Biologie Moléculaire des Leucémies Biologie Moléculaire des Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM)Aigües Myéloïdes (LAM)

Master Physiopathologie cellulaire et moléculaireOPTION CANCEROLOGIE

29 septembre 2010 L.Mauvieux

Plan du coursPlan du cours

IntroductionIntroduction Mécanismes oncogéniques dans les LAMMécanismes oncogéniques dans les LAM Translocation et oncogénèse des LAMTranslocation et oncogénèse des LAM Epigénétique et LAMEpigénétique et LAM Questions sans réponses…Questions sans réponses…

IntroductionIntroduction

Les leucémies aigues myéloblastiquesLes leucémies aigues myéloblastiquesMécanismes oncogènes des LAMMécanismes oncogènes des LAM

Cellule souche

Différenciation myéloïde Différenciation lymphoïde

Précurseurs

Éléments matures

Précurseurs

Éléments maturesSang

Moelle

Différenciation normale

Cellule souche

Différenciation myéloïde Différenciation lymphoïde

Précurseurs

Éléments matures

Précurseurs

Éléments matures

Leucémie aiguëmyéloblastique

Leucémie aiguëlymphoblastique

Sang

Moelle

Éléments immatures

LEUCEMIES AIGUES

Éléments immatures

Leucémies aigues myéloblastiques Leucémies aigues myéloblastiques (LAM)(LAM)

Définition OMS: expansion clonale de cellules Définition OMS: expansion clonale de cellules blastiques myéloïdes dans la moelle osseuse, le blastiques myéloïdes dans la moelle osseuse, le sang ou autres tissussang ou autres tissus

Maladies génétiquement et phénotypiquement Maladies génétiquement et phénotypiquement hétérogèneshétérogènes

Incidence 2 à 3/100000 adultes dans pays Incidence 2 à 3/100000 adultes dans pays industrialisés (maximum US, Australie, Europe de industrialisés (maximum US, Australie, Europe de l’ouest)l’ouest)

Age moyen 65 ans, peu fréquent chez les enfantsAge moyen 65 ans, peu fréquent chez les enfants LAM = cancer = mutationLAM = cancer = mutationss Maladie hématologique hétérogène: Maladie hématologique hétérogène:

– MorphologiquementMorphologiquement– GénétiquementGénétiquement

Maladie hématologique génétiquement hétérogène: Maladie hématologique génétiquement hétérogène: – mutations somatiques, clonales de la CSHmutations somatiques, clonales de la CSH

– Pas de transmission à la descendance (rarissime)Pas de transmission à la descendance (rarissime)

– Plusieurs mutations nécessaires, de 3 à 20?Plusieurs mutations nécessaires, de 3 à 20?» Mutations ponctuellesMutations ponctuelles

» Amplifications, délétionsAmplifications, délétions

» Réarrangements chromosomiquesRéarrangements chromosomiques

Nombreux mécanismes oncogéniques découverts= Nombreux mécanismes oncogéniques découverts= espoir de thérapeutiques spécifiquesespoir de thérapeutiques spécifiques

TWO-HIT MODEL (Gilliland)TWO-HIT MODEL (Gilliland)

1) 1) Anomalies génétiques portant sur la prolifération et Anomalies génétiques portant sur la prolifération et la survie des progéniteursla survie des progéniteurs– Activation de voies de transductionActivation de voies de transduction

» Mutations activatrices de: Ras, c-kit,Mutations activatrices de: Ras, c-kit, FLT3 FLT3

» Mutations inhibant NF-1Mutations inhibant NF-1

– Inhibition de la phosphatase hématopoïétique SHP-2 (voie Inhibition de la phosphatase hématopoïétique SHP-2 (voie JAK-STAT)JAK-STAT)

– Inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (p15; p16) Inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (p15; p16) (méthylation)(méthylation)

identifiées dans 50% des LAMidentifiées dans 50% des LAM souvent exclusives les unes des autressouvent exclusives les unes des autres

2) 2) Anomalies agissant sur la différenciation Anomalies agissant sur la différenciation hématopoïétiquehématopoïétique– impliquant le plus souvent des facteurs de transcription ou impliquant le plus souvent des facteurs de transcription ou

des coactivateurs importants pour l’hématopoïèse normaledes coactivateurs importants pour l’hématopoïèse normale» Core binding factorCore binding factor (CBF) (CBF)» Récepteur de l’acide rétinoïqueRécepteur de l’acide rétinoïque» MLL (MLL (Trithorax homologTrithorax homolog))

=>Coopération des deux groupes pour déclencher la =>Coopération des deux groupes pour déclencher la pathologie pathologie – Souris transgénique PML-RARA: LAM en 6 mois (15-30%)Souris transgénique PML-RARA: LAM en 6 mois (15-30%)– Souris transgénique FLT3-ID: lymphome T en 6 moisSouris transgénique FLT3-ID: lymphome T en 6 mois– Souris reconstituée avec une moelle FLT3-ID + PML-RARA: Souris reconstituée avec une moelle FLT3-ID + PML-RARA:

