Zahia BENMOUNA - univ-oran1.dz

Université d’ORAN Faculté des Sciences

Département de Biotechnologie

Thèse de MAGISTER en Biotechnologie

Option : Ecosystèmes microbiens complexes

Présentée par

Zahia BENMOUNA

Intitulée

Devant le Jury :

Président : Pr. H. ZADI- KARAM Université d’Oran Examinateurs : Pr. N-E. KARAM Université d’Oran Dr. S. ROUDJ Université d’Oran Dr. Z. BOUCHERIT Université de Tlemcen

Rapporteur : Dr. F. DALACHE Université de Mostaganem

Soutenue le : / / 2012

Bactériocines des bactéries lactiques :

étude biochimique et génétique.

i

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier sincèrement, en premier lieu le Professeur Zadi-Karam Halima et le

Professeur Karam Nour-Eddine de m’avoir accueillie dans leur laboratoire, pour leur

gentillesse, leur professionnalisme et de m’avoir donnée l’opportunité de réaliser mon

mémoire de Magister dans les conditions les plus favorables.

Toute ma gratitude va à Madame Dalache Fatiha, ma directrice de mémoire pour les qualités

d’un encadrant perfectionniste dans son travail. Aussi, je la remercie pour sa rigueur, pour

son enthousiasme, pour sa patience, pour sa présence. Oui, c’est votre présence qui m’a

donné le courage, et les solutions pour tous les problèmes scientifiques, grâce à vous madame,

j’ai appris beaucoup de choses. Je ne vous remercierai jamais assez de m’avoir soutenue

quand ça n’allait pas si bien, de m’avoir poussée pour que je donne le meilleur de moi même.

C’est un immense plaisir d’avoir travaillé avec vous.

Un Merci spécial s’adresse au Professeur Karam Nour-Eddine, pour son aide considérable et

ses conseils précieux, pour être toujours présent pour répondre à mes besoins durant la

réalisation de ce mémoire. Je le remercie aussi pour l’honneur immense qu’il me fait en

examinant mon travail, ces remarques seront pertinentes au cours de la soutenance.

Je tiens à remercier encore une fois Professeur Zadi-Karam Halima d’être toujours prête à

répondre à mes questions, pour vos précieux conseils, Pour votre disponibilité, pour votre

rigueur scientifique, et de l’honneur que vous me faite en présidant le jury de soutenance.

Puisse l’expression de ma profonde gratitude atteindre, Madame Boucherit Zahia pour l’e

grand honneur qu’elle me fait en acceptant de juger mon modeste travail.

Je remercie particulièrement Madame Roudj Salima, pour ses précieux conseils, sa rigueur

scientifique et d’avoir accepté d’examiner ce travail.

Je remercie également les enseignants et les enseignantes, qui appartiennent au Laboratoire

de Biologie des Microorganismes et Biotechnologie.

Un merci chaleureux s’adresse à Amina et Ilhem d’avoir été des amies proches et d’être

toujours là pour moi. Aussi à mes camarades de Magister.

En fin, un Merci spécial s’adresse aux techniciennes du Laboratoire de Biologie des

Microorganismes et Biotechnologie, à Ilhem, Khalida, Khadidja et Atika, sans oublier

Djoher, de leur aide et soutien moral.

ii

DEDICACE

C’est grâce à Dieu « الله », le tout puissant qui m’a donné le courage et la volonté pour

achever ce modeste travail que je dédie :

A mon très cher Papa et ma très chère Maman, pour leurs sacrifices, leur soutien moral, de

leur tendresse, de leurs encouragements tout au long de mes études et durant ce mémoire, ils

m’ont offert tout pour que je réussisse, je ne les remercierai jamais assez pour tout ce qu’ils

m’ont fait, j’espère qu’ils sont fiers de moi.

A mes très Chères sœurs Dalel , Wassila, et surtout Amel, et à mon cher Frère Hamouda, qui

m’ont donné l’aide, l’amour et le courage de surmonter toutes les épreuves.

A mes deux beaux frères : Bachir et Belkheir.

A mon très cher oncle et sa femme, qui constituent pour moi un modèle de réussite.

Je dédie aussi ce mémoire à ma très chère tante TATA Salima et son mari Hbibi, pour leurs

encouragements si tendres.

iii

SOMMAIRE

ABREVIATIONS i

LISTE DES FIGURES ii

LISTE DES TABLEAUX iii

Introduction Générale 1

1. Etude bibliographique 4

1.1. Les bactéries lactiques 5

1.2. Propriétés technologiques des bactéries lactiques 8

1.3. Les agents inhibiteurs produits par des bactéries lactiques 10

1.3.1 Les acides organiques 10

1.3.2 Le peroxyde d’hydrogène 10

1.3.3 La reutérine 10

1.3.4 La production de bactériocine 11

1.4. Les bactériocines 11

1.4.1 Définition des bactériocines 11

1.4.2 Classification des bactériocines 12

1.4.3 Biosynthèse et régulation de la production des bactériocines 14

1.4.4 Le mécanisme d’action des bactériocines 18

1.5. Caractéristiques et applications industriels des bactériocines 20

1.6 Optimisation de production de bactériocine 27

2. Matériel et méthodes 31

2.1 Matériel 31

2.1. 1 Souches bactériennes 31

2.1. 2 Milieux de culture 31

2. 2 Méthodes 32

2.2. 1 Vérification de la pureté des souches et leur appartenance au groupe lactique 32

2.2. 2 Conservation des souches 32

2.2. 3 Mise en évidence des interactions négatives 33

Méthode directe : Fleming et al. (1975) 33

Méthode indirecte : Schillinger et Lücke (1989) 33 2.2.4 Production d’agents inhibiteurs dans différents milieux 34

2.2.5 Caractérisation des agents inhibiteurs 34

2.2.5.1 Inhibition par production des acides organiques 34

2.2.5.2 Détermination des inhibitions dues à la production du peroxyde

d’hydrogène ou des bactériocines 35

2.2.6 Optimisation de la production et/ou l’activité d’une bactériocine 35

2.2.6.1 Effet de la composition du milieu sur la production de bactériocine 36

Effet de la source d’azote 36

Effet de la source de carbone 37

Effet de la source de potassium 37 2.2.6.2 Effet de la température d’incubation 37

2.2.6.3 Effet du pH sur la diffusion de la bactériocine 38

2.2.7 Production de bactériocine en présence de lait 38

iv

2.2.8 Caractérisation physico-chimique de la bactériocine 39

Effet du pH 39

Effet de la température 39 2.2.9 Estimation de la quantité de bactériocine produite 40

2.2.10 Cinétique de croissance et de production de bactériocine 40

2.2.11 Effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine 41

2.2.12 Purification partielle de la bactériocine 41

2.2.12.1 Précipitation au sulfate d’ammonium 41

2.2.12.2 Dessalement 42

2.2.12.3 Estimation du Poids Moléculaire par tricine SDS PAGE 43

3. Résultats et Discussion 46

3.1. Confirmation de la pureté et l’appartenance des souches aux groupes lactiques 46

3.2 Mise en évidence des bactéries inhibitrices 47

3.2.1 La méthode de Fleming et al 1975 47

3.2.2 Mise en évidence des inhibitions par la méthode de Schillinger et Lücke (1989) 50

3.3 Production et stabilité des agents inhibiteurs dans différents milieux 53

3.4 Caractérisation des agents inhibiteurs 55

3.4.1 Inhibitions dues à la production d’acide organique 56

3.4.2 Inhibitions dues à la production de peroxyde d’hydrogène et de bactériocine 59

3.5 Optimisation de la production et/ou l’activité de la bactériocine par CHM9 61

3.5.1 L’effet de la composition du MRS sur la croissance

bactérienne et la production de bactériocine 61

Effet de la source d’azote 61

Effet de la source de carbone 64

Effet de la source de potassium 67

3.5.2 L’effet de la température d’incubation 69

3.5.3 L’effet du pH sur la diffusion de la bactériocine CHM9 71

3.6 Production de la bactériocine CHM9 en présence de lait 75

3.7 Propriétés physico-chimiques de la bactériocine 77

L’effet du pH 77

L’effet de la température 79 3.8 Estimation de la quantité de bactériocine 80

3.9 Cinétique de croissance et de production de bactériocine 81

3.10 Effet de quelques détergents sur l’activité de la bactériocine 86

3.11 Purification partielle de la bactériocine 88

3.11.1 Concentration de la bactériocine par le sulfate d’ammonium 88

3.11.2 Dessalement 91

3.11.3 Estimation du poids moléculaire de la bactériocine par

électrophorèse tricine SDS-PAGE 94

4. Conclusion et Perspectives 98

5. Annexe 1 102

6. Annexe 2 105

7. Références bibliographiques 107

v

ABREVIATIONS

ABC : ATP binding Cassette

ADN : Acide Désoxyribonucléique

ARNr : Acide Ribonucléique ribosomique.

ATB : Antibiotique

AU/ml : Unité arbitraire / millilitre.

CAT : Catalase

DO : Densité optique

EV : Extrait de viande

EY : Extrait de levure

G+C : Guanine+Cytosine.

GSP : Generally Section Pathway

h : Heure

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène

K2HPO4 : Hydrogénophosphate dipotassique

KDa : Kilo Dalton

KH2PO4 : Dihydrogenophosphate potassique

M : Mole / litre

Mb : Méga base

min : Minute

Na2HPO4 : Hydrogénophosphate disodique

NaCl : Chlorure de sodium

NaH2PO4 : Dihydrogénophosphate monosodique

nm : Nanomètre

nTp : Non tamponné

PAGE : Poly Acrylamide Gel Electrophoresis

PEP : Pepsine

pH : Potentiel d’hydrogène

PRO : Pronase E

rpm: tours par minute

SDS : Sodium Dodécyl Sulfate

Tp : Tamponné

Tris : Triaminoméhane.

TRY : Trypsine

Try : Tryptone

vi

LISTE DES FIGURES

Figure 1: L’arbre phylogénétique des bactéries lactiques. 6

Figure 2 : Régulation de la production, modifications post-

traductionnelles et auto-immunité de la nisine. 16

Figure 3 : ABC-transporteur avec le domaine protéasique. 16

Figure 4: Schéma de la biosynthèse de la production des bactériocines de la

sous classe IIa, montrant: la régulation, la synthèse, le transport et l’immunité. 18

Figure 5 : Mécanisme d’action par la formation de pores des lantibiotiques. 19

Figure 6 : Schéma du mode d’action des bactériocines de la classe IIa. 20

Figure 7 : Les facteurs influençant la production et l’activité de la bactériocine. 24

Figures 8 : Différents domaines des applications des bactériocines

des bactéries lactiques. 26

Figure 9 : Les interactions inhibitrices inter-bactériennes. 47

Figure 10 : L’effet inhibiteur des surnageants de culture des Leuconostocs

contre CHM19. 50

Figure 11 : L’effet de l’addition du lait dans le MRSY sur la production

de l’agent inhibiteur contre H2.3. 54

Figure 12 : L’effet du milieu non tamponné et tamponné sur l’effet inhibiteur des

leuconostocs et des lactobacilles. 57

Figure 13 : L’effet des enzymes protéolytiques et de la catalase sur l’activité

des agents inhibiteurs. 59

Figure 14 : L’effet de différentes sources d’azote sur la production de la

bactériocine par CHM9 testée contre H2.3. 62

Figure 15 : L’effet de différentes sources de carbone sur la production de

la bactériocine par CHM9. 65

Figure 16 : L’effet de différentes sources de carbone sur la croissance

bactérienne et la production de bactériocine par CHM9. 65

Figure 17 : L’effet de différentes sources de potassium sur la production

de bactériocine par CHM9 contre H2.3. 68

Figure 18 : L’effet de la source de potassium sur la croissance bactérienne

et la production de bactériocine de la CHM9. 68

Figure 19 : L’effet de la température d’incubation sur la production

de la bactériocine CHM9. 70

vii

Figure 20 : Effet de la température d’incubation sur la croissance

bactérienne et la production de bactériocine par CHM9. 70

Figure 21 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine. 72

Figure 22 : L’effet du pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine

produite par CHM9. 74

Figure 23 : L’effet de la présence du lait dans trois milieux différents (MRS, MRSY et

MRSm) sur la production de la bactériocine CHM9. 76

Figure 24 : L’effet des pH acides ou basiques sur l’activité de la

bactériocine CHM9 contre H2.3. 77

Figure 25 : L’effet de différentes températures sur l’activité de la

bactériocine CHM9 contre H2.3. 79

Figure 26 : Les cinétiques de production de la bactériocine dans quatre

milieux différents. 82

Figure 27 : Cinétiques de croissance bactérienne et de production de la bactériocine par

CHM9 dans quatre milieux différents. 82

Figure 28 : Concentration des surnageants de culture par le sulfate d’ammonium. 89

Figure 29 : Chromatogramme représentant la DO à 280nm des fractions obtenues par la

chromatographie et graphe de l’effet inhibiteur des fractions. 92

Figure 30 : L’effet inhibiteur des fractions obtenues par la chromatographie. 92

Figure 31: Tricine SDS PAGE de différents échantillons. 95

viii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Quelques applications des bactéries lactiques. 9

Tableau 2 : La classification de quelques bactériocines des bactéries lactiques. 14

Tableau 3 : Facteurs influençant l’activité de la bactériocine dans l’aliment. 22

Tableau 4 : Les bactéries lactiques productrices de bactériocines et les

aliments fermentés associés. 25

Tableau 5 : l’utilisation probiotique des bactériocines des classe I et II. 26

Tableau 6 : Milieux de culture non conventionnels pour l’étude de la

croissance et de la production de bactériocines de différentes bactéries lactiques. 29

Tableau 7 : les différentes souches utilisées, leur origine et identification. 31

Tableau 8 : Quantité de sulfate d’ammonium ajoutée pour les saturations désirées. 42

Tableau 9 : Caractérisation macroscopique et microscopique des souches. 46

Tableau 10 : Les interactions inhibitrices inter-bactériennes. 103

Tableau 11 : Inhibitions par les surnageants de culture des Leuconostocs. 51

Tableau 12 : La production de l’agent inhibiteur par les 24 souches dans

différents milieux. 104

Tableau 13 : Les inhibitions dues à la production d’acides organiques. 58

Tableau 14 : Inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène et aux bactériocines. 60

Tableau 15 : Effet des différentes sources d’azote sur la croissance bactérienne et

la production de la bactériocine par CHM9. 62

Tableau 16 : L’effet du pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine produite

par les souches CHM9, CHM18 et CHBK310. 72

Tableau 17 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine

produite par CHM9. 74

Tableau 18 : L’effet de différentes conditions sur la production de

bactériocine chez CHM9. 76

Tableau 19 : L’effet du pH sur l’activité de la bactériocine CHM9. 78

Tableau 20 : L’effet des températures sur l’activité de la bactériocine CHM9. 79

Tableau 21 : L’effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine

CHM9. 86

Tableau 22 : La concentration par le sulfate d’ammonium de surnageants de

culture de la CHM9.

Tableau 23 : Préparation des gels à 16, 10 et 4% d’acrylamide 107

Les bactéries lactiques ont été, depuis longtemps, un outil de conservation et de

transformation des aliments, en dépit de l’ignorance de ces potentiels technologiques. Elles

étaient présentes dans de nombreux écosystèmes microbiens, car elles ont la particularité de

prédominer dans des environnements assez riches tels que le lait et ces dérivés, les végétaux

et dans les cavités humaines et animales.

Les aliments constituent un environnement, dans lequel plusieurs bactéries peuvent

cohabiter. Certains de ces microorganismes provoquent seulement des altérations des produits

alimentaires alors que d’autres, comme listeria, causent des maladies aux consommateurs.

D’où l’importance de les éliminer. Les antibiotiques présentent depuis quelques décennies un

excellent moyen pour faire barrage à tous ces microorganismes nocifs. Cependant, ils

présentent le grand danger de l’apparition de multirésistances chez ces derniers.

Plusieurs industriels ont cherché le bon moyen afin d’éradiquer les microorganismes

d’altération, et cela par conservation à basse température et/ou l’addition de conservateurs

chimiques. Cependant, plusieurs microorganismes peuvent plus ou moins, résister à ces

conditions. De plus les conservateurs chimiques montrent de plus en plus, leur pouvoir

cancérigène à fortes doses ce qui constitue un problème grave en santé publique.

La présence des bactéries lactiques dans différents écosystèmes, peut assurer, d’une

part, le bon déroulement des étapes de production d’un aliment fermenté, ses qualités

organoleptiques, et d’autres part, sa conservation naturelle (ou bioconservation), en réduisant

ou éliminant l’addition des conservateurs chimiques et en les remplaçant par d’autres qui sont

naturels.

La bioconservation des aliments, est due aux pouvoirs antagonistes des bactéries

lactiques. En effet, elles ont la particularité de synthétiser des substances inhibitrices,

principalement les acides organiques (acide lactique et acide acétique), le peroxyde

d’hydrogène (H2O2) et les bactériocines. Ces dernières ont fait l’objet de nombreuses études

et la nisine (E234) est l’une des rares bactériocines, qui sont utilisées en agroalimentaire,

comme bioconservateur. Ces substances sont aussi utilisées comme produits pharmaceutiques

(contre certaines mammites) et parapharmaceutiques, en effet, leur champs d’utilisation

s’élargit de plus en plus, chaque jour, vus leur diversité, leur caractéristiques physico-

chimiques et leur spectre d’action. De plus elles peuvent être synthétisées par tous les genres

de bactéries lactiques.

C’est dans cette optique que s’insère notre travail dont les objectifs sont les suivants :

Faire un criblage des interactions inhibitrices entre les bactéries lactiques des

genres Lactobacillus et Leuconostoc.

Détecter la ou les bactérie(s) bactériocinogène(s).

Optimiser les conditions de production de bactériocine.

Caractériser physico-chimiquement la bactériocine la plus performante.

Faire une purification partielle, afin de déterminer son poids moléculaire.

« Ce que l’on conçoit bien, s’énonce clairement, et

les mots pour le dire arrivent aisément »

Boileau

LBMB Etudes Bibliographique

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1. Etude bibliographique

1.1 Les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont, un groupe de bactéries hétérogènes, à Gram positif, non

sporulantes, catalase négatives avec de rares souches possédant des activités pseudo-

catalasiques, aéro-tolérantes, tolérantes à l’acidité, organotrophes, d’une forme qui varie des

coques aux bacilles et leur produit majeur du métabolisme est l’acide lactique, qui est produit

à partir de glucose, d’où leur désignation. Leur ADN chromosomique est caractérisé par le

pourcentage de G+C≤55%.

La division cellulaire chez les bactéries lactiques se fait dans un seul sens, à

l’exception du genre Pediococcus, dont la division se fait dans les deux sens. Elles sont très

exigeantes du point de vue nutritionnel et ont besoin de facteurs de croissance tels que les

vitamines.

Ces microorganismes peuvent être homofermentaires, dans ce cas, ils synthétisent

l’acide lactique comme produit principal de leur métabolisme (85%). Les bactéries

hétérofermetaires, produisent en plus de l’acide lactique, de l’acide acétique, de l’éthanol et

du CO2.

Ecologie des bactéries lactiques

En général, les bactéries lactiques cohabitent dans des environnements riches en

nutriments. Comme les végétaux décomposés, les fruits, les produits laitiers, les poissons et

les viandes fermentés, les betteraves, les pommes de terre, et les cavités humaines et animales

(la bouche, les organes génitaux, les voies intestinales et respiratoires) Dellaglio et al. (1994).

Certaines espèces sont utilisées comme ferments, de plus leur pouvoir acidifiant

prévient la contamination des aliments par les microorganismes pathogènes ou d’altération,

(Hammes et al., 1991). D’autres espèces sont utilisées comme probiotiques, conférant un

potentiel bénéfique à l’écosystème intestinal humain et animal (Tannock, 2005).

Classification des bactéries lactiques

La classification des bactéries lactiques repose principalement sur leur morphologie

(bacilles ou coques), mais aussi sur les critères phénotypiques suivants (Axelsson, 2004) :


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Le mode de fermentation du glucose.

La croissance à différentes température (de 15 à 45°C).

La nature de l’acide lactique (D, L ou DL).

La tolérance ou l’intolérance aux fortes concentrations en sel (6,5%, 18%NaCl).

La tolérance à l’acidité (des pH relativement bas), au milieu alcalin ou à l’éthanol.

La tolérance aux sels biliaires.

L’hydrolyse de l’arginine, la formation de l’acétoïne.

La production des polysaccharides extracellulaires,…etc.

Orla-Jengen (1919), est le premier, qui a proposé une classification des bactéries

lactiques. Une autre classification a été donnée par Kandler et Weiss, (1986), en divisant les

bactéries lactiques en trois groupes distincts : homofermentaires strictes, hétérofermetaires

facultatives et hétérofermentaires strictes.

A partir de 1990, une classification qui se base sur le séquençage de l’ARNr 16S a été

proposée, ce dernier a permis d’organiser les genres des bactéries lactiques dans un arbre

phylogénétique (Figure 1).

Figure 1: L’arbre phylogénétique des bactéries lactiques (Axelsson, 2004)

Les bactéries lactiques peuvent se diviser en deux groupes, selon le pourcentage

G+C% dans leur génome :


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Les actinomycetes dont le G+C>50%, ce groupe renferme les genres : Atopobium,

Bifidobacterium, Corynebacterium, et Propionibacterium.

La branche des clostridiums, qui regroupe les bactéries dont le G+C< 50%, ce

groupe rassemble les principaux genres des bactéries lactiques : Carnobacterium,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus et Streptococcus.

Les bactéries lactiques constituent les genres : Lactobacillus, Lactococcus,

Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus,

Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella. D’autres genres ont

récemment, été inclus dans le groupe des bactéries lactiques, il s’agit de : Aerococcus,

Microbacterium, Propionibacterium et Bifidobacterium (Carr et al., 2002).

Caractéristiques des principaux genres :

Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène, chaque genre possède ses propres

caractéristiques, qui le différencient des autres, phénotypiquement et génotypiquement. Nous

présentons ci-dessous les caractéristiques des principaux genres lactiques: Lactobacillus,

Leuconostoc.

Genre Lactobacillus : parmi les genres les plus utilisés en agroalimentaire et la

nutrition humaine, selon la collection Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen and

Zellkulturen (DSMZ, 2008), ce genre renferme 174 espèces (les sous-espèces sont incluses).

Il contribue aux flaveurs des produits fermentés par la production de diacetyle principalement

(Kandler et Weiss, 1986). Ces bactéries sont de forme bacillaire ou cocobacillaire et ont

tendance à former des chaînettes. Elles sont des acidophiles, leur pH maximum de croissance

est de 7,2. Certaines espèces sont mésophiles, mais d’autres sont thermophiles comme

l’espèce Lactobacillus jensenii (Hammes et Vogel, 1995).

Genre Leuconostoc : sont hétérofermentaires stricts, ils produisent la forme D

lactate à partir de glucose et dégradent l’arginine. La forme des cellules varie de sphérique à

lenticulaire et sont associées en paires ou en chaînettes. Ils sont non protéolytiques et certaines

espèces possèdent l’activité caséinolytique. Les leuconostocs jouent un rôle important, dans la

qualité organoleptique et la texture des aliments. ils ont la particularité de résister aux

antibiotiques (30µg/ml de vancomycine), par conséquent ils peuvent prédominer dans un

environnement en présence de cet antibiotique (Mathot et al., 1994). Selon la collection

DSMZ (2008), ce genre renferme 24 espèces.


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Génétique des bactéries lactiques

Le génome des bactéries lactiques varie d’une espèce à une autre, (Morelli et al.,

2004). Makarova et al. (2006) ont décrit le génome de 20 souches lactiques.

Le poids moléculaire moyen des bactéries lactiques varie de 0,04 Mb (Lactobacillus

rhamnosus HN001) à 3,34 Mb (Lactobacillus plantarum WCFS1) Azcarate-Peril et

Klaenhammer (2010). Le faible poids moléculaire des bactéries lactiques explique toutes les

exigences de ces bactéries.

Les plasmides des bactéries lactiques expriment différentes fonctions, telles que la

fermentation des sources de carbones, les activités protéinases, la production de bactériocine,

les mécanismes de résistances aux antibiotiques et les mécanismes de défense contre les

phages (Morelli et al., 2004).

1.2 Propriétés technologiques des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont productrices de substances organiques. Grâce à leur

métabolisme, elles contribuent à l’arôme et confèrent des qualités organoleptiques (flaveur et

texture) spécifiques aux aliments (Caplice et Fitzgerald, 1999), tout en assurant la sécurité

alimentaire et en augmentant la durée de vie des aliments. Elles contribuent à la fermentation

des aliments par production d’acide lactique à partir d’une source de carbone (glucose). Elles

ont la propriété de dominer des environnements riches, et maîtrisent le développement

d’autres microorganismes.

De plus, elles ont été reconnues comme GRAS (Generally Recognized as Safe). En

effet, des études ont démontré le bienfait des bactéries lactiques sur la santé humaine et

animale, en tant que probiotiques (Food Agriculture Organization, 2006). D’autres travaux

ont démontré, que certaines bactéries lactiques sont capables de produire des vitamines du

groupe B : comme la biosynthèse, de l’acide folique par les ferments de yaourt, de la vitamine

B2 (riboflavine) par certaines bactéries lactiques, et la cobalamine (B12) qui est produite par

la souche de Lactobacillus reuteri CRL1098. Ainsi, les bactéries lactiques sont les meilleures

candidates pour enrichir les aliments en vitamines (Leblanc et al., 2010).

