MEMOIRE DE MAGISTER - univ-oran1.dz

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ORAN

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE APPLIQUEE

MEMOIRE DE MAGISTER

Spécialité : Microbiologie

Option : Phytopathologie et phytopharmacie

Sujet

Présenté par:

Mr SI MOHAMMED ABDESLEM

Devant les membres de jury : Mr KIHAL.M Professeur à l’université Es-Sénia Président

Mr SLIMANI.M Professeur à l’université Es-Sénia Examinateur

Mr HADADJI.M Maître de conférence à l’université Es-Sénia Examinateur

Mr HENNI. J.E Professeur à l’université Es-Sénia Rapporteur

Mme HAMINI KADAR.N Maître assistante à l’université Es-Sénia Co-rapporteur

Etude de la compatibilité végétative chez des populations de

Fusarium oxysporum isolées dans l’ouest Algérien

Remerciements

Dédicace

Sommaire

-Résumé

-Introduction .............................................................................................................. p01

Chapitre I : Etude bibliographique

La plante hôte

1. L’origine ................................................................................................................ p04

2. La description botanique ........................................................................................ p04

3. La position taxonomique ....................................................................................... p05

4. La valeur nutritionnelle ......................................................................................... p09

5. La culture de la tomate .......................................................................................... p10

5.1. Dans le monde ................................................................................................. p11

5.1. En Algérie ....................................................................................................... p12

6. Les maladies de la tomate ..................................................................................... p12

La pathologie

1. La pathologie ......................................................................................................... p14

1.1. La flétrissure fusarienne .................................................................................. p14

1.1.1. Les symptômes externes ...................................................................... p14

1.1.2. Les symptômes internes ...................................................................... p15

1.2. La pourriture racinaire ..................................................................................... p15

1.2.1. Les symptômes externes ...................................................................... p16

1.2.2. Les symptômes internes ...................................................................... p16

2. Les substances synthétisées par le parasite ............................................................ p20

2.1. Les toxines ....................................................................................................... p20

2.2. Les enzymes hydrolytiques ............................................................................ p20

3. Les mécanismes de défense ................................................................................... p20

3.1. Les barrières mécaniques ................................................................................ p20

3.2. Les barrières biochimiques ............................................................................. p21

4. Les moyens de lutte ............................................................................................... p21

4.1. La lutte culturale .............................................................................................. p21

4.2. La lutte agronomique ...................................................................................... p22

4.3. La lutte génétique ............................................................................................ p22

4.4. La lutte intégrée ............................................................................................... p22

4.5. La lutte biologique .......................................................................................... p22

4.6. La lutte physique ............................................................................................. p23

4.7. La lutte chimique ............................................................................................. p23

Le pathogène

1. Généralités ............................................................................................................. p24

2. La taxonomie du Fusarium oxysporum ................................................................. p24

3. Les Fusarium phytopathogènes ............................................................................. p26

4. Les races de Fusarium oxysporum ......................................................................... p27

5. Le cycle de développement .................................................................................... p27

Chapitre II : Matériels et méthodes

1. Les techniques d’isolement .................................................................................... p29

1.1. L’isolement à partir des fragments de tige ...................................................... p29

1.2. L’isolement à partir des racines....................................................................... p29

1.3. L’isolement à partir du sol .............................................................................. p31

2. La purification ........................................................................................................ p32

2.1. Le repiquage successif..................................................................................... p32

2.2. La culture monospore ...................................................................................... p32

3. L’identification ...................................................................................................... p34

3.1. L’étude macroscopique ................................................................................... p34

3.2. L’étude microscopique .................................................................................... p34

4. Le test du pouvoir pathogène ................................................................................. p36

5. La préparation des extraits protéiques ................................................................... p42

6. Le dosage des protéines ......................................................................................... p43

7. L’électrophorèse des protéines totales ................................................................... p44

8. La compatibilité végétative .................................................................................... p46

8.1. La sélection des mutants nit ........................................................................... p47

8.2. La caractérisation des mutants nit .................................................................. p47

8.3. L’auto-compatibilité (self compatibility) ....................................................... p49

8.4. La détermination des groupes de compatibilité végétative ............................ p50

Chapitre III : Résultats et discussion

1. L’identification ...................................................................................................... p52

1.1. La culture monospore ...................................................................................... p52

1.2. L’étude macroscopique ................................................................................... p53

1.3. L’étude microscopique .................................................................................... p53

2. Le test du pouvoir pathogène ................................................................................. p57

2.1. Le ré-isolement du pathogène ......................................................................... p61

3. L’électrophorèse des protéines totales ................................................................... p64

4. La compatibilité végétative .................................................................................... p68

5. La récapitulation des résultats obtenus .................................................................. p73

-Conclusion ................................................................................................................ p74

Liste des figures

Figure 1: Plante de tomate à maturité ........................................................................ p06

Figure 2: Feuilles de tomate ....................................................................................... p07

Figure 3: Fleur de tomate ........................................................................................... p07

Figure 4: Fruits de tomate .......................................................................................... p07

Figure 5: Tige de tomate ............................................................................................ p08

Figure 6: Système racinaire de la tomate ................................................................... p08

Figure 7: Graines de tomate ....................................................................................... p08

Figure 8: Flétrissement des feuilles ........................................................................... p17

Figure 9: Desséchement et mort des feuilles ............................................................. p17

Figure 10: Brunissement longitudinal de la tige ........................................................ p18

Figure 11: Brunissement des vaisseaux ..................................................................... p18

Figure 12: Pourriture du collet ................................................................................... p19

Figure 13: Brunissement du pivot .............................................................................. p19

Figure 14: Nécrose racinaire ...................................................................................... p19

Figure 15: Isolement à partir de la tige ...................................................................... p30

Figure 16: Isolement à partir des racines ................................................................... p30

Figure 17: Technique d'identification CLA ............................................................... p34

Figure 18: Préparation des extraits protéiques ........................................................... p42

Figure 19: Spores en germination .............................................................................. p52

Figure 20: Culture pure à partir des monospores ....................................................... p52

Figure 21: Variabilité de la pigmentation du thalle ................................................... p54

Figure 22: Mycélium cloisonné observé au microscope optique (X400) .................. p55

Figure 23: Microconidies observées au microscope optique (X400) ........................ p55

Figure 24: Microconidies en fausse tête observées au m. optique (X400) ................ p55

Figure 25: Macroconidies observées au microscope optique (X400) ........................ p56

Figure 26: Chlamydospores observées au microscope optique (X400)..................... p56

Figure 27: Monophialide observée au microscope optique (X400)........................... p56

Figure 28: Symptômes de pourriture du pivot et du collet ........................................ p59

Figure 29: Symptômes de pourriture du système racinaire ....................................... p60

Figure 30: Absence de symptômes de pourriture du système racinaire ..................... p62

Figure 31: Ré-isolement du pathogène à partir du collet et de la tige ....................... p62

Figure 32: Ré-isolement du pathogène à partir du pivot et des racines ..................... p63

Figure 33: Profils protéiques des 10 isolats et des 3 témoins .................................... p65

Figure 34: Reproduction schématique des profils protéiques .................................... p65

Figure 35: Dendrogramme de groupement des 10 isolats et des 3 témoins............... p67

Figure 36: Résultats du test d’auto-compatibilité de la souche F6 ............................. p71

Figure 37: Résultats de la confrontation F6/F7 ........................................................... p71

Figure 38: Résultats de la confrontation F6/F8 ........................................................... p71

Figure 39: Résultats de la confrontation de la souche F6/ testeur Fol 0030 ............... p72

Figure 40: Résultats de la confrontation de la souche F6/ testeur Forl 0090 ............. p72

Liste des tableaux

Tableau 1: La valeur nutritionnelle moyenne pour 100 g de tomate crue ................. p09

Tableau 2: La production annuelle de tomate par pays en milliers de tonnes ........... p11

Tableau 3: La production annuelle de tomate en Algérie par région ......................... p12

Tableau 4: Les principales maladies fongiques de la tomate ..................................... p13

Tableau 5: La notation des symptômes observés sur les plantules ............................ p38

Tableau 6: L'établissement de la gamme étalon ........................................................ p43

Tableau 7: La composition des gels d'acrylamide ..................................................... p44

Tableau 8: L'identification des mutants nit ................................................................ p49

Tableau 9: Les régions de provenance des isolats ..................................................... p53

Tableau 10: Les résultats du test du pouvoir pathogène ............................................ p57

Tableau 11: Les résultats de l’électrophorèse des protéines totales .......................... p64

Tableau 12: Les taux de similtitude entre les 10 isolats et les témoins ..................... p66

Tableau 13: Les différents types de mutants obtenus à partir des isolats .................. p68

Tableau 14: Les résultats du test d'auto-compatibilité et les croisements ................. p69

Tableau 15: Les résultats de la confrontation des isolats avec les testeurs Fol ......... p69

Tableau 16: Les résultats de la confrontation des isolats avec les testeurs Forl........ p70

Tableau 17: La récapitulation des résultats obtenus .................................................. p73

Liste des planches et schémas

Planche 1. Etape de la préparation de l'inoculum ...................................................... p39

Planche 2. Semis et préparation des plantules ........................................................... p40

Planche 3. Inoculation ................................................................................................ p41

Schéma 1. Cycle de vie du Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici............................ p28

Schéma 2. Culture monospore ................................................................................... p33

Schéma 3. la chaîne d'assimilation du nitrate .......................................................... p48

Schéma 4. Etapes à suivre lors du test de compatibilité végétative ........................... p51

Résumé

Fusarium oxysporum est un champignon d’origine tellurique très ubiquiste, qui

présente une très grande diversité génétique et écologique et qui a la capacité de

provoquer des maladies sur de nombreuses espèces végétales cultivées d’intérêt

économique.

En effet certaines souches de F. oxysporum dites pathogènes engendrent des

fusarioses sur les plantes hôtes. Deux formes spéciales sont inféodées à la tomate :

Fusarium oxysporum f.sp lycopersici qui provoque des trachéomycoses, alors que

Fusarium oxysporum f.sp radicis lycopersici engendre des nécroses racinaires.

L’étude a porté sur 10 souches de Fusarium oxysporum isolées à partir des tiges

et des racines de plantes de tomates atteintes de fusariose ainsi que trois autres

souches témoins : Forl 12, Fol 8 et Fo (non-pathogène).

Etant donné que les bio-essais sur plantes permettent de déterminer le pouvoir

pathogène, un test rapide et miniaturisé sur plantules de tomate a été mis au point et

nous a permis de confirmer à la fois, le pouvoir pathogène et la forme spéciale.

L’analyse du profil protéique des 10 isolats et des 3 souches témoins obtenu sur

un gel de poly-acrylamide nous a permis de générer un dendrogramme de groupement

des souches.

Enfin, un test de compatibilité végétative a été réalisé afin de regrouper les 10

isolats en VCG.

Mots clés : Fusarium oxysporum, tomate, diversité, pouvoir pathogène, groupe

de compatibilité végétative (VCG).

Abstract

Fusarium oxysporum is a ubiquitous soil-borne fungus with a very great genetic

and ecological diversity and capacity to cause diseases on many cultivated plant

species of economic interest.

Indeed, some strains F. oxysporum knows as pathogenic cause vascular diseases

on host plants. Two special forms are pathogenic to tomato plant, Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici which causes tracheomycosis and Fusarium oxysporum

f.sp radicis lycopersici which causes root necrosis.

The study concentrated on 10 strains of Fusarium oxysporum isolated from

stems and roots of tomato plants displaying wilt symptoms and 3 reference strains:

Forl 12, Fol 8 and Fo (no pathogen).

Bio-tests on plant make possible to determine the pathogenicity, a miniaturized

fast test on tomato seedlings was realized and allowed us to confirm the pathogenicity

and the special form at the same time.

The analyze of the protein profile of the 10 isolates and the 3 reference strains in

poly-acrylamide gel electrophoresis allowed us to generate a dendrogramme grouping

of strains.

Finally, a vegetative compatibility test was done in order to group the 10

isolates in VCGs.

Key words: Fusarium oxysporum, tomato, diversity, pathogenicity, vegetative

compatibility group (VCG).

الملخص

وساثٍ و بُئٍ كبُش و قذسة ع مه انفطشَبث انتشابُت الأكثش تىاجذا و انتٍ تتمُض بتىى

.عهً انتسبب فٍ أمشاض نهكثُش مه أوىاع انىببتبث انمضسوعت راث أهمُت اقتصبدَت

إن بعط سلالاث انممشظت تسبب مشض الأوعُت عىذ انىببتبث انتٍ تؤوَهب

انزٌ َسبب : و انطمبطم عشظت نشكهُه مه هزي انسلانت

. انزبىل و انزٌ َسبب تعفه انجزوس

سلالاث مه مستخشجت مه سُقبن و جزوس طمبطم مصببت 10انذساست تشكضث عهً

. (غُش ممشض): سلالاث أخشي كشىاهذ3و

الاختببس انبُىنىجٍ عهً انىببتبث َمكه مه إثببث انقذسة انممشظت، نهزا قمىب ببختببس مصغش سشَع عهً وببتبث

.طمبطم فتُت مكىىب مه إثببث انقذسة انممشظت و شكم انسلانت فٍ آن واحذ

. معبَىت انهىَت انبشوتُىُت نهسلالاث انعشش و انشىاهذ انثلاثت مكىتىب مه اوجبص سسم بُبوٍ مقسم نهزي انسلالاث

.﴾ ﴿أخُشا قمىب ببختببس انتىافق مه أجم إسىبد انسلالاث انمذسوست إنً مجمىعبث انتىافق

. ، انطمبطم، انتىىع، انقذسة انممشظت، مجمىعبث انتىافق:الكلمات المفتاحية

Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici

Fusarium oxysporum

Fo و Fol 8 ،Forl 12

VCG

Fusarium oxysporum

Introduction

1

Les micro-organismes sont des êtres vivants microscopiques pouvant vivre dans

différents milieux comme l’eau, l’air et le sol. Ils vivent en interaction avec leur

environnement et forment ainsi de véritables écosystèmes. Les microorganismes sont

présents en très grand nombre dans le sol soit : 109 bactéries et 10

6 spores de

champignons par gramme de sol.

