i

UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU---------------

UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE

(UFR/SVT)

Mémoire Présenté

Par : ILBOUDO Désiré

Pour l’obtention du Diplôme d'Etudes Approfondies en BiologieMoléculaire de l’Université de Ouagadougou

SUR LE THEME:

DIAGNOSTIC MOLECULAIRE PAR PCR EN TEMPS REEL

DU COMPLEXE MYCOBATERIUM TUBERCULOSIS

RESISTANT A L’ISONIAZIDE ET A LA RIFAMPICINE.

Soutenu le, 24 juin 2013 devant le jury composé de :

Président : Pr Martial OUEDRAOGO, Professeur Titulaire, Université de OuagadougouMembres : Pr. Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou.

Dr Virginio PIETRA, Chargé de Recherche, Université de Brescia, Italie

LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

(LABIOGENE)

N° d’Ordre .............................../LABIOGENE

ii

DEDICACE

A mes enfants Gaël Emilien et Astrid Olga

A mon épouse

A mes sœurs et mes frères:

A mon Père disparu

A tous mes amis et à ceux qui me sont chers

iii

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au laboratoire du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro

ANNIGONI (CERBA/LABIOGENE).

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au Professeur Jacques SIMPORE, Directeur de ce

mémoire, membre du jury et Directeur de plusieurs institutions : Laboratoire de Biologie

Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE de l’UFR/SVT) ; CERBA ; Laboratoire du

Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou et Recteur de l’Uni versité Saint Thomas

d’Aquin (US-TA). Merci pour ce thème de recherche pertinent que vous m’avez proposé,

merci pour le soutien financier de cette recherche, pour votre encadrement exceptionnel, vos

précieux conseils, vos encouragements et votre disponibi lité malgré vos multiples fonctions.

A notre Maître et président du Jury le Professeur Martial OUEDRAOGO : Vous nous faites un

grand honneur en acceptant, malgré vos multiples occupations de précider ce jury. Votre

compétence dans le domaine de la pathologie respiratoire fait de vous le juge idéal pour ce

travail. Soyez assuré, professeur, de notre profonde gratitude.

Au Professeur Jean-Baptiste NIKIEMA , aux Dr Charlemagne GNOULA et Dr Virginio

PIETRA pour la qualité de leur enseignement ;

Au Docteur Cyrille BISSEYE , pour l’encadrement technique au laboratoire et son aide

précieuse dans la réalisation de ce travail ;

Aux Docteurs Florencia DJIGMA, Djénéba OUERMI, Diane GHILAT, Linda Tani SAGNA,

Moctar ZEBA et à mesdames OUATTARA Madeleine et Zoenabo DOUAMBA pour leur

disponibilité, leurs conseils et leur contribution à la réalisation de ce travail ;

Au Père YONLI Albert Théophane pour sa disponibilité et pour son aide technique apportée

lors de nos manipulations dans la partie biologie molécu laire.

iv

A tous les enseignants-chercheurs du département de Biochimie/ Biologie Moléculaire

Appliquée/Substances Naturelles/ Plantes médicinales et Phytothérapie pour la qualité de la

formation reçue.

A la Conférence épiscopale italienne (CEI), pour le soutien financier dans la réalisation de nos

travaux de mémoire de DEA.

A l'Union Economique et Monétaire Ouest Africain (UEMOA) , pour son soutien financier qui

a permis la réalisation de nos travaux de mémoire de DEA.

Aux Docteurs Patrick Kaboré, Diandé Soub a et Grissoum Tarnagda pour leur soutien et leurs

précieux conseils.

A mes et collègues du centre médical Saint Camille et du CERBA qui ont tout mis en œuvre pour

la réalisation du présent travail. Je les remercie tous pour cette opportunité, cette atmosphère de

recherche conviviale, qu’ils ont créée.

Au personnel du CDT de l'Hôpital du District de Bogodogo, Monsieur Ouédraogo Frédéric et

Madame Ouédraogo Martine en particulier et mes collègues du laboratoire. Je leur dis merci.

v

TABLE DES MATIERES

LISTE DES ABREVIATIONS................................ ................................ ................................ ....... v

RESUME ................................ ................................ ................................ ................................ ....... vi

LISTE DES TABLEAUX................................ ................................ ................................ ........... viii

LISTE DES FIGURES ................................ ................................ ................................ ................. xii

INTRODUCTION ................................ ................................ ................................ .......................... 1

CHAPPITRE I : GENERALITES ................................ ................................ ................................ .. 4

I. GENERALITES SUR LES MYCOBACTERIES ................................ ................................ ...... 5

I.1 Définition et classification ................................ ................................ ................................ ................................ ......5

I.2 Caractéristiques de M. tuberculosis ................................ ................................ ................................ .....................9

I.3 Le génome de M. tuberculosis ................................ ................................ ................................ ............................. 10

II. EPIDÉMIOLOGIE DE LA TUBERCULOSE ................................ ................................ ........ 12

II.1 La tuberculose dans le monde ................................ ................................ ................................ ...........................12

II.2 La tuberculose au Burkina Faso ................................ ................................ ................................ .....................13

II.3 La tuberculose Maladie ................................ ................................ ................................ ................................ ......15II.3.1 Transmission et développement de la maladie ................................ ................................ .............................. 15II.3.2 L’Infection ................................ ................................ ................................ ................................ .....................15II.3.3 La primo-infection ................................ ................................ ................................ ................................ .........16II3.4 La tuberculose pulmonaire ................................ ................................ ................................ ............................. 16II.3.5 Tuberculose extra-pulmonaire ................................ ................................ ................................ .......................17

III. DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE ................................ ................................ .............. 17

III.1 Le diagnostic Bactériologique ................................ ................................ ................................ ..........................17III.1.1 Examen microscopique ................................ ................................ ................................ ................................ 17III.1.2 La culture ................................ ................................ ................................ ................................ .....................18III.1.3 Détermination de la sensibilité aux antibiotiques ................................ ................................ .........................19

III.2 Le test tuberculinique: princip es, indications et interprétation ................................ ................................ ....20

iii

III.3 Nouvelles techniques de diagnostic microbiologique ................................ ................................ .....................20III.3.1 Les tests immunologiques de détection d’antigènes ................................ ................................ .....................20III.3.2 Les techniques de biologie moléculaire ................................ ................................ ................................ ........21

III.4 La radiologie ................................ ................................ ................................ ................................ ......................22

IV. TRAITEMENT DE LA TUBERCULOSE ................................ ................................ ............ 22

IV.1 Schéma thérapeutique standard ................................ ................................ ................................ .....................22

IV.2 Observance du traitement ................................ ................................ ................................ ............................... 23

IV.3 La résistance aux antibiotiques antituberculeux : définitions et mécanismes généraux ............................. 23

IV.3.1 Résistance de M. tuberculosis aux antibiotiques antituberculeux ................................ ............................. 24IV.3.1.1 Résistance naturelle................................ ................................ ................................ ................................ ...24IV.3.1.2 Résistance primaire ................................ ................................ ................................ ................................ ..24IV.3.1.3 Résistance secondaire ou acquise................................ ................................ ................................ .............24IV.3.1.4 Sélection des mutants résistants ................................ ................................ ................................ ................25IV.3.1.5 Résistance multiple ................................ ................................ ................................ ................................ ...25

IV.3.2 Les antibiotiques antituberculeux : classification, mécani sme d’action et de résistance .........................25IV.3.2.1 Médicaments antituberculeux de « première ligne ................................ ................................ ....................26IV.3.2.2 Médicaments anti -tuberculeux de « seconde ligne » et alternatifs ................................ ............................31

CHAPITRE II: NOTRE ETUDE ................................ ................................ ................................ .. 34

I. MATERIELS ET METHODES ................................ ................................ ................................ 36

I.1 Cadre de l’étude ................................ ................................ ................................ ................................ ...................36

I.2 Les prélèvements ................................ ................................ ................................ ................................ ..................36

I.3 Examen microscopique ................................ ................................ ................................ ................................ ........37I.3.1 Technique de confection des frottis ................................ ................................ ................................ ................371.3.2 Fixation du frottis ................................ ................................ ................................ ................................ .........37I.3.3 Coloration par la technique de ZIEHL NEELSEN à chaud ................................ ................................ ............381.3.4 Lecture du frottis ................................ ................................ ................................ ................................ ............391.3.5 Expression des résultats ................................ ................................ ................................ ................................ ..40

I.4 Identification de Mycobacterium tuberculosis par PCR en temps réel ................................ ..........................41I.4.1 Extraction de l’ADN ................................ ................................ ................................ ................................ .......41I.4.2 Amplification ................................ ................................ ................................ ................................ ..................42I.4.3 Lectures et interprétation des résultats ................................ ................................ ................................ ...........43

I.5 Détection des gènes de résistances à la rifampicine et à l’is oniazide ................................ ............................... 43

1.5.1 Protocole ................................ ................................ ................................ ................................ ............................46

iv

I.5.3 Analyse des résultats de la PCR ................................ ................................ ................................ .....................48

II.RESULTATS ................................ ................................ ................................ ............................ 48

II.1 Population d’étude ................................ ................................ ................................ ................................ ..............48

II.2 Répartition des patients selon le traitement ................................ ................................ ................................ .....50

II.3 Diagnostic de MTB par microscopie et PCR en Temps réel ................................ ................................ ...........51

II.4 Performance de la microscopie par rapport à la PCR en temps réel ................................ ...........................51

II.5 Résistance aux antituberculeux. ................................ ................................ ................................ ........................52II.5.1 Fréquence des mutations ................................ ................................ ................................ ................................ 52

II.5.1.1 Mutations qui confèrent une résistance à la rifampicin e ................................ ................................ ........52II.5.1.2 Mutations qui confèrent une résistance à l’isoniazide ................................ ................................ ............53

II.5.2 Multi Drug Résistance(MDR) ................................ ................................ ................................ .......................54

III.DISCUSSION ................................ ................................ ................................ .......................... 55

III.1 Comparaison Microscopie et PCR pour le diagnostic de MTB ................................ ................................ ....55

III.2 Mutation gène rpoB ................................ ................................ ................................ ................................ ..........55

III.3 Mutation des gènes inhA et Kat G................................ ................................ ................................ ...................56

III.4 Multi Drug Résistance (MDR) ................................ ................................ ................................ .........................57

IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................ ................................ ................... 58

v

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN : Acide désoxyribonucléique

ARN : Acide ribonucléique

BAAR : Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants

BK : Bacille de Koch

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice

ETH : Ethionamide

INH : Isoniazide

katG: Catalase-Peroxidase Gene

MDR : Multidrug Resistance

MR: Multi resistant

MTB : Mycobacterium tuberculosis

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

PAS : l’acide para-aminosalycilique

PCR : Polymerase Chain Reaction

PNT : Programme National Tuberculose

PZA : Pyrazinamide

RIF : Rifampicine

rpoB: RNA polymerase B subunit

TB : Tuberculose

TB MDR : Tuberculose Multi Drug Resistant

TB-MR : Tuberculoses à bacilles multi résistants

TB-UR : Tuberculoses à bacilles Ultra résistants

TPM- : Tuberculose à Microscopie Négative

TPM+: Tuberculose à Microscopie Positive

VIH: Virus de l’immunodéficience humaine

vi

RESUMEL’augmentation des cas de tuberculoses pharmaco -résistantes est un phénomène réel et une

préoccupation dans de nombreux pays. Selon des données de l’OMS, en 2011 environ 12 millions de

cas de tuberculoses ont été recensés dans le monde dont plus de 630 000 cas de « Tuberculose Multi

Drug Resistant » (TB-MDR) (OMS, 2012). Au Burkina Faso l’ampleur du problème de pharmaco

résistance aux antituberculeux n’est pas très bien connu, alors que la prise en charge des TB-MDR

est une urgence médicale.

Le présent travail a consisté au diagnostic biologique du complexe Mycobacterium tuberculosis

résistant à la rifampicine et à l’isoniazide par PCR en temps réel. Dans notre approche il s’est agi

d’une identification du complexe Mycobacterium tuberculosis par microscopie et par PCR en temps

réel puis la détection et l’étude des mutations spécifiques des gènes rpoB, katG et les gènes inhA

associées respectivement à la résistance à la rifampicine ou à l'isoniazide.

Notre étude a porté sur 74 échantillons comprenant 67 prélèvements de crachat et 7 souches de

culture du complexe MTB. Sur 59 échantillons soumis au dépistage, 35 (59,3%) étaient positifs à la

microscopie contre 26 (44,1%) à la PCR en temps réel. La sensibilité et la spécificité de la

microscopie par rapport à la PCR en temps réel étaient respectivement de 68% et de 91%.

Les mutations du gène rpoB conférant une résistance à la rifampicine ont été retrouvées dans 7

échantillons sur 9 soit 77,8%. Les mutations ont concerné les codons 516, 531 et 533. La mutation la

plus fréquente a été le codon 531 (33 ,3%). Les mutations du gène inhA conférant une résistance à

l’isoniazide étaient de 88,9%. Les mutations du gène katG conférant une résistance à l’isoniazide

ont été présentes dans 33,3% des échantillons. Le codon 315 était le seul codon incriminé. Des

mutations à la fois du gène rpoB et inhA ou katG conférant une multi Drug résistance (MDR) ont

été détectés dans 7 échantillons.

Dans notre étude les mutations des gènes rpoB (codons 516, 531 et 533), katG (codon 315) et de

l’INH (codon C209T) associées à une résistance à la rifampicine et à l’isoniazide ont été observées.