100% de pénétrance avec délai raccourci100% de pénétrance avec délai raccourci

bon pronostic

mauvais pronostic

Coopération entre les mutations dans Coopération entre les mutations dans la pathogénèse des LAM la pathogénèse des LAM

FLT3-ITDFLT3-TKD

KITRAS

PTPN11JAK2

PML-RARARUNX1-RUNX1TA

CBFB-MYH11MLL fusions

CEBPaNPM1

Avantage prolifératif Altération de la différenciationEt de l’apoptose

Anomalies de Type I Anomales de Type II

Leucémogénèse: processus multi étapes(3)

réalité + complexe

CBF

RARα

Réarr MLL

Co activateurs

C/EBP

blocage de différenciation

bcr-abl

TEL-PDGFRβ

RAS

FLT3

autres TK activées

avantage prolifératif

LEUCEMIE AIGUE

WNT

Notch

Bmi-1

Hox

auto-renouvellement

apoptose?

… ?

autres…

LAM : Maladie de la cellule souche, multi-étapesLAM : Maladie de la cellule souche, multi-étapes Rares Rares famillesfamilles avec mutations du gène AML1: leucémie tardive avec mutations du gène AML1: leucémie tardive

(anomalies chromosomiques supplémentaires dans les cellules (anomalies chromosomiques supplémentaires dans les cellules

hématopoïétiques)hématopoïétiques)

détection de translocations chromosomiques associées aux leucémies détection de translocations chromosomiques associées aux leucémies

in uteroin utero [t(4;11)], la pathologie apparaissant plus tard dans la vie [t(4;11)], la pathologie apparaissant plus tard dans la vie

sang de cordonsang de cordon ombilical: transcrits de fusion ombilical: transcrits de fusion TEL–AML1TEL–AML1 et et AML1–AML1–

ETOETO 100 fois plus fréquents que la prévalence de la leucémie aiguë 100 fois plus fréquents que la prévalence de la leucémie aiguë

correspondante dans la populationcorrespondante dans la population

Existence de pathologies évoluant progressivement vers la leucémie Existence de pathologies évoluant progressivement vers la leucémie

aigue myélolastiqueaigue myélolastique

Owen CJ, Blood. 2008 Aug 21

Anomalies géniquesAnomalies géniques

« « Bruit » chromosomiqueBruit » chromosomique (aléatoire)? (aléatoire)? Anomalies primairesAnomalies primaires

– précocesprécoces– confère le caractère oncogéniqueconfère le caractère oncogénique

Anomalies secondairesAnomalies secondaires– au cours de l ’évolution de la maladieau cours de l ’évolution de la maladie– influe sur la progressioninflue sur la progression– modifie phénotype tumoralmodifie phénotype tumoral

ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES ORIGINE GENETIQUE ACQUISE DES LEUCEMIES :REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES LEUCEMIES :REMANIEMENTS CHROMOSOMIQUES

(DE L'ADN)(DE L'ADN)

Hyperdiploidie 50-65 chromosomesHypodiploidie 26-34 chromosomes

CONSEQUENCES MOLECULAIRES DESCONSEQUENCES MOLECULAIRES DESREMANIEMENTS REMANIEMENTS

CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE CHROMOSOMIQUES :MODIFICATION DE GENES CIBLESGENES CIBLES

Caryotype (cytogénétique conventionelle)

IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21) IGH/CCND1

Peinture chromosomique

Multi-FISH

Gènes impliqués dans les translocations

Ce sont très souvent des facteurs de transcription qui interviennent Ce sont très souvent des facteurs de transcription qui interviennent dans la « maintenance » des CSH et dans l’hématopoïèse précoce dans la « maintenance » des CSH et dans l’hématopoïèse précoce (oncogènes)(oncogènes)

Cheminement de la découverte des fonctions de ces oncogènes:Cheminement de la découverte des fonctions de ces oncogènes:– 1 - d’abord par la compréhension de la pathologie maligne1 - d’abord par la compréhension de la pathologie maligne: les : les leucémiesleucémies

– 2 - Certaines anomalies chromosomiques récurrentes de ces 2 - Certaines anomalies chromosomiques récurrentes de ces leucémiesleucémies

– 3 – des modèles animaux modifiés (Tg; KO)3 – des modèles animaux modifiés (Tg; KO)

Anomalies chromosomiques = guideAnomalies chromosomiques = guide Permet le clonage des gènes responsablesPermet le clonage des gènes responsables Compréhension de la physiopathologieCompréhension de la physiopathologie Marqueur de clonalité / Facteur pronosticMarqueur de clonalité / Facteur pronostic Cible thérapeutique potentielleCible thérapeutique potentielle