Parmi ces microorganismes, on trouve des champignons telluriques dont une

espèce ubiquiste nommée Fusarium oxysporum est présente dans tous les types de

sols et sous différents climats (Burgess, 1981). Ce champignon a la particularité de se

développer en saprophyte dans le sol. Il fait partie des champignons filamenteux

appartenant à la famille des Tuberculariacées (groupe des Hyphomycètes) avec un

mycélium aérien sur le milieu de culture potato-dextrose-agar (PDA) où il prend

différentes couleurs allant du blanc au violet (Snyder et Hansen, 1940).

Le Fusarium oxysporum produit trois types de spores asexuées (Burgess,

1981) :

- Des chlamydospores qui sont des formes de résistance pluricellulaires et

munies d’une paroi épaisse qui permettra au champignon de survivre.

- De nombreuses microconidies unicellulaires et des macroconidies abondantes,

constituées de deux à trois cellules, et qui possèdent la caractéristique principale de

cette espèce lors des observations microscopiques.

Les microconidies et les macroconidies, issues de la multiplication végétative,

sont supportées par des conidiophores et sont utiles à la dissémination du champignon

(Nelson et al., 1983).

Cette espèce fongique comprend deux types de souches : des souches

phytopathogènes responsables de fusarioses chez de nombreuses espèces végétales

d’intérêt économique et des souches dites non-pathogènes c’est-à-dire qu’aucun effet

néfaste n’a été observé sur une espèce végétale.

Les formes pathogènes montrent un très haut niveau de spécificité d’hôte et sont

regroupées en formes spéciales (f.sp.) selon l’espèce végétale infectée (Armstrong et

Armstrong, 1981). Par exemple, les souches de la forme spéciale lycopersici sont

pathogènes pour la tomate alors que les souches de la forme spéciale albedinis sont

pathogènes pour le palmier dattier.

Ces souches sont dites pathogènes car elles ont la capacité de croître au-delà du

cortex et dans le xylème de la plante formant ainsi une association endophyte avec

l’hôte.

Introduction

2

Deux formes spéciales différentes sont spécifiques à la tomate : F. oxysporum

f.sp. lycopersici (Fol) qui provoque des trachéomycoses vasculaires et F. oxysporum

f.sp. radicis-lycopersici (Forl) qui engendre des pourritures racinaires. Dans les deux

cas, la fusariose se traduit par un flétrissement de la plante pouvant aller jusqu’au

dessèchement des feuilles (Laterrot et al., 1988).

Les souches de F. oxysporum non-pathogènes ne sont responsables d’aucun

symptôme sur l’hôte végétal et ne causent aucune maladie. En effet, les souches sont

alors incapables de pénétrer dans les tissus vasculaires de la plante et parfois, la plante

localise l’infection et met en place un mécanisme de défense qui empêche leur

intrusion. (Gao et al., 1995).

Il y a quelques années, le seul moyen de lutte contre la fusariose était d’arroser

les cultures avec du bénomyl ou encore du bromure de méthyle, mais ces produits

sont dangereux et peu efficaces et ont été interdits par la suite. Parallèlement à cette

lutte chimique, les producteurs utilisaient également des variétés de tomates

résistantes, essentiellement à la forme spéciale lycopersici, mais l’évolution génétique

de ces champignons a laissé apparaître de nouvelles races capables de contourner les

résistances de ces plantes.

Il a été démontré que des souches de F. oxysporum non-pathogènes pour une

espèce végétale peuvent entrer en compétition pour les nutriments ou la colonisation

racinaire avec des souches de F. oxysporum pathogènes (Alabouvette et al., 1998 ;

2006). Ainsi, l’activité infectieuse des formes spéciales de F. oxysporum peut-être

limitée par cette compétition. Donc les souches non-pathogènes peuvent être utilisées

comme moyen de lutte biologique contre les souches pathogènes.

Parmi les souches appartenant à la même forme spéciale, certaines peuvent être

plus ou moins virulentes envers leur hôte. Ces degrés de virulence dépendent des

gènes de résistance de la plante hôte. Ainsi, on peut distinguer plusieurs races parmi

une forme spéciale selon le degré d’interaction entre la souche fongique et le

génotype de l’hôte. Par exemple, chez F. oxysporum f.sp. lycopersici il existe trois

races.

Le déterminisme génétique du pouvoir pathogène et la spécificité d’hôte de

F. oxysporum ne sont pas connus. De plus, aucun caractère morphologique ou cultural

ne permet de différencier les souches pathogènes des souches non-pathogènes ou de

distinguer les différentes formes spéciales. C’est pourquoi de nombreuses méthodes,

essentiellement moléculaires, ont été développées pour caractériser les souches de

Introduction

3

F. oxysporum et rechercher des marqueurs du caractère pathogène ainsi que de la

spécificité d’hôte.

Parallèlement aux méthodes moléculaires, les souches de F. oxysporum peuvent

être caractérisées par un test de compatibilité végétative (Puhalla, 1985).

Ce test permet de regrouper des souches capables de former des hétérocaryons,

ces souches appartiennent donc au même VCG (Vegetative Compatibility Group).

Cette méthode est depuis de nombreuses années une méthode de référence pour la

caractérisation des populations de F. oxysporum. Une nomenclature internationale des

VCG a été proposée, comprenant un code pour la forme spéciale et un numéro de

VCG. Ainsi, on connaît actuellement 5 VCG pour la forme spéciale lycopersici (VCG

0030, 0031, 0032, 0033 et 0035) et 9 VCG pour la forme spéciale radicis-lycopersici

(VCG 0090, 0091, 0092, 0093, 0094, 0096, 0097, 0098 et 0099) (Katan, 1991 ; 1999).

Cependant, toutes ces méthodes ne permettent pas de mettre en évidence le

pouvoir pathogène d’une souche, il est donc nécessaire d’effectuer des tests

biologiques sur plante. En effet, ces tests vont permettre de distinguer les formes

pathogènes des souches non-pathogènes par observation de symptômes sur des

plantes infectées par un pathogène. Ces tests sont généralement réalisés sur plantes

entières en serres et sont lourds à mettre en œuvre. Il serait donc intéressant de

disposer de tests rapides et miniaturisés.

Même si des variétés de tomate résistantes à Fol existent, des variétés

sensibles sont toujours cultivées dans de nombreux pays, notamment en Afrique du

Nord pour des raisons économiques et pour leurs aptitudes à s’adapter aux conditions

climatiques tout en offrant des fruits de bonne qualité. Dans les pays du Maghreb et

même dans de nombreux pays du bassin méditerranéen où la culture de la tomate a

une place économique très importante, les fusarioses de la tomate dûes à Fol et aussi à

Forl, présentent une sérieuse menace.

Dans le cadre de mon travail, l’objectif est d’isoler des souches de Fusarium

oxysporum pathogènes de la tomate dans différentes régions de l’ouest Algérien, les

identifier, mettre en évidence leur pouvoir pathogène par un test biologique

miniaturisé sur plantules de tomate et distinguer la forme spéciale, comparer leur

profil protéique obtenu sur gel de poly-acrylamide et les regrouper en groupe de

compatibilité végétative (VCG).

Chapitre I :

Étude bibliographique

4

1. L’origine :

La tomate (Lycopersicum esculentum) est originaire des Andes d’Amérique du

sud. Elle fut tout d’abord domestiquée au Mexique, puis introduite en Europe en

1544.

De là, sa culture s’est propagée en Asie du sud et de l’est, en Afrique et au

Moyen orient.

Parmi les noms communs utilisés pour désigner la tomate : tomate (Français et

espagnol), jitomate (Espagnol Mexicain), pomodoro (Italien), tomati (Afrique de

l’ouest), tomat (Indonésien), faan ke’e (Chinois).

Etymologiquement, le mot tomate est une déformation du mot inca Tomalt et le

mot Lycopersicum qui signifie en latin "Pêche de loup", appellation peu alléchante à

laquelle on a ajouté au XVIIIe siècle l'adjectif esculentum à cause des propriétés

gustatives de ce légume-fruit (Naika et al., 2005).

2. La description botanique :

La tomate (voir fig.1) est une plante herbacée appartenant à la famille des

solanacées, cette famille regroupe d’autres espèces qui sont également bien connues,

telle que la pomme de terre, le tabac, le poivron et l’aubergine.

La tomate est généralement cultivée comme plante annuelle, elle peut atteindre

une hauteur de plus de deux mètres (Chaux et Foury, 1994).

Le feuillage :

Les feuilles (voir fig.2) sont disposées en spirale de 15 à 50 mm de long et de 10 à 30

mm de large avec un pétiole mesurant entre 3 et 6 cm de long.

Les folioles sont ovées à oblongues, couvertes de poils glandulaires.

Les grandes folioles sont parfois pennatifides à la base.

Les fleurs :

Les fleurs (voir fig.3) sont bisexuées, régulières de 1,5 et 2 cm de diamètre. Elles

poussent opposées aux feuilles ou entre elles.

Le tube du calice est court et velu, les sépales sont parfois persistants.

La corolle est constituée en général de six pétales qui peuvent atteindre une longueur

de 1 cm. Elles sont jaunes et courbées lorsqu’elles sont mûres.

L’androcée est formé de quatre étamines, les anthères ont une couleur jaune vif et

entourent le style qui a une extrémité stérile allongée.

Etude bibliographique de la plante hôte

http://fr.wikipedia.org/wiki/Plante_herbac%C3%A9e

5

Le gynécée dont l’ovaire est supère est formé de deux à neuf carpelles. En général la

plante est autogame, mais la fécondation croisée peut avoir lieu grâce aux abeilles et

aux bourdons qui sont les principaux pollinisateurs.

Le fruit :

Le fruit de la tomate (voir fig.4) est une baie charnue, de forme globulaire ou aplatie

avec un diamètre de 2 à 15cm.

Lorsqu’il n’est pas encore mûr, le fruit est vert et poilu.

La couleur des fruits mûrs varie du jaune au rouge en passant par l’orange. En général

les fruits sont ronds et réguliers ou côtelés.

La tige :

La tige (voir fig.5) pousse jusqu'à une longueur de 2 m, elle est pleine et fortement

poilue et glandulaire.

Le port de croissance varie entre érigé et prostré.

La racine :

La plante de tomate possède une forte racine pivotante qui pousse jusqu'à une

profondeur de 50 cm ou plus, la racine principale produit une densité de racines

latérales et adventices (voir fig.6).

Les graines :

Les graines (voir fig.7) sont nombreuses : en forme de rein ou de poire, elles sont

poilues, beiges, de 3 à 5 mm de long et de 2 à 4 mm de large.

L’embryon est enroulé dans l’albumen.

Mille graines environ pèsent approximativement 2,5 à 3,5 g (Naika et al., 2005).

3. La position taxonomique : (Rick et al., 1990)

Embranchement : Phanérogames

Ordre : Angiospermes

Classe : Dicotylédones

Sous-classe : Gamopétales

Famille : Solanacées

Genre : Lycopersicum

Espèce : esculuntum, pimpinellifolum, cheesmanii, hirsutum, perviflarum,

chmielewskii, peruviarum, pennelli

Quelques variétés de tomate: Agora, Marmande, Saint pierre, Rio grande etc…


6


Figure 1. Plante de tomate à maturité

7

Foliole

Feuille


Figure 3. Fleur de tomate

Figure 2. Feuilles de tomate

Figure 4. Fruits de tomate

8

Poils

Glande

Racine pivotante

Racines adventives


Figure 5. Tige de tomate

Figure 6. Système racinaire de la tomate

Figure 7. Graines de tomate

9

4. La valeur nutritionnelle :

La consommation des fruits de la tomate contribue à un régime sain et équilibré,

ils sont riches en minéraux, en vitamines, en acides aminés, en sucre ainsi qu’en fibres

alimentaires (voir tableau.1).

Les tomates rouges contiennent du lycopène, un anti-oxydant qui contribue

possiblement à la protection vis-à-vis des substances carcinogènes et que l'on retrouve

à raison de 30 mg dans 200 ml de sauce tomate.

Les tomates se consomment fraîches en salade, cuites dans des sauces, dans des

soupes ou dans des plats de viande ou de poisson. Il est possible aussi de les

transformer en purée, en jus et en ketchup (Naika et al., 2005).

Tableau 1. La valeur nutritionnelle moyenne pour 100 g de tomate crue

(Bernardin, 1985)

Eléments Teneur

Eau 93 g

Protéine 1 g

Glucide 4 g

Lipide 0,3 g

Fibres 1,2 g

Cellulose 0,6 g

Vitamines

Vitamine B1 0,09 mg

Vitamine B3 0,5 mg

Vitamine C 38 mg

Sels

minéraux

Calcium 11 mg

Chlore 40 mg

Fer 0,6 mg

Potassium 280 mg

Magnésium 10 mg

Sodium 3 mg

Phosphore 27 mg

Soufre 11 g

En outre, la tomate possède aussi quelques propriétés médicinales par exemple :

- Un antibiotique (Feuilles) :

Chez les Incas d’Amérique du Sud et chez certaines tribus en Nouvelle-Guinée, on

utilise les feuilles fraîches pour guérir les plaies infectées.

- Un anti-fatigue (Nature) : La tomate fraîche ou le jus de tomate accélère la

formation du sucre dans le sang et apporte un regain d'énergie naturelle.


10

- Elle est excellente pour la santé du foie (Nature) :

La tomate contient des traces d'éléments anti-toxiques appelés chlorine et sulfure. La

chlorine permet de mieux filtrer les déchets de l'organisme et le sulfure protège le foie

contre certains engorgements.

La tomate est excellente pour contrecarrer les effets négatifs lorsqu'on a tendance à

manger trop gras en aidant le foie à dissoudre les graisses et à les éliminer plus

facilement.

- Elle diminue l'hypertension (Nature) :

La tomate étant riche en potassium, des études cliniques ont démontré qu'elle agit

positivement sur les reins dans plusieurs cas : un bon fonctionnement rénal permet de

diminuer l'hypertension.