Le pouvoir antimicrobien de ces microorganismes, est l’une des propriétés

technologiques les plus recherchées en industrie alimentaire. Ces activités antimicrobiennes

sont essentielles à l’innocuité et à la conservation des aliments fermentés, (Klaenhammer et


Page 9

al., 1994). L’acide lactique et les bactériocines sont les produits antimicrobiens les plus

utilisés, en industrie agroalimentaire pour la conservation des aliments. En effet, certains

industriels, ajoutent une source de carbone (le glucose) durant la fermentation, aux ferments

lactiques pour stimuler la production de l’acide lactique, qui provoque une diminution du pH

de l’environnement et inhibe la prolifération des microorganismes d’altération dans les

saucisses fermentés (Bover-Cid et al., 2001).

La nisine est la bactériocine la mieux caractérisée et la plus utilisée comme

bioconservateur (Galvez et al., 2007). Les bactériocines permettent d’éviter l’ajout de certains

composés chimiques pour la conservation des aliments.

Pour tous ces avantages, la plupart des bactéries lactiques ont fait l’objet de plusieurs

applications, le tableau 1 récapitule quelques applications des bactéries lactiques.

Tableau 1 : Quelques applications des bactéries lactiques. (Zhu et al., 2009)

Souches lactiques applications Références

Lactobacillus acidophilus NCFM Probiotique Altermann et al. (2005)

Lactobacillus brevis ATCC 367 Ferment des ensilages, levain,

fermentation de la bière Dubchak et al. (2006a)

Lactobacillus casei ATCC 334 Probiotique, fermentation du lait, la

flaveur des fromages Dubchak et al. (2006b)

Lactobacillus casei BL23 Probiotique, fermentation du lait,

flaveur du fromage Kandler and Weiss (1986)

Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus ATCC BAA-365 fermentation du yaourt Tamime and Robinson (1999)

Lactobacillus helveticus DPC 4571 Industrie fromagère Callanan et al. (2008)

Lactobacillus johnsonii NCC 533 Probiotique Pridmore et al. (2004)

Lactobacillus plantarum WCFS1 Conservation des aliments, tels que le lait,

la viande et les végétaux, probiotique Kleerebezem et al. (2003)

Lactobacillus reuteri F275 Probiotique Morita et al. (2008)

Lactobacillus sakei subsp. sakei 23

K

Conservation des aliments, fermentation

de la viande Chaillou et al. (2005)

Lactococcus lactis subsp. cremoris

MG1363

La fermentation des aliments laitiers, une

souche modèle Wegmann et al. (2007)

Leuconostoc citreum KM20 fermentation du Kimchi Kim et al. (2008)

Leuconostoc mesenteroïdes subsp.

mesenteroïdes ATCC 8293

Fermentation d’aliments : choucroute, des

légumes, production de dextrane Dubchak et al. (2006c)

Streptococcus thermophilus LMG

18311 Fermentation du fromage et du yaourt Bolotin et al. (2004)

Les bactéries lactiques sont capables de synthétiser une grande variété d’agents

inhibiteurs dont les cibles peuvent être différentes. Cependant, l’acide lactique et les

bactériocines restent les principaux.


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1.3 Les agents inhibiteurs produits par les bactéries lactiques

La production des antimicrobiens par les bactéries lactiques, est connue depuis

longtemps. Les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène et d’autres molécules

antimicrobiennes sont les principaux agents inhibiteurs produits par ces microorganismes. Ces

agents inhibiteurs diffèrent par leur cible mais aussi par leur nature et leur structure.

1.3.1 Les acides organiques

Ils sont produits par catabolisme des sources de carbone. L’acide lactique est le seul

acide issu de la glycolyse par la voie homofermentaire, alors que la voie hétérofermentaire

génère en plus de l’acide lactique, de l’acide acétique. Ces acides traversent la membrane

cytoplasmique et diminue le pH du milieu intracellulaire, ce qui provoque l’inhibition des

fonctions cellulaires (Kashet, 1987). Plusieurs microorganismes d’altération des aliments sont

connus pour leur sensibilité aux changements de pH intracellulaire. De plus, les bactéries

lactiques semblent être compétitives en conditions acides, causant l’inhibition d’autres

bactéries (Klaenhammer et al., 1994). Cependant si l’acidité du milieu dépasse les seuils

acceptés par la souche, des cas d’auto-inhibitions peuvent être observées, en effet au cours de

la fermentation d’une bactérie lactique, l’administration en continue de glucose, provoque la

production en continue des acides organiques, par conséquent, une diminution progressive du

pH du milieu et si celui-ci n’est pas contrôlé, la bactérie peut s’auto-inhiber (Grattepanche,

2005).

1.3.2 Le peroxyde d’hydrogène

Les bactéries lactiques ne possèdent pas généralement de catalase. L’accumulation de

peroxyde d’hydrogène par l’action des oxydases (Daeschel, 1989), est une cause de l’activité

antimicrobienne, en particulier des lactobacilles. Le H2O2 peut être auto-inhibiteur dans le cas,

ou l’activité peroxydasique n’est pas importante (Price et Lee, 1970).

1.3.3 La production d’antibiotique

La reutérine est parmi les ATB des bactéries lactiques, la plus caractérisée et purifiée,

produit par certaines souche de Lactobacillus reuteri, lorsque le glycerol est utilisé comme

source de carbone (Stackengrand et Tenber, (1988); Talarico et al., 1990). Cet ATB bloque la

synthèse de l’ADN (Talarico et Dobrogosz, 1989), ce qui explique son large spectre d’action.


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1.3.4 La production de bactériocine

Klaenhammer (1988), suggère que 99% des bactéries peuvent produire au moins une

bactériocine. Pour des raisons de sécurité alimentaire, plusieurs bactéries n’ont pas fait l’objet

d’études, pour la production de bactériocines. Les bactériocines des bactéries lactiques sont

les plus abordées dans la recherche. Ces substances protéiques, sont des toxines à spectre

d’action plus ou moins large (Riley et Wertz, 2002). Ces molécules constituent la deuxième

cause de l’effet inhibiteur des bactéries lactiques, après celle causée par les acides organiques.

Le chapitre suivant est consacrée aux bactériocines des bactéries lactiques, à leur

classification, leur biosynthèse et sa régulation, l’immunité des bactéries productrices, leur

mode d’action, d’une part. Et d’autre part, il fera l’objet de l’optimisation de leur production

et leur application dans différents domaines.

1.4 Les bactériocines

Le terme «bactériocine

» est employé pour la première fois par Jacob et al, (1953) pour

les peptides à spécificité importante, produits par certaines souches et actifs contre les souches

de la même espèce. La première bactériocine, nommé la colicine était produite par

Escherichia coli S (Gratia, 1925). Depuis, l’étude des bactériocines s’est élargie. Rogers et

Whitter (1928), furent les premiers à étudier les inhibiteurs des bactéries lactiques, et plus

spécialement des lactocoques.

1.4.1 Définition des bactériocines

D’après Klaenhammer (1988), les bactériocines sont des substances de nature

totalement ou partiellement protéique, à activité bactéricide envers les espèces proches de la

souche productrice. Elles sont synthétisées par voie ribosomale, sous forme de peptides

inactifs, et deviennent actives en milieu extracellulaire ; dans la plupart des cas, elles sont

codées par des gènes plasmidiques. Ces substances antagonistes se différencient entre elles

par : leurs poids moléculaires, leurs propriétés biochimiques, leur spectre et leur mode

d’action (Klaenhammer, 1988). Elles sont actives contre les bactéries à Gram positif,

néanmoins, certains auteurs ont observé que certaines bactériocines exercent aussi un effet

inhibiteur contre les bactéries Gram négatives (Todorov et al., 2005). Les bactériocines

produites par les bactéries lactiques sont généralement cationiques, hydrophobiques ou

amphiphiliques, composées de 20 à 60 acides aminés (Nes et Holo, 2000).


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1.4.2 Classification des bactériocines

La classification des bactériocines repose sur les critères qui les différencient.

Klaenhammer (1993), propose une classification des bactériocines en 4 classes distinctes :

Classe I : appelée aussi «classe des lantibiotiques

», elle renferme les bactériocines

post-traductionellement modifiées, caractérisées par une taille moléculaire < à 5 KDa, stables

à la chaleur, elles contiennent des acides aminés inhabituels tels que la lanthionine.

Cette classe est subdivisée en deux types, selon leur structure et leur mode d’action :

Le type A, regroupe les lantibiotiques linéaires, avec une charge nettement positive, leur

mode d’action se manifeste par la formation de pores sur la membrane de l’hôte.

Le type B, constitue les lantibiotiques globulaires, possédant une charge négative, ou ne

contenant pas de charge, elles attaquent des enzymes spécifiques et les inhibent (Mc Auliffe et

al., 2001).

La nisine, est une bactériocine du type A des lantibiotiques, un peptide de 34 acides aminés,

de poids moléculaire de 3,5 KDa et thermorésistante. Découverte par hasard en 1928, elle a

été appelée «une substance inhibitrice du Groupe N (streptococci)

» en 1947. Sa structure a été

élucidée en 1971. Elle est active à des pH bas (Luc et Hansen, 1990). En 1983, la nisine est

ajoutée dans la liste des additifs alimentaires (E234), elle est reconnue comme GRAS par

FDA (Food and Drug Administration). Elle est produite par des souches de Lactococcus lactis

subsp lactis. Depuis, d’autres variantes (A, Z, Q, U et U2) ont été isolées (Lubelski et al.,

2008 ; de Aruaz et al., 2009).

Classe II : renferme les bactériocines, dont le poids moléculaire n’excède pas les 10

KDa, thermorésistantes, et qui ne possèdent pas des acides amines inhabituels, elles ne

subissent pas de modifications post-traductionnelles. Cette classe est subdivisée en 3 sous

classes :

Sous classe IIa : ces bactériocines font partie de la famille des pédiocines, qui

présentent une partie N terminale conservée, à activité anti-Listeria. Grâce à cette qualité,

plusieurs chercheurs se sont intéressés à l’isolement des bactériocines qui appartiennent à

cette sous classe. La mésentéricine Y105 est une bactériocine de la classe IIa et elle

contient 37 acides aminés (Hechard et al, 1992).


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Sous classe IIb : regroupe les bactériocines contenant deux peptides, l’activité de ces

peptides permet de distinguer deux types : le type E (Enhancing), ou un des deux peptides

sert à stimuler l’activité de l’autre peptide et le type S (Synergy) ou les activités des deux

peptides sont complémentaires. La lactacine F produite par Lactobacillus johnsonii est

une bactériocine de la sous classe IIb (Allison et al, 1994).

Sous classe IIc : elle contient d’autres bactériocines qui ne peuvent pas être classées

dans les sous classes IIa et IIb. L’acidocine B est une bactériocine de cette sous classe,

produite par Lactobacillus acidophilus (Leer et al, 1995).

Classe III : cette classe rassemble les bactériocines de poids moléculaire supérieur à

30 KDa, sensibles à la chaleur, ce qui limite leur utilisation possible dans l’industrie

agroalimentaire. La helveticine J, une bactériocine de cette classe, est produite par

Lactobacillus helveticus A (Joerger et Klaenhammer, 1990).

Classe IV : Klaenhammer (1993), a regroupé dans cette classe les bactériocines qui

possèdent une ou plusieurs molécules de nature non protéique, mais lipidiques et/ou

glucidiques, ces dernières sont nécessaires à leur activité. L’activité de la plantaricine S

est affectée par les enzymes lipolytiques et glycolytiques (Jimenez-Diaz et al., 1993).

Plusieurs classifications ont été proposées par d’autres chercheurs. Après celle

proposée par Klaenhammer (1993), la classification de Nes et al. (1996) qui a éliminé la

classe IV, car aucune bactériocine de ce type n’a été purifiée, ni chimiquement caractérisée.

La classification la plus récente, est proposée par Heng et Tagg, (2006), elle regroupe

quatre classes : classe I pour les lantibiotiques, Classe II : peptides non modifiés, Classe III :

protéines et la classe IV pour les peptides cycliques. La classification des bactériocines

permet d’établir une relation entre la fonction et la structure de ces molécules, pour une

application possible. Le mode d’action de la plupart des bactériocines se manifeste par

l’adsorption à la membrane de l’hôte et la formation des pores, ce qui provoque la mort

cellulaire (Bauer and Dicks, 2005; Cotter et al,. 2005; Drider et al., 2006),

Le tableau suivant, cite quelques bactériocines produites par différentes souches avec

leur classification basée sur celle proposée par Klaenhammer (1993).


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Tableau 2 : La classification de quelques bactériocines des bactéries lactiques. Chen et

Hoover, (2003).

bactériocine souche productrice Références

Classe I- lantibiotique

type A

nisine Lactococcus lactis Hurst, (1981)

lactocine S Lactobacillus sake Mortvedt et al, (1991)

Classe I- lantibiotiques

type B

cinnamycine Streptomyces cinnamoneus Sahl et Bierbaum, (1998)

ancovenine Streptomyces sp.

Classe IIa

pediocine PA-1/AcH

Pediococcus acidilactici

Henderson et al. (1992);

Motlagh et al. (1992)

lactococcine MMFII Lactococcus lactis Ferchichi et al. (2001)

Classe IIb

lactococcine G Lactococcus lactis Nissen-Meyer et al.(1992)

plantaricine EF Lactobacillus plantarum Anderssen et al. (1998)

Classe IIc

acidocine B Lactobacillus acidophilus Leer et al. (1995)

Classe III

helveticine J Lactobacillus heleveticus Joerger et Klaenhammer, (1986)

helveticin V-1829 Lactobacillus helveticus Vaughan et al. (1992)

Dans la partie suivante, nous allons aborder la biosynthèse et la régulation de la

production des bactériocines.

1.4.3 Biosynthèse et régulation de la production des bactériocines

Le mécanisme de biosynthèse des bactériocines et sa régulation fait appel à un

système complexe, en effet, la biosynthèse dépend d’un ensemble de gènes de structure, qui

codent pour le peptide et son transport ainsi que l’immunité de la bactérie productrice. Cet

Opéron transcrit un prépeptide (non actif), qui sera actif en milieu extracellulaire ; la cellule

doit s’immuniser contre sa propre bactériocine.

La production des bactériocines de classe I et II est détaillée ci-dessous :


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La biosynthèse des lantibiotiques :

La nisine est le lantibiotique la plus caractérisé et étudié. Pour cela, nous allons

détailler sa biosynthèse. En général, la biosynthèse de la nisine, comme celle des autres

bactériocines de cette classe, se déroule en trois étapes (figure 2) : la formation des acides

aminés inhabituels (les modifications post traductionnelles), l’organisation en structure

cyclique de la prénisine et le clivage et le transport vers l’extérieur. Ces derniers sont assurés

par le système de transport (le transporteur ABC dépendant).

La nisine étant la bactériocine la plus utilisée en industrie agroalimentaire, nous avons choisi

de présenter sa biosynthèse en détaille.

Le gène de structure est appelé Nis, il code pour un prépeptide de 23 à 30 acides

aminés, qui sera clivé à l’extérieur de la cellule. Mais avant, il subira des modifications post-

traductionnelles : les serines et les thréonines seront déshydratés par une déshydratase,

formant ainsi des acides aminés inhabituels (déhydroalanines et déhydrobutyrines). Ces

derniers établiront une structure cyclique, par des ponts thioéther, avec les cystéines proches,

à l’aide d’une cyclase codée par les gènes NisB et NisC ou le gène NisM.

Le transport du prépeptide est assuré par le gène de structure, qui sera clivé par une

protéase NisP ou par le domaine protéasique (figure 3) du système transporteur ABC, le NisT

(Mc Auliffe et al., 2001).

La régulation de la production se fait par le système « Quorum sensing »

(Kleerebezem, 2004), qui possède deux composantes, une histidine kinase NisK, et un

régulateur de réponse NisR. La première composante phosphoryle la deuxième, sous l’effet

d’un stimulus extérieur. Le régulateur de réponse phosphorylé, stimule l’expression de

l’Opéron. Le stimulus extérieur est la nisine elle-même, on parle d’une autorégulation

(Kleerebezem, 2004).

L’immunité de la souche productrice est assurée par quatre gènes NisI, NisF, NisE et

NisG. Stein et al. (2003), ont suggéré que le NisI est une lipoprotéine, qui en interagissant

avec la nisine, empêche cette dernière à former des pores, alors que le NisF, NisE et NisG

(transporteur ABC) exportent les nisines, qui ne sont pas liées avec la lipoprotéine.


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Figure 2 : Régulation de la production, modifications post-traductionnelles et auto-immunité

de la nisine, (Patton et al., 2005) NisA : prépeptide NisB : déshydtratase NisC : cyclase NisT : l’ABC transporteur

NisP : la protéase NisK : l’histidine kinase NisR : le régulateur de réponse

NisI : la lipoprotéine d’immunité NisG, NisE et NisF : l’ABC transporteur.

Figure 3 : ABC-transporteur avec le domaine protéasique, (Patton et al., 2005) ABC : cassette ATP dépendante

La biosynthèse des bactériocines de classe II :

Les bactériocines de cette classe, sont synthétisées sous forme d’un prépeptide, ce

prépeptide ne contient pas des acides aminés inhabituels, il n’est pas biologiquement actif. Il

sera transporté à l’extérieur après le clivage de son peptide leader et la formation des ponts

disulfure (Ennahar et al., 2000 ; Drider et al., 2006). Les bactériocines de la sous classe IIa

ont intéressé de nombreux chercheurs, du fait de leurs propriétés physico-chimiques et leur

activité anti-Listeria. Pour cela, nous allons détailler la biosynthèse de la sous classe IIa.

L’entérocine P produite par Enterococcus faecium P13 est une bactériocine appartenant à la

classe IIa (Cintas et al., 1997).


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Certaines bactériocines de cette sous classe sont sécrétées par une voie appelée « la voie

sec-dependent » (Keyser et al., 2003). La sécrétion de la bactériocine se fait par une

translocation du peptide à travers un pore formé par plusieurs protéines, le peptide leader

est une séquence spécifique des protéines synthétisées par cette voie, il sera clivé lors de

l’exportation à l’extérieur.

Une autre voie de biosynthèse, généralement utilisée par les bactériocines de la

classe IIa fait appelle au système GSP : voie générale de sécrétion (figure 4), contenant

deux protéines distinctes : ABC transporteur et une protéine accessoire, La protéine

accessoire est ancrée vers la membrane extérieure de la cellule, alors que le ABC

transporteur est ancré dans la membrane vers l’intérieur de la cellule.

La régulation de la biosynthèse des bactériocines de la classe IIa, fait appelle à un

système « Quorum sensing » à 3 composantes : une protéine d’induction, une histidine

kinase et un régulateur de réponse, ces protéines sont co-transcrites.

La protéine d’induction est le prépeptide contenant un peptide leader de type double

glycine (GG), il sera clivé lors de son transport par le système ABC, le peptide leader

interagit avec l’histidine kinase et active le régulateur de réponse afin de stimuler les

gènes de structure, on parle d’une auto-induction (Drider et al., 2006).

L’immunité de la souche productrice de la bactériocine de classe IIa, se manifeste

par une immunité dite « immunité croisée ». Elle est plus spécifique par rapport à

l’immunité des souches de bactériocines de classe I. En effet, il n’existe pas de similarité

entre les protéines d’immunité de la classe IIa et les bactéries productrices de ces

bactériocines sont partiellement protégées contre les autres bactériocines de classe IIa.

Ceci indique que les protéines d’immunité n’appartiennent pas forcément au même gène

de structure (Quadri et al., 1994). Ces protéines sont composées de 88 à 114 acides

aminés, et sont ancrées dans la membrane cytoplasmique. Les protéines d’immunité

interagissent avec une protéine membranaire, en empêchant l’insertion de la bactériocine

(indirectement), afin de former les pores.


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Figure 4: Schéma de la biosynthèse de la production des bactériocines de la sous classe IIa,

montrant: la régulation, la synthèse, le transport et l’immunité (Ennahar et al., 2000).

La biosynthèse des bactériocines varie d’une classe à une autre, sa complexité dépend

de la composition chimique de cette molécule. La biosynthèse des bactériocines de classe III

est plus complexe, ces bactériocines ont une structure tridimensionnelle d’une protéine à

poids moléculaire, qui peut atteindre les 30 KDa. La biosynthèse des bactériocines de la

classe IV nécessite la liaison des composés lipidique ou des composés glucidique au

prépeptide pour sa fonction biologique.

Dans cette partie, nous avons vu la machinerie de biosynthèse des bactériocines les

plus étudiées, qui incluent la production du prépeptide, son transport au milieu extracellulaire,

son activation par clivage du peptide leader et l’immunité de la souche productrice. Nous

avons choisi deux classes des bactériocines, qui ont été largement étudiées. Il s’agit de la

classe I, dont la nisine fait partie et de la classe IIa, pour la propriété anti-Listeria.

1.4.4 Le mécanisme d’action des bactériocines

Il varie d’une classe à une autre, en général, les bactériocines interagissent avec la

membrane cytoplasmique de la cellule hôte. Le mode d’action des bactériocines, peut être

bactéricide ou bactériostatique, déterminés respectivement par la mort cellulaire ou


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l’extension de la phase logarithmique, de la cellule sensible. Nous présenterons dans ce

chapitre le mécanisme d’action des bactériocines de classe I et de classe II :

Les lantibiotiques :

Ils interagissent soit par des interactions électrostatiques, soit par liaison au précurseur

du peptidoglycane, le lipide II (un récepteur spécifique), cette liaison va permettre la

formation des pores. Le maintien de ces derniers, au niveau membranaire, empêche la

régénération de la paroi cellulaire (Dortu et Thonart, 2009) (figure 5). La formation des pores

cause l’efflux des petits composés intracellulaires, comme les ions et les acides aminés. Cet

efflux provoque le déséquilibre de la force proton motrice, de part et d’autre de la membrane,

l’arrêt des fonctions cellulaire et la mort de la cellule (Patton et al., 2005).

Figure 5 : Mécanisme d’action par la formation de pores des lantibiotiques.

(Breukink et de Kruijff, 2006) (1) : le rapprochement du lantibiotique de la membrane plasmique de l’hôte.

(2) : l’adsorption du lantibiotique au lipide II.

(3) : la formation du pore.

(4) : la structure complexe du pore formée par 8 molécules de nisine et 4 lipides II, générant un pore (2nm).

Les bactériocines de classe II

L’action des bactériocines de la classe II se fait généralement, par l’adsorption à la

membrane, son insertion et la formation des pores.


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La sous classe IIa est, largement, étudiée, pour son efficacité contre Listeria. Son

action commence par des liaisons électrostatiques entre la bactériocine et la membrane.

La nature cationique des bactériocines de cette sous classe et la nature hydrophile de la

partie N terminale, se conjuguent avec la partie anionique (tête du phospholipide). Dans

un 2ème

temps, des interactions hydrophobes se produisent entre la partie amphiphile des

chaines acyl lipidiques (la queue du phospholipide) et la partie C terminale de la

bactériocine (hydrophobe).

Il a été démontré que la formation des pores, nécessite l’intervention de plusieurs

molécules de bactériocines qui s’agrègent (figure 6). Contrairement aux lantibiotiques, la

perte de l’ATP n’est pas due à son efflux (la taille des pores est relativement faible), mais

est due à sa consommation excessive pour régénérer la force proton motrice et/ou à

l’incapacité de la cellule à produire l’ATP suite à l’efflux des phosphates.

Figure 6 : Schéma du mode d’action des bactériocines de la classe IIa (Ennahar et al., 2000).

1.5 Caractéristiques et applications industriels des bactériocines

Les bactériocines offrent de multiples avantages pour une utilisation saine, dans

différents domaines. Cependant le domaine d’utilisation le plus exploité, est la

bioconservation.

(1) Reconnaissance d’un récepteur

Positionnement de la bactériocine

(2) Interaction électrostatique

Spécifique

(La sensibilisation

des cellules)

Non Spécifique

(Des cellules

susceptibles)

(3) Interaction hydrophobique

Efflux et perte des composantes

intracellulaire Réorganisation et

insertion

Réorganisation et insertion

Agrégation

Augmentation de la liaison à ce site (4) La formation d’un pore


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Caractéristiques des bactériocines des bactéries lactiques

Grâce aux caractéristiques des bactériocines des bactéries lactiques, plusieurs

avantages ont été décrits. Gàlvez et al. (2007) ont noté les propriétés suivantes, elles :

Sont des substances, qui ne présentent, aucun danger.

Ne sont pas toxiques pour les cellules eucaryotes.

Sont inactivées par des protéases digestives, et n’influent pas significativement sur

la flore intestinale.

Sont tolérantes à des pH acides ou basiques et à des températures élevées.

Possèdent un spectre d’action plus ou moins large, contre des bactéries

pathogènes et/ou d’altérations.

Montrent un mode d’action bactéricide en agissant sur la membrane

cytoplasmique.

Sont codées par des gènes souvent plasmidiques, permettant leurs manipulations

génétiques.

Applications industriels des bactériocines

Les bactériocines sont utilisées comme bioconservateurs sous une forme purifiée ou

partiellement purifiée.

Beaucoup d’études ont montré que la bactériocine semi-purifiée est plus efficace in

vitro que la bactériocine purifiée, néanmoins, les préparations partiellement purifiées peuvent

contenir d’autres métabolites (acide lactique) et d’autres composés comme les protéines

(Gàlvez et al., 2007).

Le domaine agroalimentaire : Les produits altérés par les microorganismes

pathogènes et d’altération, constituent une perte économique considérable. L’amélioration de

la conservation et de la qualité du produit fini, est un défi majeur des industriels

agroalimentaires. L’application des bactériocines comme bioconservateurs permet d’offrir les

bénéfices suivants (Thomas et al., 2000) :


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Une extension de la durée de vie des aliments.

Une protection durant les traitements thermiques.

Une diminution des risques de contamination par les bactéries pathogènes durant

la chaine de production.

Une diminution de la perte économique causée par les microorganismes

d’altération.

La réduction de l’ajout des conservateurs chimiques.

La mise au point de nouveaux aliments avec moins d’acide et de sels, et contenant

plus d’eau.

Une meilleure préservation des aliments et qu’ils soient riches en vitamines et en

qualités organoleptiques.

Satisfaire l’industriel et le consommateur.