– molécule spécifique éventuelle molécule spécifique éventuelle (acide rétinoique)(acide rétinoique)

– Adaptation du traitement en fonction de critères Adaptation du traitement en fonction de critères pronostics associés aux différentes anomaliespronostics associés aux différentes anomalies

●Récepteurs-FLT3-PML-RARA

●Transduction du signal-Ras

                

NoyauSurveillance intégrité ADN

p53

●Cycle cellulaire -p27 -p15

● Activation gènes de la différenciation: -AML1-RARA

●Facteurs de transcription-AML1, MYH11-ETV6 (TEL)-MLL…

Modification épigénétiquesADN, histones, miRNA

Oncogénèse des LAM:Cibles multiples

LAM et translocations LAM et translocations chromosomiqueschromosomiques

Elles sont réciproques, stables et équilibréesElles sont réciproques, stables et équilibrées Entraînent la fabrication d’un transcrit de fusion et Entraînent la fabrication d’un transcrit de fusion et

d’une protéine chimérique avec de nouvelles d’une protéine chimérique avec de nouvelles propriétés qui va interférer avec la maturation propriétés qui va interférer avec la maturation myéloidemyéloide

récurrentesrécurrentes Particularité: dans les LAM qui apparaissent après un Particularité: dans les LAM qui apparaissent après un

traitement avec des agents alkylants, s’accompagnent traitement avec des agents alkylants, s’accompagnent de délétions de chromosomes 5 et 7de délétions de chromosomes 5 et 7

Mécanismes oncogènes principaux dans les LAMMécanismes oncogènes principaux dans les LAM Peu de mutations prédisposantes transmissibles ont été trouvéesPeu de mutations prédisposantes transmissibles ont été trouvées Translocations chromosomiques réciproquesTranslocations chromosomiques réciproques nombreuses: nombreuses:

– Découverte des gènes impliquésDécouverte des gènes impliqués– Cassures de l’ADN: au hasard?Cassures de l’ADN: au hasard?– Rôle de la structure chromatinienne:Rôle de la structure chromatinienne:

» « accessibilité »« accessibilité »

– Sites sensibles spécifiques:Sites sensibles spécifiques:» ADN topoisomérasesADN topoisomérases» Sites hypersensibles à la DNaseSites hypersensibles à la DNase» Séquences AluSéquences Alu

Mutations de gènes Mutations de gènes (FLT3, NPM1), fréquentes en l’absence de (FLT3, NPM1), fréquentes en l’absence de translocationstranslocations

Classification des LAMClassification des LAM (OMS, 2001, 2008) (OMS, 2001, 2008)– Distingue les LAM avec anomalies chromosomiques Distingue les LAM avec anomalies chromosomiques

récurrentes des autresrécurrentes des autres

Analyse génomique du locus 11q23 (gène MLL)Analyse génomique du locus 11q23 (gène MLL)

Impliqué dans 15% des LAMImpliqué dans 15% des LAM > 70 translocations, >50 gènes partenaires > 70 translocations, >50 gènes partenaires

différents décritsdifférents décrits Dans la très grande majorité corrélée à un mauvais Dans la très grande majorité corrélée à un mauvais

pronostic de la maladiepronostic de la maladie

MLL (Mixed lineage leukemia)MLL (Mixed lineage leukemia)

2 domaines de fixation à l’ADN2 domaines de fixation à l’ADN 1 domaine méthyl-transférasse1 domaine méthyl-transférasse Un bromodomaine (fixation protéines)Un bromodomaine (fixation protéines) 1 domaine de transactivation (fixation CBP, activation HOX)1 domaine de transactivation (fixation CBP, activation HOX) 1 domaine de type SET (homologies trithorax drosophile+++)1 domaine de type SET (homologies trithorax drosophile+++)

– Activité methyltransferase , notamment sur gènes HOX cruciaux pour le Activité methyltransferase , notamment sur gènes HOX cruciaux pour le développementdéveloppement

SETZn-fingerZn-finger Bromo TADFY

ADN chromatine CBP méthylation

chromatine

SLN

1-Analyse génomique des points 1-Analyse génomique des points de cassure des translocations (1)de cassure des translocations (1)

Les points de cassure ne sont pas distribués au Les points de cassure ne sont pas distribués au

hasard dans le gènehasard dans le gène Situés sur des « clusters » introniques (BCRs)Situés sur des « clusters » introniques (BCRs) Des biais de localisation ont été montrés:Des biais de localisation ont été montrés:

– BCRs des t(4;11) chez l’enfant par rapport à l’adulteBCRs des t(4;11) chez l’enfant par rapport à l’adulte

– Entre des leucémies de novo et secondaires à un Entre des leucémies de novo et secondaires à un traitement par chimiothérapie et/ou radiothérapietraitement par chimiothérapie et/ou radiothérapie

– => mécanismes probablement différents!!!=> mécanismes probablement différents!!!