- Elle soulage les coups de soleil (Nature) :

Un remède miracle: une tranche de tomate posée sur un coup de soleil pendant 15

minutes enlève l'effet de la brûlure, évite que la peau pèle ou cloque (Naika et al.,

2005).

5. La culture de la tomate :

La culture de la tomate a des exigences écologiques :

- La température :

La tomate demande un climat relativement frais et sec pour fournir une récolte

abondante et de qualité.

Cependant, la plante s’est adaptée à une grande diversité de conditions climatiques,

allant du climat tempéré vers le climat tropical chaud et humide.

La température optimale pour la plupart des variétés se situe entre 21 et 24oC. Les

plantes peuvent surmonter un certain intervalle de températures, mais en-dessous de

10oC et au-dessus de 38

oC les tissus des plantes seront endommagés.

- La lumière :

L’intensité de la lumière affecte la couleur des feuilles, la mise à fruits et la couleur

des fruits.

- L’eau et l’humidité :

La tomate exige un arrosage abondant, le stress causé par une carence en eau et les

longues périodes arides font tomber les bourgeons et les fleurs et provoquent le

fendillement des fruits.


11

Par contre, les averses très intenses et l’humidité très élevée favorisent la croissance

des moisissures et la pourriture des fruits.

- Le sol :

La tomate pousse bien sur la plupart des sols minéraux qui ont une bonne capacité de

rétention d’eau, une bonne aération.

La tomate tolère modérément un large intervalle de pH, mais pousse le mieux dans

des sols dont la valeur du pH varie entre 5,5 et 6,8 et où l’approvisionnement en

éléments nutritifs est adéquat et suffisant.

Le choix des variétés est également une exigence pour la culture de la tomate, les

critères de sélection sont basés sur des caractéristiques telles que le type de fruit, la

forme de la plante, la vitalité, la résistance aux ravageurs et aux maladies, mais

également sur des facteurs liés au climat et à la gestion (Naika et al., 2005).

5.1. La culture de la tomate dans le monde :

La tomate est la culture la plus répandue dans le monde après la pomme de terre

(Arbaoui, 1984).

Selon les statistiques de l'organisation des Nations Unies pour l'alimentation et

l'agriculture (FAO), la production mondiale de tomates s'élevait en 2007 à 126,2

millions de tonnes pour une superficie de 4,63 millions d'hectares, soit un rendement

moyen de 27,3 tonnes à l'hectare (voir tableau.2).

Tableau 2. La production annuelle de tomate par pays en milliers de tonnes

Pays Production annuelle (x1000T)

Chine 33 645

Etats-Unis 11 500

Espagne 3 615

Mexique 2 900

Maroc 1 140

France 750

Algérie * 567


12

5.2. La culture de la tomate en Algérie :

Selon les statistiques officielles du Ministère de l’agriculture et du

développement rural, la production de tomate s’élevait en 2006 à 5.489.336 Qx pour

une superficie de 20.436 hectares, soit un rendement de 268.6 Qx à l’hectare.

Tableau 3. La production annuelle de tomate en Algérie par région

en Quintaux (Mag, 2006)

Régions Production annuelle (Qx)

Oran* 35.878

Mascara 129.000

Tlemcen 211.000

Ain Temouchent 150.000

Mostaganem 426.260

Sidi Belabbes 54.930

Relizane 53.200

Tiaret 64.385

Chlef 290.520

En Algérie, la région de Biskra est en tête avec une production annuelle de

966.308 Qx pour une superficie de 1.341 hectares, soit un rendement de 720.6 Qx à

l’hectare (Mag, 2006).

6. Les maladies de la tomate :

De la levée et pratiquement jusqu'à la récolte, les cultures de la tomate sont

sujettes à de nombreuses maladies causées par divers agents pathogènes tels que : les

virus, les bactéries, les champignons, les nématodes et les insectes etc… (Causse,

2000).

Les maladies dite fongiques (causées par les champignons) sont les plus

fréquentes (voir tableau.4), une infection fongique est souvent causée par des spores

qui y ont germé puis ont pénétré les tissus de la plante par le biais des stomates, des

blessures ou parfois même directement à travers la peau de la plante.

Les filaments mycéliens se développent dans les tissus, en tirent les éléments

nutritifs et ils y exsudent des substances toxiques pour la plantes.


13

Les effets nocifs des moisissures se limitent à la zone contaminée mais il existe

des sortes de moisissures qui peuvent envahir les tissus vasculaires des plantes et

peuvent se propager à partir de là dans toute la plante c’est le cas des Fusarium

oxysporum (Naika et al., 2005).

Tableau 4. Les principales maladies fongiques de la tomate

(Cuasse, 200; Naika et al., 2005)

Maladies Symptômes Causées par

Anthracnose Tâches plus ou moins circulaires de 1 cm avec

un centre noirâtre sur les fruits mûrs Colletotrichum coccodes

Mildiou

Légères tâches foncées avec un point jaune en

leur centre sont visibles sur les feuilles ayant

parfois un développement centrifuge et

centripète.

Sur la face inferieure des feuilles les tâches sont

blanches.

Les fruits se couvrent de tâches brunes et les

feuilles flétrissent

Phytophtora infestans

Verticilliose

Jaunissement en forme de V des feuilles de bas

en haut suivi d’un flétrissement avec un léger

brunissement des vaisseaux après une coupe

Verticillium albo-atrum

Alternariose

Tâches rondes et brunes avec des cercles

concentriques apparaissant sur les feuilles avec

un diamètre de 1,5 cm

Des grosseurs peuvent apparaitre sur les tiges et

les feuilles.

Les fleurs et les jeunes fruits tombent.

Alternaria solani

Flétrissure fusarienne

Jaunissement des feuilles de bas en haut,

apparition de racines avortées au bas de la tige,

Tissus ligneux brun rougeâtre

Fusarium oxysporum f.sp

lycopersici

Pourriture des racines

et du collet*

Brunissement des racines, de leur cylindre

central et des vaisseaux situés au niveau du

pivot et du collet,

Flétrissement juste avant la cueillette.

Les feuilles hautes fanent avant les feuilles

basses avec une décoloration jaune ou dorée.

Les fruits n'ont pas leur brillance normale.

Fusarium oxysporum f.sp

radicis-lycopersici


14

1. La pathologie :

La tomate (Lycopersicum esculentum) est sujette à deux maladies fusariennes :

La flétrissure fusarienne classique (Fusarium wilt) causée par Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici Snyder et Hansen.

La pourriture des racines et du collet (Fusarium crown and root rot) causée

par Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici Jarvis et Shoemaker (Katan

et al., 1997).

Ces derniers sont des champignons telluriques dotés d‘une spécificité stricte d‘hôtes.

Ils sont capables d‘envahir l‘ensemble du système vasculaire de la plante

provoquant ainsi son obstruction et par la suite l‘affaiblissement de la plante qui finit

par mourir (Snissi et al., 2006).

La flétrissure fusarienne et la pourriture des racines et du collet présentent

différents symptômes internes ou externes sur les différentes parties de la plante et

pendant les différents stades de vie.

1.1. La flétrissure fusarienne (Fusarium wilt) :

La flétrissure fusarienne (voir fig.8,9,10,11) est une maladie dévastatrice pour

les cultures de tomate partout dans le monde, elle est causée par Fusarium oxysporum

f.sp. lycopersici (Fol) (Walker, 1971).

Ce champignon terricole qui pénètre dans la plante par les racines envahit les

tissus ligneux et provoque le jaunissement, la flétrissure puis la mort de la plante

(Blancard, 1997).

Néanmoins, dans la mesure où il existe aujourd’hui de nombreuses variétés

résistantes au Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, ce pathogène ne représente plus

un grand danger pour la culture de la tomate.

1.1.1. Les symptômes externes :

La maladie évolue très rapidement, les parties des limbes touchés flétrissent

comme par manque d’eau, c’est le flétrissement rapide (Quick wilt).

Les feuilles asséchées gardent leur chlorophylle et apparaissent avec un aspect

gris verdâtre (Laterrot et al., 1978).

Il s’ensuit un jaunissement puis une nécrose d’une partie ou de la totalité du

limbe avec des éclaircissements au niveau des nervures.

Etude bibliographique de la pathologie

15

L’atteinte des feuilles se fait progressivement de bas en haut ce qui fait que le

feuilles se trouvant à la base de la plante sont déjà mortes (Messiaen, 1981 ; Gindrat,

1975).

Il arrive fréquemment qu’un seul rameau soit atteint et ceci avant l’apparition

des symptômes de la maladie sur le reste de la plante.

Au niveau de la tige de la plante atteinte, apparait une dépression longitudinale

qui part du collet puis remonte unilatéralement.

Les tissus au niveau de la dépression sont de couleur brune (Bouhot, 1972).

D’autres symptômes peuvent parfois apparaitre à savoir :

L’inclinaison et la courbure progressive vers le sol des pétioles et des limbes

(épinastie), le ralentissement de la croissance et la formation de bourrelets adventives

sur la tige (Laterrot et al., 1978).

1.1.2. Les symptômes internes :

Une coupe longitudinale au niveau de la tige des plantes atteintes, présente dans

la partie ligneuse et adjacente au cortex vert, une coloration brune sombre des tissus

conducteurs.

Des coupes transversales laissent apparaitre également des tissus bruns foncés

contenant souvent des fragments mycéliens.

1.2. La pourriture racinaire (Fusarium crown and root rot) :

La pourriture des racines et du collet (voir fig.12,13,14) est une maladie causée

par Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl) (Jarvis et Shoemaker, 1978).

Cette maladie a été découverte pour la première fois au Japon en 1969

(Menzies et Jarvis, 1994) et s’est propagée à travers le monde à partir de 1970

(Yamamoto et al., 1974).

Elle a été signalée dans plusieurs pays du bassin méditerranéen où elle est plus

ou moins dommageable (Blancard, 1997).

Cette maladie terricole causée par Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici

s’attaque aux plantules et entraine leur mort (Henni, 1998).

Elle peut s’exprimer surtout à maturité lorsque les plantes sont chargées de

fruits (Blancard, 1997).

Il existe des cultivars de tomate résistants au Forl mais ne sont pas largement

utilisés (Brayford, 1996).


16

1.2.1. Les symptômes externes :

Contrairement aux maladies vasculaires notamment, des flétrissements plus ou

moins importants apparaissent sur les folioles du sommet de la tige, dans cette zone,

la tige est fortement amincie.

En fonction des plantes, ces flétrissements peuvent être dans un premier temps

réversible durant la nuit, et leur incidence peut varier en fonctions des conditions

climatiques.

Les flétrissements peuvent être soudains, peuvent évoluer très rapidement vers

la nécrose et le desséchement des folioles et des feuilles, et peuvent aussi conduire à

la mort des plantes.

Certains auteurs signalent aussi l’apparition de jaunissements foliaires situés à

la périphérie du limbe des vieilles feuilles. Ceux-ci sont suivis de la nécrose des

pétioles et de la chute des feuilles. Certaines plantes affectées précocément voient leur

croissance réduite.

Quelle que soit la gravité des flétrissements, les symptômes primaires sont à

rechercher sur les racines et le collet des plantes.

Sur les racines apparaissent de nombreuses lésions brun rougeâtres, humides,

évoluant rapidement en pourriture.

Plus le diamètre des racines est faible, plus celles-ci pourrissent et se

décomposent rapidement.

1.2.2. Les symptômes internes :

Il convient à noter que le système vasculaire présente aussi quelques

symptômes, bien que nous n’ayons pas à faire à une maladie uniquement vasculaire

D’une manière générale, le cylindre central des grosses racines révèle des

brunissements assez marqués. Il en est de même pour les tissus vasculaires du pivot et

ceux situés de part et d’autre de ces derniers.

Le brunissement peut s’étendre jusqu’à la tige sur plusieurs dizaines de

centimètres au-dessus du collet.

Des racines adventives se développent parfois sur la tige pour faire face à

l’attaque du champignon (Blancard, 1997).


17


Figure 8. Flétrissement et jaunissement des feuilles

Figure 9. Desséchement et mort des feuilles

18


Figure 10. Brunissement longitudinal de la tige

Figure 11. Brunissement des vaisseaux (Agrios, 2005)

19


Figure 12. Pourriture du collet (Agrios, 2005)

Figure 13. Brunissement du pivot (Agrios, 2005)

Figure 14. Nécrose racinaire (Blancard, 2009)

20

2. Les substances synthétisées par le parasite :

Deux substances importantes sont synthétisées : les toxines et les enzymes

hydrolytiques.

2.1. Les toxines :

Les champignons du genre Fusarium sont connus pour leur aptitude à

synthétiser certaines toxines, parmi elles, on distingue les lycomarasmines et les

acides fusariques (Gaumann, 1958 ; Tzeng et Devay, 1985).

Ces toxines augmentent la perméabilité cellulaire et provoquent une importante

transpiration des plantes atteintes (Corbaz, 1990).

2.2. Les enzymes hydrolytiques:

Les symptômes de brunissement et d’obstruction des vaisseaux conducteurs ont

été reproduits pour la premières fois par Gothoskar et Sheffer, 1953 en trempant des

plantules dont les racines on été sectionnées dans des solutions contenant des enzymes

pectiques du commerce.

Sachant que la paroi des cellules végétales est formée essentiellement de

substances pecto-cellulosiques, le parasite s’attaque à cette dernière en utilisant ces

deux enzymes : la pectine méthyle estérase (PME) qui hydrolyse les groupements

méthyle de la pectine et les polygalacturonases (PG) qui hydrolysent les liaisons

glucosidiques.

Une activité cellulolytique a été également observée chez le parasite. Hussain et

Dimond, 1960 ont constaté la production de cellulase sur des tiges de tomates

infectées (Henni, 1998).

3. Les mécanismes de défense :

La plante atteinte développe une série de barrières mécaniques et biochimiques

pour lutter contre le parasite (Beckman, 1988).