La résistance à la rifampicine était due aux mutations : (Asp516Val, Ser531Trp, Leu533Pro) et celle

à l’isoniazide par les substitutions Ser315Thr du gène katG et C209T du gène inhA.

Conclusion : La PCR en temps réel qui permet l’identification des allèles mutants rpoB, katG et inhA

de M. tuberculosis est un outil de diagnostic épidémiologique de grande importance car elle permet

de déterminer le niveau de résistance à la rifampicine et à l’isoniazide.

Mots clés: Mycobacterium tuberculosis, résistance, rifampicine, isoniazide, rpoB, inhA, katG

vii

Summary

The increase in cases of drug-resistant tuberculosis is a real phenomenon and concern many

countries. According to WHO, in 2011 about 12 million cases of tuberculosis have been

identified worldwide, including more than 630 000 cases of Multi Drug Resistant Tub erculosis

(MDR-TB) (WHO, 2012). In Burkina Faso the magnitude of the problem of drug resistance to

TB is not well known, while the management of MDR -TB is a medical emergency.

This work consisted in biological diagnosis of Mycobacterium tuberculosis resis tant to

rifampicin and isoniazid by real -time PCR. Our approach is an identification of Mycobacterium

tuberculosis complex by microscopy and real -time PCR and the detection and study of specific

mutations in genes rpoB, katG and inhA genes respectively ass ociated with resistance to

rifampicin or isoniazid. Our study included 74 samples including 67 samples of sputum and 7

strains of MTB culture. Of 59 samples screened 35 (59.3%) were positive to microscopy against

26 (44.1%) to the real-time PCR. The sensitivity and specificity of microscopy compared to the

real-time PCR was respectively 68% and 91%. Mutations in the rpoB gene conferring resistance

to rifampicin were found in 7 (77, 8%) of 9 samples. The mutations concerned the codons 516,

531 and 533.The most frequent mutation was codon 531 (33.3%). Mutations in the inhA gene

conferring resistance to isoniazid were 88.9%. Mutations in the katG gene conferring resistance

to isoniazid are present in 33.3% of samples. Codon 315 was the only offending codon.

Mutations in both the rpoB and katG or inhA gene conferring multi Drug resistance (MDR) were

detected in seven samples.

In our study, mutations in the genes rpoB (codons 516, 531 and 533), katG (codon 315) and INH

(codon C209T) associated with resistance to rifampin and isoniazid was observed. The

rifampicin resistance was due to mutations (Asp516Val, Ser531Trp, Leu533Pro) and the

isoniazid by Ser315Thr substitutions of katG gene and C209T of inhA gene.

Conclusion: The real-time PCR for the identification of mutant allele’s rpoB, katG and inhA of

M. tuberculosis is a great important tool for epidemiological diagnosis because it determines the

level of resistance to rifampicin and isoniazid.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis , resistance, rifampicin, isoniazid, rpoB, inhA, katG

viii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Estimation du nombre de cas de tuberculose pris en charge par le PNT dans le cadre

du projet Fonds Mondial ................................ ................................ ................................ ............... 14

Tableau 2: Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis ............................... 33

Tableau 3: Expression des résultats de recherche de BAAR ................................ ........................ 40

Tableau 4: Programme de la PCR MTB -MULTI (Identification du complexe MTB) ................ 47

Tableau 5: Programme de la PCR pour la détection des mutations du gène rpoB ..................... 47

Tableau 6: Programme de la PCR de détection des mutations des gènes katG et inhA ............... 47

Tableau 7: Caractéristiques de notre population d'étude ................................ .............................. 49

Tableau 8: Diagnostic de MTB par microscopie et par PCR en temps réel chez les patients

dépistés................................ ................................ ................................ ................................ .......... 51

Tableau 9: Performance des tests de microscopie des BAAR comparativement à la PCR .......... 52

Tableau 10: Mutations du gène rpoB ................................ ................................ ............................ 52

Tableau 11: Mutations du gène inhA et katG ................................ ................................ ............... 53

xii

LISTE DES FIGURES

Figure 1:Scénario évolutif de M. tuberculosis ................................ ................................ ................ 8

Figure 2: Image de M. tuberculosis par microscopie électronique à balayage (21228x)

(http://phil.cdc.gov/phil/details.asp ................................ ................................ ................................ . 9

Figure 3 : Représentation du génome de M. tuberculosis H37Rv ................................ ................ 11

Figure 4: Estimation de l’incidence de la tuberculose en 2011 ................................ .................... 13

Figure 5: Evolution du taux d’échec au traitement des nouveaux cas de TPM+de 2000 à 2006 . 15

Figure 6: structure de l’isoniazide (INH) (www.chembiofinder.com) ................................ ......... 26

Figure 7: Résumé des mutations identifiées dans le gène katG d’isolats de M. tuberculosis

résistants à l’INH (Ramaswamy & Musser, 1998) ................................ ................................ ....... 28

Figure 8: Résumé des mutations identifiées dans le gène inhA et sa région promotrice, chez les

isolats de M. tuberculosis résistants à l’INH (et ETH) (Ramaswamy & Musser, 1998) .............. 28

Figure 9: Structure de la rifampicine (www.chthera.fr) ................................ .............................. 29

Figure 10: Résumé des mutations identifiées dans le gène rpoB d’isolats de M. tuberculosis

résistants à RIF (Ramaswamy & Musser, 1998) ................................ ................................ .......... 30

Figure 11: Observation au microscope d’une lame colorée au Zielh Neelsen ............................. 40

Figure 12: Schéma montrant la procédure de détection des mutations ................................ ........ 44

Figure 13: Schéma montrant les étapes de la PCR de détection des résistances ........................ 46

Figure 14: courbe d’amplifications montrant la séquence de gène muté. ................................ ..... 48

Figure 15: Répartition des patients selon le traitement reçu. ................................ ........................ 50

1

INTRODUCTION

L’augmentation des cas de tuberculoses pharmaco -résistantes est un phénomène réel, inquiétant

et une préoccupation dans de nombreux pays. Selon des données de l’OMS, en 2011 environ 12

millions de cas de tuberculoses ont été recensés dans le monde dont plus de 630 000 cas de

Tuberculose Multi Drug Resistant (TB -MDR) (OMS, 2012) c'est-à-dire des cas de tuberculose

où les bacilles résistent au moins à l’isoniazide et à la rifampicine , les deux principaux

médicaments antituberculeux majeur . Au niveau mondial, le taux de succès des traitements des

nouveaux cas de tuberculoses pulmonaires à frottis positif était de 87 % en 2009 et de 76% au

Burkina Faso à la même période (OMS, 2011 ; Ministère de la santé Burkina Faso, 2010 ).

Dans la région Afrique de l’OMS, la tuberculose reste l'une des principales maladies qui

constituent un probleme de santé publique avec 601 149 cas à frottis positifs en 2010(OMS,

2011). En 1997 en Côte d’Ivoire au total 192 cas de tuberculose à microscopie positive ont été

enregistrés au CHU de Treichville dont 8 ont été confirmés résistants à la rifampicine et à

l’isoniazide (Ouedraogo M ., et coll.). De même au Mali en 2010, le taux de TB MDR avait

atteint 35,7% de cas sur 126 cas suspects (Traore B. et al. 2012).

Au Burkina Faso l’ampleur du problème de pharmaco résistance aux antituberculeux n’est pas

bien connue. Les cas notifiés sont issus des études de cohorte dans les principaux services de

pneumologie du pays. Dans une étude portant sur la détection moléculaire de la résistance à la

rifampicine et à l’Isoniazide, sur les 108 cas chroniques de tuberculose enregistrés, 24 ont été

confirmés résistants à la rifampicine et à l’isoniazide (Saleri N. et Coll 2009).

Dans la même période entre janvier 2006 et Mars 2009, au total 156 cas de tuberculose

chronique ont été enregistrés au Burkina Faso et 50 cas de Mycobacterium tuberculosis ont été

identifiés par culture. Sur ces 50 mycobactéries isolés, 34 (68%) ont été confirmés MDR et

deux cas de tuberculose ultra résistant (XDR) c'est-à-dire des tuberculoses résistants à d’autres

antituberculeux en plus de la rifampicine et l’isoniazid e (Saleri N. et Coll 2010).

2

Enfin dans une étude récente, les résistances aux antituberculeux chez les nouveaux cas de

tuberculose pulmonaire ou traités antérieurement au Burkina F aso étaient très élevées pour

l’isoniazide (66,7%), rifampicine (51,6%) ainsi que le taux de TB -MDR qui a atteint (50,5%)

des cas. Cependant, cette étude n’a concerné que les cas de tuberculoses à microscopie positive

sous traitement et sur lesquels un test de sensibilité a ux antituberculeux selon la méthode des

proportions a été réalisé (Sangaré et al., 2010).

Ainsi en pratique au Burkina Faso l’étude des résistances n’est faite qu’après la mise sous

traitement ; ceci après que le patient ait subi un échec thérapeutique. Donc le diagnostic pré-

thérapeutique de la multirésitance n’est pas encore une réalité

Le diagnostic des TB-MDR est apporté par la mise en évidence des mycobactéries, par culture

suivie de l’antibiogramme, ou par la détection de la présence d’ADN ou d’A RN mycobactérien

muté conférant une résistance à un antibiotique donné (techniques d’amplification). La

détermination rapide de la présence du génome bactérien par PCR ( polymerase chain reaction)

constitue un progrès récent dans le diagnostic de la tuberculose. Dans les cas graves, où

l’établissement rapide d’un diagnostic et la mise immédiate sous traitement antituberculeux sont

impératifs, elle permet de gagner du temps en révélant la présence d’antigènes mycobactériens

alors que l’examen microscopique direct est négatif et que la preuve de la présence de

mycobactéries viables sera apportée deux à huit semaines plus tard par culture (Brändli et al.

2003).

Au Burkina Faso, les tests de résistan ce aux antituberculeux ne sont pas réalisés

systématiquement. Après un dépistage microscopique, les patients suspects d’avoir une

tuberculose sont d’abord traités suivant un schéma standard de l’OMS qui préconise des

thérapies de 3 à 4 antibiotiques (Rifa mpicine, Isoniazide, Pyrazynamide et Ethambutol) pendant

deux mois, suivi de la prise de Rifampicine et Isoniazide pendant 4 mois (PNT Burkina Faso,

2008). C’est après échec du traitement que la recherche de résistance est faite par culture. Pour le

diagnostic rapide des TB-MDR par PCR, les échantillons sont d’abord collectés dans les

différentes régions du Burkina et acheminés au Programme National Tuberculose (PNT).

Lorsque le nombre est suffisant pour lancer une PCR, les crachats sont envoyés en Europe p our

analyse avec pour conséquence une longue durée d’attente pour les résultats et un coût

relativement plus élevé. Alors que la prise en charge des TB -MDR est une urgence médicale.

3

Cette situation peut compromettre les chances de survie des patients mai s aussi le contrôle de

l’infection tuberculeuse.

C’est dans le but de proposer une méthode d’analyse, fiable et rapide pour le diagnostic des

résistances de Mycobacterium tuberculosis (MTB) que nous avons entrepris d’identifier les

résistances du complexe Mycobacterium tuberculosis et de détecter les mutations des gènes

associées à une résistance à l'Isoniazide ou à la Rifampicine par PCR en temps réel.

4

CHAPPITRE I : GENERALITES

5

I. GENERALITES SUR LES MYCOBACTERIES

I.1 Définition et classification

Les mycobactéries appartiennent au genre Mycobacterium, de la famille des Mycobacteriaceae,

de l’ordre des Actinomycétales et de la classe des Actinobactéries (Shinnick, 1994).

Parmi les mycobactéries, il faut distinguer les bacilles causant la tuberculose comme:

Mycobacterium tuberculosis ou Bacille de Koch(B.K) : responsable de la tuberculose

humaine.

Mycobacterium africanum : agent responsable, le plus souvent, de la tuberculose en

Afrique de l’ouest (Bonard et al, 2000).

Mycobacterium bovis : agent responsable de la tuberculose chez les bovins et parfois chez

l’homme (O'Reilly et al, 1995).

Mycobacterium microti , caprae et pinnipedii : agents responsables de la tuberculose chez

les rongeurs, les chèvres et les mammifè res marins (Prodinger et al, 2002).

Mycobacterium canetti : agent responsable de tuberculose humaine (en particulier à

Djibouti) (van Soolingen et al, 1997 ; Koeck et al, 2005).

Toutes ces mycobactéries, capables de causer la tuberculose, sont regroupées sous la

dénomination de mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis.

Les autres mycobactéries appelées mycobactéries atypiques ou non -tuberculeuses sont

omniprésentes dans l’environnement et peuvent dans certaines circonstances

(immunodépression, lésion, maladie préexistante,…) devenir pathogènes pour l’homme :

Mycobacterium avium-intracellulare : agent responsable de maladies respiratoires.

Mycobacterium ulcerans : agent responsable de l’ulcère de Buruli (nécroses chroniques

de la peau et des tissus mous).

6

Mycobacterium marinum : agent responsable d’infections cutanées torpides (maladie des

aquariums).

Mycobacterium abscessus : agent responsable d’infections cutanées et pulmonaires

(notamment chez les patients mucoviscidosiques) (Jonsson et al, 2007).

