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Biologie Moléculaire

Compétences Techniques

Compétences

Micropipetage

Préparation de solutions

Travailler avec les concentrations

Dilutions

Quantités

Électrophorèse sur gel d’agarose

Micropipetage- Mesurer de petits volumes

Permet la mesure de microlitres (µL)

1 000 X moins que 1 millilitre

2-20 µL 50-200 µL 100-1000 µL

Max. 0.02 mL 0.2mL 1mL

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Réglage du volume- P20

Dizaines (0, 1=10 or 2=20)

Unités (0-9)

Décimale (1-9 = 0.1-0.9)

Réglage du volume- P200

Centaines (0, 1=100 ou 2=200)

Dizaines (0, 1-9=10-90)

Unités (1-9)

Réglage du volume - P1000

Milliers (0, 1=1000)

Centaines (0, 1-9=100-900)

Dizaines (0, 1-9=10 - 90)

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Utilisation du micropipetteur

Étape 1

Insérer embout

Étape 2

Peser piston

jusqu’au

Premier arrêt

Étape 3

Insérer embout dans la

solution a être prise

Étape 4

Aspirer l’échantillon en

relâchant lentement le piston

Étape 5

Retirer pipetteur

Livraison

Commencer à livrer 1er arrêt =livrer 2e arrêt = expulsion

Directives pour reproductibilité optimale

Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré

VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON

PROFONDEUR D’IMMERSION consistante

3-4mm sous la surface

EVITER les bulles d’airs

Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur

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Préparation des Solutions

Définitions

Solution

Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique

Solution composée de deux composantes

Soluté

– Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la

plus petite quantité

Solvant (OU Diluent)

– Partie de la solution dans laquelle le soluté est

dissout – Habituellement le plus grand volume

Concentration = Quantité de soluté

Quantité de solution (Pas solvant)

Trois façons d’exprimer les concentrations:

Concentration Molaire (Molarité)

Pourcentages

Masse par volume

Concentrations

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Molarité

No de Moles de soluté/Litre de solution

Masse de soluté/PM de soluté = Moles de

soluté

Moles de soluté/vol en L de solution = Molarité

Pourcentages

Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que :

V/V – volume de soluté/100 mL de solution

M/M – Masse de soluté/ 100g de solution

M/V – Masse de soluté/100 mL de solution

Tous représentent des fractions de 100

Pourcentages (suite)

%V/V

Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5%

Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas!

%M/V

Ex. 16g soluté/50mL solution =32%

Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas!

% M/M

Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9%

Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas!

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Les Dilutions

La Réduction d’une Concentration

Une Fraction

Dilutions

Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes

Exemple : Faire du jus d’orange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus d’orange congelé avec trois (3) cannettes d’eau

Dilutions (suite)

Les dilutions sont exprimées comme le volume de la solution étant diluée par le volume total final de la dilution

Dans l’exemple du jus d’orange, la dilution serait exprimée comme 1/4, pour une cannette de jus à un TOTAL de quatre cannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vous diriez pour l’exemple du jus : « un dans quatre ».

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Dilutions (suite)

Un autre exemple :

Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux).

Dilutions (suite)

Un autre exemple :

Une (1) partie d’acide concentré est diluée avec 100 parties d’eau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie d’acide + 100 parties d’eau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite “un dans cent un ”.

Dilutions (suite)

Remarquez que les dilutions n’ont pas d’unités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre

Exemple : 1/10 ou « un dans dix»

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Dilutions (suite)

Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus d’une partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée.

Dilutions (suite)

Exemple: Deux (2) parties d’un colorant sont diluées avec huit (8)

parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution est initialement exprimée comme 2/10, mais la substance originale doit être exprimée comme étant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliser une équation de rapport et de proportion. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose :

__2 parties de colorant = ___1.0___ Volume total de 10 parties x 2 x = 10 x = 5 La dilution est exprimée comme étant 1/5.

Dilutions (suite)

La dilution n’est pas toujours comme des nombres entiers. Exemple: Deux parties (2) de sang sont diluées avec cinq (5) parties

de saline. Le volume total de solution est sept (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore une fois, ceci est calculé en utilisant une équation de rapports et de proportions. Rappelez-vous que les dilutions sont exprimées en terme de 1 à quelque chose:

__2 parties de sang_____ = ___1.0___ Volume total de 7 parties x 2 x = 7 x = 3.5 La dilution est exprimée comme 1/3.5

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Qu’est que cela veut dire??

Si une solution possède une dilution de 1/10 le nombre représente 1 partie de l’échantillon ajouté à 9 parties de diluant.

Si cette solution était préparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvent doivent être utilisés?

Ceci représente 1 partie d’échantillon ajoutée à 9 parties de diluant.

En autres mots, quel est le volume de 1 partie et de 9 parties?

Facteur de Dilution

EXEMPLE: Quel est le facteur de dilution si vous ajoutez 0.1 mL d’un spécimen à 9.9 mL de diluant? Le volume final est égal au volume de l’échantillon

PLUS le volume du diluent: 0.1 mL + 9.9 mL = 10 mL

Le facteur de dilution est égal au volume final diviser par le volume de l’échantillon : 10 mL/0.1 mL = Facteur de dilution de 100X

Exemple d’un Problème

Quel est le facteur de dilution quand 0.2 mL est ajouté à 3.8 mL de diluant?

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Dilutions en série

Si une dilution de 1/8 d’une solution mère est faite suivie par une dilution de 1/6 quelle est la dilution finale?

La dilution finale est: 1/8 x 1/6 = 1/48

Dilutions

Moyen de réduire une concentration

Dilution: Une fraction du facteur de dilution

Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et

désirez une solution de 5mg/mL

Facteur de dilution = Conc. que j’ai

Conc. que je veux

Facteur de dilution = 25mg/mL

5mg/mL = 5X

Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties Totales

Exemple

Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL d’une solution de 2mM à partir d’un mère de 0.1M

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Quantités

Les quantité ne sont PAS égales aux concentrations!

Ex 1.

Deux pommes par sac = une concentration

Deux pommes = une quantité

Ex 2.

10g par 100 mL = une concentration

10g = une quantité

D’une concentration aux quantités

La concentration indique la quantité dans un volume donné

Ex. 1mM = 1millimole par chaque litre

Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole

Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimoles?

Électrophorèse sur Gel d’Agarose

Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins d’après leur taille et leur conformation

Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp

Pouvoir de résolution entre fragments ≥100pb

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Migration Sur Gel d’Agarose Puit

Direction de

migration

Haut (-)

Bas (+)

Super enroulé

Relâché

Linéaire

Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel d’agarose?

Est-ce qu’il y a de l’ADN

Combiens de conformations

Combien de fragments

Taille des fragments

Taille totale des molécules d’acides nucléiques

Nombre de coupures

Linéaire?

Circulaire?

Profil de Migration sur Agarose

Distance de Migration

Log d

e la

tail

le

1.0%

1.5%

Résolution

Résolution

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Taille (pb) Distance (mm)

23,000 11.0 9,400 13.0 6,500 15.0 4,400 18.0 2,300 23.0 2,000 24.0

100

1,000

10,000

100,000

0 5 10 15 20 25 30

Distance, mm

Taille

pair

e d

e b

ase

B

A

Déterminer les tailles