3.1. Les barrières mécaniques :

Quand le parasite pénètre par les racines, un brunissement de quelques cellules

du parenchyme ligneux voisin de la partie du vaisseau infecté apparait.

Cette réaction est suivie par la formation de thylles, sécrétion gommeuse

permettant à la plante d’isoler l’agent pathogène en obstruant le vaisseau envahi avant

que le filament mycélien ne produise des conidies.


21

Si cette réaction tarde à venir, l’infection par les conidies se généralise et se

propage à plusieurs vaisseaux entrainant la mort de la plante par gommose, thyllose,

et hyperauxinie générale.

Les symptômes externes de la maladie reflètent le degré de l’invasion des

vaisseaux vasculaires par les filaments mycéliens (El Mahjoub, 1984).

3.2. Les barrières biochimiques :

Deux substances biochimiques sont élaborées par la plante dés l’attaque du

parasite (Henni, 1998).

3.2.1. Les polyphénoloxydases :

Ce sont des enzymes à base de cuivre, elles sont activées en cas de blessures et

interviennent dans l’oxydation des composés phénoliques de la plante et contribuent

avec les cellules du parenchyme à la formation des thylles (Messiaen, 1981).

3.2.2. Les phytoalexines :

Elles sont considérées comme des antibiotiques, leur rôle est de freiner la

progression du parasite à l’intérieur des vaisseaux.

Ride et Drysdale, 1971 indique que dans le cas d’infection d’une plante de

tomate, une relation s’établit dés les premiers jours de l’agression entre la

concentration de tomatine (substance inhibitrice) et le blocage de l’agent pathogène

(Henni, 1997).

4. Les moyens de lutte :

Les méthodes de lutte appliquées pour le contrôle des fusarioses sont

généralement limitées, comme c’est le cas pour l’ensemble des maladies parasitaires

vasculaires.

Il n’existe actuellement aucun moyen réellement efficace pour contrôler

totalement ces maladies, les mesures de contrôle demeurent dans leur globalité

d’ordre préventif (Rouxel et al, 1979).

4.1. La lutte culturale :

Elle consiste à éviter les conditions qui favorisent la maladie : un sol léger et

acide, un manque d’azote et de calcium, des températures élevées supérieure à 28oC


22

(température optimale du développement du Fusarium oxysporum) et un manque de

lumière.

La méthode de prévention la plus courante est le chaulage afin de maintenir le

pH entre 6,4 et 7 (Scott, 1923).

Des chercheurs Taïwanais Sun et Huang, 1985 ont mis au point un amendement

organique et minéral qui permet de contrôler efficacement diverses espèces de

Fusarium.

Cet amendement est un mélange de 4,4% de bagasse (résidus de canne à sucre),

8,4% de son de riz, 4,25% de coquilles d’huîtres, 8,5% d’urée, 1,04% de nitrate de

potassium, 13,16% de super phosphate de calcium et 60,5% de cendres minérales

(Booth, 1971).

4.2. La lutte agronomique :

Elle est considérée comme la plus pratique, elle consiste à stopper la culture de

la plante qui héberge le Fusarium pendant plusieurs années, ainsi l’arrêt de

l’exploitation des champs garantit l’apparition des chlamydospores.

4.3. La lutte génétique :

Elle consiste à introduire des gènes de résistance au niveau des plantes appelées

plantes trans-génétiques. Ces gènes sont responsables de la synthèse de protéines

capables d’éliminer le parasite.

Cependant, cette technique fut inefficace car elle a été à l’origine de l’apparition

de races plus virulentes (Henni, 1998).

4.4. La lutte intégrée :

C’est la combinaison de toutes les techniques précédentes afin de lutter contre

les phytopathogènes pour une longue durée. Ces méthodes ne sont efficaces que si

l’on a une meilleure connaissance des mécanismes qui sont à l’origine des interactions

entre la plante et l’agent pathogène (Corbaz, 1990).

4.5. La lutte biologique :

Des méthodes alternatives, notamment celles qui se basent sur l’exploitation des

potentialités microbiennes antagonistes ont fait l’objet de plusieurs études.

Parmi les microorganismes expérimentés avec succès, à l’égard des maladies

d’origine tellurique, les Pseudomonas spp. fluorescents et les Fusarium non


23

pathogènes qui occupent une place de choix (Armstrong et Armstrong, 1981 ; Rouxel

et al., 1979 ; Benchabane, 2005).

Aujourd’hui, il a été démontré que des souches de F. oxysporum non-

pathogènes pour une espèce végétale peuvent entrer en compétition pour les

nutriments ou la colonisation racinaire avec des souches de F. oxysporum pathogènes

(Alabouvette et al., 1998 ; 2006).

Ainsi, l’activité infectieuse des formes spéciales de F. oxysporum peut-être

limitée par cette compétition.

4.6. La lutte physique :

Anchisi et al en 1985 ont utilisé un traitement à l’eau chaude pour protéger les

plants dans un sol où la maladie est présente.

La technique consiste à traiter les racines des plants avec de l’eau entre 48 et

49oC pendant 30 secondes avant de les transplanter, cela stimule la croissance des

racines. La taille des racines procure ainsi une protection contre la maladie.

La stérilisation ou la solarisation ne sont pas des solutions efficaces à long terme

(Corbaz, 1990).

4.7. La lutte chimique :

Elle est efficace mais présente beaucoup d’effets néfastes, elle se fait par une

désinfection du sol à l’aide de fongicides.

Les fongicides les plus usités reste le triazole et ces dérivés qui sont des

composés très actifs grâce à leur noyau qui possède une activité pharmacologique,

antibactérienne, antifongique et hypoglycémique (Hamoir et al, 2001).


24

1. Généralité :

Le genre Fusarium est bien connu pour son rôle important en phytopathologie,

ce dernier regroupe un grand nombre d’espèces (Messiaen et Cassini, 1968).

Les espèces de Fusarium oxysporum se caractérisent par une large gamme de

plantes hôtes et la plupart des souches pathogènes de F. oxysporum envahissent le

système vasculaire de ces plantes et présentent une spécificité parasitaire, c'est-à-dire

que l’espèce ne peut attaquer qu’un hôte déterminé (Ozenda, 1990).

2. La taxonomie du Fusarium oxysporum :

Parmi les champignons, agents de maladies vasculaires, ceux appartenant au

genre Fusarium sont les plus fréquents et les plus dommageables pour les cultures

(Nelson et al., 1981 ; Messiaen et al., 1991 ; Bounaga, 1985).

Depuis la description de ce genre par Link en 1809, de nombreux travaux ont

été consacrés à la taxonomie de ce champignon (Booth, 1984).

Découvert par Link en 1809 et délimité dans son sens actuel par Appel et

Wollenweber en 1910, le genre Fusarium appartient au groupe des tuberculariacées

qui produisent des macroconidies pluricellulaires en forme de croissant typique

(Messiaen et Cassini, 1968).

De 1910 à 1935 la systématique du Fusarium a été élucidée par les travaux de

Wollenweber, qu’il réalisa soit seul, soit en collaboration avec Appel d’abord, et

Reinking ensuite.

Cette systématique fut cautionnée par une conférence internationale qui a eu

lieu à Madison en 1924, où le premier manuel de clé d’identification des espèces de

Fusarium fut publié (Messiaen et Cassini, 1968).

Cette clé d’identification a permis de décrire 143 espèces de Fusarium

regroupées en 16 sections.

Dés 1935, la systématique de Railo remettait en question la systématique de

Wollenweber en ce qui concerne les distinctions spécifiques, mais en reconnaissant la

valeur des sections.

En 1940, Snyder et Hansen formulèrent les mêmes objections, et en 1945, le

genre Fusarium se trouve réduit à 9 espèces (Messiaen et Cassini, 1968 ; Booth,

1975).

De toutes les espèces du genre Fusarium que l’on rencontre dans le sol, c’est

l’espèce F. oxysporum qui est la plus répandu (Mayer, 1967).

Etude bibliographique du pathogène

25

La classification du genre fut basée essentiellement sur :

--Les caractères culturaux (aspect du mycélium aérien, pigmentation des thalles);

--Les caractéristiques des spores (forme, taille, septations,…..) et des organes sur

lesquels elles sont formées (Bouhot, 1981);

--Les caractéristiques des organes fructifères qui donnent éventuellement naissance

aux spores (sporodochies et pionnotes) ;

--La présence ou l’absence de sclérotes.

L’espèce se distingue par la production de microconidies rassemblées en fausse tête à

partir de monophialides courts (Burgess et Liddell, 1983). Seule la reproduction

asexuée est connue chez cette espèce, ce qui la place dans le groupe des

deutéromycètes (champignons imparfaits).

En fait, Fusarium oxysporum est un des deutéromycètes telluriques appartenant

à la classe des hyphomycètes et à la famille des tuberculariacées.

Par ailleurs, certaines espèces de Fusarium possèdent une forme parfaite

(Hyphomyces, Gibberalla, Nectaria, Calonectaria).

L’identification des espèces de Fusarium est assez difficile, elle est basée sur la

morphologie des spores asexuées (Fisher et al., 1982).

Les microconidies : F. oxysporum est caractérisé par la présence abondante de

microconidies (Tivoli, 1988) fusiformes à réniformes, présentant 0 à 2 septa,

agglomérés en fausses têtes produites par de petits phialides (5-12 x 2,2-3,5µm).

Des observations microscopiques ont montré qu’une population de Fusarium

oxysporum f.sp. lycopersici est constituée de plusieurs propagules dont les

microconidies à elles seules constituent plus de 90% de cette population (Tello-

Marquina et Alabouvette, 1984).

Les macroconidies : légèrement arquées, présentant 3 à 4 septa, la cellule basale

pédicellée, la cellule apicale en crochet, produite par des phialides sur des

conidiophores ramifiés ou en sporodochie (27-46 x 3-4,5 µm) (Messiaen et Cassini,

1968).

Les chlamydospores : hyalines, lisses ou rugueuses, globuleuses, terminales ou

intercalaires (5-15µm de diamètre) (Komi, 1993).

Les chlamydospores sont des organes de conservation, résultant de

l’accumulation de réserves dans une région (article du mycélium ou conidie) qui se

dilate quelque peu et s’entoure finalement d’une membrane épaisse de teinte

généralement foncée (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Nelson et al., 1923). Après


26

trois semaines de culture, de nombreuses chlamydospores intercalaires apparaissent

sur le mycélium (Tivoli, 1988).

3. Les Fusarium oxysporum phytopathogènes :

Parmi ces champignons telluriques, une espèce ubiquiste nommée Fusarium

oxysporum est retrouvée dans tous les types de sols (Burgess, 1981). Ce champignon

filamenteux décrit par Snyder et Hansen en 1940, appartient à la famille des

Tuberculiacées (classe des Hyphomycètes).

Ce champignon a la capacité de provoquer des maladies sur de nombreuses

espèces végétales cultivées, d’intérêt économique (Armstrong et Armstrong, 1981).

En effet, certaines souches de F. oxysporum sont dites pathogènes et engendrent des

fusarioses (trachéomycose, nécrose, fonte de semis) sur des plantes hôtes.

Ces souches pathogènes ont une grande spécificité d’hôte et sont ainsi

regroupées en formes spéciales (Armstrong et Armstrong, 1981). D’autres souches

sont dites non pathogènes car leur effet pathogène n’a encore été observé chez aucune

espèce végétale.

Les Fusarium oxysporum comprennent un ensemble très diversifié de formes

plus ou moins spécialisées (Dommergues et Mangenot , 1970). Cette forme spéciale

(forma specialis, f.sp) présente une virulence particulière pour telle ou telle plante

(Messiaen et Cassini, 1968 ; Snyder et Hansen, 1945).

Les formes spécialisées de Fusarium oxysporum s’attaquent à la plupart des

plantes cultivées mono et dicotylédones (El Modafar, 1994).

Certaines formes spéciales ne présentent plus de réel problème agronomique,

c’est le cas de la forme spéciale lycopersici, pour laquelle la plupart des variétés de

tomate cultivées sont résistantes, des variétés sensibles sont toujours cultivées dans de

nombreux pays, notamment en Afrique du Nord comme l’Algérie où, pour des raisons

économiques, ces variétés sont utilisées.

Par contre, il existe toujours des problèmes causés par F.oxysporum f.sp radicis-

lycopersici, responsable de pourriture racinaire sur la tomate dans de nombreux pays

du bassin méditerranéen (Can, 2004; Utkhede, 2006).

Néanmoins, il existe certaines souches dites non pathogènes, c'est-à-dire

qu’elles n’ont pas de pouvoir pathogène connu ou ne sont pas pathogènes pour

l’espèce végétale considérée.


27

4. Les races de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici :

Trois races de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici ont été rapportées, elles se

distinguent entre elles par leur degré de virulence vis-à-vis des cultivars de tomate

contenant un seul gène de résistance (Mc Grath et al., 1987 ; Stall, 1962).

La race 1, la plus cosmopolite a été initialement décrite en 1886 (Booth, 1971),

la race 2 a été d’abord découverte en 1945 à Ohio (Alexander et Tucker, 1945).

La race 3 a été observée en Australie en 1978 (Gratttidge et O’Brien, 1982) et a

été successivement rapportée aux Etats unis : en Californie (Davis et al, 1988),

Floride (Volin et Jones, 1982), Géorgie (Chellemi, 1992), Arkansas et Nord Carolina

(Marlatt et al., 1996) et au Tennessee (Bost, 2001). Elle a également été retrouvée au

Mexique (Valenzuela-Ureta et al., 1996).

Actuellement, peu de cultivars résistants à la race 3 sont commercialisés (Jones

et al., 1991).

5. Le cycle de vie : (voir schéma.1)

Les F. oxysporum ne sont pas des parasites obligatoires, en absence de la plante

hôte, ils mènent une vie de saprophyte sur des débris végétaux et des matières

organiques. Les isolements effectués indiquent qu’un gramme de sol renferme prés de

100.000 propagules (Smith, 1965) et les F. oxysporum représentent 40-70% de la

population fusarienne totale.