Mycobacterium tuberculosis , l’agent responsable de la tuberculose, est un pathogène mortel

infectant un tiers de la population mondiale. Au sein du genre Mycobacterium, ces pathogènes

opportunistes obligatoires sont très liés et part agent des facteurs déterminant de virulence en

commun. Les mutations, plus que les transferts horizontaux de gène, ont conduit l’évolution

récente de Mycobacterium tuberculosis et son adaptation à l’hôte humain.

Le genre Mycobacterium est le seul représentant de la famille des Mycobacteriaceae de l’ordre

des Actinomycetales. Il comprend des bactéries dont le génome a une teneur élevée en Guanine

et en cytosine (55 à 70 %) et la paroi contient des acides mycoliques, absents du règne ba ctérien

à l’exception de quelques genres voisins ( Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus,

Tsukamurella, Dietzia et Gordonia). Depuis l’avènement des techniques d’identification

moléculaire, le genre Mycobacterium a connu une très grande évolution et comprend à ce jour,

97 espèces différentes (Tortoli, 2003).

Groupes génétiques des souches de M. tuberculosis

Des substitutions nucléotidiques se produisent au sein du génome des bactéries. Il s’agit de

mutations ponctuelles, plus communément appelées SNP pour « Single Nucleotide

Polymorphism ». Il existe deux catégories de substitutions nucléotidiques :

- les SNP synonymes (silencieux)

- les SNP non-synonymes (non silencieux)

Exemples : SNP non-synonyme : mutation nucléotidique d’une cytosine « C » en

thymine « T » provoquant la modification du codon et de l’acide aminé qu’il encode.

TCG TTG Sérine Leucine

SNP synonyme : mutation nucléotidique d’une guanine « G » en adénine « A » provoquant la

modification du codon mais pas de l’acide aminé qu’il encode.

7

TCG TCA Sérine Sérine

Les SNP non-synonymes résultent en des changements d’acides aminés pouvant provoquer un

changement de phénotype et entrai ner de ce fait une sélection évolutionnaire. C’est ce

type de modification génétique que l’on retrouve fréquemment chez M. tuberculosis au

niveau des gènes impliqués dans la résistance aux antibiotiques, conférant les phénoty pes

résistants. A l’opposé, les SNP synonymes n’altèrent pas la séquence d’acides aminés des

protéines. Ces mutations sont donc considérées comme fonctionnellement neutres. Elles sont,

cependant, les marques de l’évolution et, de ce fait, fourni ssent une base pour des études

génétiques de relation évolutionnaire (phylogénétique) entre souches.

La comparaison des génomes séquencés de différentes souches de M. tuberculosis a permi de

mettre en évidence une diversité génomique intraspécifi que très réduite et notamment un taux de

variation nucléotidique (SNP) extrêmement faible par rapport aux autres bactéries

pathogènes. Plusieurs études indépendantes ont montré une homologie de séquence >99,9%

(Garnier et al., 2003). Deux hypoth èses peuvent être évoquées pour expliquer ce manque de

diversité nucléotidique chez M. tuberculosis : soit la bactérie possède une fidélité de

réplication inhabituelle ou un système de réparation des erreurs d’incorporation très efficace,

soit son origine est d’évolution récente. Etant donné que la fréquence de mutations

spontanées chez M. tuberculosis se situe dans la gamme enregistrée pour les autres bactéries, la

première hypothèse peut être écartée (David, 1970).

Groupes génétiques principaux

Streevatsan utilisa deux SNP non -synonymes mais fonctionnellement neutres pour établir

3 grands groupes génétiques appelé PGG1, PGG2 et PGG3 (PGG pour « Principal

Genetic Group ») (Sreevatsan et al., 1997a). Les deux SNP utilisés concernent : le codon

463 (Leu463Arg) du gène katG encodant la catalase -peroxydase KatG et le codon 95 (Thr95Ser)

du gène gyrA encodant GyrA, la sous -unité A de la gyrase. Ces 2 SNP ne sont pas impliqués

dans la résistance aux antibiotiques. Tous les isolats de M. Tuberculosis peuvent être

classés dans ces 3 groupes génétiques. Selon les études, il semble que les organismes du PGG1

sont ancestraux à ceux du PGG2 et que ceux du PGG2 sont eux -mêmes ancestraux à ceux du

8

PGG3 (Gutacker et al., 2002). On remarque aussi que les organismes du PGG1 sont liés à M.

bovis, l’agent causal de la tuberculose bovine, ainsi qu’à M. microti, M. africanum.

Plus récemment, une nouvelle étude portant sur un SNP synonyme au niveau du codon 203

du gène katG permit de subdiviser le PGG1 en deux groupes distincts (Frothingham et

al., 1999).

L’analyse par séquençage de 26 gènes structurels a montr é une faible proportion de substitutions

nucléotidiques synonymes dans le complexe d’espèce de M. tuberculosis comparé aux autres

bactéries pathogènes. En accord avec les précédentes études éléctrophorétiques, cette faible

proportion de mutation neutre dan s les gènes structurels indique que M. tuberculosis est issu

d’une évolution récente avec une expansion clonale globale ( Streevatsan et al, 1997). La figure

1 montre la structure génétique de Mycobacterium prototuberculosis et l’origine de M.

tuberculosis.

Figure 1:Scénario évolutif de M. tuberculosis

9

D’après Streevastsan et al, 1997

Le précurseur du complexe de M. tuberculosis est caractérisé par le codon 463 katG et le codon

95 de gyrA. Ces deux sites utilisés comme marqueurs génétiques permettent d’identifier trois

groupes de M. tuberculosis.

I.2 Caractéristiques de M. tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis se présente sous la forme d’un fin bâtonnet, de 1 - 10 μm de long et

0, 2 - 0,6 μm de large. La figure 2 illustre cette pr ésentation.

Figure 2: Image de M. tuberculosis par microscopie électronique à balayage (21228x)(http://phil.cdc.gov/phil/details.asp

Les bacilles tuberculeux sont rectilignes ou légèrement incurvés, aérobies ou microaérophiles,

non sporulants et dépourvus de capsule. La croissance de M. tuberculosis est particulièrement

lente avec un temps de doublement de 12 à 24h (Harshey et al, 1977).

Une des caractéristiques majeures des mycobactéries est la richesse de leur paroi en lipides

(60%) et, en particulier, en acides mycoliques (acides gras à longue chaîne). Cette teneur élevée

en lipide les rend imperméables aux colorants basiques. La coloration de Gram est donc

difficilement réalisable.

10

Pour obtenir une visualisation des mycobactéries au microscope, il est nécessaire de réaliser la

coloration de Ziehl-Neelsen dont le principe repose sur l’acidoalc oolo- résistance de la

mycobactérie, c’est-à-dire sa capacité de résister à la décoloration par les acides et alcools après

une coloration à base d’arylméthane, telle que la fuchsine de Ziehl (Gangadharam et al, 1981).

I.3 Le génome de M. tuberculosis

Le génome de M. tuberculosis souche de référence H37Rv a été séquencé et annoté. Le

séquençage du génome montre que le chromosome de M. tuberculosis est circulaire et contient

4411529 paires de bases avec un pourcentage en guanine et cytosine d’environ 65,6% et 3924

gènes codant des protéines (Cole et al, 1998).

L’analyse du génome de M. tuberculosis a également permis d’identifier plusieurs nouvelles

familles de gènes précédemment inconnues :

- Les gènes codant les protéines proline-glutamate (PE) et proline-proline-glutamate (PPE)

qui occupent presque 10 % du génome.

- Les 14 gènes esx codant pour les protéines de la famille ESAT -6(antigènes protéiques

fortement reconnus par les lymphocytes T) présents dans 11 régions différentes. Les

protéines ESAT-6 seraient impliquées dans le pouvoir pathogène de M. tuberculosis

(Cole et al, 1998 ; Tekaia et al, 1999).

M. tuberculosis, l’agent de la tuberculose humaine, partage plus de 99,9 % d’identité de son

ADN avec les autres membres du complexe de bacilles tuberculeux. (Pym et al, 2002) Montrer

les différences

11

Le cercle extérieur indique l'échelle de Mb, 0 représentant l'origine de réplication. Le premier

anneau de l'extérieur indique les positions des gènes de l'ARN stables (le s ARNt sont bleus, et

les autres sont de couleur rose) et la région de répétition directe (cube rose); les entrailles du

second anneau montrent la séquence codante par brin (sens horaire, vert foncé; antihoraire, vert

clair), le troisième anneau représente l'ADN répétitif (séquences d'insertion, orange, famille REP

13E12, rose foncé; prophage, bleu), le quatrième anneau montre les positions des membres de la

famille PPE (vert), le cinquième anneau montre la famille PE les membres (violet, à l'excl usion

PGRS), et le sixième cycle montre les positions de l' PGRSsequences (rouge foncé).

L'histogramme (au centre) représente G + C, avec <65% G + C en jaune, et> 65% G + C en

rouge. Elle a été produite avec le logiciel de DNASTAR.

Figure 3 : Représentation du génome de M. tuberculosis H37Rv

D’après Cole et al, (1998)

12

II. EPIDÉMIOLOGIE DE LA TUBERCULOSE

II.1 La tuberculose dans le monde

La tuberculose est l’une des maladies la plus meurtrière au monde ; elle se situe en seconde

position juste après le VIH/SIDA. (OMS, 2011).

En 2011, on estimait à 8,7 millions le nombre de nouveaux cas de tuberculose avec 13% co-

infectés par le VIH et 1,4 millions de décès (OMS, 2012). La figure 4 montre l’estimation des

nouveau cas de tuberculose pour 100 000 habitants en 2011.

Environ 3,7% des nouveaux cas de tuberculose dans le monde sont dus à des souch es

multirésistantes. La proportion est bien plus grande chez les patients déjà traités et atteint 20%

environ. La fréquence de la TB-MR varie sensiblement d’un pays à l’autre. Quelque 9% des cas

de TB-MR sont aussi résistants à deux autres classes de médic aments. On parle alors de

tuberculose ultrarésistante (TB-UR). En mars 2013, 84 pays avaient signalé au moins un cas de

TB-UR. L’OMS estimait à 0,5 million environ le nombre de cas de TB -MR dans le monde en

2011. Environ 60% des cas sont concentrés en Afr ique du Sud, au Brésil, en Chine, en

Fédération de Russie et en Inde. Le nombre de cas de TB -MR détectés et diagnostiqués

augmente grâce aux tests de diagnostic rapide mis en place en 2012(OMS , 2013).

13

Figure 4: Estimation de l’incidence de la tuberculose en 2011

II.2 La tuberculose au Burkina Faso

La tuberculose demeure un problème de santé publique au Burkina Faso. En 2007, l’incidence de

la tuberculose pulmonaire à microscopie positive était de 19,4 pour 100.000 habitan ts et celle de

toutes les autres formes de tuberculose était de 27,4 pour 100.000 habitants (Ministère de la santé

Burkina Faso ,2008).

En 2009, 3 061 nouveaux cas de tuberculose à microscopie positive (TPM+) ont été

diagnostiqués et mis sous traitement soit un taux d’incidence notifiée de 20,1 nouveaux cas de

TPM+ (NCTPM+) pour 100 000 habitants.

14

En ce qui concerne la co-infection tuberculose/VIH, la proportion de malades tuberculeux

infectés par le VIH est passée de 22,8% en 2008 à 20,4% en 2009 (Ministère de la santé Burkina

Faso, 2010).

Aussi, une augmentation régulière du taux de succès au traitement des nouveaux cas TPM+ a été

notée depuis 2000 (60,3% en 2000, 67,2% en 2004, 72,8% en 2006 et à 76,2% en 2008. Il faut

signaler que ces résultats, bien qu’encourageants, restent encore en deçà de la norme de 85%

recommandée par l’OMS (Ministère de la santé Burkina Faso, 2010).

En 2011 Au Burkina faso on estime à 1,8% le nombre de nouveaux cas de TB -MR et 19% de

TB-MR déjà traités parmi les 5543 cas de tuberculose déclarés. Seulement 68 cas ont pu être

testés au laboratoire et 42 cas ont pu être confirmés.

Tableau 1: Estimation du nombre de cas de tuberculose pris en charge par le PNT dans lecadre du projet Fonds Mondial

Année Nouveaux cas TPM+ Tuberculose toutes

formes confondues

Taux de détection

des cas TPM+

2005 2656 4087 25%

2006 3811 5862 35%

2007 5132 7895 46%

2008 6516 10024 57%

2009 8200 12615 70%

Au Burkina Faso, le taux d’échec au traitement des nouveaux cas TPM+ s’est accru de 2,5% en

2000 à 8,3% en 2006. Ce qui constitue le défi majeur auquel le PNT doit faire face (Ministère de

la santé Burkina Faso, 2008). Plusieurs raisons peuvent expliquer cette augmentation du taux

d’échec thérapeutique : la mauvaise observance du traitement ; les nouvelles infections par des

bacilles déjà résistants mais surtout par le manque de diagno stic précoce des résistances avant la

mise sous traitement.

15

II.3 La tuberculose Maladie

II.3.1 Transmission et développement de la maladie

La tuberculose est transmise par voie aérogène, c’est -à-dire d’une personne atteinte de

tuberculose pulmonaire à une autre personne non infectée. L’infection se transmet à travers un

aérosol de très petites gouttelettes de sécrétions bronchiques, qui sont dispersées dans l’air lors

de quintes de toux et inhalées par la personne saine en contact.