Pour cela, l’aliment peut être supplémenté par une préparation de bactériocines (ex

situ), ou par l’ajout directement de la souche productrice qui sera mise dans les conditions qui

lui permettront de produire la bactériocine (In situ) (Schillinger et al., 1996 ; Stiles, 1996).

Dans l’application ex situ, la bactérie productrice est cultivée (dans un fermenteur industriel)

dans un milieu contenant du lait ou du lactosérum. La bactériocine peut être additionnée sous

forme purifiée ou semi-purifiée. Cependant plusieurs facteurs peuvent influencer l’efficacité

de la bactériocine dans les aliments (tableau 3).

Tableau 3 : Facteurs influençant l’activité de la bactériocine dans l’aliment (Gàlvez et al.,

2007).

Facteurs influence sur l’activité de la bactériocine

L’aliment

Conditions de la fabrication de l’aliment.

Température de stockage.

pH de l’aliment, et sa variation.

Inactivation par les enzymes de l’aliment.

Interaction avec les ingrédients de l’aliment.

Instabilité durant la durée de vie de l’aliment.

La flore de l’aliment

Diversité des microorganismes.

La charge microbienne.

Sensibilité à la bactériocine.

Interaction avec la flore de l’aliment.

Les bactéries

indésirables

La charge microbienne.

Sensibilité de la bactériocine.

Etat physiologique.

Protection par les barrières physico-chimiques (biofilms).

Développement de la résistance.


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La technologie de préparation de la bactériocine sous forme immobilisée, dans des

microsomes, permet un bon rendement. Ces microsomes sont des réservoirs, qui assurent la

diffusion, au fur et à mesure du concentré de la bactériocine. Ils permettent de protéger les

bactériocines contre les protéases et les inactivations dues aux interactions avec l’aliment.

L’immobilisation de la bactériocine 32Y produite par Lactobacillus curvatus dans un film de

polyéthylène, la rend plus active contre Listeria monocytogenes (Mauriello et al., 2004).

L’application directement de la souche productrice de bactériocine dans l’aliment,

offre plus d’avantages par rapport, à son emploi ex situ du point de vue de son efficacité et du

coût. Pour cela, beaucoup d’auteurs ont étudié la sélection et le développement des bactéries

bactériocinogènes pour une application alimentaire (Ross et al., 2000 ; Leroy et al., 2006). La

souche bactériocinogène peut être utilisée dans un ferment, en coculture ou comme culture

protectrice pour les aliments non fermentés.

La bactérie bactériocinogène utilisée en tant que ferment, doit être capable de réaliser

la fermentation des aliments et de produire la bactériocine.

L’utilisation de la bactérie bactériocinogène en coculture ne doit pas influencer la

physiologie du ferment.

L’ajout d’une culture protectrice, de bactéries bactériocinogènes permet d’inhiber les

microorganismes pathogènes et d’altération, durant la conservation des aliments non

fermentés. Cette culture peut se développer et produire la bactériocine, durant le stockage de

l’aliment à basse température et/ou durant les conditions de traitements thermiques (Holzapfel

et al., 1995).

En plus, des facteurs qui influencent l’activité de la bactériocine, d’autres affectent sa

production (Gàlvez et al., 2007), (figure 7) :

Une perte spontanée de l’effet inhibiteur de la bactérie.

Une infection par des bactériophages.

Antagonismes des autres bactéries contre la souche bactériocinogène.

La bactérie productrice de bactériocine n’accomplit pas les propriétés désirées du

ferment.

Difficultés des manipulations génétiques et du transfert du caractère

bactériocinogène dans les starters souhaités.

La faible capacité de la souche à produire la bactériocine dans la matrice de

l’aliment.


Page 24

Figure 7 : Les facteurs influençant la production et l’activité de la bactériocine, (Gàlvez,

2007).

L’application des bactéries productrices de bactériocines comme ferments, se fait sur

la base de leur potentiel technologique de réaliser une fermentation. Lactobacillus plantarum

LPCO10 a été inoculée pour l’optimisation de la fermentation des olives vertes (Leal-Sanchez

et al., 2003), cette souche a prédominé la flore des olives et a montré son activité

bactériocinogène.

D’autres qualités peuvent être intéressantes, telles que le potentiel probiotique, la

qualité nutritionnelle et la réduction des additifs chimiques (Settanni et Corsetti, 2008).

Plusieurs applications ont été réalisées dans ce domaine (tableau 4).

Dans le domaine médical : L’utilisation de bactériocines purifiées sous forme

d’antibiotiques peptidiques dans le domaine thérapeutique, est une application prometteuse.

En effet, les antibiotiques montrent de plus en plus leurs limites, vis-à-vis des phénomènes de

résistances, qui ne cessent d’augmenter. Pour cela, l’utilisation des peptides antimicrobiens à

la place de ces ATB, est une alternative prometteuse (Papagianni, 2003).

La nisine a fait l’objet d’une étude dans de nombreuses applications, notamment dans

le domaine pharmaceutique, comme nutraceutiques (un aliment qui présente des propriétés

curatives ou préventives d’une maladie) et cosmétique (Luquet et Corrieu, 2005 ; Colas et al.,

2007). Aranha et al. (2004), ont suggéré le développement d’une alternative contre les

infections vaginales en utilisant la nisine. En médecine, la nisine peut être utilisée pour les

dermatites (Valenta et al., 1996), comme agent thérapeutique dans le traitement des ulcères et

Charge microbienne.

Etat physiologique.

Interactions microbiennes.

Diversité microbienne.

Facteurs physico-

chimiques (pH,

T°C, aw, temps…).

Composition de

l’aliment (nutriments,

ingrédients, additifs).

Structure de l’aliment

et la capacité tampon.

La souche bactériocinogène

La capacité à s’implanter et à proliférer

Adaptation à l’environnement de l’aliment.

Sensibilité aux facteurs environnementaux

(conservateurs, phages, bactériocines).

Production de bactériocine (induction, taux

de production, stabilité du caractère).

Stabilité de la bactériocine

Procédure de production.

La bactériocine

Activité dans l’aliment.

Interactions avec d’autres barrières.

Stabilité du spectre antimicrobien.


Page 25

les infections des colons pour les patients immuno-déficients (Dubois, 1995 ; Kim et al.,

2003).

Tableau 4 : Les bactéries lactiques productrices de bactériocines et les aliments fermentés

associés (Settanni et Corsetti, 2008).

Souche productrice Bactériocine Source Références

Enterococcus feacalis T33 Bactériocine T33 et 4 Sorgho (blé

égyptien)

Hartnett et al.

(2002)

Enterococcus faecium

BFE900 Enterocine 900 Olives noirs Frank et al. (1996)

Lactobacillus amylovorus

DCE 471 Amylovorine L471

Liqueur de maïs

frais

De Vuyst et al.

(1996)

Lactobacillus plantarum

LPCO10 Plantaricine S et T Olives verts

Jiminez-Diaz et al.

(1993)


KF66 Bactériocine KF66

Jus de

pamplemousse Kelly et al. (1996)

Lactobacillus plantarum 423 Plantaricine 423 Bière de Sorgho Van Reenen et al.

(1998)


ST194BZ

Bactériocines ST194BZ(a)

et ST194BZ(b) Boza

Todorov et dicks,

(2005)

Lactococcus lactis subsp

cremoris R Lactococcine R Radis

Yildirim et

Johnson, (1998)

Lactococcus lactis BH5 Lactacine BH5 kimchi Hur et al. (2000)


lactis M30 Nisine Z

Germes de

haricots Cai et al. (1997)

Lactococcus lactis KF30 et

KF31 Lactacine 3147 orge

Settanni et al.

(2005)


lactis LJH80 et NCK400 Nisine Choucroute Harris et al. (1992)

Un nouveau domaine médical est en pleine expansion, il s’agit de l’utilisation de la

bactériocine comme une conception rationnelle de médicaments. Arnusch et al. (2008) ont

conçu un hybride nisine-vancomycine, ce dernier est très actif contre les entérocoques

résistants à la vancomycine.

Les différents domaines d’application des bactériocines des bactéries lactiques sont

récapitulés dans la figure 8.

Une application probiotique des bactériocines est envisageable (tableau 5), notamment

pour le système intestinal, pour la cavité buccale, respiratoire et génitale. Comme la

bactériocine de la souche Lactobacillus pentosus et L. jensenii 5L08, qui inhibent la

croissance de Candida albicans, agent des infections vaginales (Aroutcheva et al., 2001;

Kaewsrichan et al. 2006).


Page 26

Tableau 5 : l’utilisation probiotique des bactériocines des classe I et II (Gillor et al., 2008).

Figure 8 : Différents domaines des applications des bactériocines des bactéries lactiques

(Leblanc, 2010).

Dans d’autres domaines : toujours pour lutter contre les microorganismes d’altération.

Par exemple dans la fabrication du bioéthanol, qui se fait dans des conditions non stérile,

grâce à des microorganismes qui convertissent la source de carbone en éthanol. Cependant, la

présence de contaminants peut dévier le métabolisme désiré. L’utilisation des antibiotiques

n’a pas donné de bons résultats, face aux problèmes des biofilms et de résistance des bactéries

Bactériocines Souches

productrices Souches sensibles Utilisation probiotique Références

classe I

ABP-118

Lactobacillus

salivarius

UCC118

Listeria

monocytogenes

Prévention des infections

gastriques.

Corr et al.

(2007)

Bovamine™

Lactobacillus

acidophilus

Propionibacterium

freudenreichii

E. coli O157:H7 Prévention des infections

du colon.

Brashears et

al.(2003a);

Brashears et al.

(2003b)

UN L. acidophilus LB

H. pylori, H. felis

préventions des infections

gastriques humaines.

Coconnier et al.

(1998);

Michetti et al.

(1999)

class II

Pediocine

Pediococcus

acidilactici

Enterococcus,

L. monocytogenes,

Klebsiella,

Pseudomonas,

Shigella

préventions des infections

gastriques humaines.

Speelmans et

al. (2006)

Enterocine

Enterococcus

faecium EK13

Salmonella

dusseldorf SA13,

E. coli,

Clostridia sp.

Réduire les infections des

cailles japonèses (poultry)

Prévention des infections

gastriques (lapins)

Laukova et al.

(2003)

Laukova et al.

(2006)

Conception rationnelle de

médicaments

Application des

bactériocines des bactéries

lactiques

Médecine

humaine

Ingrédients

alimentaires

Médecine

vétérinaire

Transformation

des aliments


Page 27

d’altération (les bactéries acétiques). Plusieurs études ont adoptées l’utilisation des

bactériocines pour lutter contre ces microorganismes (Muthaiyan et al., 2010).

Dans cette partie, nous avons évoqué les différentes applications des bactériocines des

bactéries lactiques. Elles sont utilisées pour lutter contre le développement des

microorganismes d’altération et/ou pathogènes. Cependant, ces applications peuvent

nécessiter des étapes d’optimisation de production. C'est-à-dire, mettre la souche

bactériocinogène dans les conditions optimales, qui lui permettent une production plus

intéressante de bactériocine.

1.6 Optimisation de la production de bactériocine

La production des bactériocines par les bactéries lactiques a été étudiée par de

nombreux chercheurs. Il est connu, que la production de bactériocines par les bactéries

lactiques, peut être influencée par le pH, la composition du milieu de culture, la température

d’incubation, la taille de l’inoculum, la densité cellulaire et d’autres facteurs

environnementaux (Eijsink et al., 2002 ; Strompfovà et Laukovà, 2007). Ces facteurs peuvent

influencer fortement la synthèse de la bactériocine. Pour plusieurs bactéries

bactériocinogènes, différentes optimisations ont été décrites. Les optimisations mentionnées

dans la littérature, peuvent être réalisées selon trois axes :

Les conditions de stress peuvent stimuler la production de bactériocine.

L’optimisation de chaque ingrédient du milieu de croissance des bactéries lactiques.

L’ajout d’un milieu riche dans le milieu de croissance de la bactérie

bactériocinogène (notamment, l’ajout du lait).

Ces trois axes, ont été largement discutés par de nombreux auteurs. Les bactéries

productrices de bactériocines ne répondent pas de la même manière, vis-à-vis d’une même

méthode d’optimisation.

Pour le premier cas, de nombreuses bactéries lactiques ont été mises dans des

conditions de stress afin de stimuler la production de la bactériocine. Des travaux ont

démontré, que les stress influencent la croissance bactérienne, mais, stimulent souvent la

production de bactériocine. La production de la bactériocine par Lactobacillus pentosus B96

est stimulée à 22°C d’incubation (Delgardo et al., 2005). Une forte aération (oxygénation ≥

1ml/min), ne permet pas une bonne croissance, mais stimule la production de l’amylovorine L

par Lactobacillus amylovorus DCE (Neysens et De Vuyst, 2005). Une production maximale

de la bactériocine synthétisée par Lactobacillus animalis C060203, est stimulée en présence


Page 28

d’EDTA (1%) et de 0,5% de SDS (Chen et Yanagida, 2006). Dans d’autre cas, le stress est

réalisé en inoculant en coculture, une souche dite « inductrice » avec la souche productrice de

bactériocine, Ruiz-Barda et al, (2009) ont stimulé la production de bactériocine par

Lactobacillus plantarum NC8, en l’inoculant en coculture avec une souche « inductrice »

comme Enterococcus faecium 6T1a-20 et Pediococcus pentosaceus FBB63. L’alcool, les

détergents, le sel (conditions de stress pour la croissance bactérienne) à fortes concentrations,

peuvent stimuler la production de bactériocine, 5 à 10 g/l de sel dans le milieu de culture de la

bactérie, Lactobacillus acidophilus IBB 801 stimule la production de l’acidophiline 801

(Zamfir et Grosu-Tudor, 2009).

D’autres chercheurs ont stimulé la production de la bactériocine en modifiant et/ou

augmentant la concentration des ingrédients du milieu de culture. Ces auteurs ont observé

qu’une bonne croissance bactérienne permet une bonne production de bactériocine. Pour la

plus part des cas, les sources de carbone, d’azote, de potassium, l’utilisation de milieux

tamponnés et de vitamines, et autres éléments, ont stimulé la croissance bactérienne, et par

conséquent, la production de bactériocines. Le tableau 6 résume des exemples d’optimisation

des milieux de culture réalisés, pour stimuler la croissance bactérienne et la production de

bactériocine.

Pour d’autres cas, la stimulation de la production de bactériocine était dans un milieu

de culture riche en éléments, notamment le lait, le lactosérum, jus de datte…etc. Certains

travaux, citent que l’emploi du lait, dans un milieu de culture, stimule fortement la production

de bactériocine. Zhang et al. (2010) ont obtenu la plus grande activité inhibitrice de la

bactériocine produite par Lactobacillus fermentum F6 dans 10% de lait écrémé reconstitué.

Alors que, Faustino Jozala et al. (2004) ont optimisé la production de la nisine par

Lactococcus lactis dans du MRS et du M17 additionnés de 25% de lait.


Page 29

Tableau 6 : Milieux de culture non conventionnels pour l’étude de la croissance et de la

production de bactériocines de différentes bactéries lactiques. (Juàrez Tomàs, et al., 2010).

Milieu de

culture Composition (g/l) Optimisation Référence

TGE

(Trypticase,

Glucose,

Extrait de

levure)

Trypticase :10; glucose :10;

extrait de levure : 10; MgSO4 :

0,05; MnSO4 : 0,05; Tween80 : 2

pH :6,5–6,8

Pour la pediocine AcH par les

souches de Pediococcus

acidilactici et la nisine par

Lactococcus lactis W8.

Biswas et

al. (1991)

Mitra et

al. (2005)

TGE tamponné

La même composition que le milieu

TGE, mais additionné de citrate de

sodium : 5; acétate de sodium : 5;

KH2PO4 : 0,5

Pour la nisine produite par les

souches Lactococcus lactis

subsp. Lactis, la leuconocine

Lcm1 par Leuconostoc carnosum

et sakacine A par Lactobacillus

sakei LB 706.

Yang et

al. (1992)

Yang et

Ray,

(1994)

Le milieu BRFS

Extrait de levure : 10; glucose,

sucrose ou fructose :5;

MgSO4_7H2O : 0,05; MnSO4 :

0,005; (NH4)2HPO4 :2,5;

Tween80 :1.

Pour la plantaricine C

synthétisée par Lactobacillus

plantarum LL441

Bruno

Barcena et

al. (1998)

Milieu

complexe

Tryptone:10; extrait de levure:10;

glucose: 30; MgSO4_7H2O: 0,02;

MnSO4_H2O: 0,05; KH2PO4: 2,7;

Tween 80: 1.

Pour la sakacine P par

Lactobacillus sakei CCUG

42687

Moretro et

al. (2000)

Milieu optimisé

Soybean peptone : 4,5; extrait de

levure :10; sucrose : 10;

MgSO4_7H2O : 0,2; KH2PO4 :28,42

NaCl : 2; pH :6,8

Pour la nisine produite par

Lactococcus lactis ATCC 11454

Li et al.

(2002)

Milieu de

culture à base

de levain

Tryptone:10; extrait de levure: 12;

Lab Lemco:5; maltose: 10;

fructose: 10; cysteine/HCl: 0,5;

MgSO4_7H2O: 0,2; MnSO4_H2O:

0,05; KH2PO4: 2; Tween80: 1.

Pour l’amylovorine L471 de

Lactobacillus amylovorus

DCE 471

Leroy et

al. (2006)

Milieu optimisé

Tryptone : 5; extrait de levure: 10;

sucrose: 26,8; MgSO4_7H2O : 0,2;

K2HPO4 : 19,1; NaCl: 8,1; acide

ascorbique : 0,5; Tween80: 3;

pH: 6,5

Pour la production de la nisine

par Lactococcus lactis Lac2.

Zhoo,

(2008)

Les valeurs des ingrédients sont mentionnées en g/l, pour le tween80 en ml/l.

« Un problème sans solution, est un problème mal posé »

Albert Einstein

LBMB Matériel & Méthodes

Page 31

2. Matériel et Méthodes

2.1 Matériel

2.1.1 Souches bactériennes

Nous avons utilisé 25 souches lactiques pour la réalisation de cette étude. Ces souches

ont été isolées de différents biotopes et identifiées au Laboratoire de Biologie des

Microorganismes et Biotechnologie (LBMB) à l’Université d’Oran (voir le tableau n°7).

Tableau 7 : les différentes souches utilisées, leur origine et identification.

Souches Origines identification

LVK11, LVK30, LVK31, LVK32

Lait de vache (El-Kerma)

(Karam, 1995) Lactobacillus sp.

CHTD27

CHTD29

Lait de chamelle cru (Tindouf)

(Belkheir, 2004)

Lactobacillus brevis

Lactobacillus

cellobiosus

BH14 Lait de chamelle (Illizi)

(Bounoua, 2005)

Lactobacillus

plantarum

CHBK 309, CHBK310, CHBK311,

CHBK312, CHBK314, CHBK315,



CHBK326, CHBK327.

Lait de chamelle (Bechar)

(Kalbaza, 2010)

Leuconostoc

mesenteroides subsp

dextranicum.

CHM9, CHM18, CHM19

Lait de chamelle (Mauritanie)

(Cheikh, 2008)

Lactobacillus sp.

H2.3

Blé fermenté (Relizane)

(Bouziani et Sebbaha, 2006) Lactococcus lactis

2.1.2 Milieux de culture

Le milieu de culture, utilisé pour toutes les souches lors de la réalisation de cette étude

est le milieu MRS (Man, Rogosa et Sharpe, 1960).

Le milieu Mayeux grâce auquel la vérification de l’identité des souches appartenant au

genre Leuconostoc et plus précisément à l’espèce Leuconostoc mesenteroïdes subsp

dextranicum, a été utilisé car il permet la visualisation de la production de dextranes.


Page 32

La composition des deux milieux est présentée en annexe 2.

2.2 Méthodes

2.2.1 Vérification de la pureté des souches et leur appartenance au groupe lactique

La pureté des souches est vérifiée par un triple repiquage successif d’une colonie

ensemencée par la méthode d’épuisement de charge (méthode des quadrants).

Par la suite, un examen macroscopique est effectué en décrivant la couleur, l’aspect et

la forme des colonies.

Un examen microscopique après coloration de Gram d’une colonie (voir annexe 2), a

été réalisé afin de déterminer la forme des cellules, leur mode d’association et le type Gram.

Les bactéries lactiques sont Gram positives.

L’appartenance des souches au groupe lactique est aussi vérifiée par le test de

l’activité catalasique, en déposant une goutte de peroxyde d’hydrogène (H2O2) sur une

colonie, l’effervescence de la suspension indique que la bactérie est catalase positive,

l’absence de réaction montre qu’elle est catalase négative.

Généralement, les bactéries lactiques sont à catalase négative.

2.2.2 Conservation des souches

La conservation des souches peut être de courte ou de longue durée :

Une conservation de courte durée se fait par ensemencement d’une colonie sur une

gélose solide inclinée, après incubation à 30 °C pendant 24 h, les géloses sont conservées à

4°C pour quelques semaines (Font de Valdez, 2001).

Une conservation de longue durée, quelques années (Font de Valdez, 2001), est faite

par un ensemencement d’une colonie soit dans un milieu liquide additionné de glycérol (v/v)

à 40%, soit dans du lait écrémé (10%). Après incubation, on conserve les cultures à -20 °C.


Page 33

2.2.3 Mise en évidence des interactions négatives

Deux types de méthodes sont utilisés, direct qui repose sur un contact cellulaire et

indirect qui consiste à tester des surnageants de cultures sur des cellules bactériennes.

Méthode directe : Fleming et al. (1975)

Les souches à tester pour leur pouvoir inhibiteur sont ensemencées en touches (à l’aide

d’un inoculateur multipoint) sur la surface du milieu MRS solide. Après une pré-incubation à

30 °C pendant 18 h, on coule 7 ml de gélose molle MRS préensemencée avec 500 µl d’une

culture bactérienne jeune (indicatrice du pouvoir inhibiteur).

Après une incubation de 24h, on mesure le diamètre des halos clairs apparus autour des

souches ensemencées en touches.

Par ce test, toutes nos souches ont été testées comme inhibitrices et comme indicatrices, sauf

H2.3, elle est utilisée seulement comme indicatrice.

Méthode indirecte : Méthode de diffusion en puits : Schillinger et Lücke (1989)

Cette méthode permet de détecter les inhibitions dues à des agents inhibiteurs sécrétés

dans le milieu de culture des souches inhibitrices. En effet, elle permet de tester les

surnageants de culture.

Cette méthode consiste à couler 7 ml de MRS gélose molle en surfusion contenant 500

µl d’une jeune culture de la bactérie indicatrice, sur une gélose solide stérile, après

solidification, des puits sont creusés à l’aide d’une cloche de Durham stérile. Un volume de

surnageant est mis dans ces puits, après diffusion pendant une nuit à 4°C, on incube à 30°C

pendant 24h.

Pour l’obtention des surnageants :

On ensemence le milieu MRS liquide à 5% d’inoculum de la bactérie inhibitrice après

incubation à 30°C pendant 18 à 20h, le surnageant est récupéré par 2 centrifugations des

cultures à 5000 rpm pendant 15 min.

Des zones claires autours des puits indiquent que le surnagent contient des substances

inhibitrices.


Page 34

Cette méthode a été testée avec les surnageants des souches ayant montré un pouvoir

inhibiteur par la méthode de Fleming et al. (1975). Les souches indicatrices ont aussi été

déterminées grâce à la même méthode.

2.2.4 Production d’agents inhibiteurs dans différents milieux

Pour obtenir une meilleure répétabilité et reproductibilité des résultats, nous avons

réalisé des tests dans du MRS additionné de lait et d’extrait de levure.

Ce test a été réalisé selon la méthode de Schillinger et Lücke (1989). Les surnageants testés

ont été obtenus par culture des souches inhibitrices dans les milieux suivants :

MRS + 2,5% d’extrait de levure : MRSY (Benkeroum, 2000).

MRSY tamponné : MRSY Tp (le tampon Na2/K), 0,2 M, pH7,0 est utilisé, (voir

annexe 2).

MRSY + 25 % de lait écrémé (10%) (Faustino Jozala et al., 2004).

MRSY Tp + 25 % de lait écrémé.

Nous avons ensemencé à 5% d’inoculum à chaque fois et incubé à 30°C pendant 20h.

La lecture des résultats a consisté à faire la comparaison des effets inhibiteurs des surnageants

de culture obtenus avec les différents milieux. Comme témoin, nous avons utilisé un

surnageant obtenu après culture dans le MRS.

2.2.5 Caractérisation des agents inhibiteurs

Les bactéries lactiques sont capables d’inhiber d’autres bactéries du même groupe ou

d’autres genres par la production d’un grand nombre d’agents inhibiteurs. Parmi lesquels nous

pouvons citer principalement les acides organiques (acide lactique), le peroxyde d’hydrogène

ou les bactériocines.

2.2.5.1 Inhibition par production des acides organiques

La production des acides organiques par les souches lactiques est parmi les causes

majeures d’inhibition des bactéries, pour éliminer l’effet de ces acides sur les bactéries

indicatrices, un milieu tamponné à pH 7 est utilisé.

Nous avons testé l’effet inhibiteur dans du MRS (gélose dure et gélose molle)

tamponné avec Na2/K à 0,2 M, pH7,0 (voir annexe 2) par la méthode de Fleming et al.

(1975). Du MRS non tamponné a été utilisé comme témoin.


Page 35

La lecture des résultats consiste à comparer les zones d’inhibition obtenues dans les milieux :

MRS tamponné et MRS non tamponné.

2.2.5.2 Détermination des inhibitions dues à la production du peroxyde d’hydrogène ou

des bactériocines

Le peroxyde d’hydrogène est un agent inhibiteur dont l’effet peut être levé par la

catalase. De la même manière les bactériocines, qui sont des substances protéiques, sont

dégradées par des enzymes protéolytiques (Klaenhammer, 1993). Les bactéries lactiques

secrètent les bactériocines et le peroxyde d’hydrogène dans le milieu extracellulaire d’où

l’intérêt de rechercher ces substances dans les surnageants de culture.