Ces champignons persistent dans le sol principalement sous forme de spores de

résistance (chlamydospores) en état de dormance (Booth, 1971).

En contact de l’hôte et une fois les conditions favorables, les chlamydospores

germent et les jeunes filaments pénètrent au niveau des racines.

Après pénétration dans la cellule épidermique, le mycélium se ramifie,

colonisent ainsi toutes les cellules avoisinantes.

Les hyphes mycéliens progressent à l’intérieur des cellules puis colonisent le

cortex, arrivé au niveau du cylindre central, le parasite s’installe dans les vaisseaux

du xylème d’où il se propagera dans la tige par l’intermédiaire des microconidies

aisément véhiculées par la sève dans toutes les parties de la plante.

A la surface des feuilles, se forment des organes fructifères appelés

sporodochies qui produisent des macroconidies qui vont à leur tour contaminer

d’autres plantes lorsqu’elles sont transportées par le vent, par l’eau ou bien par

l’intermédiaire des insectes (El Mahdjoub, 1972).


28

1- Conidies, chlamydospores ou mycélium vivant dans le sol

2- Germination des spores

3- Pénétration du tube germinatif à l’intérieur des racines

4- Invasion des vaisseaux par les conidies et/ou mycélium

5- Production de gomme à l’intérieur des vaisseaux

6- Flétrissement et mort de la plante

7- Sporodochies ou mycélium produisant des conidies


Schéma 1. Cycle de vie du Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Agrios, 2005)

Chapitre II :

Matériels et méthodes

29

1. Les techniques d’isolement :

L’isolement a été effectué dans différentes régions de l’ouest Algérien à partir

de plantes de tomates atteintes de fusariose.

Dans la wilaya d’Oran (Sidi Maarouf, Hassi Bounif et Boutlelis).

Dans la wilaya d’Ain Temouchent (Ouled Taoui).

Dans la wilaya de Mascara (Mohammadia, plaine de la Habra).

Cinq souches fournies par Mme Hamini Kadar ont été isolées dans l’est

Algérien dans la wilaya d’Annaba.

1.1. L’isolement à partir des fragments de tige : (voir fig.15)

La technique consiste d’abord à couper transversalement la tige en petits

fragments, les rincer à l’eau distillée, les mettre dans l’hypochlorite de sodium (eau

de javel) à 5% pendant trois minutes pour une désinfection superficielle et afin

d’éliminer les saprophytes, puis les rincer de nouveau avec de l’eau distillée stérile

pour éliminer les traces d’eau de javel.

Après rinçage, les fragments sont coupés longitudinalement puis trempés dans

de l’alcool éthylique à 90% pendant trois minutes pour la fixation.

A la fin, 2 à 4 fragments sont mis dans des boîtes de Pétri contenant du milieu

PDA (voir annexe I) + ATB (Streptomycine et chloramphénicol à raison de 20

mg/100 ml) pour minimiser la contamination, ces dernières sont incubées à 28oC

pendant une semaine (Rapilly, 1968).

1.2. L’isolement à partir des racines : (voir fig.16)

En premier lieu, les racines sont coupées en petits fragments, rincées à l’eau

distillée puis désinfectées à l’hypochlorite de sodium.

Après un rinçage à l’eau distillée stérile, les racines sont coupées

longitudinalement puis trempées dans de l’alcool éthylique à 90%.

Les fragments de racines sont déposées dans des boîtes de Pétri contenant du

milieu PDA + ATB (Streptomycine et chloramphénicol à raison de 20 mg/100 ml),

ces dernières sont incubées à 28oC pendant une semaine (Davet et Rouxel, 1997).


30

Fragment de tige

Fragment de racine


Figure 15. Isolement à partir de la tige

Figure 16. Isolement à partir des racines

31

1.3. L’isolement à partir du sol :

Il existe deux types de techniques permettant de détecter la présence des

champignons du sol et de les isoler.

Avec les techniques directes, on obtient directement le développement de

colonies sur un milieu nutritif plus ou moins sélectif, soit par incorporation du sol

dans le milieu, soit, plus rarement, par immersion dans le sol du milieu fixé sur un

support. Ces méthodes ne sont utilisables que pour des champignons capables d’un

développement saprophyte.

Dans le deuxième cas, la technique indirecte consiste à piéger le champignon

dans le sol à l’aide de substrats vivants ou inertes, puis à l’isoler à partir de ces

substrats lorsque sa biologie le permet (Davet et Rouxel, 1997).

Technique directe :

Les échantillons du sol sont prélevés à 10 cm de profondeur, ils sont ensuite

tamisés puis mis à sécher dans une étuve à 28oC pendant 7 jours (Hoking et Stuart,

1987).

Le principe consiste ensuite à incorporer le sol directement dans le milieu PDA,

c’est la technique des « sols plats » de Warcup en 1950.

Le milieu PDA coulé dans les boîtes de Pétri est maintenu en surfusion à 37-

40oC, une faible quantité de terre (5-15 mg) est saupoudrée puis immédiatement

dispersée dans le milieu en agitant délicatement jusqu'à solidification, les boîtes de

Pétri sont ensuite incubées à 28oC pendant 7 jours (Davet et Rouxel, 1997 ; Henni,

1998).

Technique indirecte :

Le principe consiste à mettre le sol en suspension dans de l’eau distillée stérile

(10 g de terre dans 90 ml d’eau distillée stérile) après agitation, on obtient une

solution qui représente la dilution 10-1

, des prélèvements de 1ml sont effectués et

introduits dans des tubes contenant 9 ml d’eau distillée stérile jusqu'à obtention de la

dilution 10-6

.

Une fois les dilutions obtenues, 1 ml de chacune est versé dans une boîte de

Pétri contenant du milieu PDA à raison de 3 boîtes pour chaque dilution.

Après homogénéisation, les boîtes de Pétri sont mises à incuber (Rapilly, 1968).


32

2. La purification :

2.1. Le repiquage successif :

Après une semaine d’incubation, des filaments mycéliens apparaissent autour

des petits fragments des tiges et des racines.

A partir de là, nous procédons alors à la recherche du Fusarium.

Après une identification primaire, nous effectuons des repiquages successifs

dans de nouvelles boîte de Pétri contenant du milieu PDA + ATB (Streptomycine et

chloramphénicol à raison de 20 mg/100 ml) pour obtenir des cultures plus ou moins

pures.

Néanmoins, les cultures obtenues risquent d’être contaminées par des bactéries

et par des champignons qui sont parfois invisibles et afin d’éviter ce risque, le procédé

le plus simple et le plus sûr reste celui de la culture monospore (Rappily, 1968 ;

Zerrouk, 1994).

2.2. La culture monospore :

La technique de la culture monospore (voir schéma.2) permet d'obtenir une

culture pure à partir des spores fongiques par étalement sur malt triton (voir annexe I).

Dans un premier temps, repiquer la souche à monosporer dans une boîte

contenant du milieu PDA et la laisser se développer sur la totalité de la surface de la

boîte pendant 5 à 6 jours.

Prélever un explant à partir de la périphérie de la boîte et l’introduire dans un

tube contenant 9 ml d’eau distillée stérile, après agitation, on obtient une suspension

sporale.

On effectue des dilutions au dixième à partir de la suspension sporale :

On prélève 1 ml de la suspension sporale que l’on introduit dans un tube

contenant 9 ml d’eau distillée stérile puis on agite.

On répète l’opération autant de fois jusqu’à la dilution voulue.

A partir des deux dernières dilutions (10-3

et 10-4

), on prélève 1 ml que l’on

étale à l’aide de billes stériles sur milieu malt triton.

Après 24h d’incubation à 28oC, à l’aide d’une loupe binoculaire, on procède au

repérage et à la délimitation des spores en germination.

On prélève 3 à 4 conidies que l’on dépose dans une boîte de Pétri contenant du

milieu PDA (Protocole I.N.R.A. Dijon).


33

1ml 1ml 1ml

Agitation

Agitation

Agitation

Agitation

9ml d’eau

distillée stérile

Malt triton

Fragment

mycélien

Boîte de Pétri contenant du Malt triton

1ml 1ml


Schéma 2. Culture monospore

34

3. L’identification :

Une fois les souches pures obtenues, on passe à l’étude macroscopique et

microscopique.

3.1. L’étude macroscopique :

L’identification se fait à l’œil nu, elle se base essentiellement sur les caractères

suivant : la vitesse de croissance, l’aspect du mycélium aérien, couleur de l’envers de

la colonie, l’odeur et la couleur des sporodochia

3.2. L’étude microscopique :

L’identification a été réalisée sur milieu CLA (Carnation Leaf Agar) :

Un fragment mycélien issu de la culture monospore est mis dans un milieu

gélosé à 2% en présence d’un fragment de feuille d’œillet stérile de 3-5 mm2 (voir

fig.17).

Après une dizaine de jours, on passe à l’observation directe des boites de Pétri

sous microscope optique (In situ) (Leslie et Summerell, 2006).

Fragment de

feuille d’œillet

Fragment

mycélien

Milieu

gélosé à 2%


Figure 17. Technique d'identification CLA

35

L’étude macroscopique et microscopique nous a permis d’obtenir 5 isolats de

Fusarium oxysporum qui vont être utilisés par la suite ainsi que 5 autres isolats et 3

souches témoins fournis par Mme Hamini Kadar (I.N.R.A. Dijon).

Les trois souches témoins sont :

X1 : Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Forl 12)

X2 : Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol 8)

X3: Fusarium oxysporum (Fo) non-pathogène


36

4. Le test du pouvoir pathogène :

Le pouvoir pathogène d’un champignon se définit comme sa capacité à

provoquer des infections chez un hôte.

Le test du pouvoir pathogène permet de différencier les souches pathogènes des

souches non pathogènes.

En 2004, Rep démontra la présence d’une protéine secrétée par le Fusarium

oxysporum f.sp. lycopersici dans le xylème lors de l’infection qu’il surnomma Six

pour (Secreted in xylem), cette protéine peut être détectée par PCR en utilisant des

amorces spécifiques. Mais aucun marqueur moléculaire pour Forl n’a été décrit à ce

jour, c’est pour cela que le test du pouvoir pathogène en serre reste le seul moyen

d’identifier les souches appartenant à la forme spéciale radicis-lycopersici.

Ce test a été réalisé avec le couple plantule-pathogène (voir planche.1,2,3).

Les souches sur lesquelles a porté notre test sont : F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8,

F9, F10, Forl 12 (X1), Fol 8 (X2) et Fo (X3) à raison de 5 répétitions pour chaque

souche.

La variété de tomate, Monfavet H63-5 Hybride F1, sensible aux trois races de

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici a été utilisée pour ce test.

Principe : le système racinaire est coupé à 7 mm sous le pivot avant d’être mis en

contact direct avec une suspension de conidies de l’agent pathogène.

Les plantules sont ensuite transférées dans des pots individualisés et placés au

hasard. Au bout de 21 jours, une notation est effectuée (présence / absence de

symptômes et éventuellement le type de symptômes).

La durée totale de l’expérience : (laboratoire + serre) est de 6 semaines et se

déroule comme suit :

J0 → Mise en culture des souches sur boîte de Pétri contenant du milieu PDA solide

et incuber à 28oC pendant 5 jours.

J5 → Repiquage des souches dans autant de tubes PDA que de répétitions et incuber à

28oC pendant 8 jours.

J9 → Semis des graines de tomate :

- Remplissage des pots avec du terreau amendé de sable ;

Avant le semis - Léger arrosage des pots avec l’eau de robinet ;


--Tassage manuel.

37

- Déposer les graines tomate dans les pots ;

- Recouvrir avec une fine couche de terreau ;

- Placer les pots en conditions favorables en serre.

J10 → Arrosage délicat tous les jours à la même heure (entre 9 h et 10 h) avec l’eau

de robinet.

J13 → Transfert des souches dans des tubes contenant du milieu minimum liquide

(MML) (voir annexe) : à partir des tubes PDA mis en culture à J5, 2 ml de MML sont

introduits dans chaque tube. Vortexer environ 20 secondes puis récupérer 1 ml qui est

introduit dans le tube contenant 9 mL de MML correspondant.

J20 → Préparation des inoculums :

- Filtrer la suspension conidienne des tubes MML dans des tubes à hémolyse

étiquetés puis ajuster la suspension à 1x106 spores/ml ;

- Conserver une nuit à 4°C.

J21 → Inoculation et transplantation :

- Les plantules de tomate semées à J9 sont extraites des pots ;

- Les plantules sont rincées avec de l’eau distillée stérile ;

- Couper les systèmes racinaires à 7 mm au scalpel en dessous du pivot ;

- Les inoculums conservés à 4°C sont vortexés ;

- Dans chaque tube à hémolyse, une plantule dont le système racinaire a été

- coupé est placée pour tremper pendant 30 minutes.

Après inoculation, transplanter chaque plantule dans un pot de terreau/sable (stérile)

comme suit :

Après le semis

Le semis

- Arroser légèrement et délicatement à l’eau de robinet.


38

- Faire un trou avec un cône stérile ;

- Placer la plantule dans le trou ;

- Combler le trou autour des racines de la plantule ;

- Verser le contenu du tube à hémolyse dans le trou de la plantule correspondante ;

- Combler le trou totalement avec du terreau stérile ;

- Verser le reste de la suspension conidienne sur toute la surface du pot.

NB : Ne pas arroser le jour de l’inoculation.

J22 → Arrosage délicat à l’eau de robinet en évitant le lessivage de l’inoculum ;

J23 → Arrosage tous les jours à l’eau de robinet entre 9 h et 10 h du matin ;

J42 → Notation des symptômes.