Le risque augmente nettement pour les personnes en contact fréquent avec d’autres personnes

atteintes de tuberculose non encore diagnostiquée ni traitée, les profe ssionnels de la santé, ainsi

que pour le personnel et les travailleurs sociaux des institutions de transit et d’accueil des

immigrants sont aussi concernés (Rouillon, 1976)

II.3.2 L’Infection

Chez certains sujets exposés, les mycobactéries inhalées dans les voies respiratoires survivent et

interagissent avec le système de défense immunitaire. La réaction a lieu à l’intérieur des

macrophages alvéolaires qui ont phagocyté les mycobactéries, et se caractérise par la libération

de cytokines, le recrutement de cellules T et la formation progressive de granulomes. La

signature de la réaction immunitaire est la sensibilisation des lymphocytes T qui seront capables,

Figure 5: Evolution du taux d’échec au traitement des nouveaux cas de TPM+de2000 à 2006

16

quelques semaines après l’infection, de reconnaître les peptides antigéniques de M. tuberculosis

et de réagir par une libération d’interféron gamma et de cytokines et le recrutement de cellules

inflammatoires en cas de nouveau contact naturel ou artificiel (Maes et al, 1999 ; Zellweger,

1997). Cette réaction est à la base du test tuberculinique et des t ests sanguins de dépistage de

l’infection tuberculeuse latente (Rieder, 1997).

La majorité des sujets contaminés ne développent pas la tuberculose dans les suites immédiates

de l’infection et peuvent ne pas présenter de signe clinique de la maladie pendan t des mois voire

des années. Une fois passée la phase initiale, les micro -organismes entrent dans une phase

prolongée de latence, caractérisée par un ralentissement de leur métabolisme. L’infection

tuberculeuse est limitée aux granulomes formés lors de la primo-infection et peut être détectée

seulement par une conversion tuberculinique ou par la présence de lymphocytes sensibilisés à

l’égard des peptides antigéniques spécifiques de M. tuberculosis (Algood et al, 2005).

II.3.3 La primo-infection

La tuberculose primaire est en général asymptomatique, mais peut se manifester par un état

fébrile, une perte pondérale et une baisse de l’état général, parfois aussi d’adénopathies hilaires

unilatérales, d’un infiltrat parenchymateux et/ou d’un épanchement pleural . La tuberculose

primaire peut s’accompagner d’un érythème noueux, sous forme de nodules rouges et

douloureux sur la face antérieure des jambes. De telles manifestations s’observent plus souvent

chez les enfants en bas âge ou les personnes immunodéprimées (Brandli, 1998)

II3.4 La tuberculose pulmonaire

La tuberculose de réactivation est habituellement caractérisée par une toux lentement progressive

sur des semaines ou des mois. Cette toux échappe facilement à l’attention si le malade est

tabagique (Brandli, 1998 ; Janssens et al, 1999)

Dans les cas d’atteinte pulmonaire, l’examen physique apporte peu d’indices. La fièvre est

présente chez deux tiers environ des malades. Les anomalies biologiques, par exemple une

accélération de la vitesse de sédimentation ou une augmentation du taux de l a protéine

17

C-réactive, une leucocytose minime, une lymphopénie ou une anémie peuvent s’observer mais

ne peuvent pas être utilisé pour établir le diagnostic. Le médecin doit penser à la possibilité

d’une tuberculose chez les malades qui accusent des symptô mes suspects (toux persistante

depuis plusieurs semaines, amaigrissement, sudations nocturnes) (Cohen et al, 1996 ; Tattevin et

al, 1999).

II.3.5 Tuberculose extra-pulmonaire

Elle est souvent asymptomatique sur le plan général. Le diagnostic est diffici le et repose sur des

arguments, clinique, biologique, radiologique, histologique et parfois bactériologique. La

certitude diagnostique de ces localisations est souvent difficile à obtenir. Les manifestations

extra pulmonaires les plus connues sont les lymphadénites tuberculeuses, la tuberculose pleurale,

la tuberculose uro-urinaire, osseuse, méningée et la tuberculose miliaire qui résulte d’une

dissémination hématogène diffuse des mycobactéries en un ou plusieurs points de l’organisme et

surtout aux poumons d’éléments nodulaires de petite taille d'origine tuberculeuse.

(Sharma et al, 2005).

III. DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE

Le diagnostic de la tuberculose repose sur la mise en évidence des mycobactéries. La mise en

évidence peut être directe, par examen microscopique et culture ou indirecte, par la détection de

la présence d’ADN ou d’ARN mycobactérien (techniques d’amplification). L’examen

radiologique et les symptômes cliniques fournissent des indices m ais ne constituent pas une

preuve formelle de la tuberculose (Zellweger, 2002).

III.1 Le diagnostic Bactériologique

III.1.1 Examen microscopique

Pour mettre en évidence les mycobactéries, on utilise leur propriété d’acido alcoolo -résistance.

Deux méthodes de coloration sont applicables en routine, la méthode de Ziehl -Neelsen et la

méthode fluorescente.

18

Avec la méthode de Ziehl-Neelsen, les frottis sont colorés par la fuchsine phéniquée à chaud,

puis, après décoloration par l’acide et l’alcool, cont re colorés par le bleu de méthylène. Au

microscope optique les bacilles acido -alcoolo-résistants (BAAR) apparaissent comme des

bâtonnets rouges sur fond bleu.

Avec la méthode fluorescente, où la fuchsine est remplacée par l’auramine, et au microscope à

fluorescence sous lumière bleue ou rayonnement UV, les BAAR apparaissent comme des

bâtonnets jaunes-verts brillants sur fond sombre (Grosset et al, 1990 ; Nolte et al, 1995).

L’examen microscopique n’est pas très sensible puisqu’il faut de 5 000 à 10 000 bac illes par

millilitre de produit pathologique pour que l’on puisse voir au moins un BAAR sur un frottis

avec une probabilité supérieure à 95 % (Parrot et al, 1976). Malgré ses limites, l’examen

microscopique est une étape essentielle du diagnostic de la tub erculose puisqu’il permet de

détecter rapidement, les malades les plus contagieux pour leur entourage (Shaw et Wynn-

Williams, 1954).

III.1.2 La culture

Comme la microscopie, la culture permet de confirmer le diagnostic de la tuberculose. Après

humidification, décontamination et centrifugation, les échantillons sont ensemencés sur des

milieux spécifiques. Le milieu solide à l’œuf de Löwenstein -Jensen est le milieu de culture le

plus couramment employé en raison de sa grande sensibilité, de son faible prix de revient et de

l’aspect typique qu’y prennent les colonies de M. tuberculosis. Lors de la primoculture, les

colonies de M. tuberculosis s’y développent en moyenne entre 21 et 28 jours et celles de M.

bovis et de M. africanum 1 mois plus tard (Grosset et al, 1990).

Pour pallier la lenteur des cultures sur milieux solides, de nouvelles méthodes ont été mises au

point, basées sur l’utilisation d’un milie u liquide dérivant du milieu 7H9 et d’un artifice pour

détecter précocement la croissance (La respirométrie radiométrique, ou Bactec 460 TB system)

(Siddiqi et al, 1984), le Mycobacterial growth indicator tube ( MGIT) et Bactec 960 (Becton

Dickinson) qui détecte l’apparition de la fluorescence sous l’effet de la réduction d’oxygène, le

système MB/BacT (Organon Teknika) basé sur la modification de couleur d’une membrane sous

l’effet du dégagement de CO2, l’ESP culture system II (ESPII, Difco) qui mesure la variation de

19

pression et le système MB Redox (Biotest) qui detecte la croissance grâce à l’apparition de

grains colorés sous l’effet de la variation du potentiel redox.

L’identification et la culture des mycobactéries doivent être obligatoirement suivies d’un test de

sensibilité aux antituberculeux majeurs. Les tests de sensibilité sont habituellement effectués par

des méthodes de culture mais peuvent également faire appel à des méthodes d’analyse du

génome bactérien.

Plus sensible que la bacilloscopie de s crachats, la culture permet de confirmer le diagnostic de

certaines formes de tuberculose, elle permet d’identifier précisément l’espèce mycobactérienne

en cause et de distinguer les bacilles vivants et les bacilles morts, ce qui est très important pour le

suivi du traitement. Cependant cette technique est délicate et présente un risque élevé de

contamination pour le personnel et le délai d’obtention des résultats retarde le traitement (WHO,

2010).

III.1.3 Détermination de la sensibilité aux antibiotiqu es

L’antibiogramme fournit des informations importantes sur les chances de succès du traitement

en cours, et s’il y a lieu de modifier celui -ci pour atteindre la guérison. Il permet de déterminer la

sensibilité du bacille tuberculeux aux différents antib iotiques utilisés dans le traitement de base

(Heifets & Desmond, 2005). Il consiste en l’observation de la croissance mycobactérienne sur

milieu de Löwenstein-Jensen (milieu à l’œuf) contenant différentes concentrations

d’antibiotiques testés (Drobniewski et al, 2007). Ce test est long, étant donné la lenteur de

croissance de M. tuberculosis. Pour obtenir l’antibiogramme, il faut compter environ 4 semaines

après l’identification de la bactérie. Ce délai peut être réduit de moitié par la réalisation de

l’antibiogramme en milieu liquide du type BACTEC (décrit plus haut). Récemment, un test

colorimétrique (REMA, resazurin microplate assay) basé sur la modification de coloration de la

resazurine suite à sa réduction par les bactéries tuberculeuses, a également é té proposé pour

mettre rapidement (8 jours) en évidence une éventuelle croissance de M. tuberculosis en

présence de différentes concentrations d’antibiotiques (Palomino et al, 2002 ; Affolabi et al,

2008).

20

III.2 Le test tuberculinique: principes, indications et interprétation

Comme la primo-infection est souvent asymptomatique (ou peu évocatrice), un examen clinique

du patient ne suffit pas. Le diagnostic d’une infection tuberculeuse latente nécessite la réalisation

d’une intradermoréaction (IDR) tuberculinique (ou test de Mantoux).

Il s’agit d’un test d’hypersensibilité retardée. Cette épreuve consiste en l’injection intradermique

(face antérieure de l’avant -bras) d’un mélange de protéines tuberculeuses purifiées appelé PPD

(Purified Protein Derivative) ou tuberculine. Cette réaction immunitaire est mise en évidence par

l’injection intradermique d’un extrait stérile, appelé tuberculine. Le résultat s’exprime par la

dimension en millimètre du diamètre d’induration développée autour du point de ponc tion et

mesurée transversalement par rapport au sens de l'injection. Le diamètre de l'induration peut

varier de 0 à 30 mm. Une réaction est jugée négative lorsque le diamètre d'induration est < à 5

mm.Une réaction est jugée positive lorsque le diamètre d'i nduration est >= à 5 mm.

III.3 Nouvelles techniques de diagnostic microbiologique

III.3.1 Les tests immunologiques de détection d’antigènes

* Le LAM urine Test® (Chemogen, USA)

Il permet de rechercher le lipoarabinomannane (LAM), constituant glycolipidique de la paroi

bactérienne, dans les urines des sujets tuberculeux (Dubrous, 2009)

*Le Test Patho-TB® (Anda Biologicals, France)

Il s’agit d’un test utilisant des anticorps polyclonaux permettant le diagnostic antigénique rapide

de la tuberculose par une technique de filtration.

* Les tests immunologiques explorant l’immunité à médiation cellulaire (tests de production

d’interféron)

Le sang total ou les cellules mononuclées recueillis chez le patient sont incubés en présence

d’antigènes spécifiques codés par la région RD1 de M. tuberculosis.

21

Le test mesure, par une technique immunoenzymatique, la quantité d’interféron γ produite par

les lymphocytes T ainsi stimulés.

Deux tests d’immunodiagnostic reposant sur ce principe sont disponibles : le test Quantiféron®,

commercialisé par Cellestis (Australie/USA) et le test TB Elispot®, commercialisé par

Immunotec (Royaume Uni) (Pai et al, 2006).

*Les tests cutanés

Une alternative séduisante a été initiée par Nakamura et al en 2001. Un antigène spécifique du

complexe M. tuberculosis (MPB-64) est délivré au patient au moyen d’un patch cutané. La

lecture s’effectue 48 à 72 heures après l’applic ation. Des études réalisées aux Philippines et au

Japon ont montré que ce test présentait une bonne sensibilité (88 %) et une excellente spécificité

(100 %) pour le diagnostic de tuberculose maladie tout en restant négatif en cas de tuberculose

infection.

*Les tests respiratoires (breath detection method)

Les tests respiratoires constituent une piste de recherche. Ils pourraient permettre de détecter

certains composants organiques volatiles dans l’air expiré des patients tuberculeux ( Phillips et al,

2007 ; Tobias et al, 2005)

III.3.2 Les techniques de biologie moléculaire

* Les techniques classiques d’amplification génique

Elles permettent d’identifier le complexe M. tuberculosis directement à partir des échantillons

cliniques. Il existe plusieurs tests commercialisés : Amplicor® MTB test (Roche Diagnostics),

Amplified TM Mycobacterium tuberculosis Direct Test® (Gen-Probe), BD ProbeTecTM ET

assay (Becton Dickinson). Ces tests commerciaux sont standardisés et offrent plus de garanties

que les tests «maison» qui donnent des résultats très variables. Les performances de ces tests

d’amplification génique ont été abondamment étudiées et leur valeur est maintenant bien établie

(Nahid et al, 2006). Outre leur rapidité, la majorité des études souligne leur forte spécificité et

leur bonne valeur prédictive positive.