Pour cela nous avons utilisé la méthode de Schillinger et Lücke (1989) afin de tester

des surnageants de culture traités avec différentes enzymes.

Nous avons incubé les surnageants de culture actifs pendant 2 heures, en présence des

enzymes suivantes : pepsine, trypsine, pronase E et la catalase à une concentration finale de 2

mg/ml (Cocolin et al., 2007). Les surnageants de culture ont été traités à 100°C pendant 2 min

(Ivanova et al., 1998), afin d’inactiver les enzymes, puis testés.

Les enzymes ont été préparées dans des solutions tampon :

- Tampon de sodium à 0,1 M Na2/Na, pH7,0, pour les enzymes trypsine, pronase E et la

catalase (voir annexe 2).

- 0,05 M d’acide citrique à pH2,0 (voir annexe 2) pour la pepsine (Xiraphi et al., 2005).

La lecture des résultats consiste à faire la comparaison entre l’effet inhibiteur des

surnageants traités aux enzymes et un surnageant non traité. Une levée d’inhibition en

présence de catalase signifie que l’agent inhibiteur est le peroxyde d’hydrogène alors que dans

le cas des enzymes protéolytiques il s’agit d’un agent protéique c’est à dire une bactériocine.

2.2.6 Optimisation de la production et/ou de l’activité d’une bactériocine

L’effet de chaque constituant du milieu MRS sur la production de bactériocines, a été

étudié par Leroy et De Vuyst (2003), Todorov (2008), ainsi que d’autres chercheurs, qui ont

pu démontrer une très grande différence selon les ingrédients et leurs concentrations.


Page 36

L’optimisation de l’effet inhibiteur de la bactériocine consiste à maîtriser les facteurs

qui influencent sa biosynthèse et son activité. Parmi les facteurs étudiés : La composition du

milieu, la température d’incubation de la souche productrice, la diffusion de la bactériocine à

travers la gélose,… etc.

Remarque : La lecture du résultat pour toute l’étude de ces effets consiste à comparer les halos

d’inhibition. Un halo de diamètre plus important qu’un autre reflète une production plus

intéressante de bactériocine dans un milieu bien défini et sera utilisé pour l’étude de l’effet

suivant.

2.2.6.1 Effet de la composition du milieu sur la production de bactériocine

En nous basant sur les références, (Todorov et Dicks, 2004; Todorov, 2008), Nous

nous sommes intéressés aux sources d’azote, de carbone et de potassium.

Cette étude a été réalisée selon la méthode de Schillinger et Lücke (1989) et nous avons

utilisé comme témoin, pour chaque étape, des surnageants obtenus par culture de la souche

productrice de bactériocine en milieu MRS modifié de l’étape précédente. Le milieu qui sera

retenu à la fin de cette optimisation sera constitué par les concentrations optimales des

ingrédients testés.

Effet de la source d’azote

La bactérie bactériocinogène est ensemencée à 5% d’inoculum dans 100 ml de MRS

(témoin) et de MRS dont la source d’azote (c à d la peptone, l’extrait de viande et l’extrait de

levure) a été modifiée. Les modifications que nous avons apportées touchent la nature de la

source d’azote ou sa concentration, en retenant comme concentration maximale et globale

2%.

Le MRS a été modifié comme suit :

MRS1 : contient 2% tryptone.

MRS 2 : contient 2% extrait de levure.

MRS 3 : contient 2% extrait de viande.

MRS 4 : contient 1,5% tryptone + 0,5% extrait de levure.

MRS 5 : contient 1,5% tryptone + 0,5% extrait de viande.

MRS 6 : contient 1% tryptone + 0,5% extrait de levure + 0,5% extrait de viande.


Page 37

Effet de la source de carbone

La source d’azote, qui a permis d’obtenir le meilleur effet inhibiteur par rapport au

MRS non modifié, a été maintenue pour ce test.

100 ml, de milieu MRS modifié, sont ensemencés avec 5ml d’une culture jeune. Dans

ce cas le glucose (2%) est remplacé par 2% de chacun des sucres suivants : maltose, lactose,

saccharose ou glycérol. Après incubation à 30°C pendant 20h, les surnageants de ces cultures

sont récupérés par deux centrifugations à 5000 rpm pendant 15 min et testés.

Effet de la source de potassium

Le milieu MRS se compose de 2 g/l (0,2%) de K2HPO4, L’effet de ce sel est important

sur la croissance des bactéries lactiques du genre Lactobacillus par rapport au sulfate de

magnésium et au sulfate de manganèse.

Nous voulons étudier l’effet du KH2PO4 ou du K2HPO4 ou l’effet de la combinaison

de ces deux sels sur la production de bactériocine.

Pour cela, 0,2% de K2HPO4 sont remplacés par 1% de K2HPO4, 2% K2HPO4, 2%

KH2PO4 ou par 1% K2HPO4+1% KH2PO4 (Mollendorff et al., 2009) dans le milieu qui a

donné l’effet inhibiteur le plus grand à l’étape précédente.

Les surnageants testés ont été préparés comme suit :

100 ml de chaque milieu modifié sont ensemencés à 5% d’inoculum de la souche inhibitrice

et incubés à30°C pendant 20 h, puis centrifugés deux fois à 5000 rpm pendant 15 mn.

A ce stade, un milieu adéquat pour une production de bactériocine optimale de la souche

sélectionnée, est constitué.

2.2.6.2 L’effet de la température d’incubation

La température d’incubation peut influencer la production de bactériocine (Krier et al

1998). Le milieu contenant les concentrations optimales en source d’azote, de sucre et de

potassium a été utilisé dans ce test. Des flacons de 100 ml de ce milieu ont été ensemencés à

5% d’inoculum et incubés à différentes températures, à savoir : 25°C, 30°C (témoin), 35°C,

40°C et 45°C pendant 20 h.


Page 38

Les surnageants obtenus ont été testés par la méthode de Schillinger et Lücke (1989).

2.2.6.3. Effet du pH sur la diffusion de la bactériocine

La diffusion de la bactériocine dans la gélose est un paramètre important qui doit être

maîtrisé afin de bien quantifier l’effet inhibiteur (Blom et al., 1997). En plus du laps de temps

que dure la diffusion à 4°C, lors de la réalisation de la méthode de Schillinger et Lücke

(1989), le pH de la gélose semble être important. En effet la diffusion de certaines substances

comme les antibiotiques semble meilleure à pH neutre (le milieu Mueller hinton utilisé pour

les antibiogrammes est tamponné à pH7).

Pour cela, nous avons essayé d’optimiser la diffusion de la bactériocine, en comparant

la diffusion à travers le film de gélose solide et molle, tamponnée et non tamponnée (témoin).

La méthode utilisée est celle de Schillinger et Lücke (1989).

2.2.7 Production de bactériocine en présence de lait

Par ce test, nous avons voulu pousser l’optimisation encore plus loin, en réalisant

différentes combinaisons des conditions d’optimisation testées précédemment et qui sont :

L’addition de lait.

L’addition de 2,5% d’extrait de levure.

Optimisation de la composition du MRS.

Le pH du milieu de culture des inhibitrices (non tamponné et tamponné).

Le milieu obtenu des optimisations dûment réalisées est nommé MRSm.

Dans cette étude, nous avons utilisé pour la culture de la souche bactériocinogène du

MRSm additionné de lait. Et ceci pour voir si la présence du lait (à 25%) peut augmenter

l’effet inhibiteur de la bactériocine.

Dans ce but, Les surnageants testés par la méthode de diffusion en puits, sont obtenus

par ensemencement à 5% d’inoculum de la souche bactériocinogène dans les milieux MRS,

MRSY et MRSm, en conditions tamponnées ou pas (témoin) en présence de lait ou pas

(témoin).

Après incubation pendant 20h à 30°C, les surnageants de culture sont récupérés et

testés par la méthode de diffusion en puits.


Page 39

La lecture des résultats consiste à comparer les diamètres des halos d’inhibition,

obtenues pour tous les cas testés.

2.2.8 Caractérisation physico-chimique de la bactériocine

Certaines propriétés physico-chimiques des bactériocines permettent de donner une

idée sur leur classification. Il s’agit plus particulièrement de la thermorésistance, en effet, les

bactériocines thermosensibles appartiennent à la classe III alors que les thermorésistantes sont

de la classe I ou II (Dortu et Thonart, 2009).

De ce fait, des surnageants de culture des souches bactériocinogènes ont été traités

pour étudier l’effet de différents paramètres physico-chimiques sur l’activité de la

bactériocine (la température, l’acidité ou la basicité).

Pour tous les tests réalisés dans cette partie nous avons utilisé la méthode de diffusion

en puits.

Effet du pH

Nous avons ajusté le surnageant de culture de la souche bactériocinogène à des pH

acides ou basiques : pH 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 en utilisant du HCl ou du NaOH à 3N. Puis pour

les doubles de ces échantillons, nous avons réajusté le pH à 7.

Par la suite, ces surnageants ont été testés. Un surnageant natif (dont le pH intial a été

maintenu) a été utilisé comme témoin.

La lecture des résultats se fait par comparaison, de l’effet inhibiteur des surnageants

dont le pH est réajustés et non réajustés avec celui du surnageant natif.

Effet de la température

Pour l’effet de la chaleur sur l’activité des bactériocines, des surnageants de culture

ont été chauffés à 60, 80 ou 100°C pendant 10, 15 ou 20 min et à 120°C pendant 20 min

(autoclavage).

Ces surnageants et un surnageant non traité à la chaleur (témoin) ont été testés par la

méthode de diffusion en puits.


Page 40

La lecture des résultats consiste à faire la comparaison entre ceux obtenus avec les

surnageants traités et le surnageant non traité.

2.2.9 Estimation de la quantité de bactériocine produite

Afin d’estimer avec plus de précision la quantité de bactériocine produite dans le

MRSm tamponné. Nous avons réalisé le test suivant :

La quantification de la bactériocine en unité arbitraire par millilitre de surnageant est

réalisée selon la méthode décrite par Pucci et al. (1988) qui se base sur des dilutions « Critical

Dilution Assay » mais adaptée à la méthode de Lücke et schillinger (1989) selon Yanagida et

al. (2005).

Pour ce test nous avons procédé de la manière suivante :

Des dilutions en cascade au 1:2 par le milieu MRSm tamponné ont été effectuées avec le

surnageant d’une culture de 20h à 30°C de la souche inhibitrice, 100 µl de ces dilutions ont

été testés par la méthode de schillinger et Lücke (1989) en utilisant une gélose molle et une

gélose solide tamponnées.

Après l’étape de diffusion et d’incubation, la bactériocine a été quantifiée comme suit :

Une unité arbitraire est définie comme l’inverse de la plus grande dilution montrant une zone

d’inhibition, soit :

AU/ml = (1000/d)*D (Parente et al., 1994)

Où d est le volume mis dans les puits

D est le facteur de dilution.

2.2.10 Cinétique de croissance et de production de bactériocine

Plusieurs auteurs ont montré une relation entre la croissance, et plus précisément la

biomasse, et la production de bactériocines chez les bactéries lactiques.

La cinétique de production peut nous renseigner sur le type de métabolite qu’est la

bactériocine (métabolite primaire ou secondaire) et aussi sur le temps d’incubation nécessaire

pour une production maximale.

Afin d’établir ces deux cinétiques nous avons procédé de la manière suivante :


Page 41

Un volume de 200 ml de chacun des milieux de culture suivants : MRS, MRS Tp, MRSm et

MRSm Tp ont été ensemencés à 5% d’inoculum d’une culture jeune de la souche

bactériocinogène.

Puis toutes les 2 heures, un volume de culture était pris, pour établir la courbe de

croissance de la souche inhibitrice et la courbe de production de la bactériocine selon les

méthodes suivantes :

Nous avons suivi la croissance en mesurant la densité optique à 600 nm.

La production de bactériocine a été évaluée par la méthode de diffusion en puits.

2.2.11 L’effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine

Des volumes égaux de surnageants de culture sont additionnés de 1% de : SDS,

tween20, tween80, urée, NaCl, tritonX100 et de 0,1, 2 et 5 mM d’EDTA. Chacun de ces

volumes et un surnagent non traité (témoin) sont testés par la méthode de diffusion en puits.

En parallèle, et aussi comme témoins, des volumes d’eau distillée stérile contenant les

mêmes concentrations en détergents ont été testés, afin de déterminer l’effet du détergent seul

sur la bactérie indicatrice (Albano et al. ,2007).

2.2.12 Purification partielle de la bactériocine

La purification d’une substance quelconque, synthétisée par une cellule vivante, est

une tache difficile à réaliser, du fait qu’elle se trouve dans un milieu complexe. Ce milieu

contient d’autres éléments qui peuvent êtres nécessaires pour son activité.

Nous avons essayé de purifier notre bactériocine en commençant par une

concentration au sulfate d’ammonium, puis un dessalage en utilisant une colonne de Sephadex

G25, enfin nous avons essayé d’estimer le poids moléculaire de la bactériocine par

électrophorèse Tricine SDS-PAGE (Schägger et Von Jagow., 1987)

2.2.12.1 Précipitation au sulfate d’ammonium

La précipitation au sulfate d’ammonium est la technique la plus utilisée pour la

concentration des protéines destinées à la purification, le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 est

le sel de choix en le comparant à d’autres sels à effet précipitant, il permet de maintenir la

structure de la protéine donc son activité, de plus il est fortement soluble et pas coûteux

(Burgess, 2009).


Page 42

Un litre de surnagent d’une culture de 20 h d’incubation à 30°C est récupéré par une

centrifugation à 5000 rpm pendant 15 min à 4°C. Pour ce surnageant on réalise plusieurs

saturations en série.

Nous avons commencé à 40% de saturation pour cela, le sulfate d’ammonium a été

ajouté peu à peu, après incubation à 4°C pendant 24 à 72 heures, deux centrifugations à 5000

rpm pendant 30 min sont réalisées pour récupérer les protéines qui ont précipité à 40%. Quant

au surnageant, il est testé pour une éventuelle activité inhibitrice résiduelle. Le précipité est

récupéré, dans un volume égal au dixième ou au centième du volume initial de surnageant,

dans un tampon K/Na2, 0,2M à pH7,0. La préparation ainsi obtenue est subdivisée en deux

volumes, un petit volume est testé par la méthode de diffusion en puits et le reste est

reprécipité au sulfate d’ammonium à 50% de saturation, et ainsi de suite pour les saturations

de 60, 70 et 80% selon le tableau ci-dessous (Harris, 1989).

Tableau 8 : Quantité de sulfate d’ammonium ajoutée pour les saturations désirées

Pourcentage de saturation 40% 40-50% 50-60% 60-70% 70-80%

Quantité de (NH4)2SO4 ajoutée

graduellement dans 100 ml 22,9 g 5,9 g 6,1 g 6,3 g 6,6 g

A chaque fois, le surnageant est testé pour l’activité résiduelle par la méthode de diffusion en

puits.

2.2.12.2 Dessalement

La précipitation au sulfate d’ammonium conduit à la présence de sel autour de la

protéine précipitée ce qui peut interférer lors de la réalisation de certaines techniques comme

l’électrophorèse. D’où la nécessité d’éliminer toute trace de ces composés des préparations de

bactériocines.

L’élimination des sels de sulfate d’ammonium peut être faite soit par dialyse contre

l’eau distillée soit par chromatographie de filtration sur gel, en utilisant le Sephadex G25

Nous avons opté pour l’utilisation de la chromatographie avec un gel Sephadex G25

pour l’élimination du sulfate d’ammonium (Jiminez-Diaz et al., 1995) ainsi les molécules (les

protéines) de grand poids moléculaire seront les premières à être éluées par rapport aux


Page 43

molécules de sels qui seront retardées et descendront les dernières, c’est une méthode de

dessalement plus rapide que la dialyse par exemple.

Nous avons réalisé ce test dans les conditions suivantes :

- Le volume de l’échantillon appliqué est de 25 à 30% du volume du gel, le débit peut

atteindre jusqu’à 200 ml/h (Scopes, 1994) alors que le volume de récolte est de 3% du

volume de gel.

- L’équilibrage de la colonne se fait par passage de 3 fois le volume du gel en tampon

K/Na2 à 0,05M, pH7,0.

- Le lavage de la colonne se fait par une solution de NaOH à 0,2 M + 0,02% d’azide de

sodium (3 fois le volume du gel).

- Un volume de 13 ml de l’échantillon résultant de l’étape précédente (saturation au

sulfate d’ammonium) est appliqué à une colonne de 45×1,3 cm.

- L’élution se fait avec le même tampon (3 fois le volume du gel) avec un débit de

2ml/min et des fractions de 1,5 ml sont collectées.

La densité optique de chaque fraction est mesurée à 280 nm. De l’ensemble des

fractions obtenues (appartenant aux pics) et vue leur nombre, nous n’avons testé pour l’effet

inhibiteur qu’une seule sur deux par la méthode de diffusion en puits. Les fractions montrant

une activité seront regroupées.

2.2.12.3 Estimation du Poids Moléculaire par Tricine SDS-PAGE

Cette électrophorèse est destinée aux protéines de poids moléculaire allant de 1 à 100

KDa et préférentiellement aux protéines de poids moléculaire inférieur à 30 KDa.

Nous avons utilisé un gel constitué de 3 gels de concentrations différentes en

acrylamide : Un gel de séparation à 16%, un gel espaceur à 10% et le gel de concentration à

5% (Schägger, 2006).

60 µl d’échantillon préparé avec un tampon de charge (voir annexe 2) sont déposés dans les

puits du gel d’électrophorèse.

Tous les échantillons à tester ont été déposés en double, dans deux parties du gel.

Les échantillons que nous avons choisis pour l’électrophorèse sont les suivants :

des surnageants natifs

des précipités.


Page 44

L’électrophorèse a été réalisée à 50V pendant une nuit (l’ajout graduel du voltage permet une

bonne séparation à la fin de l’électrophorèse).

A la fin de l’électrophorèse le gel est divisé en deux parties, dont une sera colorée pour

visualiser les bandes protéiques (bactériocines) et la deuxième partie du gel sera testée pour

l’effet inhibiteur des bandes protéiques en présence de la souche indicatrice.

☞ la partie du gel contenant les marqueurs de taille (lysozyme et nisine à 0,8 mg/ml) est

mise dans une solution de fixation du gel pendant une heure et est colorée par une solution de

coloration au bleu de Coomassie pendant 2 heures et décolorée pendant plus d’une heure,

jusqu’à ce que la décoloration soit complète. Toutes les solutions utilisées sont décrites en

annexe 2.

☞ La deuxième partie du gel est fixée dans une solution de 20% d’isopropanol et 10%

d’acide acétique pendant une heure à deux heures, puis rincée plusieurs fois à l’eau distillée

stérile. On la dépose sur une surface de gélose solide tamponnée, ensuite on coule dessus un

film de gélose molle ensemencé par l’indicatrice (Bhunia et al., 1987). La position de la

bactériocine active est visualisée par une zone d’inhibition, comme décrit par Van Reenen et

al. (1998).

« Cherchons comme cherchent ceux qui doivent trouver et trouvons

comme trouvent ceux qui doivent chercher encore. Car il est écrit :

celui qui est arrivé au terme ne fait que commencer.»

Saint Augustin

LBMB Résultats & Discussions

Page 46

3. Résultats et Discussion

3.1 Confirmation de la pureté et l’appartenance des souches au groupe lactique

La pureté des souches s’observe par la présence d’un seul type, soit de colonies par

boîte, soit un seul type de cellules en observation microscopique. La réaction négative au

peroxyde d’hydrogène d’une souche, ainsi qu’un type Gram positif permettent de confirmer

son appartenance au groupe lactique.

Toutes les souches sont catalase négatives et de Gram positives. Le tableau 9

récapitule les observations macroscopiques et microscopiques.

Tableau 9 : Caractérisation macroscopique et microscopique des souches.

Les souches Observations macroscopiques Observations microscopiques

Leuconostoc

mesenteroides

subsp

dextranicum.

MRS

Colonies rondes à contour

régulier, de couleur

blanchâtre et d’aspect peu

bombé. Petites cellules de forme

lenticulaire, association en amas

ou en chaînettes.

Mayeux

Grosses colonies gluantes,

envahissantes et

translucides.

Lactobacillus sp

Lactobacillus

plantarum

Lactobacillus

brevis

Lactobacillus

cellobiosus

LVK11

LVK30

LVK31

LVK32

CHM9

CHM18

CHM19

BH14

Colonies rondes à contour

régulier, de couleur

blanchâtre et d’aspect peu

bombé.

Cellules de forme cocobacillaire,

isolées ou associées en

diplocoques ou en amas.

Cellules sous forme de bacilles

longs, isolées ou associées en

Chaînettes généralement.

CHTD27

CHTD29

Grosses colonies à contour

irrégulier, gluantes plus ou

moins plates.

Cellules sous forme de bacilles

courts, isolées ou associées en

diplocoques, en amas ou en

chaînettes.

Lactococcus

lactis H2.3

Petites colonies blanchâtres

à contour régulier, à aspect

peu bombé.

Petites cellules de forme ronde,

associées en amas.

Ces résultats confirment l’appartenance de toutes les bactéries au groupe lactique.


Page 47

3.2 Détection des bactéries inhibitrices

Dans cette partie nous avons réalisé d’une part, une mise en évidence des inhibitions

entre bactéries par contact direct, par la méthode de Fleming et al. (1975), et d’autre part une

analyse de l’effet des surnageants de culture sur des bactéries indicatrices par la méthode de

schillinger et Lücke (1989).

3.2.1 La méthode de Fleming et al. (1975)

Elle permet de réaliser un screening des bactéries antagonistes, cette méthode dite

« directe » permet d’évaluer l’effet antagoniste de souches ensemencées en touches (tests)

contre des souches ensemencées en masse (indicatrices). Chacune des bactéries de notre

échantillon a été testée comme inhibitrice et indicatrice.

Les figures suivantes montrent quelques aspects des résultats observés :

Figure 9 : Interactions inhibitrices inter-bactériennes.

1 : CHBK 309, 2 : CHBK310, 3 : CHBK311, 4 : CHBK312, 5 : CHBK314, 6 : CHBK315, 7 : CHBK316, 8 : CHBK318, 9 : CHBK319,

10 : CHBK320, 11 : CHBK323, 12 : CHBK325, 13 : CHBK326, 14 : CHBK327, 15 : CHM9, 16 : CHM18, 17 : CHM19, 18 : LVK11,

19 : LVK30, 20 : LVK31, 21 : LVK32, 22 : CHTD27, 23 : CHTD29, 24 : BH14

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 10 (voir annexe 1).

L’ensemble des résultats observés nous permet de déduire plusieurs remarques :

15 16 17

20 19 18

23 22

19

21

24

LVK11

15 16 17

20 19 18

23 22

19

21

24

CHBK315

LVK11

4 3 2 1

8 7 6 5

12 11 10 9

14 13

CHBK310

4 3 2 1

8 7 6 5

12 11 10 9

14 13


Page 48

Parmi les 532 interactions testées, 484 ont montré des inhibitions, ce qui correspond à

91% du total. Les 9 % restant, correspondent à 48 combinaisons non inhibitrices.

Les deux genres de bactéries lactiques qui constituent notre échantillon n’ont pas eu le

même comportement en effet :

Effet inhibiteur des leuconostocs :

Le taux des inhibitions, exercées par les leuconostoc, contre les autres bactéries

lactiques est d’environ 77%. Dans un total de 306 combinaisons, 277 sont des

interactions négatives.

L’effet inhibiteur exercé par les leuconostocs est plus important contre les lactobacilles

(les diamètres ont atteint 1,1 cm) que contre les leuconostocs (diamètre inférieur à 0,8

cm).

Parmi les inhibiteurs du genre Leuconostoc, 77,42% sont capables d’inhiber des espèces

de Lactobacillus et les halos d’inhibition ont une taille qui varie de 0,6 cm à 1,1 cm.

Parmi les souches ayant présentées les halos les plus grands, nous avons la CHBK318

qui inhibe le lactobacille CHM18 avec un halo de 1,1 cm. Les autres Lactobacilles ne

sont pas inhibés par les leuconostocs.

Parmi les bactéries qui ont été très peu ou pas du tout inhibées, il y a les souches

CHTD27 et CHTD29. En même temps, ces deux souches ont montré l’effet inhibiteur le

plus grand contre CHM19.

Effet inhibiteur des lactobacilles :

Les inhibitions exercées par les lactobacilles contre les lactobacilles sont plus

importante par rapport à celle exercées contre les leuconostocs.

Le taux d’inhibitions des bactéries lactiques par les souches du genre Lactobacillus

représente 91,6%.

Parmi les Lactobacilles inhibiteurs, 96,2% sont capables d’inhiber des espèces du genre

Leuconostoc. La CHTD27, la CHTD29 et la BH14 inhibent la CHBK312 avec des halos

de 1,4 cm. On note que les souches CHBK312, CHBK315, CHBK316 et CHBK319 ne

sont pas inhibées par CHM19.

Parmi les souches de leuconostocs indicatrices pour les lactobacilles, la souche

CHBK312 s’avère la plus sensible aux lactobacilles, et parmi les indicatrices

lactobacilles, la CHM19 a été inhibée par tous les lactobacilles en présentant les halos


Page 49

d’inhibitions les plus grands. Deux autres souches semblent être de bonnes indicatrices

pour les lactobacilles, il s’agit de LVK30 et LVK31.

Ce résultat n’est pas surprenant, en effet les lactobacilles sont connus pour leur

pouvoir inhibiteur par rapport au Leuconostoc, ceci est noté par plusieurs auteurs. Jensen et

al.,( 2009) ont montré dans leur étude, que les Lactobacilles inhibent la plupart des souches de

leuconostocs utilisées (66,7%) et inhibent peu les espèces de lactobacilles (37%).