Les plantules sont extraites des pots, puis après avoir rincé les racines à l’eau de

robinet, les symptômes sont notés comme suit :

Tableau 5. La notation des symptômes observés sur les plantules

Paramètres étudiés Notations

Racines Racines normales (blanches) : RAS

Nécroses racinaires : NR

Pivot Marron : M

Tiges (coupe transversale,

brunissement du cylindre central)

Aucun brunissement : RAS

Brunissement du cylindre central : +

Coupe longitudinale du pivot Coupe non-effectuée : /

Léger brunissement : +

Brunissement prononcé :


39

1- Mise en culture des souches

2- Repiquage sur tubes PDA

3- Transfert sur MM liquide

4- Filtration de la suspension sporale

Suspension conidienne

1

3

4

2

Planche 1. Etapes de la préparation de l'inoculum


40

Le semis

Plantules de tomate âgées de 15 j

Vraies feuilles


Planche 2. Semis et préparation des plantules

41

Témoin négatif

de tomate

Témoin positif

de tomate

Fol 8

de

tomate

Forl 12

de tomate

Fo


Planche 3. Inoculation

42

5. La préparation des extraits protéiques : (voir fig.18)

5.1. La mise en cultures des souches sur milieu PDA liquide :

Dans des Erlenmeyers contenant chacun 50 ml de milieu PDA liquide, 10

isolats dont les 3 témoins Forl 12 (X1), Fol 8 (X2) et Fo (X3), sont mis en culture

pendant 10 jours.

5.2. La filtration des mycéliums :

Au bout de 10 jours, après apparition des mycéliums dans les milieux de

culture, on procède à la filtration à l’aide de la gaze stérile.

Les mycéliums récupérés sont séchés délicatement à l’aide d’un papier filtre

pour éliminer les traces du milieu de culture puis peser.

5.3. Le broyage des mycéliums :

Les mycéliums récupérés sont broyés dans un mortier contenant 2 ml de tampon

phosphate (voir annexe III) et du sable traité dont le poids est égale à celui du

mycélium à broyer dans des conditions de froid.

5.4. La centrifugation :

Les mycéliums broyés sont récupérés dans des tubes Falcon, ces derniers sont

centrifugés à raison de 8000 t/min pendant 20 minutes.

Après centrifugation, le surnageant est récupéré dans des tubes Eppendorf

étiquetés à raison de 100 µl de surnageant par tube puis conservés au congélateur.

Filtration + Broyage + Centrifugation

Mycélium Surnageant


Figure 18. Préparation des extraits protéiques

43

6. Le dosage des protéines :

La méthode utilisée dans notre expérimentation est celle de Bradford (1976).

Les protéines forment avec le bleu de Coomassie G250 un complexe coloré

présentant un maximum d’absorption à 595 nm.

L’analyse des protéines est basée sur le changement de l’intensité de la couleur

du complexe en réponse à diverses concentrations en protéines.

Une courbe d’étalonnage est réalisée par une solution d’albumine sérique

bovine

(BSA) préparée à 1mg/ml dans de l’eau distillée.

Le tableau suivant représente la procédure à suivre pour l’établissement de la

gamme étalon.

Tableau 6. L'établissement de la gamme étalon

Tube 1 2 3 4 5 6

Concentration (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Solution mère BSA (µl) 0 10 20 30 40 50

Eau distillée (µl) 50 40 30 20 10 0

Réactif de Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2

Le témoin (le blanc) qui correspond au tube no1 ne contient que 50 µl d’eau

distillée et 2 ml du réactif de Bradford (voir annexe).

La lecture se fait à la longueur d’ondes λ = 595 nm.

6.1. La détermination de la concentration en protéines des échantillons :

Pour déterminer la concentration en protéines des échantillons, on prend 50 µl

de chaque échantillon auxquels on ajoute 2 ml du réactif de Bradford, après agitation

au vortex et incubation à température ambiante pendant 2 minutes, la lecture se fait à

la longueur d’ondes λ = 595 nm par rapport au blanc de la gamme étalon.

Les concentrations en protéines des échantillons sont ensuite déduites par

extrapolation des valeurs de densité optique obtenues sur la courbe d’étalonnage.


44

7. La révélation des protéines totales par électrophorèse (SDS-PAGE) :

L’électrophorèse est une technique analytique basée sur la migration

préférentielle des molécules ionisées soumises à un champ électrique continu

constant, dans un milieu électrophorètique de pH et force ionique précis.

L’électrophorèse SDS-PAGE selon Laemmli (1970) permet de séparer les

protéines selon leur poids moléculaire et non selon leur charge car le détergent

sodium dodécyl sulfate (SDS) dénature les protéines et les transforme en complexe

polyanionique.

La migration se fait vers l’anode, et la vitesse est en fonction de la masse du

complexe peptides-SDS.

Nous avons utilisé cette technique pour analyser les protéines totales des

isolats :

F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 et comparé leur profil par rapport aux trois

témoins Forl 12 (X1), Fol 8 (X2) et Fo (X3).

7.1. La préparation des gels d’électrophorèse :

Le gel utilisé est constitué d’un gel de séparation à 10% d’acrylamide et d’un

gel de concentration à 5% d’acrylamide (voir tableau.7).

Toutes les solutions utilisées sont préparées à partir de solutions mères, sauf

celle du persulfate d’ammonium à 10% qui est préparée extempéramment et qui en

présence du temed déclenche la polymérisation du gel.

Tableau 7. La composition des gels d'acrylamide

Produits Gel de concentration

5%

Gel de séparation

10%

Acrylamide 30% (ml) 2,5 5

Bis-acrylamide 1% (ml) 3,9 5

Tampon de séparation (pH 8,8) (ml) - 1,95

Tampon de concentration (pH 6,8) (ml) 3,75 -

H2O (ml) 4,65 4,1

SDS 10% (μl) 150 150

Persulfate de NH4 10% (μl) 100 100

Temed (μl) 50 50


45

7.2. Le coulage des gels :

Le gel de concentration est coulé en haut du gel de séparation pour permettre

une entrée homogène des échantillons dans ce dernier.

Des puits individuels sont réalisés par un peigne qui sépare le gel de

concentration en portions égales destinées au dépôt des échantillons.

7.3. Le dépôt des échantillons et la migration :

Pour chaque échantillon, on ajoute un volume précis de tampon de charge (voir

annexe II).

Chaque échantillon à analyser est ensuite chauffé à 100°C pendant 5 minutes

puis déposé dans un puits à l’aide d’une micro-pipette.

L’électrophorèse est réalisée avec un courant constant de 150 volts et une

intensité de 50 mA.

Le courant électrique est arrêté lorsque le front de migration atteint le bas du gel

de séparation.

7.4. La révélation des protéines :

Une fois l’électrophorèse achevée, le gel de séparation est écarté après

démoulage, il est trempé pendant 30 minutes dans une solution de fixation (voir

annexe II) puis il est de nouveau trempé pendant 1 heure dans une solution de

coloration (voir annexe II).

Une heure après, plusieurs décolorations sont effectuées dans une solution de

décoloration (voir annexe II).

Le gel est ensuite conservé dans une solution de conservation (voir annexe II) .


46

8. La compatibilité végétative :

La reproduction sexuée est inconnue chez le Fusarium, des échanges de

matériel génétique ne peuvent donc s’effectuer que par parasexualité impliquant la

formation d’hétérocaryons.

Ainsi, après fusion de deux filaments appartenant à des souches ayant un

patrimoine génétique différent, les noyaux qui sont réunis dans le cytoplasme

commun, peuvent éventuellement compenser réciproquement des défiances de tous

ordres.

Cependant, selon Correll et al., 1987, il existe, chez certains champignons

imparfaits, des obstacles à cette hétérocaryose.

L’échange de matériel génétique est sous le contrôle d’un certains nombre de

loci d’incompatibilité appelée vic (vegetative incompatibility) ou het (heterokaryotic

incompatibility), selon les organismes.

Deux souches sont compatibles lorsqu’elles possèdent les mêmes allèles à ces

loci, leur filaments sont alors capables de fusionner et de former des hétérocaryons.

En revanche, deux souches n’ayant pas les mêmes allèles à ces loci ne forment

jamais d’hétérocaryons même si l’anastomose entre des filaments peut se produire,

ces souches sont dites incompatibles.

Ces observations ont conduit Puhalla, 1979 à définir des groupes de

compatibilité végétative.

Selon cet auteur, la notion de groupe de compatibilité végétative (Vegetative

Compatibility Group, VCG), revêt, au plan de la biologie des populations, un intérêt

majeur puisque des isolats qui appartiennent à des VCG différents, peuvent évoluer

indépendamment, même s’ils sont géographiquement proches.

Par ailleurs, la caractérisation d’un isolat par son appartenance à un VCG

constitue une technique d’identification au sein d’une population hétérogène et offre

la possibilité de structurer cette population sur une base génétique.

A l’inverse, des souches géographiquement éloignées, mais appartenant à un

même VCG peuvent être considérées comme ayant une origine commune.

Ainsi Correll et al., 1988, ont montré que des souches de Verticillium albo-

atrum, d’origines géographique très éloignées (Amérique, Europe), appartiennent au

même VCG, ils en ont déduit que ces isolats avait une origine commune.

Pour notre part, l’objectif de notre travail est de vérifier le degré d’homogénéité

des populations de Fusarium oxysporum isolées dans différentes régions de l’ouest et


47

l’est Algérien. Pour cela nous avons étudié la compatibilité végétative entre les isolats

en utilisant la technique de complémentations entre les mutants nit.

8.1. La sélection des mutants nit :

Trois petits fragments mycéliens prélevés sur des pré-cultures sont déposés sur

le milieu chlorate à 15% et à 30% (voir annexe I), ce milieu étant un analogue

structural du nitrate, il va être assimilé par le champignon qui va le transformer en

chlorite. Cette molécule étant toxique, le champignon ne pourra survivre sur un tel

milieu. Seule une cellule du mycélium contenant une mutation sur l’un des gènes

impliqués dans l’assimilation du nitrate pourra survivre et se développera sur le milieu

contenant du chlorate.

Après sept jours d’incubation à 28oC, à l’obscurité, des secteurs mycéliens

mutés commencent à se développer à partir de la périphérie des thalles issus de

chaque fragment. Des boutures sont prélevées dans ces secteurs et déposées sur un

milieu contenant du nitrate (voir annexe I) comme seule source d’azote.

Si le mycélium croît de façon rase, il s’agit d’une souche mutante nommée nit.

Cependant, certains mutants chlorate-résistants présentant un mycélium aérien

sont capables de se développer sur milieu nitrate, il s’agit alors de mutants « crun »

(mutants chlorate-résistants utilisant le nitrate) qui ne sont pas utilisées dans les études

de compatibilité végétative.

8.2. La caractérisation des mutants nit :

D’après la voie d’assimilation du nitrate Correll et al., 1987 ; Klittich et Leslie,

1988 la mutation portée par les clones nit peut affecter soit le gène de structure de la

nitrate réductase (mutant nit1), soit le gène de régulation de la nitrate réductase

(mutant nit3), soit les gènes codant pour la synthèse du cofacteur à molybdène

(mutant nitM) (voir schéma.3).


48

Schéma 3. Différentes réactions et molécules impliquées dans la chaîne

d'assimilation du nitrate (Leslie, 2006)


Régulation

49

Les mutants nit sont identifiables après cinq jours de culture par leur aptitude à

se développer sur les différents milieux de caractérisation à savoir : le milieu nitrate,

le milieu nitrite et le milieu hypoxanthine (voir tableau.8).

Tableau 8. L'identification des mutants nit par leur croissance sur les milieux de

caracteristation (Klittich et Leslie, 1988)

Nature du mutant

Croissance sur les différents milieux de sélection

Milieu Nitrate Milieu Nitrite Milieu Hypoxanthine

Crun A A A

Nit1 r A A

Nit3 r r A

NitM r A r

r : thalle ras sans mycélium aérien

A : mycélium aérien épais et dense

Crun : mutant « chlorate résistant utilisant le nitrate »

8.3. L’auto-compatibilité (self compatibility): (Correll et al., 1989)

L’auto-compatibilité est la capacité à former un hétérocaryon lorsque deux

mutants de la même souche (nit1/nit3 ou nitM / nit1 ou nit3) sont confrontés sur

milieu minimum et forment un hétérocaryon.

Après identification des mutants nit, un test d’auto-compatibilité est réalisé pour

chacune des souches concernées par la mutation et ce, comme suit :

Une bouture du mutant nit1 est confrontée sur milieu minimum à une bouture

du mutant nit3 ;

Une bouture du mutant nit1 est confrontée sur milieu minimum à une bouture

du mutant nitM ;

Une bouture du mutant nitM est confrontée sur milieu minimum à une bouture

du mutant nit1 ou nit3.

Après incubation, s’il ya formation d’un hétérocaryon à partir des

confrontations citées ci-dessus, la souche est dite auto-compatible, dans le cas

contraire, la souche est dite auto-incompatible.


50

8.4. La détermination des groupes de compatibilité végétative :

Afin de déterminer les groupes de compatibilité végétative, on place une

bouture d’un mutant nitM au centre d’une boîte de Pétri contenant du milieu nitrate, et

de chaque coté, à environ 1 cm de distance, on dépose une bouture d’un clone mutant

nit1 et une autre d’un clone mutant nit3 provenant d’une même souche ou d’un même

isolat.

Après incubation, ces boutures régénèrent un mycélium grêle et ras

caractéristique des mutants nit.

En cas de fusion des filaments entre les deux mutants nit et formation d’un

hétérocaryon, on observe dans la zone de confrontation des thalles une bande de

mycélium aérien épais et dense, semblable à celui formé par les isolats sauvages sur le

même milieu.

L’observation facile de ce « témoin d’hétérocaryose » permet de savoir si les

deux mutants nit portent des déficiences complémentaires ou non et de déterminer

ainsi : l’auto-compatibilité ou l’auto-incompatibilité des souches (lorsque les mutants

nit confrontés proviennent de la même souche) et la compatibilité entre les souches

(lorsque les mutants nitM, d’une part et nit1 ou nit3 d’autre part proviennent de deux

souches différentes).

Il faut noter que la confrontation de mutants nit1 ou de mutants nit3 entre eux

aboutit rarement à une complémentation (Correl et al., 1987 ; Elmer et Stephens,

1989).

En pratique, les confrontations sont habituellement faites entre un mutant nitM

d’une souche et un mutant nit3 ou nit1 d’une autre.