22

III.4 La radiologie

Les anomalies visibles sur le cliché thoracique sont le meilleur signe prédictif d’une tuberculose

et leur extension est corrélée au résultat des examens bactériologiques des expectorations

(Wilcke et Kok-Jensen, 1997). Des infiltrats unilatéraux des lobe s supérieurs ou des segments

apicaux du lobe inférieur, surtout s’ils comportent des cavernes, ou une image miliaire sont

évocateurs d’une tuberculose.

La fiabilité du diagnostic radiologique de la tuberculose a été mise en doute, d’une part en raison

de l’aspect non spécifique des lésions radiologiques, d’autre part en raison de la mauvaise

reproductibilité de la lecture entre divers observateurs et même en cas de relecture par le même

observateur (Mass et al, 1976).

IV. TRAITEMENT DE LA TUBERCULOSE

Le traitement standard fait appel aux antibiotiques dits de « première ligne ». Ces antibiotiques

sont : l’isoniazide (H), la rifampicine (R), la pyrazinamide (Z) et l’éthambutol (E).

IV.1 Schéma thérapeutique standard

Le schéma de traitement est identique quelle que soit la forme de tuberculose :

(2(RHZE)/4(RH).Cette codification internationale signifie qu’il existe une première phase de

deux (2) mois avec quatre antituberculeux RHZE, suivie d’une deuxième phase de quatre (4)

mois avec deux antituberculeux RH.

La stratégie thérapeutique est le TDO (Traitement Directement Observé), c’est -à-dire une

supervision quotidienne de la prise des médicaments durant toute la durée du traitement.

Les médicaments pendant la première phase de deux ou trois mois doivent ê tre donnés chaque

jour et avalés devant le personnel de santé .

L’hospitalisation est nécessaire si l’état général du patient est altéré ou en cas de complications .

(PNT Burkina Faso, 2008).

Doivent bénéficier du régime de deuxième ligne ou de retraiteme nt les patients classés comme

rechute, échec ou reprise de traitement.

23

Ces malades doivent à nouveau être enregistrés sur le registre avec un nouveau numéro. Ces

patients étant fortement suspectés de porter des bacilles résistants, le régime associe cinq (5)

antituberculeux pendant deux (2) mois puis quatre (4) antituberculeux (sans la Streptomycine)

pendant un (1) mois et pendant cinq (5) mois la Rifampicine, l’Isoniazide et l’Ethambutol,

toujours sous supervision (PNT Burkina Faso, 2008) .

IV.2 Observance du traitement

Tous les patients devraient être surveillés pour juger de la réaction au traitement, que l’on évalue

le mieux avec la tuberculose pulmonaire par des analyses microscopiques d’expectorations (deux

spécimens) au moins à la fin de la phase initiale du traitement (à deux mois), à cinq mois et à la

fin du traitement. Les patients ayant des frottis positifs pendant les cinq mois de traitement

doivent être considérés comme des échecs au traitement et recevoir une thérapie modifiée

comme il convient. Chez les patients atteints de tuberculose extra -pulmonaire et chez les

enfants, on évalue au mieux la réaction au traitement cliniquement (TBCTA, 2006).

IV.3 La résistance aux antibiotiques antituberculeux : définitions et mécanismesgénéraux

La résistance à un antibiotique est un caractère phénotypique caractérisant la capacité d’une

bactérie à survivre et à se multiplier, en présence d’un antibiotique, à une concentration qui est

habituellement bactéricide ou bactériostatique (Zhang et al, 2005). La résistance d’une bactérie à

un antibiotique entraîne la perte d'efficacité de ce médicament lors du traitement d’une infection

causée par cette bactérie. Cette situation nécessite l’adaptation du traitement. Il existe différents

mécanismes de résistance, certains, généraux qui fonctionnant contre un large spectre

d'antibiotiques et d'autres très spécifiques d'un seul. Il existe également des mécanismes de

transfert d'une espèce à une autre, ce qui favorise la dissémination de la résistance. Dans tous l es

cas, le mécanisme aboutit à une action fortement réduite de l'antibiotique sur sa cible ou à une

perte d'effet de cette action. Il existe une grande variété de mécanismes d'action que l'on peut

regrouper dans les grandes catégories suivantes :

mutation de la cible de l'antibiotique,

modification de la cible de l'antibiotique,

24

surexpression de la cible de l'antibiotique,

contournement métabolique, la modification de l'antibiotique,

réduction de la perméabilité membranaire,

efflux des antibiotiques et la Défense altruiste (Pagès, 2004 et Youk et Oudenaaden,

2010)

IV.3.1 Résistance de M. tuberculosis aux antibiotiques antituberculeux

IV.3.1.1 Résistance naturelle

Chez les mycobactéries, le phénotype « sensible » ou « résistant » à un antibiotique donné est

spécifique d’espèce. Les mycobactéries du complexe M. tuberculosis sont naturellement

résistantes aux principales familles d’antibiotiques comme les β-lactamines, les macrolides, les

cyclines, les sulfamides et les glycopeptides (Veziris et al, 2005). Les mycobactéries non

tuberculeuses présentent également une résistance naturelle à ces antibiotiques usuels. De plus,

elles sont naturellement résistantes à la plup art des antibiotiques efficaces sur M. tuberculosis

tels que l’isoniazide, la pyrazinamide, l’ethambutol, l’acide p -aminosalicylique (Veziris et al,

2005).

IV.3.1.2 Résistance primaire

La résistance primaire se définit comme la résistance aux antitubercu leux survenant chez un

patient n’ayant jamais été traité auparavant ou ayant reçu un traitement inférieur à 1 mois. Elle

est la conséquence de l’infection d’un malade par une souche de M. tuberculosis provenant d’un

malade ayant développé cette résistance au cours d’un traitement inapproprié (OMS, 2004)

IV.3.1.3 Résistance secondaire ou acquise

La résistance acquise s’observe chez un patient avec un antécédent de traitement aux

antituberculeux d’au moins un mois et enfin la multirésistance s’observe lorsq ue la souche isolée

présente une résistance à au moins la rifampicine et à l’isoniazide, les deux antituberculeux les

plus puissants (OMS, 2004)

25

IV.3.1.4 Sélection des mutants résistants

Lorsque les bactéries sont exposées à un antibiotique, la pression de sélection favorise le

développement de mutants résistants (David, 1971). L’association de plusieurs antibiotiques

dans le traitement de la tuberculose réduit considérablement le risque de sélectionner une

bactérie porteuse simultanément de plusieurs m utations. En effet la loi de l’indépendance des

mutations fait que la probabilité de trouver une mycobactérie sauvage porteuse simultanément de

deux ou plusieurs mutations est très élevée (Youmans et al, 1947).

IV.3.1.5 Résistance multiple

• Tuberculoses à bacilles multi résistants (TB-MR) confirmées:

Les bacilles multi résistants sont des bacilles qui résistent au moins à l’isoniazide et à la

rifampicine, les deux principaux médicaments antituberculeux majeurs. La tuberculose à bacilles

multi résistants est actuellement une des formes graves et répandues de la résistance bactérienne

en tuberculose. C’est pourquoi elle est une grande source de préoccupation pour la lutte

antituberculeuse.

• Tuberculoses à bacilles ultra-résistantes (TB-UR) :

UR-TB (XDR en anglais) est l'abréviation pour la tuberculose ultra -résistante. Un patient

affecté par une tuberculose UR héberge des bacilles résistants à la rifampicine et à l’isoniazide,

en plus à n'importe quelle fluoroquinolone et au moins à un des tr ois médicaments injectables de

deuxième ligne (Capreomycine, Kanamycine, et Amikacine) (PNT Burkina Faso, 2009).

IV.3.2 Les antibiotiques antituberculeux : classification, mécanisme d’action et derésistance

26

IV.3.2.1 Médicaments antituberculeux de « première ligne

Isoniazide

L’isoniazide (INH) est le médicament antituberculeux de première ligne le plus largement utilisé.

Depuis sa découverte en 1952, l’INH a été la pierre angulaire de tous les régimes efficaces du

traitement de la tuberculose et de l’infection latente. M. tuberculosis est très sensible à l’INH

(concentration minimale inhibitrice [CMI] 0,02 –0,2 μg/ml). L’INH n’est actif que sur les bacilles

tuberculeux en phase de multiplication et il n’est pas actif sur les bacilles qui ne se multipl ient

pas, ni non plus dans les conditions anaérobies. La figure 6 montre la structure chimique de

l’isoniazide

Figure 6: structure de l’isoniazide (INH) (www.chembiofinder.com)

L’INH est un « prodrug » qui est activé par l’enzyme catalase -peroxydase (KatG) codé par le

gène katG pour produire un ensemble de produits fortement réactifs qui attaquent alors de

multiples cibles dans M. tuberculosis. Les produits réactifs produits par l’activation de l’INH

sous l’effet du KatG comportent à la fois des produits oxygénés réactifs comme le superoxyde, le

peroxyde, le radical hydroxyl, l’oxyde nitrique et des produits organiques réactifs comme le

radical ou l’anion isonicotinic -acyl et certains produits électrophiles. La cible primaire de

l’inhibition de l’INH semble être l’enzyme InhA (réductase de la protéine de transport du groupe

enoylacyl), impliquée dans l’élongation des acides gras lors de la synthèse de l’acide mycolique.

Le produit actif (le radical ou l’anion isonicotinic -acyl) provenant de l’activation de l’INH

27

médiée par le KatG entre en réaction avec le NAD(H) (nicotinamide adénine dinucléotide) pour

former un dérivé INH-NAD, et agresser alors l’InhA. (Zhang et Yew, 2009).

La résistance à l’INH est plus fréquente que la plupart des médicaments antituberculeux ; in

vitro, sa fréquence est de 1 sur 10 5 bacilles. Les isolats cliniques de M. tuberculosis résistant à

l’INH perdent souvent les enzymes catalase et peroxydase codée s par le katG, particulièrement

dans les souches de résistance élevée (CMI > 5 μg/ml). Les souches à résistance peu élevée

(CMI < 1 μg/ml) possèdent encore souvent l’activité catalasique. La mutation dans katG est le

mécanisme principal de la résistance à l’INH. La mutation S315T dans katG est la mutation la

plus courante dans les souches résistantes à l’INH, et se rencontre dans 50% à 95% des isolats

cliniques résistants à l’INH. La résistance à l’INH peut également survenir par suite de mutations

dans la région promoteur de l’opéron mabA/inhA, en provoquant une surexpression de l’InhA ou

par des mutations au niveau du site actif de l’InhA, en réduisant l’affinité de l’InhA pour le

dérivé INH-NAD. Les mutations dans InhA ou dans sa région promoteur sont habituellement

associées avec une résistance de faible niveau (CMI = 0,2–1 μg/ml) et sont moins fréquentes que

les mutations du katG. Dans M. tuberculosis résistant à l’INH et présentant des mutations inhA,

on pourrait trouver des mutations supplémentaires de katG qui conféreraient des niveaux plus

élevés de résistance à l’INH. Les mutations dans inhA ne se contentent pas de provoquer la

résistance à l’INH, mais confèrent également une résistance croisée à l’égard du médic ament

structurellement proche, l’éthionamide (ETH). Dans les souches résistantes à l’INH et négatives

pour KatG, les mutations dans la région promoteur d’ahpC, codant une alkylhydroperoxyde

réductase, entraînant une expression accrue de l’enzyme, ont été o bservées pour compenser la

perte de la catalase-peroxydase dans de telles souches. Une surexpression d’AphC ne semble pas

provoquer une résistance significative à l’INH. Environ 10% à 25% des souches dont le niveau

de résistance à l’INH est faible ne compo rtent de mutations ni dans katG, ni dans inhA; la

résistance pourrait être liée à un ou à plusieurs nouveaux mécanismes de résistance. Les figures 7

et 8 nous montrent les mutations identifiées dans les gènes katG et inhA.

28

Figure 7: Résumé des mutations identifiées dans le gène katG d’isolats de M. tuberculosisrésistants à l’INH (Ramaswamy & Musser, 1998)

Figure 8: Résumé des mutations identifiées dans le gène inhA et sa région promotrice, chezles isolats de M. tuberculosis résistants à l’INH (et ETH) (Ramaswamy & Musser, 1998)

Rifampicine

La Rifampicine est un médicament de première ligne important pour le traitement de la TB . La

rifampicine (RIF) est un dérivé de la rifamycine. Elle fut introduite dans le traitement anti

tuberculeux en 1972 et son activité bactéricide est puissante . La Rifampicine est bactéricide pour

M. tuberculosis. La figure 9 montre la structure chimique de la rifampicine.

29

La Rifampicine est active à la fois contre les bacilles en phase de multiplication et ceux en phase

stationnaire (dont l’activité métabolique est faible). Ce dernier type d’action est lié à sa puissante

activité stérilisante in vivo qui va de pair avec sa capacité de raccourcir le traitement de la TB de

12– 18 mois à 9 mois. La Rifampicine interfère avec la synthèse d’ARN en se liant à la sous -

unité β de l’ARN polymérase. L’ARN polymérase est un oligomère consistant en un noyau

enzymatique formé par quatre chaines α2ββ′ en association avec une sous-unité σ qui stimule

spécifiquement la transcription à partir des promoteurs. Le site de liaison de la rifampicine est

situé en amont du centre catalytique et bloque physiquement l’élongation de la chaîne d’ARN.