Karam et al. (2004), ont observé que les souches de Lactobacillus présentent un grand

effet inhibiteur (82,5%) contre des souches de Lactococcus, utilisées pour leur étude, et que

les lactocoques inhibent peu les lactobacilles (2,3%).

De plus, les lactobacilles sont caractérisés par leur pouvoir acidifiant qui leur permet

de résister à des pH inférieurs à 4. En comparaison, les leuconostocs ne résistent même pas à

des pH inférieurs à 4,5 (Mc Donald et al., 1990, Stiles, 1994). Cette caractéristique fait que

les lactobacilles sont souvent, préférentiellement utilisés comme ferments pour plusieurs

produits fermentés (Cocconcelli et Fontana, 2008).

La méthode de Fleming et al. (1975) permet d’évaluer quantitativement le pouvoir

inhibiteur des souches ensemencées en touches (compétitrices) sur les souches ensemencées

en masse dans la gélose molle. Elle met en évidence les inhibitions dues à la production

d’agents inhibiteurs mais aussi celles qui sont dues à la compétition vis-à-vis des nutriments

ou au contact cellulaire.

L’inhibition causée par le contact est connu chez toutes les cellules des êtres vivants,

cette inhibition n’est due ni à la compétition vis-à-vis des nutriments, ni à la production

d’agents inhibiteurs. L’inhibition par contact cellulaire se fait quand une souche occupe

l’écosystème et ne laisse pousser aucun autre microorganisme.

Todorov et Dicks (2005) ont retenu 9 colonies pour leurs larges zones d’inhibition

parmi 37 colonies montrant des inhibitions, ce même mode de sélection est utilisé par tous les

chercheurs. En se basant sur ce critère de sélection, nous avons retenu pour la suite de notre

travail les souches suivantes :

☞ Comme inhibitrices toutes les souches du genre Leuconostoc, sauf CHBK309 et

CHBK319, car elles présentent le pouvoir inhibiteur le plus faible et comme indicatrices de ce

genre, les souches CHM9, CHM19, LVK11 et H2.3; car leur inhibition par les Leuconostoc

est très importante (les halos d’inhibition ont atteint un diamètre de 1,1 cm).


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☞ Pour le genre Lactobacillus toutes les souches sont retenues comme inhibitrices et

comme indicatrices CHM19, LVK30, LVK31 et CHBK312. Le diamètre de l’inhibition des

lactobacilles exercée sur ces souches a atteint 2,4 cm.

3.2.2 Mise en évidence des inhibitions par la méthode Schillinger et Lücke (1989)

Après avoir détecté les inhibitions par contact direct entre les cellules, nous avons

voulu voir si ces mêmes inhibitions peuvent être observées par utilisation des surnageants de

culture, donc dans le cas d’une absence d’un contact cellulaire entre les souches tests et les

souches indicatrices.

Pour la mise en évidence des agents inhibiteurs, dans les surnageants de culture, par la

méthode de Schillinger et Lücke (1989), nous avons retenu pour chaque genre étudié les

souches ayant présentées le plus grand effet inhibiteur (souches test) et celle qui se sont

avérées les plus sensibles (souches indicatrices) par la méthode de Fleming et al (1975).

Le but de cette méthode, dite « indirecte », est de mettre en évidence l’agent inhibiteur

produit par la bactérie inhibitrice et dont la propriété de diffusion est importante. La diffusion

de l’agent inhibiteur ne laisse pas poussé l’indicatrice tout autour du puits. Le diamètre du

halo peut nous renseigner sur la quantité de l’agent inhibiteur produit et diffusé. Parmi tous

les agents inhibiteurs, les bactériocines sont décrites comme étant des produits très diffusibles

dans les géloses.

Parmi les quatre indicatrices retenues pour les inhibitrices du genre Leuconostoc,

seule la CHM19 était inhibée, la figure 10 et le tableau 11 montrent le résultat obtenu :

Figure 10 : L’effet inhibiteur des surnageants de culture des Leuconostocs contre CHM19.1 : CHBK 310, 2 : CHBK311, 3 : CHBK312, 4 : CHBK315, 5 : CHBK323, 6 : CHBK325, 7 : CHBK326, 8 : CHBK327, 9 : vide

4 3

2

1

8

7 6

5

9


Page 51

Tableau 11 : Inhibitions par les surnageants de culture des Leuconostocs.

S. Indicatrices

S. Inhibitrices LVK11 CHM9 CHM19 H2.3

CHBK310 0 0 0 0

CHBK311 0 0 1,5 0

CHBK312 0 0 2 0

CHBK314 0 0 0 0

CHBK315 0 0 1,2 0

CHBK316 0 0 0 0

CHBK318 0 0 0 0

CHBK320 0 0 0 0

CHBK323 0 0 1,4 0

CHBK325 0 0 1,3 0

CHBK326 0 0 1,1 0

CHBK327 0 0 1,0 0 S : souches Les diamètres des halos d’inhibition sont exprimés en cm.

On peut noter que :

Parmi les leuconostocs testés, seuls 7 sur 12 souches ont montré un grand effet

inhibiteur par leur surnageant de culture contre l’indicatrice CHM19. Ces inhibitions ne sont

pas reproductibles, en effet ces résultats ont été observés seulement dans un essai. Les autres

indicatrices se sont montrées totalement résistantes. Ces inhibitions peuvent être dues

principalement à la production d’acides organiques, de peroxyde d’hydrogène ou de

bactériocines.

Dalache (2006), a noté que le criblage des antagonistes par la méthode de Fleming et

al. (1975), a permet de détecter 53% des inhibitions entre les bactéries lactiques, alors que la

méthode de diffusion en puits n’a permet de visualiser aucune inhibition, et ceci malgré de

nombreuses répétitions. Cet auteur explique ce résultat par la faible quantité d’agents

inhibiteurs produits dans le surnageant de culture. Ce résultat a aussi été observé par

Benmouna (2008), qui a noté que le surnageant de culture des souches inhibitrices n’a donné

aucune inhibition.

Les acides organiques sont connus pour leur grand pouvoir inhibiteur, essentiellement

l’acide lactique, qui est un produit à effet bactéricide et majeur du métabolisme des bactéries

lactiques, contre les bactéries sensibles aux pH bas. Mc Donald et al. (1990) ont constaté que

la production de l’acide lactique par les microorganismes durant la fermentation végétale

permet d’éliminer le développement des souches de Leuconostoc mesenteroïdes.


Page 52

Les bactéries lactiques peuvent, dans certaines conditions, accumuler le peroxyde

d’hydrogène (H2O2). Cette substance à effet bactéricide ou bactériostatique, affecte la

membrane lipidique (Haugaard, 1968), en accédant au cytoplasme, il cause des dommages

aux constituants intracellulaires. Falagas et al., 2007, ont démontré que certains lactobacilles

inhibent la croissance des bactéries vaginales par production de peroxyde d’hydrogène.

Concernant les Lactobacilles inhibiteurs, aucune inhibition n’était observée et ceci

après plusieurs essais. Des résultats similaires ont été observés par plusieurs auteurs.

Schillinger et Lücke (1989) ont remarqué que plusieurs inhibitions des souches de

Lactobacillus sake observées par la méthode de Fleming et al (1975), ont disparu lorsqu’ils

ont utilisé la méthode de diffusion en puits ; en effet sur 19 souches inhibitrices, 6 seulement

ont pu inhiber par leurs surnageants de culture. Ces mêmes constatations ont été faites par

Lewus et al. (1991) qui ont pu montrer que ces résultats sont observés, particulièrement,

quand l’agent inhibiteur est une bactériocine. Et ils l’expliquent par les hypothèses suivantes :

Un problème de diffusion de la bactériocine dans la gélose.

L’agrégation des molécules de bactériocines entre elles.

L’hydrolyse des bactériocines par des protéases non spécifique.

Une faible concentration en bactériocines et suggèrent une augmentation du diamètre

des puits creusés pour augmenter le volume et donc la concentration de l’échantillon déposé.

Jensen et al. (2009) ont fait une étude comparative de l’activité antimicrobienne des

souches de Lactobacillus helveticus en utilisant trois méthodes différentes (Fleming et al.,

1975, la méthode de diffusion en puits et la méthode des stries croisées) et ils ont démontré

l’impact de ces dernières sur l’effet inhibiteur de la bactériocine produites par les souches

utilisées, en effet chaque souches a répondu différemment selon la méthode utilisée : par

exemple la souche Lactobacillus helveticus DGCC4439 inhibait toutes les souches

indicatrices (Lb casei, Lactococcus sp et Leuconostoc sp) en utilisant la méthode Fleming et

al. (1975) alors qu’elle inhibait beaucoup moins de souches par la méthode des stries croisées.

Le plus grand problème, auquel nous avons été confrontés, est la non reproductibilité

des résultats, pour cela nous avons décidé d’optimiser la composition du milieu de culture des

souches inhibitrices en nous basant plus particulièrement sur la littérature qui traite de

l’optimisation dans le cas de souches bactériocinogènes.


Page 53

3.3 Production et stabilité des agents inhibiteurs dans différents milieux

Dans notre travail, nous nous intéressons plus particulièrement à la production de

bactériocines, pour cela l’optimisation a été basée sur les paramètres qui augmentent la

production ou la stabilité de ces molécules.

L’effet inhibiteur dépend essentiellement de la concentration de l’agent antimicrobien

mais aussi de sa stabilité. Pour cela il nous est nécessaire de trouver le milieu le plus adéquat.

Faustino et al. (2005) ont démontré que l’ajout de 25% de lait au milieu de culture

augmente la production de bactériocines. Le même résultat a été mis en évidence par

Benkeroum et al. (2000) en supplémentant le MRS avec 2,5% d’extrait de levure. Du milieu

tamponné a aussi été utilisé pour mieux visualiser les inhibitions dues à d’autres agents que

les acides organiques. Dans notre cas nous avons testé les deux ingrédients en réalisant les

combinaisons suivantes :

MRS + 2,5% d’extrait de levure : MRSY.

MRSY tamponné : MRSY Tp.

MRSY + 25 % de lait écrémé à 10%.

MRSY Tp + 25 % de lait écrémé à 10%.

L’effet de l’addition du lait à 25% dans du MRS supplémenté de 2,5% d’extrait de

levure sur la production de l’agent inhibiteur par les 24 souches est reporté dans le tableau 12

présenté en annexe 1.

Nous avons utilisé les souches CHM19 et H2.3 comme indicatrices. La CHM19 a été

retenue grâce aux résultats du test précédent et la H2.3 présente les qualités d’une indicatrice

standard, par l’étude de souches bactériocinogènes, au sein de notre laboratoire.

La figure 11 montre quelques résultats observés :


Page 54

Figure 11 : L’effet de l’addition du lait dans le MRSY sur la production de l’agent inhibiteur

contre H2.3. Des surnageants de culture de souche LVK30 cultivée en, 1 : MRSY ; 2 : MRSY Tp ; 3 : MRSY+lait ;

4 : MRSY Tp+lait ;

Des surnageants de culture de souche LVK31 cultivée en, 5 : MRSY ; 6 : MRSY Tp ; 7 : MRSY+lait ;

8: MRSY Tp+lait ;

Des surnageants de culture de souche LVK32 cultivée en, 9 : MRSY ; 10 : MRSY Tp ; 11 : MRSY+lait ;

12 : MRSY Tp+lait;

(13-18) des surnageants de culture des souches sont cultivées en MRSY+lait, 13 : CHBK312 ; 14 : CHBK314 ;

15 : CHBK325; 16 : CHM9 ; 17 : CHM18; 18 : LVK11.

(19-24) des surnageants de culture des souches sont cultivées en MRSY Tp+lait, 19 : CHBK312 ;

20 : CHBK314 ; 21 : CHBK325 ; 22 : CHM9 ; 23 : CHM18; 24 : LVK11.

25 : puits vide.

D’après ces résultats, les remarques suivantes peuvent être faites :

Le milieu MRSY Tp additionné de lait a stimulé la production de l’agent inhibiteur

des souches CHBK310, CHM9 et CHM18, pour lesquelles nous avons enregistré des

diamètres des halos assez larges de 1,8 cm, 1,4 cm et 1.6 cm respectivement contre H2.3. Ces

mêmes souches ont donné de faibles halos d’inhibition contre l’indicatrice CHM19 (0,3, 0,6

et 0,6 cm respectivement), ce qui indique que parmi les deux indicatrices, la H2.3 est la plus

sensible.

L’effet des quatre milieux utilisés sur la production de l’agent inhibiteur chez les

autres souches n’est pas pertinent.

On note aussi que :

un halo d’inhibition de 0,8 cm est observé dans le cas des surnageants de culture des

souches CHBK309 et CHBK311 cultivées, respectivement, dans le MRSY Tp et le MRSY

additionné de lait et testées contre la H2.3. Cocolin et al. (2007) ont observé pour les deux

souches Enterococcus faecium M241 et M249, une production de bactériocines plus

importante, lorsqu’elles sont cultivées dans le lait que dans le MRS et expliquent que le lait

contient des éléments qui stimulent cette production.

Alors que l’addition de lait a permis d’observer des effets inhibiteurs plus grands et

plus stables, l’extrait de levure n’a montré qu’une légère amélioration dans le MRSY

4 3 2

1

8 7 6 5

9

10 11 12

16

15

14

13

20 19

18

17

24

21

22 23

25


Page 55

tamponné. Ce dernier résultat a été observé dans le cas de l’inhibitrice CHBK309 et est du

soit à l’effet tampon du milieu soit à l’augmentation de la production de l’agent inhibiteur.

L’effet du lait sur la production de la nisine par Lactococcus lactis ATCC11454 est

rapporté par Faustino Jozala et al. (2005) qui ont étudié l’effet de l’ajout du lait écrémé au

milieu MRS et M17 et ont démontré que l’ajout de 25% de lait dans ces milieux, donne une

production de bactériocine de 142527,94 contre 21,06 AU/ml et 6,98 AU/ml en milieu MRS

et M17 respectivement.

Chez les autres souches l’effet inhibiteur n’est pas stimulé par les quatre milieux

utilisés. Pour tous ces cas et pour les souches probablement bactériocinogènes, d’autres

optimisations et/ou conditions environnementales sont nécessaires, en effet certaines

conditions de stress stimulent la production de bactériocines. La présence d’éthanol et

d’oxygène stimulent la production de l’amylovorine L471 par Lactobacillus amylovorus

DCE471 (De Vuyst et al., 1996). D’autres chercheurs ont optimisé la production de

bactériocines chez Lactobacillus plantarum LPCO10, Lactobacillus pentosus B96 et

Lactobacillus plantarum KC21 en présence de 2,5 à 3%, 3,77% et 3% de NaCl,

respectivement (Leal-Sanchèz et al., 2002, Delgado et al., 2004, Lim, 2010).

Delgado et al. (2004) suggèrent dans leur étude que la production de bactériocines

dépend probablement des conditions environnementales durant lesquelles la fermentation

naturelle d’olive s’est déroulée et dans leur cas c’était la température et la concentration de

NaCl.

Dans d’autres cas, la production maximale de bactériocine requiert un milieu de

culture complexe, avec un pH et une température d’incubation bien maitrisés (Biswas et al.,

1991, Daba et al., 1993, Krier et al., 1998, Mataragas et al., 2003).

Les optimisations des milieux ou conditions de culture des bactéries inhibitrices

permettent d’amplifier les effets antimicrobiens et surtout de détecter plus facilement les

inhibitions dues à des bactériocines. Vus les résultats obtenus dans ces tests, nous pensons que

dans notre cas certaines inhibitions sont dues à la production de bactériocines, ceci pourra être

confirmé par la caractérisation des agents inhibiteurs.

3.4 Caractérisation des agents inhibiteurs

Les bactéries lactiques inhibent d’autres bactéries principalement, par production des

acides organiques, ou de peroxyde d’hydrogène qui s’avère toxique pour les bactéries ne

possédant pas d’activité catalasique, ou encore par production de bactériocines.


Page 56

Pour le test de mise en évidence des inhibitions dues aux acides organiques, la

méthode de Fleming et al. (1975) a été utilisée. Dans le cas des inhibitions dues aux peroxyde

d’hydrogène ou aux bactériocines c’est la méthode de Schillinger et Lücke (1989).

3.4.1 Les inhibitions dues à la production d’acides organiques

Les acides organiques ont une grande aptitude à inhiber les microorganismes surtout

ceux qui sont sensibles aux pH bas.

Pour la mise en évidence des inhibitions par production d’acides organiques, nous

avons retenu comme souche indicatrice la CHM19 pour toutes les souches inhibitrices testées.

Nous avons réalisé ce test en utilisant la méthode de Fleming et al. (1975). Ainsi des

cultures de bactéries tests ont été ensemencées en touches sur une surface de MRS solide non

tamponné d’une part, et d’autre part sur une surface de MRS solide tamponné. Après une pré-

incubation à 30°C pendant 20h, des géloses molles en surfusion, non tamponnées et

tamponnées ont été ensemencées par l’indicatrice CHM19 et coulées à la surface des boîtes

pré-incubées. Après incubation à 30°C pendant 24h, les diamètres des halos d’inhibition ont

été mesurés.

Les résultats obtenus sont montrés dans la figure 12 et récapitulés dans le tableau 13.


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Figure 12 : L’effet du milieu non tamponné et tamponné sur l’effet inhibiteur des

leuconostocs et des lactobacilles. 1 : CHBK310, 2 : CHBK311, 3 : CHBK312, 4 : CHBK314, 5 : CHBK315, 6 : CHBK316, 7: CHBK318,

8 : CHBK320, 9 : CHBK323, 10 : CHBK325, 11 : CHBK326, 12 : CHBK327, 13 : CHM9, 14 : CHM18, 15 :

CHM19, 16 : LVK11, 17 : LVK30, 18 : LVK31, 19 : LVK32, 20 : CHTD27, 21: CHTD29, 22 : BH14

13 14 15

18 17 16

21 20

19

19

22

nTp Tp

4

2

8

7

6

5

11 10

9

12

3

1

4

2

8 7

6 5

11 10

9

12

3

1

13 14 15

18 17 16

21 20

19 19

22


Page 58

Tableau 13 : Les inhibitions dues à la production d’acides organiques.

souches CHM19

gélose non tamponnée gélose tamponnée

CHBK310 0,85 0,65

CHBK311 0,9 0,7

CHBK312 0,95 0,8

CHBK314 1,1 0,75

CHBK315 1,1 0,75

CHBK316 0,8 0,75

CHBK318 0,75 0,7

CHBK320 1,2 ND

CHBK323 1,0 ND

CHBK325 0,8 0,75

CHBK326 0,95 0,8

CHBK327 0,9 0,8

CHM9 0,9 0,9

CHM18 0,9 0,9

CHM19 0,6 0,6

LVK11 0,9 0,9

LVK30 0,85 0,9

LVK31 0,8 0,8

LVK32 0,8 0,6

CHTD27 0,9 0

CHTD29 0,6 0,6

BH14 1,9 1,3 Les diamètres des halos d’inhibitions sont mentionnés en cm. ND : non déterminée

Les observations suivantes ont été faites :

Pour les interactions qui ont gardé le même effet inhibiteur en conditions tamponnées et

non tamponnées, on peut dire qu’il ne s’agit pas d’inhibitions dues aux acides organiques,

mais fort probablement au peroxyde d’hydrogène ou à des bactériocines.

Toutes les interactions antagonistes ont gardé à peu près les mêmes diamètres des halos

d’inhibitions contre CHM19 dans les deux conditions, sauf dans le cas de deux souches, pour

lesquelles les halos d’inhibition ont changé de manière très significative:

La CHTD27 où l’inhibition en milieu tamponné est complètement absente, alors que

le halo de son pouvoir inhibiteur en milieu non tamponné était de 0,9 cm. L’agent inhibiteur

dans ce cas est très certainement un acide organique. Les lactobacilles sont connus pour leur

pouvoir acidifiant par rapport aux autres bactéries lactiques Stiles (1994).


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la souche BH14 dont le halo d’inhibition était de 1,9 cm en milieu non tamponné alors

qu’il est de 1,3 cm en milieu tamponné (une diminution de 0,6 cm). Dans ce cas, nous

pouvons dire que l’inhibition est partiellement due à la production d’acides organiques.

3.4.2 Inhibitions dues à la production de peroxyde d’hydrogène et de bactériocines

Nous avons retenu pour ce test seulement les souches dont l’effet inhibiteur en milieu

tamponné n’a pas du tout changé, mais aussi celles qui en même temps ont présenté un effet

inhibiteur assez grand en présence de lait (résultats présentés dans le chapitre§ 3.3)

Pour déterminer la nature chimique de l’agent inhibiteur, l’effet des enzymes

protéolytiques (pronase E, pepsine, trypsine) et de la catalase a été testé sur les surnageants de

culture des souches CHBK310, CHM9 et CHM18. Seule l’indicatrice H2.3 a été utilisée, étant

donné qu’elle est la plus sensible :

Le traitement des surnageants de culture avec la catalase permet de détecter les

inhibitions dues à la production de peroxyde d’hydrogène.

Le traitement des surnageants de culture avec les enzymes protéolytiques permet de

détecter les inhibitions dues à la production de bactériocines, sachant que ces dernières, étant

de nature protéique, peuvent présenter des profils de digestion différents.

Les résultats obtenus par ce test sont montrés dans la figure 13 et mentionnés dans le

tableau 14 :

Figure 13 : L’effet des enzymes protéolytiques et de la catalase sur l’activité des agents

inhibiteurs.

TRY : trypsine, PEP : pepsine, PRO : pronase E, CAT : catalase.

+TRY

CHBK310

+CAT

+TRY

+PEP

CHM18+

PEP

+CAT

CHM18

+TRY

CHM18+

PRO

+TRY

CHM9

+CAT

+PRO

+PEP

+PEP

+PRO


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Tableau 14 : Inhibitions dues au peroxyde d’hydrogène et aux bactériocines.

Souches

Les enzymes

CHBK310 CHM9 CHM18

Témoin 1,2 1,0 0,8

Trypsine 0,6 0 0

Pepsine 1,0 0,8 0,6

Pronase E 0 0 0

Catalase 1,1 1,0 0,8

Les diamètres des halos d’inhibitions sont exprimés en cm.

Le traitement des surnageants de culture avec la catalase n’a permis de lever aucune

inhibition. Donc aucune des trois inhibitrices n’inhibe la H2.3 par production de peroxyde

d’hydrogène

Les résultats obtenus par traitement aux enzymes protéolytiques sont les suivants :

L’agent inhibiteur produit par les trois souches testées est complètement inactivé par

l’action de la pronase E.

Une inactivation partielle de l’effet inhibiteur produit par la souche CHBK310 a été

obtenue par traitement à la trypsine, en présence de cette enzyme le halo a diminué de 0,4 cm.

La pepsine n’a levé que très faiblement l’effet inhibiteur des trois inhibitrices. ce

résultat est observé par certains auteurs, l’agent inhibiteur produit par des souches de

Lactococcus lactis subsp lactis est résistant à la pepsine, alors qu’il est sensible à la pronase

(Benkerroum et al., 2000).

Cocolin et al. (2007) ont observé que l’effet inhibiteur se maintient à 50% après

traitement à la pepsine, alors qu’il est aboli par l’action de la trypsine, la protéinase K, la

papaine et la chymotrypsine.

Ces résultats indiquent que l’agent inhibiteur produit par les souches CHM9, CHM18

et CHBK310 n’est pas le peroxyde d’hydrogène, mais est de nature protéique, il s’agit de

bactériocines. Ces bactériocines sont nommées : Bactériocine CHM9, Bactériocine CHM18 et

mésentéricine CHBK310.

L’inactivation de l’agent inhibiteur par les enzymes protéolytiques est observée par de

nombreux chercheurs qui ont démontré qu’il s’agit de bactériocines qui ont été dégradées par

ces enzymes (Klaenhammer, 1993, Floriano et al., 1998, Deraz et al., 2005, Kumar et al.,

2010).


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L’effet de l’agent inhibiteur produit par Lactococcus lactis subsp lactis B14 n’est pas

affecté par la trypsine, la chymotrypsine, alors qu’il est aboli par l’action de la pepsine, la

pronase E et la protéinase K (Ivanova et al., 2000). Dans le cas de la leucocine J produite par

Leuconostoc sp J2, la pepsine, la trypsine, la pronase E et la chymotrypsine ont affecté son

activité mais pas la catalase (Choi et al., 1999).

3.5 Optimisation de la production et/ou l’activité de la bactériocine produite par CHM9

Parmi les trois souches bactériocinogènes, la CHBK310 est écartée à cause de la non-

reproductibilité de son effet inhibiteur. Pour les deux autres et pour des raisons pratiques,

nous n’avons retenu que la souche CHM9

Les bactériocines possèdent des propriétés cationiques, amphiphiliques ou

hydrophobiques capable de se lier à la fois aux lipides et/ou aux protéines du lait, ce qui rend,

par exemple, la nisine difficile à extraire du lait (Rossano et al., 1998). Plusieurs chercheurs

ont rencontré cette contrainte, de séparer la nisine du lait.

Pour cela, une optimisation de production de bactériocine sans addition de lait au

milieu MRS, est favorisée. Ceci peut être réalisé en analysant l’effet de chaque élément de ce

milieu sur la croissance et la production de bactériocine par la souche CHM9 :

L’optimisation que nous avons réalisée touche principalement :

La composition du milieu MRS et notamment la source d’azote, la source de carbone

et la source de potassium.

La température d’incubation de la souche inhibitrice.

La diffusion de la bactériocine dans la gélose.

Dans les deux premiers cas, la croissance bactérienne a été mesurée.

Pour tous les tests nous avons utilisé la méthode de Schillinger et Lücke (1989)

3.5.1 Effet de la composition du MRS sur la croissance bactérienne et la production de

bactériocine

Effet de la source d’azote

Dans ce test, les cultures de la bactérie bactériocinogène ont été réalisées dans du MRS

dont la source d’azote a été modifiée. Les milieux MRS et MRSY Tp sont utilisés comme


Page 62

témoins. Dans chaque cas la croissance de la souche et son effet inhibiteur ont été évalués

après 24h et 48h.