Les mutants nit1/nit3 de chacun des isolats vont être confrontés avec des

mutants nitM provenant des testeurs VCG de Fol (VCG 0030, 0031, 0032, 0033) et

de Forl (VCG 0090 I, 0090 II, 0090 III, 0091 I, 0091 II, 0092, 0093, 0094 uni, 0094 I,

0094 II, 0094 III, 0094 IV, 0096, 0098, 0099). S’il y a formation d’un hétérocaryon,

la souche à l’origine du mutant nit1/nit3 fait donc parti de ce même VCG.

La codification des VCG des souches pathogènes de F. oxysporum suit une

nomenclature internationale incluant un numéro de référence pour la forme spéciale

(003 pour la forme spéciale lycopersici et 009 pour la forme spéciale radicis-

lycopersici).


51

Obtention des mutants chlorate résistant (nit)

Identification des mutants nit par croissance sur les milieux sélectifs

Nitrate Nitrite Hypoxanthine

Eliminer les mutants crun

Confrontation entre mutants nitM et nit1/3 de la même souche

Hétérocaryon non formé

Auto-incompatibilité

Hétérocaryon formé

Auto-compatibilité

Confrontation entre mutants nitM et nit1/3 de souches différentes

Hétérocaryon formé Hétérocaryon non formé

Compatibilité Incompatibilité

Même VCG VCG différent

Schéma 4. Etapes à suivre lors du test de compatibilité végétative


Chapitre III :

Résultats et discussion

52

1. L’identification des isolats :

1.1. La culture monospore :

Après 24h d’incubation à 28oC, à l’aide d’une loupe binoculaire, on procède au

repérage et à la délimitation des spores en germination (voir fig.19).

On prélève 3 à 4 conidies que l’on dépose dans une boîte de Pétri contenant du

milieu PDA.

Après incubation, des cultures pures sont obtenues (voir fig.20), dans le cas

contraire une culture monospore est réalisée à partir des cultures obtenues

1

2

3

4

Après incubation

1 2

4 3


Figure 19. Spores en germination

Figure 20. Culture pure à partir des monospores

53

1.2. L’étude macroscopique :

L’étude macroscopique des isolats purifiés a permis de dénombrer un seul

morphotype à savoir le morphotype cotonneux avec une variabilité de la couleur et du

type de colonies.

La couleur varie entre le blanc et le violet et le jaune (voir fig.21)

1.3. L’étude microscopique :

L’observation microscopique a montré un mycélium septé (voir fig.22), la

présence de microconidies isolées (voir fig.23) ou agglomérées en fausses têtes (voir

fig.24), des macroconidies de taille variable avec 3 à 4 cloisons (voir fig.25), des

chlamydospores intercalaires ou terminales (voir fig.26) et des monophialides courts

perpendiculaires aux filaments mycéliens (voir fig.27).

NB : Les boîtes de Pétri ont été directement observées sous microscope optique

(Technique CLA In situ).

Ces techniques d’identification nous ont permis d’obtenir 5 isolats de Fusarium

oxysporum qui vont être utilisés par la suite ainsi que 5 autres isolats et 3 souches

témoins fournis par Mme Hamini Kadar (I.N.R.A. Dijon).

Le tableau suivant représente la région, l’année et la partie de la plante à partir

de laquelle l’isolement à été effectué.

Tableau 9. Les régions de provenance des isolats

Isolats Site d’isolement Organe d’isolement Année

F1 Sidi Maarouf (Oran) Tige 2009

F2 Hassi Bounif (Oran) Tige 2009

F3 Boutlelis (Oran) Racine 2009

F4 Ouled Taoui (Ain Temouchent) Racine 2009

F5 Mohammadia (Mascara) Tige 2009

F6 Annaba Tige 2007

F7 Annaba Tige 2007

F8 Annaba Tige 2007

F9 Annaba Tige 2007

F10 Annaba Tige 2007


54


Figure 21. Variabilité de la pigmentation du thalle

A B

C D

E F

G

A : isolat F1

B : isolat F2

C : isolat F5

D : isolat F7

E : isolat F9

F : isolat F6 (le verso de la boîte)

G : isolat F10 (le verso de la boîte)

55

Mycélium cloisonné


Figure 22. Mycélium cloisonné observé au microscope optique (X400)

a-Cloison

Figure 23. Microconidies observées au microscope optique (X400)

Figure 24. Microconidies en fausse tête observées au microscope optique (X400)

a

) 195 µm

20 µm

81 µm

56


Figure 25. Macroconidies observées au microscope optique (X400)

a-Cloison

Figure 26. Chlamydospores observées au microscope optique (X400)

a-Chlamydospore intercalaire.

b-Chlamydospore terminale.

Figure 27. Monophialide observé au microscope optique (X400)

a

)

a

)

b

)

79 µm

25 µm

23 µm

43 µm

57

2. Le test du pouvoir pathogène :

Pour mettre en évidence le pouvoir pathogène des souches isolées, deux bio-

essais ont été réalisés et ont permis de tester les 10 isolats de Fusarium oxysporum

obtenus ainsi que les trois souches témoins Forl 12 (X1), Fol 8 (X2) et Fo (X3).

Le premier bio-essai effectué sur des plantules âgées de 15 jours à raisons de 5

répétitions par souche s’est révélé non concluant.

Les 5 témoins négatifs non inoculés (trempés dans du MML) ne présentaient

aucun symptôme de la fusariose, par contre les plantules inoculées sont mortes parce

qu’elles n’ont pas survécu à la transplantation.

Le deuxième bio-essai effectué sur d’autres plantules âgées de 15 jours à raison

de 3 répétitions par souches s’est révélé concluant.

Les témoins positifs Forl 12 (X1) et Fol 8 (X2) se sont révélés pathogènes dans

ce bio-essai.

Deux plantules inoculées par Fol 8 sont mortes alors que les plantules inoculées

avec Forl12 ont présenté majoritairement des symptômes de brunissement du pivot,

typiques de la forme spéciale radicis-lycopersici.

Les résultats obtenus pour les 10 isolats, objet de cette étude sont consignés

dans le tableau ci-dessous :

Tableau 10. Les résultats du test du pouvoir pathogène

Souches répétitions Brunissement

des vaisseaux

Brunissement

du pivot NR CL

F1

1 RAS M - /

2 RAS M - /

3 RAS M - +

F2

1 RAS RAS - /

2 RAS RAS - /

3 RAS RAS - /

F3

1 RAS M - /

2 RAS M - +

3 RAS M - /


58

F4

1 RAS M + +

2 RAS M + +

3 RAS M - /

F5

1 RAS M - /

2 RAS M - /

3 RAS M - /

F6

1 RAS M - +

2 RAS M - +

3 RAS M - +

F7

1 RAS M - +

2 RAS M - +

3 RAS M - +

F8

1 RAS M - /

2 RAS M - /

3 RAS M - /

F9

1 RAS M + +

2 RAS M - +

3 RAS M - +

F10

1 RAS M - +

2 RAS M - +

3 RAS M - +

RAS : Aucun brunissement du cylindre central / Racines normales (blanches)

M : Pivot marron

NR : Nécrose racinaire

Cl : Coupe longitudinale du pivot

/ : Coupe longitudinale non effectuée

+ : Coupe longitudinale effectuée

: Brunissement prononcé

La figure 28 montre une plantule inoculée par la souche F1 présentant des symptômes

de pourriture du collet et du pivot, typique de la forme spéciale radicis-lycopersici.

La figure 29 illustre les symptômes observés sur les autres plantules au niveau du

système racinaire en comparaison avec celui d’un témoin négatif.


59

a)-Brunissement des vaisseaux

b) Racines adventives sur la tige

c)-Pourriture du collet

d)-Pourriture du pivot


Figure 28. Symptômes de pourriture du pivot et du collet

a

b

c

d

(Plantule inoculée par la souche F1)

60

A B C

D E F

G H I


Figure 29. Symptômes de pourriture du système racinaire

Souche F5 Souche F6

Souche F7 Souche F8 Souche F9

Souche F10 Souche F3 Souche F4

A : Système racinaire sain (Témoin négatif)

B, C, D, E, F, G : Système racinaire pourri

H, I : Coupe longitudinale du pivot montrant un brunissement des vaisseaux

61

Le pouvoir pathogène des 10 souches a été testé lors de deux bio-essais

miniaturisés. Les résultats obtenus ont été satisfaisants puisque 9 souches se sont

révélées pathogènes avec un degré de virulence qui diffère selon la souche.

En effet, les souches F1, F3, F4, F6, F7, F8, F9, F10 ont engendré des pourritures

racinaires ainsi qu’un brunissement du pivot et du collet.

Ces symptômes similaires à ceux cités par Jarvis, 1988 laissent penser qu’il

s’agirait de souches appartenant à la forme spéciale radicis-lycopersici.

Nos résultats permettent donc de confirmer le caractère pathogène et la forme

spéciale de ces souches.

Par contre, la souche F2 qui était supposée pathogène n’a engendré aucun

symptôme typique (voir fig.30) et elle est considérée donc comme non pathogène.

2.1. Le ré-isolement du pathogène :

Le ré-isolement à partir des tiges et du collet (voir fig.31) et à partir du pivot et

des racines (voir fig.32) des différentes plantules de tomate présentant des symptômes

de pourriture et la comparaison entre l’aspect macroscopique du champignon à partir

duquel l’inoculum a été préparé et le champignon obtenu après le ré-isolement a

révélé qu’il s’agit bel et bien du champignon en question ce qui confirme les postulats

de Koch.


62

A : Système racinaire sain (Témoin négatif)

B, C : Système racinaire sain (Plantule inoculée par la souche F2)


Figure 30. Absence de symptômes de pourriture du système racinaire

Figure 31. Ré-isolement du pathogène à partir du collet et de la tige

A B C

A B

C

A : Ré-isolement à partir des fragments de tige

d’une plantule inoculée par la souche F8.

B : Ré-isolement à partir du collet d’une plantule

inoculée par la souche F8.

C : Ré-isolement à partir des fragments de tige


63


Figure 32. Ré-isolement du pathogène à partir du système racinaire

A B

C D

E

A : Ré-isolement à partir des racines d’une

plantule inoculée par la souche F9.

B : Ré-isolement à partir des racines d’une


C : Ré-isolement à partir d’un fragment du pivot


D : Ré-isolement à partir des racines d’une


E : Ré-isolement à partir des racines d’une


64

3. L’électrophorèse des protéines totales :

L’électrophorèse des extraits protéiques obtenus à partir des isolats et la

décoloration complète du gel obtenu a donné pour chacune des souches étudiées des

bandes horizontales plus ou moins visibles qui correspondent aux différentes

protéines ayant migré verticalement dans le gel de séparation à 10% selon leur poids

moléculaire (voir fig.33).

La reproduction schématique des profils protéiques obtenus sur gel de ploy-

acrylamide (voir fig.34) a permis de différencier 4 niveaux de migration (S1, S2, S3,

S4) correspondant aux emplacements des différentes protéines dont le poids

moléculaire varie selon les niveaux.

L’analyse des profils protéiques de chacune des souches étudiées nous a permis

d’établir le tableau11 sur lequel la présence d’une protéine à un niveau S est indiquée

par le signe ( + ) et l’absence est indiquée par le signe ( − ).

Tableau 11. Les résultats de l’électrophorèse des protéines totales

X1 X2 X3 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

S1 − − − − − − − − − + − − −

S2 + + + + + + + + + + + + +

S3 + − + + − + + + + + + + +

S4 + + + + + + + + + + + + +

S5 + − + + − + + − − − − + +

A partir des résultats illustrés dans le tableau précédent, on a pu calculer le taux

de similitude entre les 10 isolats et les 3 témoins Forl 12 (X1), Fol 8 (X2) et Fo (X3)

selon la loi suivante :

Ts =Nombre de bandes similaire

Nombre de bandes totales× 100


Souches

Niveau

65

X1 X2 X3 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

Figure 33. Profils protéiques des 10 isolats et des 3 témoins sur gel de poly-acrylamide

S1

S2

S4

S5

X1 X2 X3 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

Figure 34. Reproduction schématique des profils protéiques des 10 isolats et des 3 témoins


S3

66

Les différents taux de similitude obtenus sont représentés dans le tableau suivant :

Tableau 12. Les taux de similitude entre les 10 isolats et les 3 témoins

X1 X2 X3 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

X1 100% 33,33% 50% 50% 33,33% 50% 50% 42,85% 42,85% 37,5% 42,85% 50% 50%

X2 33,33% 100% 33,33% 33,33% 50% 33,33% 33,33% 40% 40% 33,33% 40% 33,33% 33,33%

X3 50% 33,33% 100% 50% 33,33% 50% 50% 42,85% 42,85% 37,5% 42,85% 50% 50%

F1 50% 33,33% 50% 100% 33,33% 50% 50% 42,85% 42,85% 37,5% 42,85% 50% 50%

F2 33,33% 50% 33,33% 33,33% 100% 33,33% 33,33% 40% 40% 33,33% 40% 33,33% 33,33%

F3 50% 33,33% 50% 50% 33,33% 100% 50% 42,85% 42,85% 37,5% 42,85% 50% 50%

F4 50% 33,33% 50% 50% 33,33% 50% 100% 42,85% 42,85% 37,5% 42,85% 50% 50%

F5 42,85% 40% 42,85% 42,85% 40% 42,85% 42,85% 100% 50% 42,85% 50% 42,85% 42,85%

F6 42,85% 40% 42,85% 42,85% 40% 42,85% 42,85% 50% 100% 42,85% 50% 42,85% 42,85%

F7 37,5% 33,33% 37,5% 37,5% 33,33% 37,5% 37,5% 42,85% 42,85% 100% 42,85% 37,5% 37,5%

F8 42,85% 40% 42,85% 42,85% 40% 42,85% 42,85% 50% 50% 42,85% 100% 42,85% 42,85%

F9 50% 33,33% 50% 50% 33,33% 50% 50% 42,85% 42,85% 37,5% 42,85% 100% 50%

F10 50% 33,33% 50% 50% 33,33% 50% 50% 42,85% 42,85% 37,5% 42,85% 33,33% 100%


67

0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95

Distance Euclidienne

F5

F2

F10

F11

F9

F8

F13

F12

F7

F6

F4

F3

F1

Les taux de similitude nous ont permis de générer un dendrogramme de

groupement des souches étudiées (voir fig.35) dont la distance Euclidienne s’étale de

0,65 à 0.91.