BCRs des t(4;11) chez l’enfant par rapport à l’adulteEntre des leucémies de novo et secondaires à un traitement par chimiothérapie et/ou radiothérapie=> mécanismes probablement différents!!!

2-Analyse des séquences nucléotidiques 2-Analyse des séquences nucléotidiques aux points de cassure des translocations aux points de cassure des translocations

Séquences aux points de cassure: très peu d’homologie de Séquences aux points de cassure: très peu d’homologie de séquence (parfois séquences Alu- discuté)séquence (parfois séquences Alu- discuté)

Les points de cassure colocalisent avec des éléments de la Les points de cassure colocalisent avec des éléments de la structure chromatinienne:structure chromatinienne:– Sites de clivage de la topoisomérases IISites de clivage de la topoisomérases II

– Sites hypersensibles à la DNase 1Sites hypersensibles à la DNase 1

– SARs (scaffold attachment régions)SARs (scaffold attachment régions)

=> impliquées dans la survenue des translocations=> impliquées dans la survenue des translocations

MLL, topoisomérases et translocationsMLL, topoisomérases et translocations La topoisomérase II catalyse la relaxation des doubles La topoisomérase II catalyse la relaxation des doubles

brins d’ADN :brins d’ADN :– « Nick » de 4 bases au niveau de son site de fixation« Nick » de 4 bases au niveau de son site de fixation– Permet le passage d’une seconde hélice d’ADNPermet le passage d’une seconde hélice d’ADN– Réparation de l’ADNRéparation de l’ADN

Essentielle dans:Essentielle dans:– Condensation chromatinienneCondensation chromatinienne– Transcription, réplication, apoptose…Transcription, réplication, apoptose…

Drogues inhibant la topoisoméraseDrogues inhibant la topoisomérase– Stabilisation du complexe de clivage (poison)Stabilisation du complexe de clivage (poison)– Inhibition catalytique de l’enzyme Inhibition catalytique de l’enzyme

Aliments contiennent des éléments interagissant avec la Aliments contiennent des éléments interagissant avec la topoII (flavonoïdes, caféine, phénols des plantes):topoII (flavonoïdes, caféine, phénols des plantes):– Ex: café, pommes, oignons, soja, fruits rouges, thé, chocolat…Ex: café, pommes, oignons, soja, fruits rouges, thé, chocolat…

Gilliland, D. G. et al. Hematology;2004:80-97

Modèle de lésions induites par l’ADN topoisomérase II dans la survenue de translocation impliquant MLL

Gene MLL – chromosome 11q23

BamH1

Lovett, Brian D. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9802-9807

Sites sensibles à la topoisomérase II dans Sites sensibles à la topoisomérase II dans t(4;11)

Autoradiographs of cleavage products after 10 min incubation of 25 ng (30 000 c.p.m.) singly 5' end-labeled DNA with 147 nM human DNA topoisomerase II      

Oncogene (2003) 22, 8448–8459 Ryan J Whitmarsh et al.

Sites sensibles à la topoisomérase II dans Sites sensibles à la topoisomérase II dans t(9;11)

Éléments chromatiniens impliqués Éléments chromatiniens impliqués dans les translocationsdans les translocations

Beaucoup de sites HS Dnase sont Beaucoup de sites HS Dnase sont associés avec:associés avec:– Éléments génomiques régulateurs de la Éléments génomiques régulateurs de la

transcriptiontranscription– SARSSARS

Les SARS définissent les sites Les SARS définissent les sites d’attachement dans la matrice nucléaire d’attachement dans la matrice nucléaire des boucles de l’ADN pendant des boucles de l’ADN pendant l’interphase ou la métaphasel’interphase ou la métaphase

Zones de fragilité liée au propriétés de Zones de fragilité liée au propriétés de déroulement de l’ADN de certaines des déroulement de l’ADN de certaines des protéines qui les composentprotéines qui les composent

22ièmeième exemple: exemple:Facteurs de transcription : CBFs Facteurs de transcription : CBFs (core binding factors) et LAM(core binding factors) et LAM

Facteur de transcription dimérique:Facteur de transcription dimérique:

-CBF-CBF: AML1 (RUNX1): AML1 (RUNX1)

-CBF-CBF: MYH11: MYH11

1) Core binding factors (CBFs) dans les LAM1) Core binding factors (CBFs) dans les LAM CBF est un facteur de transcription hétérodimérique CBF est un facteur de transcription hétérodimérique

constitué de:constitué de:– CBFCBF =AML1 = RUNX1 (21q22.3) =AML1 = RUNX1 (21q22.3)