Pour M. tuberculosis, la résistance à la rifampicine survient à une fréquence de 10 –7 à 10–8. Les

mutations dans la région de la paire de base (bp) 81 de rpoB sont observées dans environ 96%

des isolats de M. tuberculosis résistants à la rifampicine. Les mutations dans les positions 531,

526, et 516 sont parmi les mutations les plus fréquentes observée s dans les souches résistantes à

la rifampicine. Les mutations dans rpoB entraînent généralement une résistance de haut niveau

ainsi qu’une résistance croisée avec toutes les rifamycines. Toutefois, les mutations spécifiques

dans les codons 511, 516, 518 e t 522 sont en association avec un faible niveau de résistance à la

rifampicine. Il existe des souches de M. tuberculosis dépendantes de la rifampicine . Ces souches

connaissent une croissance médiocre dans un milieu à base d’œufs, mais se développent mieux

en présence de rifampicine.

Figure 9: Structure de la rifampicine (www.chthera.fr)

30

A proprement parler, ces souches ne sont pas dépendantes de la rifampicine puisqu’elles

pourraient encore se développer médiocrement en l’absence de rifampicine.

Les circonstances dans lesquelles les souches dépendantes de la rifampicine surviennent restent

encore mal définies, mais elles apparaissent souvent comme une TB -MDR et semblent se

développer en présence de traitements répétés avec des rifamycines chez des patients en

retraitement. (Zhong et al, 2002). La figure 10 montre le résumédes mutations identifiés dans le

gène rpoB.

Figure 10: Résumé des mutations identifiées dans le gène rpoB d’isolats de M. tuberculosisrésistants à RIF (Ramaswamy & Musser, 1998)

La pyrazinamide

La pyrazinamide (PZA) est un médicament de première ligne important, utilisé en même temps

que l’INH et la rifampicine. Le PZA joue un rôle unique dans le raccourcissement du traitement

de la TB depuis la durée antérieure de 9 à 12 mois vers 6 mois, car il détruit une popu lation de

bacilles « persistants » dans l’environnement à pH acide des lésions, population qui n’est pas

détruite par les autres médicaments.

31

Le PZA est un médicament antituberculeux non conventionnel et paradoxal qui a une activité

stérilisante élevée in vivo, mais qui n’est pas actif contre les bacilles tuberculeux dans les

conditions normales de culture proches d’un pH neutre. Le PZA n’est actif contre M.

tuberculosis qu’à un pH acide.

Les souches de M. tuberculosis résistantes au PZA perdent leur ac tivité

pyrazinamidase/nicotinamidase. Des études ont démontré que la déficience d’activité de la

pyrazinamidase due aux mutations de pncA est la cause principale de la résistance de M.

tuberculosis au PZA. Le PZA n’est actif que contre les organismes du complexe M. tuberculosis

(M. tuberculosis, M. africanum et M. microti), mais non contre M. bovis en raison d’une

mutation caractéristique dans son gène pncA (Scorpio et A, Zhang, 1996). Des souches de M.

bovis, y compris le bacille de Calmette et Guérin (B CG), sont naturellement résistantes au PZA

et n’ont pas de pyrazinamidase ; ces caractéristiques sont habituellement utilisées pour distinguer

M. bovis de M. tuberculosis (Zhang et Yew, 2009).

Ethambutol

L’éthambutol ([(S,S′)-2,2′(éthylènediimino)di-1-butanol] ) est un médicament de première ligne

qui est utilisé en combinaison avec l’INH, la rifampicine et le PZA pour prévenir l’apparition de

la résistance aux médicaments. L’éthambutol est un agent bactériostatique actif sur les b acilles

au stade de multiplication et inefficient sur les bacilles « dormants ». L’éthambutol interfère avec

la biosynthèse de l’arabinogalactan de la paroi cellulaire (Takayama et Kilburn, 1989).

La mutation vers la résistance à l’éthambutol survient à u ne fréquence de 10–5. Les mutations

dans l’opéron embCAB, en particulier embB, et occasionnellement embC, sont responsables de

la résistance à l’Ethambutol (Telenti et al, 1997).

IV.3.2.2 Médicaments anti-tuberculeux de « seconde ligne » et alternatifs

Aminoglycosides (streptomycine, kanamycine/ amikacine/capréomycine)

La streptomycine (SM) est un antibiotique du type aminoglycoside actif contre toute une série

d’espèces bactériennes, y compris M. tuberculosis. La streptomycine détruit activement les

bacilles en multiplication à des CMI de 2 à 4 μg/ml, mais est inactive contre les bacilles

« dormants » ou intracellulaires.

32

La streptomycine inhibe la synthèse protéique en se liant à la sous -unité 30S du ribosome

bactérien, ce qui entraîne une lecture erronée du message de l’ARN messager en cours de

traduction. Les sites d’action de la streptomycine sont la sous -unité 30S du ribosome au niveau

de la protéine ribosomiale S12 ainsi que l’ARNr 16S.

La résistance à la SM est provoquée par des mutations dans la protéine S12 codée par le

gène rpsL et dans l’ARNr 16S codé par le gène rrs. Les mutations de rpsL et de rrs sont les

mécanismes principaux de la résistance à la streptomycine rendant compte respectivement de

50% et de 20% des souches résistantes à la streptomycine.

La kanamycine (KM) et son dérivé l’amikacine (AMK) sont également des inhibiteurs de la

synthèse protéique qui modifient la structure ribosomiale au niveau de l’ARNr 16S. Les

mutations sur le gène de l’ARNr 16S en position 1400 sont en associées à une résistance élevée

à la KM et à l’AMK.

La capréomycine (CPM) est un antibiotique de type polypeptide. Il a été démontré qu’un gène

appelé tlyA codant la méthyltransférase de l’ARNr est impliqué dans la résistance à la CPM

Fluoroquinolones

Dans la plupart des espèces bactériennes, les fluoroquinolones inhibent l’ADN gyrase

(topoisomérase II) et la topoisomérase IV , ce qui entraîne la mort microbienne. L’ADN gyrase

est une protéine tétramérique A2B2. La sous -unité A est porteuse du site actif rupture -réunion,

alors que la sous-unité B promeut l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate. Dans M. tuberculosis,

gyrA et gyrB encodent les sous-unités A et B. Il a été démontré qu’une région préservée, la

région déterminant la résistance à la quinolone (QRDR) de gyrA (320 bp) et de gyrB (375 bp),

est la zone la plus importante impliquée dans l’apparition de la résistance aux fl uoroquinolones

chez M. tuberculosis.

Généralement, deux mutations dans gyrA ou des mutations concomitantes dans gyrA plus gyrB

sont indispensables pour qu’apparaissent des niveaux plus élevés de résistance.

33

Ethionamide/prothionamide et thioamides

L’Ethionamide (2-ethylisonicotinamide) est un dérivé de l’acide isonicotinique ; il est bactéricide

uniquement contre M. tuberculosis, M. avium-intracellulare et M.leprae. Comme l’INH, l’ETH

est également un « prodrug » activé par EtaA/EthA (une monooxygénase), et il inhibe la même

cible que l’INH, c’est à dire l’InhA des voies de synthèse de l’acide mycolique.

Tableau 2: Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis

(Yew and Zhang, 2009)

34

CHAPITRE II: NOTRE ETUDE

35

OBJECTIFS DE L’ETUDE

Objectif général

Identifier le profil de résistance du complexe Mycobacterium tuberculosis à la rifampicine et à

l’isoniazide.

Objectifs Spécifiques

Identifier le complexe Mycobacterium tuberculosis par microscopie à partir des

expectorations.

Identifier le complexe M. tuberculosis par PCR en temps réel.

Déterminer le profil de résistance simultanée du complexe Mycobacterium tuberculosis

résistant à la rifampicine et l'isoniazide.

36

I. MATERIELS ET METHODES

I.1 Cadre de l’étude

Cette étude a eu pour cadres l’hôpital de district de Bogodogo à Ouagadougou, le Centre Médical

Saint Camille, le Programme National Tuberculose du Burkina Faso pour la collecte des

échantillons et le Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE)

pour l’analyse des échantillons. Les patients enrôlés dans cette étude étaient au nombre de 74,

âgés de 19 à 71 ans et étaient venus au laboratoire soit pour un dépistage de la tuberculo se, soit

pour un contrôle pendant ou après traitement de première ligne, ainsi que les patients en échec

thérapeutique et ayant comme traitement la rifampicine et l’isoniazide.

I.2 Les prélèvements Recueil des Crachats

Les prélèvements ont été essentiell ement des produits d'expectoration spontanée ou provoquée

recueillis dans des pots stériles. Deux échantillons par malade ont été utilisés pour le dépistage.

Ces échantillons ont été recueillis à deux jours d’intervalle. Le 1 er échantillon a été recueilli

sous supervision, le jour même de la consultation et d’autres crachoirs ont été remis aux malades

qui ont recueilli eux-mêmes les crachats du petit matin du lendemain.

Pour chaque contrôle un échantillon de crachat a été demandé au malade sous trai tement de la

tuberculose (aux 2ème, 3ème, 5ème mois et à la fin du traitement). Cet échantillon a été recueilli le

matin du jour du rendez-vous par le malade et apporté au laboratoire.

Pour la technique de prélèvement un volume de 3 à 5 ml de crachat e st ramené des bronches par

un effort vigoureux précédé d’une inspiration profonde conformément au protocole du PNT

(PNT Burkina Faso, 2008).

D’autres souches de Mycobactéries déjà identifiées ont été utilisées pour l’identification du

complexe de Mycobacterium et l’étude des résistances.

37

Transport et conservation

Tous les prélèvements ont été acheminés au CERBA dans une glacière avec des accumulateurs

de froid et y ont été immédiatement conservés au réfrigérateur. L es prélèvements ont été traités

quotidiennement ou à défaut ont été décontaminés et fluidifiés avec un mélange d’une solution

de NaOH à 4% puis conservés au réfrigérateur pendant une durée de 48 heures ou congelés entre

-20 ° C et -80 ° C.

I.3 Examen microscopique

I.3.1 Technique de confection des frottis

Sur chaque échantillon, un frottis a été confectionné en suivant le protocole défini par le

programme national tuberculose. Après dégraissage à l’alcool, les lames sont étiquetées en

marquant en haut de la lame le numéro d’enregistrement suivi de la lettre correspondante à la

série (A, B). L’anse de platine est flambée et refroidie puis, autour d’un bec Bunzen, le crachoir

est ouvert avec précaution. On prélève avec l’anse de platine une parcelle purulente de crachat

puis on étale par un mouvement continu de rotation sur une longueur de 2 cm et une largeur de 1

cm en commençant par le milieu de la lame. Les lames sont placées sur les porte -lames, frottis

tourné vers le haut et séchées à l’air ambiant. Ensuite le crachoir es t refermé et l’anse de platine

déchargée à l’intérieur du bocal contenant du sable et de l’alcool puis flambée. La même

technique est reprise pour les échantillons suivants.

A la fin de l’étalement des frottis, le papier Joseph souillé est éliminé puis la surface de travail

nettoyée à l’eau de Javel et enfin les mains lavées au savon.

1.3.2 Fixation du frottis

Pour la fixation du frottis nous avons tenu la lame avec une pince avant de la passer sur la

flamme du bec Bunsen 5 fois pendant environ 4 secon des, la face d’étalement tournée vers le

haut.

38

I.3.3 Coloration par la technique de ZIEHL NEELSEN à chaud

La coloration a été faite selon le principe suivant : En raison de ses propriétés pariétales, les

mycobactéries retiennent la coloration par la f uchsine malgré l’action combinée de l’acide et de

l’alcool. Elles apparaissent alors comme des bâtonnets rouges.

La coloration s’est faite suivant plusieurs étapes :

La coloration par la fuchsine phéniquée de Ziehl au cours de laquelle nous avons les éta pes

suivantes :

• placer la lame fixée sur la barre métallique, au dessus de l’évier ; le frottis tourné vers le

haut ;

• recouvrir le frottis de la solution de fuchsine phéniquée filtrée ;

• chauffer la lame par le dessous au moyen d’une flamme (bec Bunsen ou coton cardé

imbibé d’alcool), jusqu’à émission de vapeurs. Ne jamais aller jusqu’à ébullition ;

• laisser la lame recouverte de la solution chaude et fumante de fuchsine pendant 5 mn ;

• répéter si nécessaire ;

• rejeter le colorant et rincer le frottis à l’eau du robinet puis laisser la lame recouverte

d’eau jusqu’à l’étape suivante.

La décoloration a été faite par la solution d’acide + alcool de la manière suivante :

• rejeter l’eau qui couvre la lame ;

• faire couler doucement la solution d’acide -alcool à l’aide de la pissette ;

• dès que la solution décolorante devient incolore, arrêter la décoloration ;

• rincer le frottis à l’eau du robinet puis laisser la lame recouverte d’eau jusqu’à l’étape

suivante.

La contre-coloration par la solution de bleu de méthylène a suivi les étapes suivantes :

• rejet de l’eau qui couvre la lame ;

• couverture du frottis de la solution de bleu de méthylène filtrée ;

39

• attente d’une (1) minute ;

• rejet du contre-colorant et rinçage à l’eau du robinet ;

• séchage du frottis à l’air ambiant ( sur le râtelier).