Nous avons agit sur la composition de la source d’azote et sur sa concentration, elle est

de 2% dans tous les cas, le milieu MRS contient 2,5 % de source d’azote. Un aspect des

résultats obtenus est montré dans la figure 14.

Figure 14 : L’effet de différentes sources d’azote sur la production de la bactériocine CHM9

testée contre H2.3. Try : Tryptone EY : extrait de levure EV : extrait de viande 1 : 24h 2 : 48h

Le résultat de l’effet des différentes sources d’azote sur la croissance et la production

de bactériocine est montré dans le tableau 15 suivant :

Tableau 15 : Effet des différentes sources d’azote sur la croissance et la production de la bactériocine

par CHM9 :

Sources d’azote

24h d’incubation 48h d’incubation

DO Diamètres des

halos DO

Diamètres des

halos

MRS* 1,327 0,3 - -

MRSY Tp 1,627 0,8 3,000 0,7

Try (2%) 1,372 0,2 1,539 0,2

EY (2%) 1,573 0,2 2,039 0,25

EV (2%) 1,404 0,45 1,161 0,5

1% Try+1% EY 1,585 0,65 1,821 0,5

1% Try +1% EV 1,427 0,8 1,505 0,8

1% Try + 0,5% EY + 0,5% EV 1,539 1,0 1,689 1,0

La densité optique est mesurée à 600 nm. Les halos d’inhibition sont exprimés en cm.

Try : Tryptone. EY : extrait de levure. EV : extrait de viande. * : la DO de la souche mentionnée est une moyenne, le halo d’inhibition est observé exceptionnellement

pour quelques essais.

De l’ensemble des résultats obtenus on peut déduire les remarques suivantes :

2

1

MRSY Tp 1

Try 2 EV 1 2

EY 1 2

Try+EV 1

2

h

Try+EY

1 2

Try+EV

+EY

1

2


Page 63

Certaines sources d’azote agissent seulement sur la croissance de la souche

bactérienne alors que d’autres seulement sur la production de bactériocine.

Le milieu MRSY Tp permet une bonne croissance de la souche, mais cette biomasse

ne concorde pas avec une production maximale de bactériocine, par rapport aux autres

milieux modifiés. Dans le cas du MRS, Un halo de 0,3 cm est observé et la croissance est

faible (DO = 1,3). Par contre Biswas et al. (1991), ont constaté que la production de

bactériocine par Pediococcus acidilactici H, dans ce même milieu, est moins importante par

rapport aux autres milieux alors que la croissance est plus importante.

La croissance de la souche CHM9 dans un milieu contenant 2% de tryptone comme

seule source d’azote, a montré la croissance la plus faible au bout de 24 h (DO = 1,3), comme

celle observée en milieu MRS. Après 48h d’incubation, la DO de la biomasse a atteint 1,5, ce

qui indique que la phase de croissance se poursuit au-delà de 24h d’incubation. Concernant la

production de la bactériocine, elle est très faible ; en effet le halo d’inhibition est seulement de

0,2 cm.

La DO de la souche en milieu contenant 2% d’extrait de levure comme seule source

d’azote, est assez élevée après 24h, et continue d’augmenter pour atteindre une DO de 2 à 48h

d’incubation , alors que la production de bactériocine reste toujours faible. Des résultats

similaires ont été observés par plusieurs chercheurs qui ont indiqué que l’extrait de levure

permet une bonne croissance. Ce dernier résultat a été observé par De Vuyst et al (1996), en

cultivant Lactobacillus amylovorus DCE 471 dans un MRS contenant 4,4% d’extrait de

levure, alors que la production de bactériocine n’était pas optimale. Mollendorff et al. (2009)

ont indiqué aussi une bonne croissance en présence d’extrait de levure des souches de

Lactobacillus JW3BZ, JW6BZ, JW11BZ et JW15BZ. Lim (2010) a obtenu une croissance

optimale et une production maximale de la bactériocine (12800 AU/ml) synthétisée par

Lactobacillus plantarum KC21 en présence de 0,5% d’extrait de levure. Cette source contient

plus de facteurs de croissance, tels que des vitamines, des acides aminés libres et de petits

peptides (constitués de 2 ou 3 acides aminés) que d’hydrolysats de protéines (Aasen et al.,

2000), ce qui favorise une bonne croissance des bactéries exigeantes telles les bactéries

lactiques. Par contre, Mataragas et al. (2003) n’ont observé aucune influence de l’extrait de

levure de 10 à 15g/l sur la croissance, ni sur la production de bactériocine par Lactobacillus

curvatus L442.

L’extrait de viande employé comme seule source d’azote en milieu MRS, ne

permet pas une bonne croissance (DO de 1,4) après 24h, cette dernière diminue après 48h


Page 64

d’incubation (DO de 1,1). Concernant la production de bactériocine, elle est peu augmentée

(0,5) par rapport aux cas où l’extrait de levure (0,25 cm) ou la tryptone (0,2 cm) sont

employés séparément.

La combinaison de Try+EY (1%+1%) donne une bonne croissance (DO de 1,5)

après 24h et augmente à 1,8 après 48 h d’incubation, avec une production plus importante

(0,65 cm) par rapport à l’emploi de ces 2 sources séparément.

La combinaison Try+EV (1%+1%) donne une croissance (DO de 1,4) plus basse

que la combinaison Try+EY (DO de 1,5). A l’inverse la production de bactériocine, est plus

importante en présence de Try+EV (halo d’inhibition de 0,8 cm) qu’en présence de Try + EY

(halo de 0,65 cm). Cette production est égale à celle obtenue en milieu MRSY Tp.

Enfin la combinaison Try+EY+EV (1%+0,5%+0,5%) donne une bonne croissance de

la souche et une production plus intéressante que les autres milieux. Todorov et Dicks (2005c)

ont obtenu des productions maximales de bactériocines, synthétisées par ST26MS et ST28MS

avec respectivement 12800 AU/ml et 6400 AU/ml, en présence de 2% de Tryptone et de la

combinaison 1%Try+0,5%EY+0,5%EV, alors qu’en milieu MRS la production est de

6500AU/ml. Par ailleurs, Pal et al. (2010) et Todorov et Dicks (2005a) ont indiqué, en

comparaison avec les autres sources d’azote utilisées dans leurs études, que la tryptone à 2%

est la meilleure source d’azote, pour la production de bactériocine par Weissella

paramesenteroides DFR-8 et la ST33LD produite par Lenconostoc mesenteroïdes subsp

mesenteroïdes (12800 AU/ml). Todorov, (2008) a observé une production maximale de

bactériocine produite par Lactobacillus plantarum AMA-K en présence de 2% de tryptone,

1,5%Try+0,5% EY et 1%Try+0,5%EY+0,5%EV, mais il a conclu que la tryptone est la

source d’azote « clé » pour une production maximale de bactériocine. Nous pouvons conclure

que chaque souche peut répondre différemment vis-à-vis d’une source d’azote quelconque

pour sa croissance et la production de sa bactériocine, c’est ce qu’on appelle «l’effet souche

».

Par conséquent, pour le test de l’effet de la source de carbone sur la croissance et la

production de bactériocine, nous avons retenu la combinaison de source d’azote qui a donné

la production maximale de bactériocine qui est 1%Try+0,5%EY+0,5%EV.

Effet de la source de carbone

Le glucose est un constituant du milieu MRS, ce sucre simple semble être le plus

utilisé par les bactéries lactiques pour leur croissance. Pour analyser l’effet de la source de

carbone, nous avons remplacé le glucose par différents sucres : le saccharose, le maltose, le


Page 65

lactose et le glycerol, le témoin étant le milieu MRS modifié de l’étape précédente avec

glucose. 2% de glucose sont remplacés par 2% de chacun des sucres.

L’effet de la source de carbone sur la croissance de la souche CHM9 et la production

de bactériocine par cette souche, après 24h et 48h d’incubation est montré dans les figures 15,

16a et 16b ci-dessous :

Figure 15 : L’effet des différentes sources de carbone sur la production de la

bactériocine CHM9. GLU : glucose, LAC : lactose, Gly : glycerol, SAC : saccharose, MAL : maltose.

Figure 16 : L’effet des différentes sources de carbone sur la croissance et la production de

bactériocine par CHM9.

* : la DO de la souche mentionnée est une moyenne, le halo d’inhibition est observé exceptionnellement


Comme pour la source d’azote, une bonne croissance ne reflète pas forcément une

bonne production de bactériocine.

Et les remarques suivantes peuvent être faites :

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Glucose Saccharose Maltose Lactose Glycerol MRS*

La DO (600nm)

Diamètre du halo d'inhibition (cm)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Glucose Saccharose Maltose Lactose Glycerol

La DO (600 nm)


b: après 48 h d’incubation a: après 24 h d’incubation

GLU

LAC

MRSY Tp

+lait

MAL

GLY

SAC

Try+EV

+EY

48h 24h


Page 66

La croissance dans les milieux contenant le glucose, le maltose et le lactose est

optimale par rapport aux milieux contenants le saccharose ou le glycérol, comme seule source

de carbone. La production de bactériocine est la plus importante en milieu contenant 2% de

glucose comme seule source de carbone, ceci est reflété par le diamètre du halo d’inhibition

qui est de 1,0 cm. Ce résultat est constaté par plusieurs chercheurs toujours en présence de

20g/l de glucose. En effet, Mataragas et al., 2003 ont observé, une production maximale de

bactériocines produites par Leuconostoc mesenteroides L124 et Lactobacillus curvatus L442.

Ce même résultat a été observé par Pal et al. (2010) dans le cas de Weissella

paramesenteroides DFR-8.

En milieu contenant le saccharose comme seule source de carbone, la production de la

bactériocine par la souche CHM9 est intéressante, après 48 h d’incubation avec un halo de 0,9

cm, un halo de 0,6 cm est noté après 24h d’incubation dans ce milieu.

Le lactose diminue la production de bactériocine de 20% par rapport au glucose, alors

que la croissance est plus importante dans ce milieu après 24h d’incubation (DO de 1,6), mais

elle diminue brusquement après 48h d’incubation (DO de 1,1), ceci est peut être du à la

diminution importante du pH du milieu avec la production importante d’acides en utilisant ce

substrat.

L’emploi de glycerol dans le milieu MRS modifié en source d’azote ne permet pas ni

une bonne croissance de la souche, ni une bonne production de la bactériocine (faible halo

d’inhibition de 0,4 cm). Ce même résultat a été observé par Todorov (2008) qui a noté une

diminution de la production de la bactériocine AMA-K synthétisée par Lactobacillus

plantarum AMA-K en présence de 2% de glycerol.

Ces résultats contredisent ceux observés par Todorov et Dicks (2005a) pour lequel

l’emploi de 2% de glucose ou de lactose, diminue la production de bactériocine de 6400

AU/ml par rapport à l’emploi de 2% de maltose qui donne une production maximale de la

bactériocine ST33LD (12800 AU/ml). Dans une autre étude l’emploi de 5 à 10 g/l de

saccharose augmente la synthèse de la bactériocine ST311LD produite par Enterococcus

faecium ST311LD (Todorov et Dicks, 2005b).

Todorov (2008), a constaté une production de 12800 AU/ml dans le MRS contenant

2% de glucose (20 g/l) ou de maltose, et cette production a été doublée en présence de 30 g/l,

alors que l’emploi de lactose comme seule source de carbone dans le milieu, réduit de 75%

(1600 AU/ml) la production de bactériocine par Lactobacillus plantarum AMA-K. Ces


Page 67

résultats sont surprenants d’autant plus que cette souche était isolée à partir du lait fermenté

et prouvent que la production de bactériocine dépend de la combinaison de plusieurs facteurs.

Lim (2010) obtient un maximum de production de bactériocine par Lactobacillus

plantarum KC21 mais en présence de 1,5% de glucose ou 1% de lactose (12800 AU/ml),

alors que 2% de glucose et 2% de lactose, diminuent la production de cette bactériocine à

3200 AU/ml et 2% de maltose diminue la production à 400 AU/ml.

En conclusion, nous pouvons dire que le glucose à 2% constitue la meilleure source de

carbone.

Effet de la source de potassium

L’effet de la source de potassium sur la production de bactériocine a été étudié par

plusieurs auteurs (De Vuyst et Vandamme, 1993 ; Todorov et Dicks, 2005 ; Mollendorff et

al., 2009 ; Lim, 2010).

Le MRS contient 2g/l de K2HPO4, cette concentration indique que les lactobacilles

ont besoin de cette source pour leur développement. Pour l’étude de l’effet de la source de

potassium sur la production de bactériocine, nous nous sommes basés sur les travaux de

Mollendorff et al. (2009).

Pour cela, les 0,2% de K2HPO4 du milieu MRS modifié obtenu des étapes précédentes

ont été substitués par :

1% de K2HPO4,

2% de K2HPO4,

2% de KH2PO4

1% K2HPO4 + 1% KH2PO4.

Tous ces milieux en plus du témoin, qui contient 0,2% de K2HPO4 ont été ensemencés à 5%

d’inoculum de la souche CHM9.

La figure 17 montre le résultat obtenu :


Page 68

Figure 17 : L’effet des différentes sources de potassium sur la production de la bactériocine

CHM9 contre H2.3.

1 : 0,2%K2HPO4. 2 : 1% K2HPO4. 3 : 2% K2HPO4. 4 : 2% KH2PO4. 5 : 1%K2HPO4+1% KH2PO4.

Le résultat de l’effet de la source de potassium sur la croissance et la production de la

bactériocine CHM9 après 24h et 48h d’incubation est montré dans les figures 18.a et 18.b

Figure 18 : L’effet de la source de potassium sur la croissance et la production de la

bactériocine CHM9.

(1) : 0,2%K2HPO4. (2) : 1% K2HPO4. (3) : 2% K2HPO4. (4) : 2% KH2PO4. (5) : 1%K2HPO4+1% KH2PO4. *: la DO de la souche mentionnée est une moyenne, le halo d’inhibition est observé exceptionnellement


Nous pouvons faire les remarques suivantes :

La croissance de la souche CHM9 est la plus importante en milieu contenant 2% de

K2HPO4 (DO de 1,9). Une DO de 1,8 est enregistrée dans les milieux contenant 1% de

K2HPO4 et 1% de K2HPO4 + 1% de KH2PO4, alors qu’elle est la plus faible en présence de

2% de KH2PO4 (1,6). Une DO de 1,7 est obtenue dans le milieu contenant 0,2% de K2HPO4.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0

0,5

1

1,5

2

2,5

(1) (2) (3) (4) (5) MRS*

La DO (600 nm)


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0

0,5

1

1,5

2

2,5

(1) (2) (3) (4) (5)

La DO (600 nm)


a : après 24h d’incubation b : après 48h d’incubation

1

2

GLU

5

3

4

Try+EV

+EY

48h 24h


Page 69

Concernant la production de bactériocine :

Les milieux contenant 1% et 2% de K2HPO4 comme source de potassium permettent

une production maximale de la bactériocine, ceci est reflété par le diamètre du halo

d’inhibition qui est de 1,2 cm par rapport à 1,0 cm obtenu dans le milieu contenant 0,2% de

K2HPO4. Ce résultat peut être du au pH du milieu, puisque le K2HPO4 est une base qui permet

de tamponner le milieu à la neutralité. Kim-Hi (2005) a observé que la production de la

micrococcine GO5 par Micrococcus sp GO5 est huit fois plus importante dans un milieu

contenant 2 à 2,5% de K2HPO4 que dans un milieu contenant 0,2% de K2HPO4.

Cependant le milieu contenant 2% de KH2PO4 comme seule source de potassium n’a

pas permis une production de bactériocine (halo de 0 cm), car le KH2PO4 est un acide et peut

diminuer fortement le pH du milieu ce qui peut provoquer une répression de la production de

bactériocine. Ce résultat ne concorde pas avec les travaux de De Vuyst et Vandamme (1993),

qui ont constaté une production maximale de la nisine produite par Lactococcus lactis subsp

lactis NIZO22186 dans un milieu contenant jusqu’à 5% de KH2PO4 comme seule source de

phosphore. Ces auteurs indiquent que cette source crée des conditions de pH favorables pour

la production de cette bactériocine, mais à 6% de KH2PO4, aucune production n’est observée,

expliquant que cette concentration de KH2PO4 a provoqué une lyse cellulaire.

A ce stade, un milieu que l’on nommera MRSm est constitué. Il s’agit du milieu MRS

dont la source d’azote et la source de potassium sont modifiées. Ces sources sont modifiées

comme suit : 1% Try+0,5% EY+0,5%EV (comme source d’azote) et 2% de K2HPO4 (comme

source de potassium). La source de carbone n’est pas modifiée (2% de glucose).

Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la température d’incubation

de la souche bactériocinogène (pour une production maximale) ainsi qu’aux conditions de

diffusion dans la gélose (pour une quantification meilleure).

3.5.2 Effet de la température d’incubation

La température d’incubation est un paramètre qui doit être maîtrisé pour la croissance

et la production de la bactériocine. Ce paramètre a fait l’objet de plusieurs études, qui ont

montré que la température de production des bactériocines est souvent inférieure à la

température optimale de croissance (Krier et al., 1998). Dans notre cas, nous avons testé les

températures (25, 35,40 et 45°C). La culture témoin a été réalisée à 30°C. Les cultures ont été

réalisées, pendant 24h et 48h, dans le milieu MRSm par ensemencement avec 5% d’inoculum

de la souche CHM9.


Page 70

L’effet de la température d’incubation sur la croissance de la souche CHM9 et la production

de sa bactériocine après 24h et 48h d’incubation est montré dans les figures 19, 20a et 20b :

Figure 19 : L’effet de la température d’incubation sur la production de la bactériocine CHM9.

Figure 20 : Effet de la température d’incubation sur la croissance bactérienne et la production

de bactériocine par CHM9.

D’après ces résultats, les remarques suivantes peuvent être faites :

La croissance de la souche CHM9 est quasi identique pour toutes les températures

d’incubation (DO de 1,5 à 1,6).

La production de la bactériocine semble être identique aux températures 25, 30, 35 et

40°C, en effet des halos d’inhibition de 1,2 à 1,3 sont observés. Cependant, nous notons à la

température 25°C après incubation de 24h ou 48h, que l’effet inhibiteur est à son maximum

(1,3 cm). Certaines bactériocines répondent différemment à ces mêmes températures, exemple

celle décrite par Lim (2010) et produite par Lactobacillus plantarum KC21 qui ne montre

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

25°C 30°C (T) 35°C 40°C 45°C

La DO (600nm)


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

25°C 30°C (T) 35°C 40°C 45°C

la DO (600nm)


25°C

30°C

2% K2HPO4

45°C

35°C

40°C

GLU

a : après 24h d’incubation b : après 48h d’incubation

48h 24h


Page 71

aucune activité à la température d’incubation 25°C contre Staphylococcus aureus ATCC6538,

mais qui est très active à 30°C,

Par contre la croissance de la souche bactériocinogène à 45°C, entraîne une

diminution de l’effet inhibiteur de 77%.

Ce résultat a été observé par plusieurs chercheurs étudiants l’effet de la température

d’incubation sur la production de bactériocines. en effet Lim (2010) n’a détecté aucune

activité de la bactériocine produite par Lactobacillus plantarum KC21 à 45°C d’incubation.

Pour expliquer ce phénomène Messens et al., 2003 ont suggéré qu’à une température

d’incubation élevée, des protéases sont activées en réponse au stress thermique. Aussi, Juarez

Tomas et al. (2002), ont supposé qu’à des températures supérieures à 44°C, les cellules de

Lactobacillus salivarius CRL1328 ont été incapables de synthétiser ou sécréter des

bactériocines alors que la croissance n’est pas affectée par cette température.

2.5.3 L’effet du pH sur la diffusion de la bactériocine CHM9

Plusieurs auteurs étudient les facteurs intrinsèques du milieu (ou de l’aliment)

influençant l’efficacité de la diffusion de la bactériocine, surtout si elle fait l’objet d’une

application agro-alimentaire. Blom et al. (1997), ont analysé plusieurs facteurs, parmi eux, le

pH du milieu, et ils ont démontré qu’il peut influencer la diffusion de la bactériocine. D’autres

chercheurs lient la diffusion de la bactériocine aux agents tampons du milieu. En effet le

glycéro-phosphate contenu dans le milieu M17, interfère avec les zones d’inhibition causées

par l’agent inhibiteur produit par Pediococcus acidilactici PO2, en comparaison avec d’autres

agents tampons (Hoover et al., 1989).

Dans ce test, nous voulons étudier l’effet du pH neutre de la gélose molle et de la

gélose dure sur la diffusion des bactériocines produites par les souches CHM9, CHM18 et

CHBK310. Ce test a été réalisé selon la méthode de Schillinger et Lücke (1989). Nous avons

cultivé les souches inhibitrices dans différents milieux testés pour l’optimisation et qui sont

les suivants :

☞ MRS, MRS tp, MRSTP+lait.

☞ MRSY + lait, MRSY TP + lait.

☞ 0,2% K2HPO4, 1% K2HPO4, 2% K2HPO4.

☞ 1% K2HPO4 + 1% KH2PO4.

Les figures 21a et 21b suivantes montrent quelques résultats observés :


Page 72

Figures 21 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine.

4 : surnageant de CHM9 issu de MRS+lait. 5 : surnageant de CHM18 issu de MRSY+lait.

10 : surnageant de CHM9 issu de MRSY Tp+lait. 11 : surnageant de CHM18 issu de MRSY Tp+lait.

Tableau 16 : L’effet du pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine produite par les

souches CHM9, CHM18 et CHBK310

Les

souches Les milieux de culture

H2.3

Gélose Non TP Gélose TP

CHM9

MRSY + lait 1,2 1,4

MRSY Tp + lait 1,0 1,2

0,2% K2HPO4 0,8 1,0

1% K2HPO4 1,0 1,2

2% K2HPO4 1,0 1,2

1% K2HPO4+1%KH2PO4 0,8 1,0

CHM18 MRSY + lait 1,2 1,2

MRSY Tp + lait 1,2 1,2

CHBK310

MRS 0,6 0,8

MRS Tp 0,6 0,8

MRS Tp + lait 1,6 1,8

Les diamètres sont mentionnés en cm.

Tp

a : gélose

non

tamponnée

b : gélose

tamponnée

4

4

5

5

11

11

10

10

4 3 2

1

8 7 6 5

9 10 11

nTp

4 3 2

1

8 7 6 5

9 10 11


Page 73

Pour chaque milieu de culture de la souche bactériocinogène nous avons étudié la

diffusion en conditions tamponnées et non tamponnées. Dans ce cas les géloses dure ou molle

sont tamponnées ou non tamponnées simultanément.

Dans la plupart des cas nous avons observé une légère augmentation des halos

d’inhibition en conditions tamponnées par rapport à celles non tamponnées. L’augmentation

des halos d’inhibition a été observée quelque soit le milieu de culture de la souche

bactériocinogène.

Dans un deuxième temps, nous avons réalisé un autre essai de diffusion dans

différentes conditions, à savoir :

☞ gélose solide nTp / gélose molle nTp.

☞ Gélose solide nTp / gélose molle Tp.

☞ Gélose solide Tp / gélose molle nTp.

☞ Gélose solide Tp / gélose molle Tp.

Ce test a été réalisé avec des surnageants obtenus après culture de la souche bactériocinogène

CHM9 dans des milieux contenant différentes sources de carbone ou d’azote.

Le tableau 17 et les figures 22a, b, c et d suivants montrent les résultats obtenus :


Page 74

Figure 22 : L’effet de pH de la gélose sur la diffusion de la bactériocine produire par CHM9.

a : gélose molle nTp/gélose solide nTp. b : gélose molle nTp/gélose solide Tp.

c : gélose molle Tp/gélose solide nTp. d : gélose molle Tp/gélose solide Tp.

1 : surnageant de culture de 24h, 2 : surnageant de culture de 48h,

T1 : surnageant de la souche cultivé dans MRS dont la source d’azote est (Try+EV+EY),

T2 : surnageant de culture de la souche cultivée dans MRSY Tp+lait. v : puit vide

Tableau 17 : L’effet du pH du milieu sur la diffusion de la bactériocine produite par CHM9

échantillon Solide nTp/

molle nTp

Solide nTp/

molle Tp

Solide Tp/

molle nTp

Solide Tp/

molle Tp

Glu 24h 0,1 0,1 1,0

Synergie des

halos

48h 0,3 0,2 1,0

Lac 24h 0,1 0,4 0,8

48h 0,2 0,4 0,8

Gly 24h 0,1 0,4 1,2

48h 0,1 0,4 1,2

Sac 24h 0,1 0,1 0,8 1,4

48h 0,1 0 0,8 Synergie des

halos Mal

24h 0 0,1 0,6

48h 0 0,1 0,8 1,4

Try+EY+EV 24h 0,1 0,2 0,8 Synergie des

halos MRSY+lait 24h 0,4 0,2 0,5 Les diamètres sont mentionnés en cm.


Tp/

Tp

2 1

GLU

LAC

MAL

GLY 1

SAC

2 T1

2 1

1

1

2

T2

d

2

T2

Tp/

nTp

2 1

GLU

LAC

MAL

GLY 1

SAC

2

T1

2 1

1

1

2

2

c

2

nTp/

nTp

1

GLU

LAC

T2

MAL

GLY 1

SAC 2

T1

2

1 2

1

1

2

a

2

nTp/

Tp

1

GLU

LAC

T2

MAL

GLY 1

SAC 2

T1

2

1

1

1 2

2

b

v

v

v


Page 75

La réalisation de la méthode de Schillinger et lücke (1989) avec une gélose solide

tamponnée permet une bonne diffusion. Ce même résultat a été observé dans le cas de la

piscicoline, pour laquelle Blom et al. (1999) ont remarqué une meilleure diffusion dans un

milieu de pH 7.