– CBFCBF (16q22.1) (16q22.1)

Rôle majeur dans l’hématopoïèse:Rôle majeur dans l’hématopoïèse:

Impliqués dans des translocations récurrentes des LAM:Impliqués dans des translocations récurrentes des LAM:– t(8;21)(q22;q22) t(8;21)(q22;q22) ETO-AML1 (10 à 15% des LAM) ETO-AML1 (10 à 15% des LAM)

– t(3;21)(q26;q22) t(3;21)(q26;q22) AML1-EVI1 (<1%) AML1-EVI1 (<1%)

– inv16(p11;q22) inv16(p11;q22) CBFb-MYH11 (10% des LAM) CBFb-MYH11 (10% des LAM)

– Sans compter t(12;21) TEL-AML1 dans 30% des LAL de l’enfantSans compter t(12;21) TEL-AML1 dans 30% des LAL de l’enfant

Mutations ponctuelles de AML1Mutations ponctuelles de AML1

Conséquences des anomalies CBFConséquences des anomalies CBF

Souris KO CBFSouris KO CBF ou AML1: ou AML1:– mort à J11.5 du développementmort à J11.5 du développement

– pas d’hématopoïèse définitivepas d’hématopoïèse définitive

Ces trois translocations inhibent la fonction normale de Ces trois translocations inhibent la fonction normale de CBF, les transcrits chimériques pouvant:CBF, les transcrits chimériques pouvant:– Recruter des hitones déacétylases (HDAC)Recruter des hitones déacétylases (HDAC)

– Des co-represseurs (NCOR1, NCOR2, Sin3ADes co-represseurs (NCOR1, NCOR2, Sin3A

– En recrutant des méthyl transférasesEn recrutant des méthyl transférases

Souris Transgénique AML1-ETO: effet « immortalisant » Souris Transgénique AML1-ETO: effet « immortalisant » des progéniteursdes progéniteurs

Anomalies des CBFs associées à un pronostic favorableAnomalies des CBFs associées à un pronostic favorable

Localisation des points de Localisation des points de cassure dans RUNX1/AML1cassure dans RUNX1/AML1

35 patients avec t(8;21)- AML1 -ETO: point de 35 patients avec t(8;21)- AML1 -ETO: point de cassure génomique dans l’intron 5cassure génomique dans l’intron 5

10 patients avec t(3;21) – AML1-EVI1: introns 5 et 10 patients avec t(3;21) – AML1-EVI1: introns 5 et 7a7a

TEL-AML1 : leucémies aiguës lymphoblastiques: TEL-AML1 : leucémies aiguës lymphoblastiques: point de cassure différentpoint de cassure différent

Yanming Zhang, Janet D. Rowley. dna repair 5 ( 2 0 0 6 ) 1282–1297

Sites sensibles topoII - DNase gène AML1Sites sensibles topoII - DNase gène AML1

Colocalisation des points de cassureColocalisation des points de cassure– Les sites topoisomérase IILes sites topoisomérase II– les sites hypersensibles à la Dnase I…les sites hypersensibles à la Dnase I…

……colocalisation des points de cassure avec le niveau colocalisation des points de cassure avec le niveau d’énergie libre nécessaire pour dérouler l’ADN super-d’énergie libre nécessaire pour dérouler l’ADN super-enrouléenroulé

Niveau d’énergie libre ADN du gène AML1Niveau d’énergie libre ADN du gène AML1

Les zones d’énergie libre faible colocalisent avec Les zones d’énergie libre faible colocalisent avec les points de cassure dans:les points de cassure dans:– AML1, ETOAML1, ETO

– mais aussi montré pour BCR, ABL, MLLmais aussi montré pour BCR, ABL, MLL

Les sites de clivage topoII et l’energie libre les Les sites de clivage topoII et l’energie libre les plus faibles sont probablement des sites plus faibles sont probablement des sites vulnérables pour les cassures, réparées ensuite par vulnérables pour les cassures, réparées ensuite par des mécanismes de réparation « non homologue » des mécanismes de réparation « non homologue » (NHEJ: non-homologous end-joining)(NHEJ: non-homologous end-joining)

Oncogénèse des LAM etOncogénèse des LAM etLigands des récepteurs aux Ligands des récepteurs aux

hormoneshormones

L’histoire d’un succès thérapeutiqueL’histoire d’un succès thérapeutique

Translocations récurrentes du chr Translocations récurrentes du chr 17q21dans 5-8% des LAM17q21dans 5-8% des LAM

Arrêt de maturation au stade Arrêt de maturation au stade promyélocytairepromyélocytaire

cassure dans le gène du récepteur à cassure dans le gène du récepteur à l’acide rétinoïquel’acide rétinoïque (RARA (RARA