1.3.4 Lecture du frottis

Les lames ont été lues au microscope à l’objectif 100 avec huile à immersion et la lecture faite

systématiquement champ par champ en allant de la périphérie vers le centre du frottis, en

commençant par son coin supérieur gauche (lecture en créneau). Tous les BAAR ont été comptés

sur 20 à 300 champs microscopiques selon la richesse du frottis.

Les critères de lecture suivants ont été observés :

1) Pour les frottis très riches et présentant plusieurs bacilles par champ, 20 champs ont été lus et

la moyenne des bacilles par champ a été considérée.

2) Pour les frottis riches mais ne présentant pas plu s d’un bacille par champ, 100 champs de

frottis ont été lus.

3) Lorsque le nombre de bacilles dans 100 champs était inférieur à dix, 300 champs de frottis au

total ont été lus.

40

1.3.5 Expression des résultats

Les données chiffrées obtenues ont été exprimées sous forme de croix sur le bulletin du malade

comme le montre le tableau de correspondance ci -dessous.

e d BAAR comptés

Tableau 3: Expression des résultats de recherche de BAAR

Nombre de BAAR Comptés Résultats Interprétation

0 BAAR/300 champs NEG Frottis négatif

1-9 BAAR/300 champs 1-9 (noter le chiffre exact) Frottis faiblement positif

10-100 BAAR/300 champs + Frottis positif

10-100 BAAR/100 champs ++ Frottis riche

>1 BAAR/ champ +++ Frottis très riche

Figure 11: Observation au microscope d’une lame colorée au Zielh Neelsen

41

I.4 Identification de Mycobacterium tuberculosis par PCR en temps réel

Mycobacterium tuberculosis a été identifié par PCR en temps réel (Real -Time PCR) à partir de

crachats de patients grâce au kit d’identification M TB Real-TM (Sacace Biotechnologies, Como,

Italie). Ce kit permet la détection qualitative du complexe Mycobacterium tuberculosis (M.

tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti) dans les crachats, l'urine, les

lavages bronchiques, les tissus et autres produits biologiques.

I.4.1 Extraction de l’ADN

Les échantillons ont été traités de la manière suivante :

1. Homogénéiser dans une enceinte sécurisée après mélange avec un volume égal de 4% d’une

solution de NaOH. Mélanger intensément avec un rotateur de tubes pendant 5 -20 minutes (en

fonction de la densité de l'échantillon).

2. Centrifuger les échantillons à 3000 rpm (2800-3000 g) pendant 15 min et jeter

soigneusement le surnageant en laissant 500 -1000 µl dans le tube.

3. Remettre en suspension les culots et les transférer dans un tube de 1,5 ml.

4. Centrifuger les échantillons à 12000 rpm pendant 5 -10 min, éliminer le surnageant et utiliser

le même tube de 1,5ml pour l'extraction de l’ADN.

Procédure d’extraction

La procédure d’extraction a suivi les étapes ci -après :

1. Préparer le nombre requis de tubes de 1,5 ml en polypropylène à usage unique pour micr o

centrifugeuse dont un tube pour le contrôle négatif de l'extraction (contrôle négatif, C -).

2. Ajouter dans chaque tube 10 µl de MTB IC (Internal Control) et 300 µl de solution de lyse

3. Ajouter 100 µl d'échantillons dans le tube approprié à l'aide d e pipette avec embout possédant

une barrière aérosol.

4. Préparer les contrôles comme suit:

- ajouter 100 µl de contrôle négatif au tube étiqueté Contrôle négatif

42

5. Vortexer et incuber pendant 5 min à 65 ° C. Centrifuger pendant 7 -10 sec.

6. Ajouter 400 µl de Prec Sol et mélanger au vortex. Centrifuger tous les tubes à 13.000 tr / min

pendant 5 min et en utilisant une micropipette avec embout possédant une protection contre les

aérosols, retirer soigneusement et éliminer le surnageant de chaque tube s ans perturber le culot.

7. Ajouter 500 µl de solution de lavage (Tampon 3) dans chaque tube. Vortexer vigoureusement.

et centrifuger tous les tubes à 13.000 tr / min pendant 60s. Retirer soigneusement et jeter le

surnageant de chaque tube sans perturber le culot.

8. Ajouter 200 µl de tampon de lavage (Tampon 4) dans chaque tube. Vortexer vigoureusement

et centrifuger tous les tubes à 13.000 tr / min pendant 60s. Retirer soigneusement et éliminer le

surnageant de chaque tube sans perturber le culot.

9. Incuber tous les tubes bouchons ouverts à 65 ° C pendant 5 min.

10. Reprendre le culot dans 50 à 90 µl tampon d’élution (RE -Buffer). Incuber pendant 5 min à

65 ° C et vortexer périodiquement.

11. Centrifuger les tubes à 13000g pendant 60s. Le surnageant con tient des ARN / ADN prêts

pour l'amplification. Les échantillons traités sont conservés à 2 -8 ° C pendant un délai maximum

de 5 jours ou congelés à - 20 ° / -80 ° C.

I.4.2 Amplification

Pour l’amplification nous avons procédé par :

1. Préparer la quantité nécessaire de tubes de réaction (ou plaque PCR) pour les échantillons et

les contrôles.

2. Préparer dans le nouveau tube stérile pour chaque échantillon 10 x (N+1) μl de PCR-mix-1, 5

x (N+1) de PCR Buffer Flu, 0,5 x (N+1) de TaqF DNA Polymerase et 0,5 x (N+1) of UDG-

Enzyme. Vortexer et centrifuger brièvement.

3. Ajouter dans chaque tube 15 µl de mélange réactionnel.

4. Ajouter 10 µl d'ADN extrait dans le tube approprié.

5. Préparez pour chaque panel 2 contrôles:

● ajouter 10 μl de DNA-buffer au le tube étiqueté pour le contrôle d'amplification négatif;

43

● ajouter 10 μl of C+ MTB & IC au tube étiqueté pour le cont rôle d’amplification positif;

6. Insérer les tubes dans le thermocycleur.

I.4.3 Lectures et interprétation des résult ats

Les résultats ont été interprétés par la présence de croisement de la courbe de fluorescence avec

la ligne de seuil. Mycobacterium tuberculosis a été détecté sur canal FAM (vert) et l’ IC DNA

sur le canal JOE(Jaune)/HEX/Cy3.

I.5 Détection des gènes de résistances à la rifampicine et à l’isoniazide

La détection des mutations responsables des résistances à la rifampicine et l’isoniazide a été

faite par Real Time PCR en utilisant un kit commercial (MTB Real -TM Resistance 8 kit, Sacace

Biotechnologies, Como, Italie) en suivant les instructions du fabricant.

44

PROCEDURE

<105 Cel/ml

Extraction d’ADN

>106 Cel/ml

Extraction d’ADN

Figure 12: Schéma montrant la procédure de détection des mutations

CrachatsColonies de Bk

Mise enculture

(1 semaineenviron)

Tests de turbidité

avec une série de dilutions

Analyse des résultats

PCR en temps réel pour ladétection des mutationsde l’ADN de M.tuberculosis associées aune résistance al’Isoniazide

PCR en temps réel pour ladétection des mutations del’ADN de M. tuberculosisassociées a une résistance ala Rifampicine

PCR en temps réel Multiplex (20 cycles)

(rpoB, katG, inhA)

PCR en temps réel pour la détectionqualitative et quantitative de M.Tuberculosis

45

ORDRE DE PASSAGE DES ECHANTILLONS

+ +

+ - -

+

+ -

+ -

-

-

Rifampicinresistantsample(s)(rpoB 533) n5

Isoniazid katG 315(B407-50FRT)50

Sample(s) sensitive toIsoniazid50- (k1+k2)

Rifampicin rpoB 531(B402-50FRT)

50

Rifampicin rpoB 526-1(B403-50FRT)50-n1

Rifampicin rpoB 516(B405-50FRT)50-(n1 +n2)

Rifampicin rpoB 526-2(B404-50FRT)50-(n1 +n2+n3)

Rifampicin rpoB 533(B406-50FRT)50-(n1 +n2+n3+n4)

Sample(s) sensitive toRifampicin50-(n1 +n2+n3+n4+n5)

Rifampicinresistantsample(s)(rpoB 526) n4

Rifampicinresistantsample(s)(rpoB 526) n2

Rifampicinresistantsample(s)(rpoB 516) n3

Rifampicinresistantsample(s)(rpoB 531) n1

Multi(B401-50FRT)50

Isoniazid inhA 209(B408-50FRT)50-k1

Isoniazidresistantsample(s)(inhA209) k2

Isoniazidresistantsample(s)(katG 315) k1

SAMPLESe.g. 50 startingsamples

-

+

-

46

Tous les échantillons ont été d’abord testés pour la résistance à la rifampicine (rpoB codon 531

résistance mutation) et l'isoniazide (katG codon 315 mutation). Pour les échantillons positifs

(croix rouge), le test était terminé et ils ont été classés comme résistants à la rifampicine ou à

l'isoniazide. Pour les échantillons négatifs (vert moins) l'analyse passait à la prochaine mutation,

comme indiqué par les flèches. Les échantillons négatifs pour toutes les 5 mutations de l'ADN

gène rpoB ont été classés comme sensibles à la rifampicine, les échantillo ns négatifs pour toutes

les deux mutations d'ADN (gènes katG et INHA) ont été considérés comme sensible à

l'isoniazide.

1.5.1 Protocole

La réaction de PCR pour l’identification des résistances a été faite selon le protocole suivant :

1. Préparer la quantité nécessaire de tubes de réaction (ou plaque PCR) pour les échantillons et

les contrôles.

2. Préparer dans un nouveau tube stérile pour chaque échantillon le mélange réactionnel comme

suit: 20 x (N + C) µl de mix PCR -1 et 0,5 x ADN polymérase (N + C) de Taq

N = nombre d'échantillons, C = nombre de contrôle fourni avec le kit Vortex et centrifuger

brièvement.

3. Ajouter dans chaque tube 20 µl de mélange réactionnel.

4. Ajouter 5,0 µl d'échantillons d'ADN extraits, contrôles positifs et négatifs dans des tubes

appropriés.

Les programmes d’amplification des gènes de résistance à la rifampicine et à l’isoniazide sont

présentés dans les tableaux ci -dessous :

Figure 13: Schéma montrant les étapes de la PCR de détection des résistances

47

Tableau 4: Programme de la PCR MTB-MULTI (Identification du complexe MTB)

Etape Température Temps Cycles

1. 95°C 5 mn 1

2. 66°C 50s. 20

3. 95°C 20s.

Tableau 5: Programme de la PCR pour la détection des mutations du gène rpoB

PCR en temps réelEtape Température en

°CTemps Détection de la

fluorescenceRépétition descycles

(Dénaturation)94 3 mn ---

1

Cycle de(Dénaturation,Hybridation,élongation)

94 20s ---

3560 30s ---

57 30s FAM/Green,JOE/Yellow/HEX/Cy3,Rox/Orange/Texas Red,

Cy5/Red*

Tableau 6: Programme de la PCR de détection des mutations des gènes katG et inhA

PCR en temps réelEtape Température en

°CTemps Détection de la

fluorescenceRépétition descycles

Hold(Dénaturation)

94 3 mn ---1

Cycling(Dénaturation,Hybridation,élongation)

94 20s ---

3562 30s ---

57 30s FAM/Green,JOE/Yellow/HEX/Cy3,Rox/Orange/Texas Red,Cy5/Red*

48

I.5.3 Analyse des résultats de la PCR

Les résultats ont été interprétés par le logiciel de l'appareil grâce à la présence de croisement de

la courbe de fluorescence avec la ligne de seuil. Les résultats sont validés en la matière si les

contrôles positifs et négatifs de l'amplification et de l'extraction sont valides.

Figure 14: courbe d’amplifications montrant la séquence de gène muté.

II.RESULTATS

II.1 Population d’étude

L’étude a porté sur 74 échantillons comprenant 67 prélèvements de crachat et 7 souches de

culture du complexe MTB. Le tableau 7 montre la répartition des sujets en fonction de leur sexe,

groupe d’âge et de leur statut VIH -1. La majorité des cas de tuberculoses a été retrouvée chez les

patients de la tranche d’âge 21 à 30 ans (29,9%) et 31 à 40 ans (28,4%). L’âge médian des

patients était de 38,52± ans. Les enfants de moins de 5 ans particulièrement à risque de

développer une tuberculose lorsqu’ils sont contaminés ne sont pas représentés. La majorité des

patients était de sexe masculin (61,2%).

49

Tableau 7: Caractéristiques de notre population d'étude

caractéristiques Nombre Pourcentage Total

Tranches d'âge

0-15 ans 0 0,0%

16-20 ans 3 4,5%

21-30 ans 20 29,9% 67(100%)

31-40 ans 19 28,4%

41 -50 ans 11 16,4%

50 ans et plus 14 20,9%

Sexe

Masculin 41 61,2% 67(100%)

Féminin 26 38,8%

Statut sérologique

VIH

Négatifs 60 89,6%

Positifs 7 10,4% 67(100%)

50

II.2 Répartition des patients selon le traitement

Figure 15: Répartition des patients selon le traitement reçu .

Sur 42 patients dépistés positifs, 35 patients étaient sous traitement antituberculeux spécifiques

de 1ère ligne (Rifampicine, Isoniazide, Ethambutol, Pyrazinamide), 7 étaient sous un traitement

de 2ème ligne ou sous régime de retraitement composé de (Streptomycine Rifampicine,

Isoniazide, Ethambutol, Pyrazinamide). La répartition des patients par ligne d e traitement est

représentée sur la figure 10 ci -dessus.