A la distance 0,71 les souches étudiées forment 4 groupes distincts.

La majorité des souches se trouvent au sein d’un grand groupe désignée I, il

s’agit des souches : X1, X3, F1, F3, F4, F9, la souche F7 est le seul membre du groupe

III.

Les souches F5, F8, F6 se trouvent au sein du groupe II et les souches X2 et F2 se

trouvent au sein du groupe IV.

En somme le groupe I de loin le plus abondant, rejoint le groupe II et III à la

distance euclidienne 0,84 les quatre groupes finissement par rejoindre le groupe IV à

la distance euclidienne 0,91.


X1

X3

F1

F3

F4

F9

F10

F5

F6

F8

F7

X2

F2

Figure 35. Dendrogramme de groupement des 10 isolats et des 3 témoins

I

II

III

IV

68

4. La compatibilité végétative :

Des mutants nit ont été obtenus à partir de tous les isolats, un seul type de

mutant a été obtenu à partir des isolats F1, F2, F3, F4, F5 donc pas de croisement

possible d’où l’impossibilité de vérifier l’auto-compatibilité des isolats, par contre il

était possible de croiser les mutants appartenant à des isolats différents ce qui a permis

de vérifier si ces derniers appartenaient au même VCG.

Pour les isolats : F6, F7, F8, F9, F10 les trois types de mutants ont été obtenus

d’où la possibilité de vérifier l’auto-compatibilité et la possibilité de les croiser en eux

et avec les isolats précédemment cités.

Le tableau suivant représente les différents types de mutants obtenus à partir des

isolats

Tableau 13. Les différents types de mutants obtenus à partir des isolats

Mutant nit1

Mutant nit3

Mutant nitM

F1 + − −

F2 − − +

F3 + − −

F4 + − −

F5 − − +

F6 + + +

F7 + + +

F8 + + +

F9 + + +

F10 + + +

+ : Mutant obtenu

− : Mutant non obtenu

Par ailleurs un mutant nit 1 a été confronté avec un mutant nit M d’un testeur

Fol : 0030, 0031, 0032, 0033 et Forl : 0090 I, 0090 II, 0090 III, 0091 I, 0091 II, 0092,

0093, 0094 uni, 0094 I, 0094 II, 0094 III, 0094 IV, 0096, 0098, 0099.

Type de mutant

Isolats


69

Et comme certains isolats n’ayant pas formé de mutant nit 1, c’est le mutant nit

3 qui est alors confronté au mutant nit M du testeur.

Les résultats obtenus des différents croisements effectués sont représentés dans

les tableaux suivant :

Tableau 14. Les résultats du test d'auto-compatibilité et le croisement

des souches entre elles

nit1 nitM nit3 nit3 nitM nit1/3 nit1/3 nit1/3 nit1/3 nit1/3

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

nit1 F1 × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM F2 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nit3 F3 ∅ ∅ × × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nit3 F4 ∅ ∅ × × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nit3 F5 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nit1/3 F6 ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ + + + ∅ ∅

nit1/3 F7 ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ + + + ∅ ∅

nit1/3 F8 ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ + + + ∅ ∅

nit1/3 F9 ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ + ∅

nit1/3 F10 ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ ∅ +

× : Croisement non effectué

∅ : Aucun hétérocaryon formé

+ : Formation d’hétérocaryon

Tableau 15. Les résultats de la confrontation des isolats avec les testeurs Fol

nit1 nitM nit3 nit3 nitM nit1 nit1 nit1 nit1 nit1

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

nitM 0030 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0031 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0032 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0033 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

Isolats

Testeurs

Isolats

Isolats


70

Tableau 16. Les résultats de la confrontation des isolats avec les testeurs Forl

nit1 nitM nit3 nit3 nitM nit1 nit1 nit1 nit1 nit1

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

nitM 0090 I ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0090 II ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0090 III ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0091 I ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0091 II ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0092 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0093 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0094 uni ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0094 I ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0094 II ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0094 III ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0094 IV ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0096 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0098 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

nitM 0099 ∅ × ∅ ∅ × ∅ ∅ ∅ ∅ ∅

De ces différents croisements il en ressort que les isolats : F1, F2, F3, F4, F5 n’ont

pas donné les trois types de mutants nit nécessaires pour effectuer tous les

croisements et aucun hétérocaryon n’a été observé lorsque le croisement était

possible, cela laisse supposer que soit tout ces isolats sont self-incompatibles ou alors

s’ils ne le sont pas, certains d’entre eux peuvent appartenir à des VCG connus ou

alors aucun VCG connu ne peut leur être assigné.

Les isolats F6, F7, F8, F9, F10 (voir fig.36) sont tous auto-compatibles, par

ailleurs seul les isolats : F6, F7, F8 sont compatibles entre eux, cela laisse dire qu’ils

appartiennent au même VCG (voir fig.37, 38).

Le testeur VCG 0097 étant non disponible cela suggère l’existence d’au moins

deux nouveaux VCG au sein de la population de Fusarium oxysporum f.sp. radicis-

lycopersici.

Les lettres C, G et X sont temporairement attribuées à ces différents groupes

comme suit : VCG (C) attribué aux isolats F6, F7, F8 VCG (G) attribué à l’isolat F9

VCG (X) attribué à l’isolat F10.

Isolats

Testeurs

Résultats et discussion Résultats et discussion

71

Formation d’hétérocaryon

Figure 36. Résultat du test d’auto-compatibilité de la souche F6

Figure 37. Résultat de la confrontation du mutant nitM de la souche F6

avec le mutant nit1 de la souche F7

Figure 38. Résultat de la confrontation du mutant nitM de la souche F6

avec le mutant nit1 de la souche F8


nitM nit1

nit1 nitM

nit1 nitM

72

Absence d’hétérocaryon


Figure 39. Résultat de la confrontation du mutant nit1 de la souche F6

avec le mutant nitM du testeur Fol 0030

Figure 40. Résultat de la confrontation du mutant nit1 de la souche F6

avec le mutant nitM du testeur Forl 0090

Absence d’hétérocaryon nit1

nitM

nit1 nitM

73

5. La récapitulation des résultats obtenus :

Les résultats des différents tests réalisés au cours de notre travail sur les 10

isolats ainsi que leur provenance sont résumés dans le tableau suivant :

Tableau 17. La récapitulation des résultats obtenus

Souches Provenance

Test bio Conclusion VCG Pays Ville Région

F1 Algérie Oran Sidi Maarouf P : 3

N : 0 Forl /

F2 Algérie Oran Hassi Bounif P : 0

N : 3 Non

pathogène /

F3 Algérie Oran Boutlelis P : 3

N : 0 Forl /

F4 Algérie A. Temouchent Ouled Taoui P : 3

N : 0 Forl /

F5 Algérie Mascara Mohammadia P : 3

N : 0 Forl /

F6 Algérie Annaba Annaba P : 2

N : 1 Forl C


N : 1 Forl C


N : 0 Forl C


N : 0 Forl G


N : 0 Forl X

P : pathogène

N : non pathogène


74

Conclusion

Les pays du bassin méditerranéen et en particulier les pays du Maghreb, où la

culture de la tomate occupe une place économique très importante, sont confrontés à

une recrudescence des fusarioses de la tomate causées par Fusarium oxysporum f.sp.

lycopersici et Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici.

Ce fléau est favorisé par les changements climatiques à savoir : une température

en hausse durant toute l’année et un taux d’humidité croissant permettant le

développement des champignons.

Dans le cadre de notre étude et afin de mettre en évidence le pouvoir pathogène

des souches isolées, un test miniaturisé sur plantules de tomate a été mis au point.

Les résultats obtenus nous ont permis de distinguer des souches pathogènes

appartenant à la forme spéciale radicis-lycopersici et des souches non-pathogènes qui

pourraient être utilisées comme moyen de lutte biologique potentiel susceptible de

protéger les cultures de tomates contre les agents pathogènes tout en limitant

l’utilisation de pesticides, ce qui s’intègre parfaitement dans une démarche

respectueuse de l’environnement.

Le profil protéique des souches étudiées dont le dendrogramme nous a conduit à

les répartir en quatre groupes distincts montrant une hétérogénéité au sein de la

population de Fusarium oxysporum isolés dans l’ouest et l’est du pays.

Le test de compatibilité végétative a révélé l’existence d’au moins deux

nouveaux groupes de compatibilité végétative au sein de la population avec des codes

représentés par des lettres relatives à ces groupes, temporairement.

75

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Annexe I : Composition des milieux de culture

Milieu Potato Dextrose Agar (PDA) solide :

Pomme de terre ....................................................................................................... 200 g

Glucose .................................................................................................................... 10 g

Agar .......................................................................................................................... 20 g

Eau distillée ........................................................................................................ 1000 ml

pH=5,6

Milieu Potato Dextrose Agar (PDA) liquide :

Pomme de terre ....................................................................................................... 200 g

Glucose .................................................................................................................... 10 g

Eau distillée ........................................................................................................ 1000 ml

pH=5,6

Milieu gélosé à 2% :

Agar .......................................................................................................................... 20 g

Eau distillée ........................................................................................................ 1000 ml

Milieu Malt Acide Triton :

Malt acide triton : Acide citrique ....................................................................... 250 mg/l

Triton ......................................................................................................................3 ml/l

Eau distillée ........................................................................................................ 1000 ml

Milieu de base :

Saccharose................................................................................................................. 30 g

KH2PO4 ....................................................................................................................... 1 g

KCl ........................................................................................................................... 0,5 g

MgSO4 7H2O ........................................................................................................... 0,5 g

Solution d’oligo-éléments ......................................................................................... 2 ml

Agar........................................................................................................................... 20 g

Eau distillée ........................................................................................................ 1000 ml

pH=5,7

Solution d’oligo-éléments :

Acide citrique .............................................................................................................. 5 g

ZnSO4 7H2O ................................................................................................................ 5 g

FeSO4 7H2O ........................................................................................................... 4,75 g

Fe(NH4)2 (SO4)2 6H2O ................................................................................................ 1 g

CuSO4 5H2O ........................................................................................................... 0,25 g

MnSO4 H2O ............................................................................................................ 0,05 g

H3BO3 .................................................................................................................... 0,05 g

NaMoO4 2H2O ....................................................................................................... 0,05 g

Eau distillée ........................................................................................................ 1000 ml

Ne préparer que 100 ml de la solution qui peut etre concervée à l’abri de la lumiere.

Milieu Chlorate :

Milieu de base

L-asparagine ............................................................................................................. 1,6 g

NaNO3 ......................................................................................................................... 2 g

KClO3 ........................................................................................................................ 15 g

pH=5,7

Milieu Nitrate :

Milieu de base

NaNO3 ......................................................................................................................... 2 g

pH=5,7

Milieu Nitrite :

Milieu de base

NaNO2 ...................................................................................................................... 0,5 g

pH=5,7

Milieu Hypoxanthine (MH) :

Milieu de base

Hypoxanthine ........................................................................................................... 0,2 g

pH=5,7

Les milieux de culture sont autoclavés à 120oC pendant 20 minutes

Annexe II : Composition des solutions d’électrophorèse (SDS PAGE)

Tampon de charge (SDS PAGE) :

Tris ......................................................................................................................... 0,15 g

SDS .......................................................................................................................... 0,4 g

Glycérol..................................................................................................................... 1 ml

β-Mercaptoéthanol ................................................................................................. 0,5 ml

Bleu de Bromophénol ............................................................................................ 0,01 g

Eau distillée q.s.p ...................................................................................................... 5 ml

Le tampon de charge est réparti à raison de 0,5 ml dans des tubes à hémolyse avant

d’être conservé au congélateur jusqu’au moment de l’emploi

Tampon de migration (pH=8,3) :

Tris ......................................................................................................................... 3,03 g

SDS ............................................................................................................................. 1 g

Glycine ................................................................................................................... 14,4 g

Eau distillée q.s.p ................................................................................................ 1000 ml

Le tampon de migration est conservé au réfrigérateur

Tampon de concentration (pH=6,8) :

Tris .............................................................................................................................. 3 g

Eau distillée q.s.p .................................................................................................... 20 ml

Tampon de séparation (pH=8,8) :

Tris ......................................................................................................................... 36,3 g

Eau distillée q.s.p .................................................................................................. 100 ml

Solution d’acrylamide 30% :

Acrylamide ................................................................................................................ 15 g

Eau distillée q.s.p .................................................................................................... 50 ml

Solution de bis-acrylamide 1% :

N’N’-bis-méthyleine-acrylamide ............................................................................. 0,5 g

Eau distillée q.s.p ................................................................................................... 50 ml

Solution de coloration des protéines totales :

Bleu de Coomassie G250 ......................................................................................... 1,5 g

Ethanol .................................................................................................................. 250 ml

Acide acétique ......................................................................................................... 40 ml


Solution de fixation :

Acide acétique ....................................................................................................... 200 ml


Solution de décoloration:

Ethanol .................................................................................................................. 250 ml



Solution de conservation :



Annexe III

Tampon phosphate (pH=7,1):

Solution A : NaH2PO4, H2O....................................... 2,76 g dans 100 ml d’eau distillée

Solution B : NaHPO4, 2H2O ..................................... 7,12 g dans 200 ml d’eau distillée

Ajuster le pH de la solution A à 7,1 avec la solution B.

Réactif de Bradford :

Bleu de Coomassie R250 ....................................................................................... 10 mg

Acide Orthophosphorique 85 %.............................................................................. 10 ml

Ethanol 95 % ............................................................................................................. 5 ml

Eau distillée q.s.p .................................................................................................. 100 ml

MEMOIRE DE MAGISTER - univ-oran1.dz

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