaction est irréversible,

la vitesse de la réaction

augmente avec la

concentration de substrat tant

que [S]/KM est petit.

Dès que le substrat devient

saturant, v≈Vmax, et (valeur

relative, d(v)/v tend vers 0.

• L’élasticité est donc grande

pour [S]/KM petit, faible pour

[S]/KM grand…

Elasticité d'une réaction Michaelienne irréversible:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101

[S]

Ela

stic

ité

• Si au contraire la réaction est

réversible, la vitesse résiduelle

s’annule à l’approche de

l’équilibre;

une faible modification de [S] ou

[P] entraînera une grande

modification de la vitesse

résiduelle;

• Attention: le produit aura

également une très grande

élasticité (inverse) près de

l’équilibre!

Elasticité d'une réaction Michaelienne réversible:

-30

-20

-10

0

10

20

30

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101

[S]El

astic

ité Equ

ilibr

e

Elasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions réversibles:

Elasticité d’enzymes coopératives:

Dans le cas d’enzymes

coopératives, la vitesse de

la réaction augmente plus

vite que [S] aux faibles [S];

l’élasticité est alors >1.

Elle diminue lorsque

l’enzyme approche de la

saturation.

offreM

demandeM

Jdemande

Joffre

C

C

demandeoffre M

Pour que l’activité (la concentration) d’une enzyme contrôle le Flux, il faudrait que son élasticité soit la plus faible possible en valeur absolue:

• De préférence: réaction loin de l’équilibre, voire même irréversible; enzyme saturée

• De préférence PAS: enzyme réversible près de l’équilibre, ou enzyme coopérative!

Fonction des enzymes coopératives, allostériques dans le contrôle des voies métaboliques?

Les enzymes coopératives ont une grande élasticité, ce qui n’est pas idéal pour que leur concentration puisse contrôler le flux. (Si on augmente la [Enzyme coopérative], [S] va chuter, et la vitesse de la réaction à l’état stationnaire variera peu).

Conclusion: il est inutile d’augmenter la [ ] de ces enzymes pour augmenter le flux!

Voie comportant deux enzymes:

Quelles conditions faut-il remplir pour que la concentration des métabolites soit à peu

près constante? (homéostasie)

Dans quelles conditions la concentration du métabolite intermédiaire (M) restera-t-elle constante?

0 Mdemande

Moffre CC

1 demandeM

Mdemande

offreM

Moffre CC

Mdemande

Moffre CC (3)

(4)

1 demandeM

Moffre

offreM

Moffre CC

1 demandeM

offreM

MoffreC

demandeM

offreM

MdemandeC

1

demandeM

offreM

MoffreC

1

Coéfficient de co-réponse:

Mi

JiMJ

iC

CO , L’idéal: coéfficient de co-réponse le plus grand

possible (variation du flux, pas du métabolite)

demandeM

offreM

Mdemande

demandeM

offreM

offreMJ

demande

C

C

1

offreMM

demande

JdemandeMJ

demandeC

CO ,

Fonction des enzymes coopératives, allostériques: homéostasie!

Pour que le flux soit contrôlé par la demande (c’est-à-dire par les besoins de l’organisme), il faut que l’élasticité de l’offre vis-à-vis des métabolites intermédiaires soit la plus grande possible. D’où l’intérêt en début de voie d’enzymes coopératives et régulées allostériquement par le produit final de la voie!

Exemple d’enzyme coopérative : Aspartate transcarbamoylase bactérienne

0 20 400

0.5

1

[SUBSTRAT] (mM)

VIT

ES

SE

0 5 100

0.5

1

[SUBSTRAT] (mM)

VIT

ES

SE

ZOOM:

+ATP

+CTP

Controle +ATP

+CTP

Controle

Élasticité et contrôle du flux:

Si l’élasticité de l’offre est grande (réactions réversible, enzymes allostériques,…) la voie est contrôlée par la demande. Donc, pour augmenter le flux, il est inutile de surexprimer les premières enzymes de la voie (surtout pas les enzymes allostériques).

Il vaut mieux surexprimer les derniers enzymes d’une voie très contrôlée, pour augmenter la demande…

Augmentation de la synthèse du Trp?