A l’inverse dans le cas de la gélose solide et molle non tamponnées, on remarque des

diamètres très faibles, ne dépassant pas 0,4 cm.

La diffusion est maximale dans le cas, où la gélose solide et molle, sont tamponnées,

on observe une très grande augmentation des halos d’inhibition dans ces conditions. Comme

dans le cas du surnageant de la culture, réalisée en MRS contenant le saccharose comme

source de carbone, qui inhibe la H2.3 avec un halo de 0,1 cm dans un milieu où la gélose

solide et molle sont non tamponnées. Un halo de 0,8 cm est enregistré dans un milieu dont la

gélose solide est tamponné et la gélose molle est non tamponnée alors qu’il atteint 1,4 cm

dans un milieu dont la gélose solide et molle sont tamponnées.

La diffusion maximale de la bactériocine, comme rapporté par Hoover et al. (1989),

dépend de l’agent tampon qui interfère avec les zones d’inhibition, dans leur cas il s’agissait

du glycero-phosphate contenu dans le milieu M17. Dans notre tampon, les sels de KH2PO4 et

Na2HPO4 sont utilisés, en effet Wolf et Gibbons (1996) ont remarqué une meilleure détection

de la nisine Z par la méthode de diffusion sur gélose en diminuant la quantité d’agar et en y

incorporant le phosphate de sodium (Na2HPO4).

Dans d’autres cas, Blom et al. (1997) notent que le pH peut provoquer une ionisation

de la matrice agar, ce qui entraine une répression de la diffusion, en effet pour une gélose à

pH 7, ils enregistrent des surfaces de diffusion faible dans le cas de la nisine et de la

pediocinePA-1.

3.6 Production de la bactériocine CHM9 en présence de lait

Dans le but, de savoir si l’ajout de lait dans le milieu de culture de la souche

inhibitrice, donne une meilleure production de la bactériocine. Nous avons testé l’effet des

milieux MRS, MRSY et MRSm dans des conditions tamponnées ou non tamponnées en

présence ou en absence de lait. Le résultat obtenu est montré dans la figure 23 et le tableau 18

suivants :


Page 76

Figure 23 : L’effet de la présence du lait dans trois milieux différents (MRS, MRSY et

MRSm) sur la production de la bactériocine CHM9. Les surnageant de culture de la CHM9 cultivée en :

1 : MRS. 2 : MRS Tp. 3 : MRS+lait. 4 : MRS Tp+lait. 5 : MRSY. 6 : MRSY Tp. 7 : MRSY+lait.

8 : MRSY Tp+lait. 9 : MRSm. 10 : MRSm Tp. 11 : MRSm+lait. 12 : MRSm Tp+lait.

Tableau 18 : L’effet de différentes conditions sur la production de bactériocine chez CHM9

Les milieux de

culture

Les conditions des

milieux

Diamètres des halos

d’inhibition

MRS

nTp 0,2

Tp 1,0

nTp+lait 0,3

Tp+lait 0,9

MRSY

nTp 0,9

Tp 0,8

nTp+lait 0,35

Tp+lait 1,0

MRSm

nTp 0,7

Tp 1,3

nTp+lait 0,8

Tp+lait 1,3

Les diamètres des zones d’inhibition sont mentionnés en cm

D’après les résultats obtenus, les remarques suivantes peuvent être faites :

Le milieu MRSm permet une meilleure production de bactériocine par rapport aux

milieux MRS et MRSY, surtout lorsqu’il est tamponné et/ou supplémenté en lait.

Le milieu MRS tamponné, supplémenté ou non en lait, donne une bonne production.

Les milieux MRSY donnent une production intéressante sauf dans le cas du MRSY

non tamponné et supplémenté en lait où le halo d’inhibition est de seulement (0,35

cm).

4 3

2

1

8 7 6 5

9 10 11

12


Page 77

Pour ces tests, nous pouvons conclure que les milieux tamponnés donnent une bonne

production de bactériocine. Ceci est distingué surtout dans le cas du MRS et MRSm. Cette

même observation a été faite par Mandal et al. (2008) qui ont constaté, une production de

bactériocine maximale dans le milieu TGE+Tween 80 tamponné à pH 6,8 (citrate de sodium,

acetate de sodium et phosphate dipotassique, chaque élément est à 0,2%).

Zaoui (2011), a observé que le surnageant de la souche Enterococcus faecalis BO2 a

montré une activité inhibitrice très importante, lorsque la souche est cultivée en milieu M17

Tp+lait

Pour la réalisation des tests suivants, nous avons retenu le milieu MRSm tamponné.

3.8 Propriétés physico-chimique de la bactériocine

La plupart des auteurs s’intéressent à l’étude de la stabilité de l’activité de la

bactériocine, à différents pH acides et basiques ainsi qu’aux températures élevées.

Ces études permettent d’une part de caractériser la bactériocine pour une utilisation en

industrie agro-alimentaire, et d’autres part de la classer en fonction de son degrés de

résistance aux traitements thermiques.

L’effet du pH

Dans ce cas les pH des surnageants de culture sont divisés en deux lots. Pour un lot le

pH est ajusté à la valeur désirée puis ramené à pH 7 (R). Pour le deuxième lot le pH est ajusté

à la valeur désirée et maintenu à cette même valeur (Nr).

L’effet du pH acide ou basique sur l’activité de la bactériocine CHM9 est montré dans

la figure 24 et le tableau 19 suivants :

Figure 24 : L’effet des pH acides ou basiques sur l’activité de la bactériocine CHM9 contre

H2.3. Nr : Non réajusté, R : réajusté.

R4

R2 Nr2 T

Nr12

Nr6

Nr4 Nr9

R9 Nr7 Nr7 R12

R6

Nr8 R8


Page 78

Tableau 19 : L’effet du pH sur l’activité de la bactériocine CHM9.

pH du milieu Etat du milieu Diamètre du halo l’inhibition

Témoin (pH>6) 1,2

pH=2 Non réajusté 1,2

réajusté 1,4


réajusté 1,2


réajusté 1,4


réajusté 0,2*


Réajusté 1,2

pH=12 Non réajusté 0

Réajusté 0.2*

Les diamètres des zones d’inhibition sont mentionnés en cm. * halos trouble.

D’après ce qui est indiqué dans le tableau, on peut faire les remarques suivantes :

De manière générale l’activité de la bactériocine CHM9 n’est pas affectée par les pH

qu’ils soient acides ou basiques. Ceci est observé par plusieurs chercheurs, Todorov et Dicks

(2004), Kwaadsteniet et al. (2005) et Ozlem (2005) qui ont respectivement remarqué que

l’activité de la mesentericine ST99, la bactériocine ST15 et la leucocine OZ ne sont pas

affectées par des pH allant de 2 à 12. Ghrairi et al.(2008) ont indiqué la stabilité de l’activité

de la bactériocine produite par Enterococcus faecium MMT21 aux pH compris entre 2 et 10.

Néanmoins, on remarque une absence d’inhibition pour l’échantillon de pH8 non

réajusté et les échantillons de pH 12 réajusté et non réajusté, ceci est dû à une dilution lors de

l’ajout du NaOH ou du HCl pour l’ajustement ou le réajustement.

Dans le cas de la bactériocine produite par Enterococcus faecium NIAI 157, Ohmomo

et al. (1999) ont remarqué qu’au-delà du pH7, l’activité de cette bactériocine diminue. Alors

que l’entérocine F-420 est stable à des pH allant de 4 à 8. Les pH acides ou basiques affectent

légèrement l’activité de la sakacine C2 alors que le pH 6 permet de maintenir totalement

l’activité de cette bactériocine (Gao et al., 2010).

Ces résultats rejoignent ceux observés par Benmouna (2008) et Kout (2011), qui ont

observé que l’activité inhibitrice des bactériocines n’est pas affectée par les pH acides ou

basiques.


Page 79

L’effet de la température

Dans le but d’analyser l’effet de la chaleur sur l’activité de la bactériocine produite

par CHM9, Les surnageants de culture ont été soumis à différents traitement thermiques, à

savoir 60, 80 ou 100°C pendant 10,15 ou 20 min et 120°C pendant 20 min (autoclavage).

Puis, ils ont été testés par la méthode de schillinger et Lücke (1989) avec comme témoin un

surnagent qui n’a pas été traité.

Le résultat obtenu est montré dans la figure 25 suivante :

Figure 25 : L’effet de différentes températures sur l’activité de la bactériocine CHM9 contre

H2.3.

L’effet de différentes températures sur l’activité de la bactériocine CHM9 est indiqué

dans le tableau 20:

Tableau 20 : L’effet des températures sur l’activité de la bactériocine CHM9

Températures Durée

d’incubation

Diamètre du halo

d’inhibition

Surnageant natif 1,4

60°C

10 min 1,2

15 min 1,4

20 min 1,2

80°C

10 min 1,4

15 min 1,4

20 min 1,4

100°C

10 min 1,4

15 min 1,2

20 min 1,2

120°C 20 min 0,8 Les diamètres des zones d’inhibition sont mentionnés en cm.

15min

80°C

60°C

T

20min

10min

100°C

120°C

20 min


Page 80

On peut faire les remarques suivantes :

L’activité de la bactériocine CHM9 n’est pas affectée par les traitements à 60, 80

ou 100°C pendant 10, 15 ou 20 minutes, mais l’autoclavage du surnageant de culture a

entraîné une perte partielle qu’on peut estimer à 30%. la thermorésistance des bactériocines

est notée par plusieurs chercheurs. L’acidocine D20079 n’est pas sensible aux traitements

thermiques à 70°C ou 100°C pendant 60min, alors que son activité est diminuée de 50% après

30 min à 120°C (Deraz et al., 2005). Les mêmes résultats ont été obtenus concernant l’activité

des bactériocines AMA-K et plantaricin LR/14 qui n’est pas affectée après 20 min à 121°C

(Todorov et al., 2007, Kumar Tiwari et Srivastava. 2008), alors que l’activité de la bozacine

14 et la bactériocine ST15 est complètement abolie à 121°C pendant 20 min (Ivanova et al.,

2000, Kwaadsteniet et al., 2005).

L’activité inhibitrice de la CHM9 a été conservée après des traitements à des

températures assez élevées, comparables, à la pasteurisation (80°C pendant 10 min) et à la

stérilisation du lait (100°C pendant 5 min).

Nous pouvons conclure que la bactériocine de la souche CHM9 est

thermorésistante.

Grace à cette caractéristique, la bactériocine CHM9 peut être classée soit dans la

classe I ou II.

Aussi la résistance de la bactériocine CHM9 à ces traitements (pH et températures)

est un témoin qu’elle peut présenter un grand intérêt en technologie agroalimentaire, soit au

cours de la fabrication soit en étape finale de fabrication mais aussi dans la conservation des

aliments.

3.8 Estimation de la quantité de bactériocine produite

La quantification de la bactériocine produite, permet d’apprécier sa concentration et a

été estimée en unité arbitraire par ml de surnageant de culture de la souche bactériocinogène.

Pour cela, nous avons utilisé la méthode de dilution critique décrite par Pucci et al.

(1988) mais réalisée selon Yanagida et al. (2005). Nous avons obtenu le résultat suivant:

Selon Parente et al. (1994), on calcule la quantité de bactériocine produite par la

formule suivante :

AU/ml = (1000/d)*D

d : est le volume mis dans les puits


Page 81

D est le facteur de dilution.

Dans notre cas la dilution maximale de bactériocine ayant produit une inhibition est :

AU/ml = (1000/0,1)*1/8 = 1250 AU/ml

La quantité de bactériocine produite par CHM9 cultivée dans le milieu MRSm Tp est

de 1250 AU/ml de surnageant de culture.

Chaque bactériocine produite par une bactérie lactique se caractérise par une

concentration propre à sa production dans un milieu bien défini. Cette quantification dépend

de la sensibilité de l’indicatrice utilisée dans l’essai, l’utilisation d’une souche plus sensible

permet d’apprécier cette quantité à la hausse. Dans notre cas, chacune des conditions permet

de produire une quantité de bactériocine différente.

Pour cela, nous avons réalisé la cinétique de croissance et de production de la

bactériocine dans différents milieux, à savoir : le milieu MRS, MRS Tp, MRSm et MRSm Tp.

3.9 Cinétique de croissance bactérienne et de production de la bactériocine

Les cinétiques de croissance de la bactérie bactériocinogène et de production de la

bactériocine par la souche CHM9, permettent de nous donner des indications sur l’étape

durant laquelle la bactériocine est produite mais aussi sur la phase pendant laquelle la

production est maximale.

Selon la littérature, la plupart des bactériocines des bactéries lactiques sont des

métabolites primaires (De Vuyst et Vandamme, 1992), mais il existe certaines qui sont des

métabolites secondaires. Les métabolites primaires sont produits au cours de la phase de

exponentielle et jouent un rôle vital pour une croissance active, alors que les métabolites

secondaires sont synthétisés après la phase de croissance de l’organisme et n’interviennent

pas généralement dans les fonctions vitales de l’organisme (Kleinkauf et al., 1986).

Nous avons essayé de suivre la cinétique de croissance de la souche CHM9 et la

production de sa bactériocine toutes les deux heures d’incubation pendant 30 heures à 30°C

dans quatre milieux différents : MRS, MRS Tp, MRSm et MRSm Tp.

Les figures 26 (a, b, c et d) 27 (a, b, c et d) suivantes montrent le résultat obtenu :


Page 82

Figure 26 : Les cinétiques de production de la bactériocine dans quatre milieux différents. a: MRS nTp, b: MRS Tp, c: MRSm nTp et d: MRSm Tp.

Figure 27 : Cinétiques de croissance bactérienne et de production de la bactériocine par

CHM9 dans quatre milieux différents. (a) : MRS nTp (b) : MRS Tp (c) : MRSm nTp (d) : MRSm Tp.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

t=0 t=2 t=4 t=6 t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30


La DO (600nm)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

t=0 t=2 t=4 t=6 t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30


La DO (600nm)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

t=0 t=2 t=4 t=6 t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30


La DO (600nm)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

t=0 t=2 t=4 t=6 t=8 t=10 t=24 t=26 t=28 t=30

Diamètre du halo …

La DO (600nm)

b

c d

a

b d

a t0

t2 t4 t6 t8

t10 t24 t26 t28 t30

c

t30 t28 t24 t10

t8 t6 t4 t2

t0

t26

t0 t2 t4 t6 t8

t10

t28 t30

t0 t2 t4

t8

t10 t24 t26


Page 83

L’analyse des deux figures précédentes nous permet de faire les remarques suivantes :

La souche CHM9 a un comportement différent dans les 4 milieux de culture

utilisés.

La production de bactériocine débute pendant la phase exponentielle dans les 4

milieux utilisés. Cependant l’effet inhibiteur maximum n’est pas atteint au même moment.

Généralement, on remarque 3 à 4 phases selon les milieux:

☞ Phase de latence : de 0 à 2 heures d’incubation, est observé pour tous les milieux

☞ Phase d’accélération : elle est de 2 heures, cette phase n’est observée qu’en milieu

MRS et MRS Tp, pour les milieux MRSm et MRSm Tp, la souche CHM9 passe directement

de la phase de latence à la phase exponentielle.

☞ La phase exponentielle : est atteinte après 2h (MRSm non tamponné et tamponné)

à 4h (MRS non tamponné et tamponné) d’incubation et elle est achevée avant 24h

d’incubation pour les quatre milieux.

☞ La phase stationnaire : elle est atteinte avant les 24 heures d’incubation.

La cinétique en milieu MRS

La croissance de cette souche est relativement faible dans le milieu MRS, par rapport

aux autres milieux. Après 2 heures d’incubation, une phase d’accélération est observée et à 4h

d’incubation, la croissance de la bactérie entame la phase exponentielle pour aboutir à la

phase stationnaire (une DO de 1,5), avant les 24 h d’incubation. La production de bactériocine

dans ce milieu est la plus faible par rapport aux autres milieux. Elle commence après 2h (avec

un halo de 0,3 cm), à 6h la production augmente (un halo de 0,6 cm) et reste stable jusqu’à

28h où on remarque une petite augmentation du halo (0,8 cm) pour diminuer légèrement à

30h (halo de 0,7 cm).

La cinétique en milieu MRS Tp

La cinétique de croissance de la CHM9 en milieu MRS Tp est semblable à celle

observée en milieu MRSm Tp. à l’exception des 6 premières heures pendant lesquelles on

remarque une phase d’accélération qui précède la phase exponentielle dans le cas du MRS

tamponné. Après 6 h d’incubation, une croissance concomitante est observée entre celle en

milieu MRSm Tp et en MRS Tp. La production de bactériocine en milieu MRS Tp est aussi

similaire à celle observée en milieu MRSm Tp. Mais à 24h d’incubation une légère

augmentation est enregistrée (un halo de 1,2 cm) puis la diminution est amorcée à partir de

30h.


Page 84

La cinétique en milieu MRSm nTp

La croissance de la souche CHM9 est plus importante dans le milieu MRSm nTp que

dans les autres milieux. La phase exponentielle est rapidement atteinte après les 2 heures

d’incubation. La phase stationnaire commence avant les 24 h, avec une DO de 1,9. La

production de bactériocine dans ce milieu est importante, à 6 heures d’incubation, un halo de

1,0 cm de diamètre est mesuré. Cette production atteint son maximum à 8 heures (un halo de

1,2 cm) et reste stable jusqu’à 24h, Au delà, nous remarquons, une diminution des diamètres

des halos d’inhibition avec un léger bond à 28h. La diminution des halos d’inhibition est peut

être du, soit à une diminution de production de la bactériocine, soit à la dégradation par des

protéases non spécifiques synthétisées durant la phase stationnaire, soit à une agrégation des

bactériocines. Ceci est observé par plusieurs chercheurs, Todorov et Dicks, (2005c), ont noté

une diminution de la production de bactériocine ST311LD au-delà de 22h.

La reproductibilité du léger bond observé à 28h, doit être confirmée par d’autres

essais, dans le cas d’une confirmation, des explications doivent être apportées

La cinétique en milieu MRSm Tp

La croissance de la souche CHM9 en milieu MRSm Tp débute après 2h d’incubation,

pour s’achever à la phase stationnaire avant les 24h avec une DO de 1,8. Après 30h

d’incubation, on remarque une augmentation de la DO à 1,9. La production de bactériocine

par la souche CHM9 dans le milieu MRSm Tp augmente progressivement puis se stabilise à

un premier palier à partir de 6 h (halo de 1 cm) puis un 2ème

palier par augmentation de la

production est atteint à partir de 24h (halo de 1,2 cm de diamètre). La diminution en

bactériocine est amorcée à partir de 30h.

En comparant les cinétiques obtenues entre les différents milieux, on peut conclure ce

qui suit :

En générale, la production de la bactériocine CHM9 est négligeable pendant les

quatre premières heures, celle-ci commence après 6h d’incubation. Todorov et al. (2007) ont

remarqué que la production de AMA-K se fait après 5h d’incubation.

Une meilleure cinétique de croissance de la CHM9 est observée en milieu MRSm

nTp par rapport aux autres milieux: à titre indicatif, après 4h d’incubation, on note une DO de

0,96 de la CHM9 dans ce milieu, alors qu’elle est de 0,3 dans les milieux MRS et MRS Tp.

Une DO de 0,6 est enregistrée en milieu MRSm Tp. Concernant la production de bactériocine,


Page 85

elle est presque identique dans les milieux MRSm nTp et Tp (à 24h d’incubation, une même

production est observée dans ces milieux).

La production de bactériocine commence au début de la phase exponentielle,

atteint son maximum au début de phase stationnaire, et reste presque stable durant cette phase.

Ce résultat rejoint celui observé par Tomé et al. (2008), en effet la production de la

bactériocine synthétisée par Enterococcus faecium ET05 a été détectée au début de la phase

exponentielle (6h) et atteint son maximum à 24h d’incubation c'est-à-dire pendant la phase

stationnaire.

La croissance de la souche CHM9 et la production de la bactériocine sont les plus

faibles en milieu MRS.

La croissance de la souche CHM9 et la production de bactériocine sont aussi

importantes dans le milieu MRS Tp.

Nous remarquons aussi, que le milieu tamponné, soit MRS ou MRSm, donne de

meilleure cinétique de croissance et de production de bactériocine. La présence de 2% de

K2HPO4 permet de tamponner le milieu à la neutralité ce même résultat a été décrit par

Mandal et al. (2008) qui ont observé une croissance optimale, de la souche Pediococcus

acidilactici LAB 5 (DO de 1,8) et une production maximale de la pediocine NV 5 dans un

milieu tamponné à pH6,6 (2200 AU/ml).

Tous ces résultats montrent que la bactériocine produite par CHM9 est un métabolite

primaire, synthétisé pendant la phase active de croissance (phase exponentielle). De

nombreux auteurs, dont Todorov et al. (2007), Cocolin et al. (2007), Ghrairi et al. (2008) et

Kumar et al. (2010), ont observé ce même résultat et ont indiqué que, la plupart des

bactériocines sont des métabolites primaires. Néanmoins de rares bactériocines ont été

décrites comme étant des métabolites secondaires, comme l’acidocine B, la production de

cette bactériocine par Lactobacillus acidophilus M46 n’est pas liée à la croissance (Ten Brink

et al.,1994). Biswas et al. (1991) ont indiqué que la pediocine AcH est produite à 60%

pendant les 8 premières heures et les 40% restants, sont synthétisés pendant les 8 heures qui

suivent. Ces auteurs ont considéré que cette bactériocine est un métabolite secondaire. Les

mêmes observations ont été faites par d’autres chercheurs mais, ils ont noté qu’il s’agit de

métabolites primaires (De Vuyst et al, 1996, Todorov et Dicks, 2005a et Todorov, 2008)


Page 86

La purification des bactériocines ainsi que leur utilisation dans les différentes

industries nécessitent une bonne connaissance de leur comportement dans différentes

conditions et en présence de différents produits comme par exemple les détergents.

3.10 L’effet des détergents sur l’activité de la bactériocine

L’effet des détergents sur l’activité de la bactériocine permet de déterminer la

structure de la molécule, les détergents anioniques tels que le tween 80 interfèrent avec le

noyau intérieur (hydrophobe) de la protéine, ce qui peut affecter la conformation

tridimensionnelle de la molécule, (Ivanova et al., 2000).

Pour le test de l’effet des détergents sur l’activité de la bactériocine, le surnagent d’une

culture de la souche inhibitrice réalisée dans le milieu MRSm Tp est traité par le SDS, tween

20, tween80, triton X-100, urée et le NaCl à une concentration finale de 1% et par l’EDTA à

0,1, 2 et 5mM. Comme témoin, nous avons utilisé l’eau distillée stérile traitée de la même

manière pour visualiser l’effet inhibiteur ou pas des détergents sur la souche indicatrice H2.3.

Comme deuxième témoin nous avons utilisé du surnageant de culture non traité avec les

détergents. Le résultat obtenu est indiqué dans le tableau 21 ci-dessous :

Tableau 21 : L’effet de différents détergents sur l’activité de la bactériocine CHM9.

Echantillon testé Traitement Diamètre des halos

d’inhibition

Surnageant traité avec

1% SDS 0,8

1% tween 20 1,0

1% tween 80 1,0

1% triton X-100 1,4

1% NaCl 0,8

0,1 mM EDTA 0,8

2 mM EDTA 0,8

5 mM EDTA 0,8

Surnageant non traité 1,0

Eau distillée stérile

traitée avec

1% SDS 1,0

1% tween 20 0

1% tween 80 0

1% triton X-100 1,4

1% NaCl 0

0,1 mM EDTA 0

2 mM EDTA 0

5 mM EDTA 0 Les diamètres sont mentionnés en cm.


Page 87

Le comportement de la bactériocine vis-à-vis des détergents a été différent. En effet,

certains détergents ont affecté l’activité de la bactériocine CHM9 alors que d’autres ne

causent aucune changement de son activité :

Les résultats obtenus, nous permettent de faire les remarques suivantes :

L’eau distillée stérile traitée par le SDS (détergent anionique) et le Triton X-100

(détergent non ionique) inhibent la H2.3 avec respectivement, un halo de 1,0 cm et 1,4 cm,

dans ce cas nous ne pouvons rien conclure quant à l’effet de ces deux détergents sur la

bactériocine CHM9. Cependant nous pouvons dire que l’effet des détergents et de la

bactériocine ne s’additionnent pas. Il semble même qu’on retrouve comme effet inhibiteur

seulement celui des détergents. La plantaricine C19 répond de la même manière face au

traitement par SDS et Triton X-100 (Atrih et al., 2001), alors que les bactériocines HA-6111-

2 et HA-5692-3 ne sont pas affectées par le SDS mais perdent leur activités par le traitement

au Triton X-100 à 1%, (Albano et al., 2007).

Pour les autres échantillons, seule les surnageants traités inhibent H2.3, ce qui signifie

que la bactériocine n’est pas affecté par les traitements au tween 20, tween 80 (détergents non

ionique), le NaCl, et l’EDTA. Kumari et al. (2011) justifient ce résultat par le fait que ces

détergents n’ont causé aucune dissociation de la bactériocine ou ils n’ont pas provoqué des

agrégats qui font perdre l’activité, alors que le SDS dans leur cas a augmenté l’activité de la

bactériocine.

Des bactériocines ont montré une résistante face à ces détergents et ont été décrites par

plusieurs auteurs, comme le cas de, la bozacine 14, la mesentericine ST99, la bactériocine

ST15, la bactériocine AMA-K, la bactériocine produite par la souche LR/6, la bactériocine

R1333 et les bactériocines SD1, SD2, SD3 et SD4 (Ivanova et al., 2000, Todorov et Dicks

2004, De Kwaadsteniet et al., 2005, Todorov et al., 2007, Todorov et al., 2010, Kumar et al.,

2010 et Schirru et al., 2012).