Les ligands de ce récepteur ont un Les ligands de ce récepteur ont un rôle fondamental dans la rôle fondamental dans la différenciation de la lignée différenciation de la lignée granuleusegranuleuse

Léucémies aigues Léucémies aigues promyélocytairespromyélocytaires

– récepteur nucléaire de l’acide rétinoïquerécepteur nucléaire de l’acide rétinoïque

– liaison à l’ADN (RARE) après hétérodimérisation avec un autre liaison à l’ADN (RARE) après hétérodimérisation avec un autre

récepteur nucléaire RXRrécepteur nucléaire RXR

– FT°, régulateur transcriptionnel « hormone-inductible »FT°, régulateur transcriptionnel « hormone-inductible »

– régulation de gènes cibles en présence d’ARrégulation de gènes cibles en présence d’AR

– rôle dans la maturation myéloïderôle dans la maturation myéloïde

Structure et fonction des protéines partenaires

1- RAR (17q21)

A

activation transcriptionnelle AF-1

Liaison ADN

Coiled-coil domain

Fixation ligand

Hétérodimérisation

Activation transcriptionnelle AF-2

Liaison co-Act, co-R

inconnu

B C D E F

5’-AGGTCA (N)5 AGGTCA-3’5’-AGGTCA (N)5 AGGTCA-3’3’-TCCAGT (N)5 TCCAGT-5’3’-TCCAGT (N)5 TCCAGT-5’

Fonction physiologique de RAR (en absence d’acide rétinoïque)

DEACETYLATION

REPRESSION de la

TRANSCRIPTION

(compaction chromatine)

RXR

RAR

- dimérisation RAR-RXR

RARE

– fixation sur seq régulatrices (RE) de gènes cibles

SMRTHDAC

- intervention de corépresseurs Ncor et SMRT qui recrutent des histones desacétylases (HDAC)

HAT

- Recrutement d’ histones acétyltransférases (HAT)

Fonction physiologique de RAR (en présence d’acide rétinoïque)

SRC-1

Ac

Ac

Ac

ACETYLATION

ACTIVATION de la TRANSCRIPTION

(ouverture chromatine)

DIFFERENCIATION MYELOIDE

- AR: liaison à RARα détachement des corépresseurs et le recrutement de coactivateurs (SRC1, CBP)

RXR

RAR

SMRT

RARE

Ac. Rétinoïque

(doses physiologiques)

– fonctions mal connues

– effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques

=> contrôle de la prolifération et de la survie cellulaire

– localisation nucléoplasmique et corps nucléaires ( association à d’autres protéines : CBP, Daxx, ..)

– CBP: favorise acétylation des histones activ° transcription l’interaction CBP-PML peut expliquer les effets modulateurs de PML sur la transcription

- Daxx : voie apoptotique

- PML-/-: aN de la différenciation

– domaine de dimérisation

2- PML (15q22)

D- Protéine de fusion X-RAR

N/RAR

PML (15q22)Promyelocytic Leukemia

PLZF (11q23)Promyelocytic Leukemia Zinc Finger

NMP (5q35)Nucleophosmine

NuMA (11q13)Nuclear Matrix Associated

fig. 3

RAR (17q21)

Maintien des domaines importants de chacun des partenaires:

- PML: motif RBCC (homodimérisation et interaction protéine-protéine)

- RAR: fixation ADN, activation transcription en présence ligand, hétérodimérisation RXR

B C D E FPML

RAR

3 4 5 6

3 4 5 6 3

3

3

bcr 1 (L type)

bcr 2 (V type)

bcr 3 (S type)

Protéine de fusion PML-RAR

1- structure

3

3 transcripts majeurs PML/RAR

- PML-RAR: formation hétérodimères RXR formation homodimères PML-RAR - PML-RAR

- RAR: affinité pour les corépresseurs > RXR, liaison plus forte avec N-coR et SMRT recrutement HDAC

effet dominant négatif répression de transcription aux doses

physiologiques d’AR

Protéine de fusion PML-RAR

2- conséquences fonctionnelles : modification fonction RAR

HDAC

RARE

RAR

PML

PML

RAR

DEACETYLATION

REPRESSION de la

TRANSCRIPTION

(compaction chromatine)

SMRTSMRT

Ac. Rétinoïque

(doses physiologiques)

Protéine de fusion PML-RAR

3- impact thérapeutique : effet de doses pharmacologiques d’AR- affinité coR > pour X-RAR

- déplacement courbe d’activation gènes cibles par l’AR vers des C° + fortes

-doses pharmacologiques d’AR (ATRA): détachement coR et HDAC recrutement HAT reprise de la différenciation

HAT

SRC-1

Ac

Ac

Ac

ACETYLATION

ACTIVATION de la TRANSCRIPTION

(ouverture chromatine)

REPRISE de la DIFFERENCIATION MYELOÏDE

RARE

SMRTSMRT

Ac. Rétinoïque

(doses pharmacologique

s)

RAR

PML

PML

RAR

Protéine de fusion PML-RAR

4- conséquences fonctionnelles : modification fonction PML

- PML-RAR : effet dominant négatif sur fonction de PML ?