Dans notre étude, 52 patients venaient d’être dépistés et n’avaient pas encore reçu de traitement

antituberculeux et 15 patients sous traitement ont été reçus pour contrôle.

Répartition selon le traitement

51

II.3 Diagnostic de MTB par microscopie et PCR en Temps réel

Pour les dépistages et les contrôles, la recherche de mycobactéries par microscopie a été négative

dans 28 des 74 échantillons, soit 38%. La bacilloscopie a montré la présence de BAAR dans 46

prélèvements (62,2%) et l’identification par PCR a donné 34 positifs soit (45,9%) des

échantillons.

Pour les cas de dépistage uniquement la bacilloscopie a montré la présence de BAAR dans 35

prélèvements (59,3%) soumis au dépistage et la recherche de mycobactéries par PCR en t emps

réel a été positive dans 26 des 59 échantillons soumis au dépistage soit 44,1% des cas. Le tableau

8 montre les résultats du diagnostic de MTB par microscopie et par PCR en temps réel chez les

patients venus en dépistage.

Tableau 8: Diagnostic de MTB par microscopie et par PCR en temps réel chez les patientsdépistés

Diagnostic Nombre Pourcentage (%) TotalMicroscopie

Positives 35 59,3 59 (100,0)Negatives 24 40,7

PCRPositives 26 44,1 59 (100,0)

Négatives 33 55,9

II.4 Performance de la microscopie par rapport à la PCR en temps réel

La comparaison de la spécificité et de la sensibilité de la microscopie pour la recherche de

BAAR a été faite par rapport à la PCR en temps réel. Sur les 74 échantillons de notre population

d’étude, seules les personnes venues au laboratoire pour dépistag e ont été prises en compte soit

59 personnes. La microscopie avait une sensibilité de 68% et une spécificité de 91%. Le calcul

de la sensibilité et de la spécificité a été fait tel que défini dans le tableau suivant :

52

Tableau 9: Performance des tests de microscopie des BAAR comparativement à la PCR

VP= Vrai positif ; FN= Faux négatif ; FP= Faux positif et VN= Vrai négatif.

Sensibilité de microscopie = VP/ (VP+FP)= 68%

Spécificité microscopie = VN/ (FN+VN)= 91%

II.5 Résistance aux antituberculeux.

II.5.1 Fréquence des mutations

Les résultats de l’étude des mutations se ressentent comme suit : sur 48 échantillons soumis au

test de résistance, 9 possédaient au moins une mutation qui confère une résistance à la

rifampicine ou à l’isoniazide soit un taux de 18,75%.

II.5.1.1 Mutations qui confèrent une résistance à la rifampicine

Tableau 10: Mutations du gène rpoB

Codon Muté Mutation

Acide aminé

changé Fréquence

516 GAC-GTC Asp-Val 1(11,1%)

531 TCG-TGG Ser-Trp 2 (22,2%)

531 TCG-TGG etTCG-TTG Ser-Trp et Ser-Leu 1(11,1%)

533 CTG-CCG Leu-Pro 1(11,1%)

indéterminé (C+ rpoB) 2 (22,2%)

Négatif 2 (22,2%)

Total 9(100%)

Les mutations du gène rpoB conférant une résistance à la rifampicine est ont été retrouvées

dans 7 échantillons sur 9 soit de 77,8%.

PCR Positif PCR négatif Total

Microscopie Positives VP= 24 FP= 11 VP+FP= 35

Microscopie Négative FN=2 VN= 22 FN+VN= 24

53

L’analyse des isolats a permis d’identifier les mutations sur les codons suivants 516, 531 et 533

avec les fréquences respectives suivantes 11,1%, 33,3% et 11,1%.La mutation la plus élevée a

été observée sur le codon 531. Une mutation double dans le codo n 531 (Ser→Trp + Ser→Leu) a

également été observée. Deux isolats possédant des mutations du gène rpoB dont la localisation

n’a pas été déterminée ont été observés (C+rpoB 22,22%).

II.5.1.2 Mutations qui confèrent une résistance à l’isoniazide

Tableau 11: Mutations du gène inhA et katG

Codon Muté MutationAcide aminéchangé

Fréquence(N=9)

inhAC209T C209T 7(77,8%)Site non précisé 1(11,1%)Négatif 1(11,1%)

katG315 AGC-ACA Ser-Thr 2(22,2%)315 AGC-ACA et AGC-AAC Ser-Thr et Ser-Asn 1(11,1%)

Négatif 6(66,7%)

Huit échantillons sur neuf 8/9 (88,9%) ont présenté des mutations du gène inhA conférant une

résistance à l’isoniazide dont 7 sur le gène inhA C209T de la région régulatrice et un dont le site

de mutation n’a pas été détecté par notre kit. Aucune mutation sur la région promotrice ahpC du

gène n’a été observée.

Les mutations du gène katG conférant une résistance à l’isoniazide sont présentes dans 33,3%

des échantillons. Le codon 315 était le seul codon incriminé avec une double mutation observée

Ser-Thr et Ser-Asn sur le gène katG.

54

II.5.2 Multi Drug Résistance(MDR)

Des mutations à la fois du gène rpoB et inhA ou katG conférant une multi Drug résistance

(MDR) ont été détectés dans 7 échantillons. Les mutations multiples rencontrées (44,4%) sont à

la fois des substitutions sur le codon 531 du gène ropB ( Ser-Trp (TCG-TGG) et sur le codon 209

du gène inhA (209T).

Deux substitutions (22,2%) conférant une résistance à l’isoniazide situées sur le codon 315 du

gène katG Ser-Thr (AGC-ACA) et sur le codon 209 du gène inhA (209T) de Mycobactérium

tuberculosis ont été observées.

Les substitutions doubles à l’intérieur du même gène étaient présentes dans deux cas :

Une substitution sur le codon 531 du gène ropB ( Ser-Trp (TCG-TGG) /Ser-Leu (TCG-

TTG). Cette mutation concerne l’allèle 1 et 2 du gène ropB.

Une substitution sur le codon 315 du gène katG Ser -Thr (AGC-ACA) /Ser-Asn

(AGC-AAC). Cette mutation concerne l’allèle 12 et 15 du gène katG.

55

III.DISCUSSION

III.1 Comparaison Microscopie et PCR pour le diagnostic de MTB

Dans cette étude la présence de M. tuberculosis dans les échantillons a été recherchée par

microscopie et par PCR en temps réel. M. tuberculosis a été retrouvé dans 35 prélèvements

(59,3%) par microscopie et la PCR en temps réel a permis d’identifier 26 échantillons positifs

soit 44,1% des cas. Nos résultats sont similaires à ceux de Drouillon et al. (2006) qui ont trouvé

une prévalence élevée de M. tuberculosis par microscopie (78,6%) comparativement à la PCR en

temps réel (57,1%). Ceci s’expliquerait par le fait que les BAAR observés sur lames à l’examen

direct ne correspondent pas tous à des mycobactéries appartenant au complexe Mycobacterium

tuberculosis.

III.2 Mutation gène rpoBLes mutations responsab les de la résistance à la rifampicine et à l’isoniazide ont été recherchées

aussi bien aussi chez les patients que dans les souches de MTB. Les mutations suivantes du gène

rpoB ont été retrouvées : codons 516 (11,11%), 531 (33,33%), et 533 (11,11%), le co don 531

présentant la fréquence la plus élevée. Ce codon a été associé à une résistance élevée à la

rifampicine ainsi qu’une résistance croisée avec toutes les rifampicines. Les mêmes types de

mutations ont été observés à Taïwan par Lin et al. (2012) mais à des proportions différentes: 516

(4,5%), 531 (68,2%), 533(9,1%) avec toujours une prédominance des mutations du codon 531.

La présence des mutations sur le codon 531 du gène rpoB pourrait expliquer l’échec de

traitement chez certains de nos patients a ux médicaments de première ligne dont la rifampicine.

Nos résultats sont différents de ceux de Miotto et al. au Burkina Faso en 2009 qui ont trouvé

une prédominance du codon 526 (31,2 %) contre 9,4% pour le codon 531 du gène rpoB .

Les résultats obtenus dans cette étude sont différents de ceux rapportés par Sheng et al. (2008)

qui ont trouvé une prédominance de la mutation du codon 526 (73,2%) et une faible proportion

des mutations du codon 531 (3,5%). En effet, la prévalence du co don 531 varierait selon les

régions géographiques (Sheng et al. 2008); Torres et al., 2002).

56

III.3 Mutation des gènes inhA et KatG

Dans cette étude nous avons identifié une grande proportion (88,8%) de mutations C209T au

niveau de la région régulatrice du gène de l’InhA. En effet, les mutations se situant dans la

région régulatrice, sont connues pour causer une surexpression du gène inhA renforçant

l’expression de la résistance de M. tuberculosis à l’isoniazide (Telenti et al, 1997). Les mutations

dans l’InhA ou dans sa région régulatrice sont habituellement associées avec une résistance de

faible niveau et sont moins fréquentes que les mutations du gène katG. Dans les souches de M.

tuberculosis résistantes à l’INH et présentant des mutations inhA, on pourrait trouver des

mutations supplémentaires de katG qui conféreraient des niveaux plus élevés de résistance à

l’INH. La mutation katG a été retrouvée chez 33,33% des souches de M. tuberculosis dans cette

étude. Nos résultats sont similaires à ceux rapportés en Espagne par Torres et al (2002) et ceux

de Telenti et al (1997), qui ont trouvé une prévalence de 46% de la mutation C209T dans un lot

de 85 échantillons.

Environ 70-80% des résistances clin iques à l’INH peuvent être attribuées aux mutations sur les

gènes KatG et InhA (Ramaswamy et al, 1998).

Nous avons observé singulièrement des mutations au niveau du codon 315 de KatG avec une

double mutation Sr→Thr et Sr→Asp. La mutation S315T dans katG est la mutation la plus

courante dans les souches résistantes à l’INH, et se rencontre dans 50% à 95% des isolats

cliniques résistants à l’INH (Zhang et al, 2009 ; Hazbon et al, 2006).

L’existence de cette mutation expliquerait les échecs de traitement de première ligne chez les

patients. La mutation du codon 315 de katG a déjà été associée à la résistance à l’INH dans deux

précédentes études (Belay et al, 2003 ; Morlock et al, 2003) mais ces études n’ont pas trouvé de

double mutation sur le codon 315.

57

III.4 Multi Drug Résistance (MDR)

Les mutations dans les positions 531, 516 du gène rpoB que nous avons trouvées sont parmi les

mutations les plus fréquemment observées dans les souches résistantes à la rifampicine. Les

mutations dans rpoB entraînent généralement une résistance de haut niveau ainsi qu’une

résistance croisée avec toutes les rifampicines (Zhang et al, 2009).

Les mutations dans inhA ne provoquent pas seulement la résistance à l’INH, mais elles

confèrent également une résistance croisée à l’égard d’un médicament structurellement proche,

tel que l’éthionamide (Banejee et al, 1994)

Nous avons identifié une multi résistance de MTB chez 10,44% des patients (7/67), c'est -à-dire

des patients ayant présenté à la fois des mutatio ns sur le gène ropB et sur le gène Inh ou katG. Ce

taux est faible par rapport à ceux rapportés par Torres et al (2002) et Koeck (2002)

respectivement en Espagne et à Djibouti.

En Ethiopie, Tessema et al (2009) ont trouvé une prévalence de 5% d’isolats de M. tuberculosis

multi résistants une majorité des mutations observées au niveau des codons 315 du gène katG et

531 du gène rpoB. (Tessema et al, 2012).

Ce fort taux de multi résistance dans notre étude pourrait s’expliquer par la petite taille de notre

échantillon mais aussi par le fait que les patients avaient une mauvaise observance du traitement.

58

IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

CONCLUSION

Dans notre étude les mutations des gènes rpoB (codons 516, 531 et 533), katG (codon 315) et de

l’INH (codon C209T) associées à une résistance à la rifampicine et à l’isoniazide ont été

observées. Le test MTB Real -TM Résistance 8 est un test spécifique et sensible pour le

diagnostic des résistances à l’isoniazide et la rifampicine. Il présente l’avantage d’avoir un

temps de réalisation très court et donne la possibilité d’utiliser un grand nombre d’échantillons à

la fois. Ce test peut être utilisé dans les tests de diagnostic des MDR. Malheureusement le test

moléculaire par PCR en temps réel co ût très cher et en plus, il faudra des techniciens bien formés

et un plateau technique approprié pour effectuer ces types d’analyses.

Sa mise en œuvre et sa vulgarisation permettra de réduire le temps d’attente avant la mise sous

traitement. Mais il devrait être as socié à la culture pour comparer les deux techniques et évaluer

la résistance des souches aux antituberculeux.

RECOMMANDATIONS

Comme recommandations nous proposons les activités suivantes :

L’introduction des tests de biologie moléculaire dans la détection des résistances du

complexe M. tuberculosis aux antituberculeux dans les centres de référence pour les

patients en échec thérapeutique ou suspects de TB MDR.

Le diagnostic d’espèce des myco bactéries tuberculeuses et non tuberculeuses par PCR

dans les centres de référence pour évaluer les risques liés aux résistances.

Etendre les tests de résistances à tous les antituberculeux de première ligne.

59

V. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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