Gène surexprimé <Augmentation>

de [E]

Augmentation

du flux, JTRP2 TRP4 TRP1 TRP3 TRP5

- - - - - 1 1.0

- - + + - 58 2.0

+ + - + - 35 2.4

µ - + + - 34 1.2

µ + + + - 30 2.1

+ + - + + 19 8.2

µ + + + + 23 8.8µ : surexpression d’un allèle muté, résistant à la rétroinhibition par le Trp

Niederberger et al., Biochem. J. 287:473-9, 1992

Ultrasensibilité:

• En pratique, l’élasticité d’enzymes coopératives est rarement supérieure à 2.0 comment parvenir à obtenir un coéfficient de covariance de 50 , 100 dans certaines conditions?

• Comment diminuer la sensibilité de la réponse à de très faibles signaux pour éviter les « faux départs »?

• Comment obtenir une réponse « tout ou rien » (apoptose, division cellulaire) à un stimulus?

Trends in Biochem. Sci. 21:460-466, 1996

« Ultrasensibilité »:

Zo

ne

tam

po

n

Réponse « tout ou rien »

RE

PO

NS

E

STIMULUS

• Enzyme coopérative• Phosphorylations multiples• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très

haute affinité mais en faible concentration)

• Cycle futile kinase - phosphatase: à certaines conditions seulement!– inhibition de la phosphatase et activation

simultanée de la kinase– “ultrasensibilité d’ordre zéro”

• Régulation par l’AMP

Comment l’obtenir?

Phoshorylations multiples?

• MAPK et MAPKK requièrent une double phosphorylation pour être activées:

2

• Enzyme coopérative• Phosphorylations multiples• Inhibiteur “stoechiométrique” (très haute affinité, faible concentration)• Cycle futile kinase – phosphatase (à certaines conditions seulement!)

– inhibition de la phosphatase et activation simultanée de la kinase

– “ultrasensibilité d’ordre zéro”



Ultrasensibilité due à un inhibiteur à très haute affinité:

En présence d’un inhibiteur à très haute affinité pour l’enzyme activée: il faut que la [Ea] dépasse la [Inhibiteur] avant de voir apparaître l’enzyme active…

• Exemples: cdk, P phosphatase I (glycogène synthase et phosphorylase), …



• Cycle futile kinase – phosphatase à certaines conditions seulement!





Imaginons 2 réactions irréversibles indépendantes et opposées:

• Phosphatase en concentration constante (pointillés): v ÷ [S-P]

• Kinase en concentration (ou activité) variable (traits pleins): v ÷ [S]

L’intersection des deux courbes donne le % (S-P) à l’état stationnaire…

« Ultrasensibilité d’ordre zéro »?

• Si deux enzymes concurrentes catalysant des réactions

irréversibles sont toutes les deux à très bas KM ou

associées à leur substrat (donc saturées) : l’intersection

des deux courbes lorsque l’activité de l’une d’elles est

augmentée donne une courbe sigmoïde, très raide…



• Cycle futile kinase – phosphatase à certaines conditions seulement!





Ultrasensibilité de la réponse à l’AMP:

ATP

ADPAMP

ADP

AMPATPK

AMPATPADP

eq

kinase adénylate

2

21

2

AMPK~PO4

AMPKK

AMPK

PP2C

AMP

AMP

AMP

Cibles ~PO4

Cibles

Amplification de la sensibilité:

Ultra- et sub-sensibilité de voies « bifurquées »

S

Non Régulée

Régulée

total

indind

v

v

total

dirdir

v

v

Si une des voies est saturée par S, sa vitesse est proportionnelle à [E] mais indépendante de celle de l’autre voie, qui ne peut utiliser que le substrat « résiduel »…

totalv

Exemple de bifurcation : synthèse cholestérol…

AcAcCo-A +AcCoA MévalonateHMG-CoA

IPPDMAPP

Géranyl PP

Farnésyl PP

Squalène

Cholestérol

« Statines »

Protéines géranylées, Protéines farnésylées,

Coenzyme Q, Dolichol PP,

Vitamine K,Chlorophyle,

Carotènoïdes,terpenes

etc.

Régulation Nécessité et mécanismes. Lorganisme se procure quelques composés, en synthétise la...

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