- 4 membres de la même famille impliqués ds protéines de fusion oncogène rôle propre de PML ds leucémogénèse ?

- PML: rôle antiprolifératif et pro-apoptotique

- PML-RAR: délocalisation de PML et de ses protéines partenaires (CBP et Daxx) en DH des corps nucléaires.

délocalisation dysfonctionnement ?

- blocage effet antiprolifératif et apoptose prolifération cellulaire?

- mécanisme d’action commun:

- effet dominant négatif de la protéine chimérique.

- blocage de la différenciation myéloïde

- effet thérapeutique dépendant de la nature du produit de fusion:

- AR efficace sur NPM-RAR et sur NuMA-RAR

- aucun effet sur PLZF-RAR (PLZF :domaine suppl d’intéraction avec co-R, insensible à action AR)

- AsO3 semble avoir un effet propre sur PML (relocalisation ds CN)

Autres protéines de fusion X-RAR

Modifications épigénétiquesModifications épigénétiques

Méthylation de l’ADNMéthylation de l’ADN Modification des histones:Modification des histones:

– AcetylationAcetylation– MéthylationMéthylation– Ubiquitination….Ubiquitination….

MicroRNA (miRNA)MicroRNA (miRNA)

miRNAmiRNA

Niveau supplémentaire de régulation Niveau supplémentaire de régulation cellulairecellulaire

Impliqués dans l’apoptose, la Impliqués dans l’apoptose, la differentiation, la prolifération cellulairedifferentiation, la prolifération cellulaire

Altération des miRNA impliqués dans de Altération des miRNA impliqués dans de nombreux cancers dont les LAMnombreux cancers dont les LAM– ex mir-17-92 cluster (oncogène)ex mir-17-92 cluster (oncogène)– -mir 155-mir 155

miR-17-92 clustermiR-17-92 cluster

Polycistron sur le chr 13q31 contenant 7 Polycistron sur le chr 13q31 contenant 7 micro-RNA différentsmicro-RNA différents

Impliqués dans différents cancers Impliqués dans différents cancers (lymphome, prostate, colon, poumon…)(lymphome, prostate, colon, poumon…)

sa transduction entraîne un augmentation de sa transduction entraîne un augmentation de la prolifération des progéniteurs la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques chez la souris hématopoïétiques chez la souris

miR-155miR-155

Rôle important dans la mégacaryopoïèse, Rôle important dans la mégacaryopoïèse, l’erythropoièse, la lymphopoïèsel’erythropoièse, la lymphopoïèse

Souris transgéniques miR-155: prolifération Souris transgéniques miR-155: prolifération lymphoïde Blymphoïde B

Surexprimé dans les LAM qui présentent Surexprimé dans les LAM qui présentent une différenciation monocytaireune différenciation monocytaire

miRNA et leucémiesmiRNA et leucémies

Nombreuses Nombreuses cibles potentielles cibles potentielles médicamenteusesmédicamenteuses

ConclusionsConclusions LAM: complexité et hétérogéneité des LAM: complexité et hétérogéneité des

mécanismes de l’oncogénèsemécanismes de l’oncogénèse Quel est l’ordre de survenue de ces Quel est l’ordre de survenue de ces

anomalies?anomalies? Comment les événements ont conduit à la Comment les événements ont conduit à la

survenue de la leucémie?survenue de la leucémie? Dans quelles cellules surviennent les Dans quelles cellules surviennent les

anomalies génétiques:anomalies génétiques:– Cellules souches leucémiques?Cellules souches leucémiques?

La cellule souche leucémique (CSL)La cellule souche leucémique (CSL)

Toutes les cellules leucémiques ne sont pas en Toutes les cellules leucémiques ne sont pas en cycle (1970, Clarkson)cycle (1970, Clarkson)

Une fraction minoritaire CD34+ CD38- isolées de Une fraction minoritaire CD34+ CD38- isolées de LAM peut donner des LAM dans des modèles de LAM peut donner des LAM dans des modèles de transplantation multiple transplantation multiple – Expriment des antigènes différents de la CSH normalesExpriment des antigènes différents de la CSH normales

Il existe des arguments en faveur:Il existe des arguments en faveur:– De cellules souches primitives leucémiquesDe cellules souches primitives leucémiques– De progéniteurs ayant ré-acquis des propriétés d’auto-De progéniteurs ayant ré-acquis des propriétés d’auto-

renouvellementrenouvellement– De cellules intermédiairesDe cellules intermédiaires

Rôle de l’environnement probable (réactions Rôle de l’environnement probable (réactions immunes, infections…)immunes, infections…)

Mutations ponctuelles et leucémies Mutations ponctuelles et leucémies aigues myéloblastiquesaigues myéloblastiques

Impliquant la transduction du signal: Impliquant la transduction du signal: exemples:exemples:– FLT3FLT3– RASRAS

NPM1NPM1

Parcells, B. W. et al. Stem Cells 2006;24:1174-1184

FLT3 receptor

•Récepteur Mb à activité Tyr kinase exprimé à un haut niveau dans les progéniteurs et dans les LAM

•fréquemment muté dans les LAM (35%)

•mutation ponctuelle D835 exon20: boucle d’activation du deuxième domaine tyrosine kinase de FLT3 Dans 15% des cas:

•duplication interne en tandem dans l’exon 14 (de quelques bases à >150 bp) Dans 20-25% des LAM,

•La duplication intercale un peptide dans la boucle d’activation: modification de la structure

•Toujours dans le cadre de lecture

•Activation constitutive de la kinase

Parcells, B. W. et al. Stem Cells 2006;24:1174-1184

Activation de FMS-like tyrosine kinase-3 receptor (FLT-3)

Mutations RasMutations Ras Famille Ras: Famille Ras:

protéines associées à protéines associées à la membrane, la membrane, régulant la régulant la transduction du transduction du signal secondaire à signal secondaire à la fixation d’un la fixation d’un ligand ligand

3 types: N, K, H-Ras3 types: N, K, H-Ras Les mutations de Les mutations de

confèrent une confèrent une activation activation constitutive de Ras constitutive de Ras qui reste lié au GTPqui reste lié au GTP

Mutations de Ras dans les LAMMutations de Ras dans les LAM Détectées dans hémopathies myéloïdes (23%)Détectées dans hémopathies myéloïdes (23%) Étude de 1107 patients Étude de 1107 patients (Bowe, Blood, 2005)(Bowe, Blood, 2005)

– Mutations de K-RAS: (exons 12): 11% (sur 1107 Mutations de K-RAS: (exons 12): 11% (sur 1107 patients)patients)

– Mutations de N-RAS (exons 12 et 13): 5% des patientsMutations de N-RAS (exons 12 et 13): 5% des patients

– Mutations de H-RAS Associées à certains types Mutations de H-RAS Associées à certains types morphologiques: LAM myélomonocytairesmorphologiques: LAM myélomonocytaires

Sur-représenté dans certains groupes Sur-représenté dans certains groupes cytogénétiques (t(15;17), inv16))cytogénétiques (t(15;17), inv16))

Peu d’influence sur la survie ou sur les rechutesPeu d’influence sur la survie ou sur les rechutes, , résistance au traitement…en analyse univariée ou résistance au traitement…en analyse univariée ou multivariéemultivariée

Mutations ponctuelles et LAMMutations ponctuelles et LAM

1)1) FLT3FLT3

2)2) RASRAS

3)3) NPM1NPM1

Mutations de NPM1Mutations de NPM1 NPM1 = nucléophosmineNPM1 = nucléophosmine Localisée dans le nucléole, supposée être une protéine Localisée dans le nucléole, supposée être une protéine

chaperon facilitant le transport de protéines ribosomales à chaperon facilitant le transport de protéines ribosomales à travers la membrane nucléairetravers la membrane nucléaire

Cassure de NPM1 observée dans des LA Cassure de NPM1 observée dans des LA promyélocytaires (NPM-RARA) et dans 8% des promyélocytaires (NPM-RARA) et dans 8% des lymphomes non hodgkinien (NPM-ALK)lymphomes non hodgkinien (NPM-ALK)

MutéMuté au niveau de l’exon 12 dans 35% des LAM de novo au niveau de l’exon 12 dans 35% des LAM de novo En l’absence d’anomalies de FLT3, les LAM avec En l’absence d’anomalies de FLT3, les LAM avec

mutation de NPM1 ont un meilleur pronostic.mutation de NPM1 ont un meilleur pronostic. Les 2 types d’anomalies entraînent une altération de sa Les 2 types d’anomalies entraînent une altération de sa

localisation dans la cellule, empêchant sa fonction normalelocalisation dans la cellule, empêchant sa fonction normale La mutation de NPM1 est un facteur indépendant de bon La mutation de NPM1 est un facteur indépendant de bon

pronostic dans les LAM pronostic dans les LAM

« signature » « signature » d’expression génique d’expression génique liée à la mutation de liée à la mutation de NPM1NPM1

Expression de Expression de nombreux gènes du nombreux gènes du développement HOX et développement HOX et CD34CD34

Cette signature est Cette signature est prédictive de la prédictive de la mutation de NPM1mutation de NPM1

Verhaak et al, 2005