Dans notre cas, l’activité de la bactériocine n’a pas été sensiblement affectée par le

traitement au tween80, tween20, le NaCl et l’EDTA. Concernant l’effet du SDS et du triton

X-100 à 1%, nous ne pouvons rien conclure étant donné qu’ils ont montré un effet inhibiteur

sur la souche indicatrice, même utilisés seuls.


Page 88

Pour la partie suivante, nous avons essayé de purifier notre bactériocine afin d’estimer

son poids moléculaire.

3.11 Purification partielle de la bactériocine

Les méthodes de purification des bactériocines sont nombreuses et différentes

stratégies sont décrites dans la littérature. Cependant seules quelques unes ont été

complètement purifiées, en effet les faibles rendements à l’issue de chacune des étapes des

stratégies établies rendent très difficile la purification sachant que les tests de mise en

évidence des bactériocines doivent toujours être réalisés sur des souches indicatrices.

Pour cela, pour une purification efficace, une étape de concentration de la bactériocine

produite est nécessaire.

Plusieurs méthodes ont été décrite pour la concentration de bactériocine, comme

l’emploi de solvants organiques (Piva et Headon, 1994), ou concentrer le surnageant à l’aide

d’un rotavapeur (Gao et al., 2010). Une ultrafiltration à l’aide de filtres spéciaux, ou une

précipitation par un sel sont aussi utilisées pour concentrer le surnageant de culture. Les sels

possèdent la propriété de relarguer les protéines. Le sulfate d’ammonium est largement utilisé

par la plupart des chercheurs.

3.11.1 Concentration de la bactériocine par le sulfate d’ammonium

Le sulfate d’ammonium est considéré comme un sel de choix, il est très utilisé pour

concentrer de nombreuses protéines. Cette méthode n’est pas très résolutive mais elle est

largement utilisée pour concentrer un extrait brut contenant des protéines. La précipitation au

sulfate d’ammonium est un procédé de séparation basé sur le degré de solubilité de la protéine

(Osterlund et Janson, 1997).

En se basant sur les principes de l’emploi de ce sel, nous avons réalisé la précipitation

au sulfate d’ammonium d’un surnagent de culture récupéré par 2 centrifugations d’une culture

réalisée dans le milieu MRSm Tp. Nous avons commencé par la saturation de 40%, le

précipité résultant a été suspendu à un dixième ou à un centième du volume initial, dans du

tampon K/Na2, pH7, 0,2M. Alors que le surnageant récupéré a été reprécipité pour avoir une

saturation finale de 50%, et ainsi de suite pour les autres précipitations jusqu’à 80%. L’essai

du précipité qui ne donnera aucune inhibition, indique que la saturation précédente a été

adéquate :


Page 89

Le résultat obtenu est montré dans les figures 28 (a et b) et indiqué dans le tableau 22,

suivants :

Figure 27 : Concentration de surnageant de culture par sulfate d’ammonium. a : récupération du précipité dans 1/10 du volume initial du surnageant.

b : récupération du précipité dans 1/100 du volume initial du surnageant.

Tableau 22 : La concentration par le sulfate d’ammonium du surnageant de culture de la

CHM9

Pourcentage de

saturation en sulfate

d’ammonium

Récupération à

1/10 du volume

initial

Récupération à

1/100 du volume

initial

Sur. natif 1,2

40% S 1,4

- P 0,1

50% S 0,1 0,2

P 1,4 2,6

60% S 0

-

P 0

70% S 0

P 0

80% S 0

P 0

S : surnageant P : précipité Les diamètres sont mentionnés en cm.

- : test non réalisé


L’inhibition de la H2.3, par le surnageant de culture résultant de la précipitation à la

saturation 40%, a donné un halo dont le diamètre est égal à celui obtenu avec le surnageant

natif.

P40%

P50

%

S40%

S

S50%

a S

S50% P50

%

b


Page 90

Alors que le diamètre de l’inhibition de son précipité est très faible. Ceci indique que la

saturation à 40% en sulfate d’ammonium n’a pas totalement précipitée la bactériocine CHM9.

Le précipité de saturation à 50% a donné un diamètre d’inhibition de 1,4 cm et l’effet

inhibiteur du surnageant de cette saturation est très faible (0,1 cm). On peut conclure que 50%

est le pourcentage de saturation adéquat pour faire précipiter la bactériocine CHM9.

Lors des centrifugations effectuées pour la récupération des précipités, nous avons

observé des pellicules à la surface des surnageants. Ces pellicules n’ont pas pu être récupérées

totalement, mais lorsqu’elles ont été testées par la méthode de diffusion en puits, un effet

inhibiteur a été observé par la formation de petits halos d’inhibition. Cette constatation a été

faite par plusieurs auteurs. Deraz et al. (2005) ont suggéré que la présence de tween 80 dans le

milieu interfère avec les protéines, après précipitation au sulfate d’ammonium, les

bactériocines liées au tween 80 (de nature lipidique, légère) sont présentes à la surface des

surnageants de culture après centrifugation. Muriana et Klaenhammer, (1991) et Van Laack et

al. (1992) ont remarqué trois phases distinctes après centrifugation :

☞ Le précipité

☞ Le surnageant de culture

☞ Une phase à la surface constituée de pellicules contenant des bactériocines (avec une

activité antimicrobienne).

Ces auteurs expliquent que ce phénomène est causé par la présence de tween80 dans le milieu

MRS.

La thermophiline ST-1 produite par Streptococcus thermophilus ACA-DC 0001

(Aktypis et Kalantzopoulos, 2003), la curvaticine L442 produite par Lactobacillus curvatus

L442 (Xiraphi et al., 2005) et la bactériocine SD1 produite par Enterococcus faecium SD1

(Schirru et al., 2012) précipitent bien à 50% de saturation en sulfate d’ammonium.

Pour concentrer plus le surnageant de culture, nous avons suspendu le précipité à 50%

du surnageant de culture à un centième du volume initial, ceci nous a montré un meilleur effet

inhibiteur (l’effet inhibiteur de la bactériocine a augmenté de 2,2 fois), montré dans la figure

27b présentée ci-dessus.

Chaque bactériocine décrite dans la littérature est précipitée par le sulfate d’ammonium

à une saturation bien définie. En effet, quelque soit la bactérie productrice de bactériocine, des

saturations allant de 40% à 90% de saturation en sulfate d’ammonium sont utilisées pour

précipiter les bactériocines.


Page 91

La propionicine T1, la bactériocine AMA-k et la bactériocine HA-6111-2 produites par

Propionibacterium thoenii T1, Lactobacillus plantarum AMA-K et Pediococcus acidilactici,

ont toutes été précipitées à 40% (Faye et al., 2000, Todorov et al., 2007, Albano et al., 2007).

D’autres bactériocine sont précipitées à une saturation de 60% à 65% en sulfate d’ammonium,

comme l’entérocine ON-157 produite par Enterococcus faecium NIAI 157 (Ohmomo et al.,

2000), l’acidocine D20079 produite par Lactobacillus acidophilus DSM 20079 (Deraz et al.,

2005) et la bactériocine produite par Lactococcus lactis subsp lactis LL171 (Kumari et al.,

2011), alors que la plantaricine S produite par Lactobacillus plantarum LPCO10, la

bactériocine ENTI produite par Enterococcus faecium 6T1a, et la sakacine LSJ618 produite

par Lactobacillus sakei LSJ618 précipitent à 80% de saturation en sulfate d’ammonium

(Jiminez Diaz et al., 1995, Floriano et al., 1998, Jiang et al., 2012), quand à la plantaricine

LR14 produite par Lactobacillus plantarum LR/14, elle a été précipité à 90% de saturation en

sulfate d’ammonium (Kumar Tiwari et Srivastava, 2008).

On peut conclure que la précipitation à 50% de saturation en sulfate d’ammonium

permet la précipitation de la bactériocine produite par Lactobacillus sp CHM9.

Lors des essais ultérieurs, une diminution ou une absence du halo d’inhibition, ont été

observés, respectivement, avec le surnagent de la précipitation à 40%, et du précipité à 50%.

Ceci est du à la perte d’activité de la bactériocine. La perte de l’activité des fractions

précipitées par le sulfate d’ammonium est aussi notée par Doumandji et al. (2010). D’où la

nécessité d’effectuer un dessalement. Pour cela, nous avons précipité le surnageant de culture

à 50%, et le précipité est récupéré dans un centième du volume initial du surnageant de

culture.

Le dessalement après une précipitation au sulfate d’ammonium peut être réalisé par

une simple dialyse ou par chromatographie en gel filtration en utilisant généralement le

Sephadex G25.

3.12.2 Dessalement

Le dessalement par simple dialyse présente deux principaux inconvénients : la

nécessité de changer le milieu de dialyse de temps à autre et la lenteur de la méthode. Pour

cela, le dessalement par une chromatographie en gel filtration a préférentiellement été utilisé.

En plus de sa rapidité, cette méthode permet de séparer les protéines. Le Sephadex G25 est le

gel utilisé pour cette technique (Scopes, 1994).


Page 92

Un échantillon de 13 ml (obtenu après précipitation à 50% et récupération du précipité

dans un tampon d’un centième du volume initial) est déposé dans une colonne de (45×1,3)

cm2 de Sephadex G25 pré-équilibrée par le tampon de Na2/K, 0,05 M, pH7,0. Cet échantillon

(jusqu’à 30% du volume du gel) est élué avec ce même tampon (3 fois le volume du gel), à un

débit de 2 ml/min. Des fractions de 1,5 ml sont collectées et leurs densités optiques sont

mesurées à 280nm. De l’ensemble des fractions présentant des pics, seule la moitié (une

fraction sur deux) seront testées par la méthode de diffusion en puits. Les résultats obtenus

sont présentés en figures 29 et 30.

Figure 29 : chromatogramme représentant la DO à 280 nm des fractions obtenues par la

chromatographie et graphe de l’effet inhibiteur des fractions.

Figure 30 : L’effet inhibiteur des fractions obtenues par la chromatographie.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0

5

10

15

20

25

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 100 103 106


DO des fraction à 280 nm

F1 F2

P50

%

f20 f22 f24 f26

f26 f28 f30 f32 f34


Page 93

D’après le résultat obtenu, les remarques suivantes peuvent être faites :

Le graphe obtenu représente la DO des fractions obtenues à 280 nm et montre deux grands

pics :

☞ F1 (de la fraction 20 à la fraction 32) dont la DO la plus élevée est de 17.

☞ F2 (de la fraction 33 à la fraction 56) dont la DO la plus élevée est de 21.

Ces deux grands pics, renferment des petits pics. Ces DO élevées reflètent la quantité

importante des protéines dans les fractions, et sont les premières à être éluées par leur poids

moléculaire plus important que celui des sels d’ammonium.

Après le pic F2, les DO sont moins importantes (de 0,1 à 2,5). Ces petites DO

constituent fortement les sels d’ammonium qui sont retardés à cause de leurs faibles poids

moléculaires.

De ce fait, nous n’avons testé seulement les fractions des deux pics F1 et F2 par la

méthode de diffusion en puits.

D’autre part, le test de l’effet inhibiteur des fractions des pics F1 et F2 montre que :

Le halo d’inhibition du précipité était de 0,8 cm. Les fractions de 20 à 27 du pic F1 ont

montré un effet inhibiteur qui s’est exprimé par un halo d’inhibition de 0,4cm, par contre, la

fraction 28 présente un halo d’inhibition de seulement 0,1 cm.

Cette diminution du halo d’inhibition est du à différents phénomènes :

La dilution lors de l’élution, en effet les fractions collectées sont diluées après

chromatographie.

Scopes (1994), indique que cette méthode cause une perte de protéines d’environ 10 à

15%.

La présence de substances dans le surnageant de culture, qui sont essentielles pour

l’activité de la bactériocine et qui ne sont pas éluées avec la bactériocine au cours de la

chromatographie (Jiménez-Diaz et al., 1995).

Ceci a été observée par plusieurs auteurs, Kumar Tiwari et Srivastava, (2008) ont

indiqué que l’activité totale de la bactériocine produite par Lactobacillus plantarum LR/14

diminue d’environ 4 fois après le passage du précipité en chromatographie échangeuse de

cation, de la même manière l’activité de la plantaricine S a subi une perte de 4 fois après une

chromatographie (Jiménez-Diaz et al., 1995).


Page 94

Les autres fractions de ce pic n’ont montré aucun effet inhibiteur, ceci peut être du à la

dilution plus importante de ces fractions, ou alors il s’agit d’autres protéines, que la

bactériocine, produites par la souche CHM9.

3.11.3 Estimation du poids moléculaire par électrophorèse tricine SDS-PAGE

La SDS PAGE (électrophorèse en gel d’acrylamide en utilisant le sodium dodécyl

sulfate, en condition non dénaturante) est une méthode très utilisée pour séparer les protéines,

selon leur poids moléculaire. Cette séparation permet de mettre en évidence les protéines qui

constituent un échantillon.

La tricine SDS PAGE (Schägger et Von Jagow, 1987) utilise un tampon de cathode

plus résolutif (la tricine) que celui utilisé dans l’électrophorèse en SDS PAGE. Ainsi, elle est

destinée pour la séparation des protéines de poids moléculaire allant de 5 à 20KDa. Pour cela,

un gel contenant trois concentrations en acrylamide (16%, 10% et 4%) est constitué (voir

annexe 2). Après polymérisation du gel, 60 µl des échantillons traités par un tampon de

charge, ont été déposés en double (sauf les marqueurs de taille) dans les puits du gel. Les

échantillons sont :

☞ Marqueur.1 : lysozyme (0,8mg/ml) (14,4 KDa)

☞ Marqueur.2 : nisine (0,8mg/ml) (3,3 KDa)

☞ échantillon.1 : Surnageant obtenu en MRSm.

☞ échantillon.2 : Surnageant obtenu en MRSm tamponné (nouveau)

☞ échantillon.3 : précipité 50%.

Après électrophorèse (50 V, 18h), le gel est coupé en deux parties,

la partie qui contient les marqueurs de tailles sera colorée par une solution de

coloration (voir annexe 2) et décolorée par une solution de décoloration (voir annexe 2), après

l’avoir traitée par une solution de fixation (voir annexe 2).

L’autre partie sera fixée par une autre solution d’isopropanol/acide acétique/eau

distillée (20:10:70) et rincée plusieurs fois à l’eau distillée stérile. Elle sera déposée sur une

surface de gélose solide tamponnée, on coule dessus une gélose molle ensemencée par

l’indicatrice H2.3.

Le résultat obtenu est montré dans les figures 31 (a et b) suivantes :


Page 95

Figure 31 : Tricine SDS PAGE de différents échantillons de surnageant.

(a) gel coloré par le bleu de Coomassie R250.

(b) gel mis à l’essai pour le pouvoir inhibiteur des échantillons. 1 : Mar.1 : lysozyme (0,8mg/ml) (14,4 KDa)

2 : Mar.2 : nisine (0,8mg/ml) (3,3 KDa)

3 : échant.1 : Surnageant obtenu en MRSm.

4 : échant.2 : Surnageant obtenu en MRSm Tp.

5 : échant.3 : précipité 50%.

D’après les résultats obtenus, les observations suivantes peuvent être faites :

La migration de l’échantillon de lysozyme donne, 3 bandes dont la dernière est

intense, cette dernière correspond au lysozyme. Les deux autres bandes indiquent que le

lysozyme est en présence de deux autres protéines, dont on ne connaît pas le poids

moléculaire, néanmoins, ils sont nettement inférieur à 14,4 KDa. Le deuxième marqueur qui

est la nisine n’a donné aucune bande électrophorétique.

Aucune bande électrophorétique n’est observée dans les cas du surnageant 1 et du

surnageant issu du milieu MRSm tamponné, ceci peut être du, à la faible concentration de la

bactériocine. Ces échantillons n’ont pas, non plus, donné des inhibitions.

La migration du précipité à 50% donne 4 bandes, dont la dernière est sous forme d’une

bande opaque et diffuse. Cette dernière correspond à celle qui a inhibé l’indicatrice H2.3. Ce

résultat confirme bien que l’absence de bandes électrophorétiques et de l’effet inhibiteur dans

le cas des échantillons 1 et 2 est bien du à la faible concentration en bactériocines.

La bande qui correspond à la bactériocine CHM9 a un poids moléculaire nettement

inférieur à 14,4 KDa. Ce qui confirme bien qu’il s’agit d’une bactériocine de la classe I ou II.

Zone d’inhibition de la H2.3.

b

5

a

1 2 3 4 5


Page 96

Plusieurs auteurs, ont observé une bande électrophorétique diffuse, cette bande

correspondait au peptide qui a inhibé l’indicatrice. En effet, van Reenen et al. (1998), ont

observé une trainée après coloration du gel au bleu de Coomassie. Cette bande (la plantaricine

423) correspondait à une bande peptide de 3,5 KDa, qui a inhibé la croissance de Listeria

monocytogenes. Todorov et al. (2007), ont aussi observé ce genre de bande (bande diffuse),

après coloration au bleu de Comassie du gel. Cette bande (2,9 KDa) correspondait à la

bactériocine AMA-K, qui a inhibé la croissance de la souche Lactobacillus casei LHS. Kumar

Tiwari et Srivastava (2008), ont observé des bandes électrophorétiques diffuses de la

plantaricine LR14 α et β, après coloration du gel au bleu de Coomassie. ces bandes ont des

poids moléculaires compris entre 3,4 à 6,2 KDa.

D’autres auteurs, décrivent les bactériocines synthétisées par les espèces de

Lactobacillus, comme étant des bactériocines dont le poids moléculaire ne dépasse pas les 10

KDa (De Vuyst et Vandamme, 1994), comme les plataricines produites par les souches de

Lactobacillus plantarum, dont le poids moléculaire est inférieur ou égal à 10KDa (Jiménez-

Diaz et al., 1995) et les sakacines synthétisées par les espèces de Lactobacillus sake, qui ont

des poids moléculaire qui varient entre 3,8 et 5,5 KDa (Gao et al., 2010). D’autres auteurs,

notent que la plupart des bactériocines produites par les lactobacilles sont de la classe IIa.

A ce stade, puisque la bactériocine CHM9 n’a pas été dégradée par les 3% de SDS

contenu dans le tampon de charge (annexe 2), nous pouvons déduire que 1% de SDS n’a pas

affecté l’activité de la bactériocine CHM9 (résultat du § 3.10). Cette constatation a été aussi

notée par De Kwaadsteniet et al. (2005), en effet, lors de l’électrophorèse en tricine SDS-

PAGE, la mundtcine KS produite par Enterococcus mundtii ST15, a montré une bande

peptidique active, et ont conclu que cette bactériocine n’a pas été inactivé en présence de 1%

de SDS.

LBMB Conclusion & perspectives

Page 98

4. Conclusion générale et perspectives:

Les bactéries lactiques sont un outil de bioconservation efficace de nombreux aliments

et Grace à leur métabolisme, elles sont reconnues comme GRAS. Parmi les produits de leur

métabolisme, les bactériocines sont des substances antimicrobiennes efficaces et très

recherchées pour des applications en industrie agro-alimentaire, parapharmaceutique et

pharmaceutique.

C’est dans ce sens que s’inscrit l’objectif de notre travail qui consiste à détecter des

bactéries lactiques bactériocinogènes et de faire une étude microbiologique, physico-chimique

et biochimique de leurs bactériocines.

Nous avons réalisé, tout d’abord, un criblage des interactions négatives chez 24

souches lactiques testées les une contre les autres (14 souches du genre Leuconostoc et 10

souches du genre Lactobacillus), isolées de différents biotopes. La méthode directe, a montré

que les lactobacilles sont plus inhibiteurs que les leuconostocs. Cependant l’effet inhibiteur de

ces souches, par la méthode indirecte (Schillinger et Lücke, 1989) était très faible et non

reproductible.

L’addition de 2,5% d’extrait de levure et de 25% de lait dans le milieu MRS

(MRSY+lait), a permis de montrer une activité inhibitrice importante contre H2.3, par les

surnageants de culture des souches Lactobacillus sp CHM9, Lactobacillus sp CHM18 et une

souche de Leuconostoc mesenteroides subsp dextranicum CHBK310.

L’agent inhibiteur produit par ces souches, a été dégradé par la trypsine et la pronase

E, et n’a pas été affecté en présence de catalase, alors que, la pepsine n’a levé que très

faiblement l’effet inhibiteur de ces trois inhibitrices. Ceci nous permet de conclure que les

inhibitions produites par les trois souches contre H2.3 sont dues à des bactériocines que nous

avons nommé, Bactériocine CHM9, Bactériocine CHM18 et mésentéricine CHBK310.

Puis, nous avons essayé d’optimisation la production de la bactériocine CHM9, tout en

suivant la croissance bactérienne. La production de la bactériocine CHM9 a été optimisée

dans du MRS modifié (MRSm) en source d’azote (1% try+0,5% EV+0,5%EY) et en source

de potassium (2% de K2HPO4). Le glucose à 2% constitue la meilleure source de carbone

pour une production importante de la bactériocine. Les températures d’incubation 25, 30,35 et

40°C n’ont pas affectées la production de la bactériocine CHM9, alors qu’à 45°C, une très

faible production a été enregistrée. La diffusion de la bactériocine CHM9 dans les géloses

(molle et solide) est meilleure dans les conditions tamponnées à pH7.


Page 99

Ensuite, nous avons comparé l’effet de différents milieux et conditions de culture de la

souche CHM9 sur la production de sa bactériocine, à savoir : MRS, MRSY et MRSm, en

conditions, tamponnées ou pas, supplémentés en lait ou pas. Une production maximale de la

bactériocine CHM9 a été enregistrée en milieu MRSm Tp et MRSm Tp+lait. Le milieu

MRSm Tp a été utilisé pour la suite de notre travail. La quantité de la bactériocine CHM9

produite dans ce milieu, est estimée à 1250 AU/ml.

La bactériocine CHM9 n’est généralement pas affectée par les pH acides ou basiques

(de 2 à 12), ni aux traitements à la chaleur (60, 80 et 100°C pendant 10, 15 et 20min et 120°C

pendant 20min). Ces caractéristiques ouvrent une perspective d’utilisation de la bactériocine

en agro-alimentaire, et permet de la situer en classe I ou II.

La cinétique de croissance bactérienne et de production de la bactériocine par la

souche CHM9 dans les milieux MRS et MRSm, non tamponnés (nTp) et tamponnés (Tp),

montre que la production de la bactériocine commence dès 6 heures d’incubation (phase

exponentielle), indiquant qu’il s’agit d’un métabolite primaire. Une production maximale

étant atteinte au début de la phase stationnaire (24 h). Les milieux MRSm nTp et Tp,

permettent la meilleure production de la bactériocine CHM9.

L’activité de la bactériocine n’a pas été sensiblement affectée par le traitement au

tween80, tween20, le NaCl et l’EDTA. Concernant l’effet du SDS et du triton X-100 à 1%,

nous ne pouvons rien conclure étant donné qu’ils ont montré un effet inhibiteur sur la souche

indicatrice, même utilisés seuls. Néanmoins, la présence d’une bande électrophorètique

inhibitrice de la H2.3, dans le gel de tricine SDS-PAGE (tampon de charge à 3% de SDS),

indique que la bactériocine CHM9 n’a pas été dégradée par les 1% de SDS.

La bactériocine produite par CHM9 a été précipitée à 50% en sulfate d’ammonium, le

dessalement par chromatographie en gel de Sephadex G25 a montré un chromatogramme à

deux grand pics. Certaines fractions du premier pic ont montré un effet inhibiteur.

L’estimation, du poids moléculaire de la bactériocine, a été effectuée avec un précipité

à 50% réalisé avec du sulfate d’ammonium. Ce précipité a donné 4 bandes électrophorètiques,

dont la dernière est sous forme d’une bande dense et diffuse. Cette bande correspond à la celle

qui a inhibé la H2.3, et son poids moléculaire est nettement inférieur à 14,4KDa. Les autres

échantillons (natifs) n’ont donné aucune bande électrophorétique.


Page 100

Pour approfondir plus, cette étude, notre travail pourra être complété par :

La stimulation de la production de bactériocines chez les 21 autres souches

utilisées dans cette étude, en essayant d’autres moyens d’optimisation, en vu de

détecter d’autres bactéries bactériocinogènes.

L’optimisation de la production de la bactériocine CHM18 et de la

mésentéricine CHBK310.

L’optimisation de la production de la bactériocine CHM9, en essayant d’autres

sources d’azote, afin de repérer les acides aminés nécessaires pour une

production maximale. D’autres sources de carbone, peuvent être aussi étudiées,

pour leur effet sur la production de bactériocine.

La confirmation que dans le cas des 2% de KH2PO4, il s’agit bien d’une lyse

cellulaire.

L’identification moléculaire des souches Lactobacillus sp CHM9 et CHM18,

pour faire une comparaison de leur bactériocines avec celles décrites dans la

littérature.

La quantification de la production de la bactériocine CHM9 dans les milieux,

qui ont permis une bonne production (MRS Tp et MRSm), et la recherche

d’une souche indicatrice plus sensible, pour une meilleure évaluation de la

quantité de cette bactériocine en AU/ml.

L’utilisation des marqueurs de taille, pour une estimation précise du poids

moléculaire, de la bactériocine CHM9, afin de déterminer avec exactitude la

classe à laquelle elle appartient.

De connaître le spectre d’action de la bactériocine CHM9, en utilisant

différentes bactéries pathogènes et/ou d’altération, comme : E. coli, des

espèces de Pseudomonas, de Salmonella, de Shigella et d’autres...

102

Tableau 10 : Les interactions inhibitrices inter-bactériennes exercées par les souches utilisées

Les diamètres sont mentionnés en centimètre. In : Inhibitrices. Id : Indicatrices.

IN

ID LVK11 LVK30 LVK31 LVK32 CHM9 CHM18 CHM19 H2.3 CHTD27 CHTD29 CHBK309 CHBK310 CHBK311 CHBK312 CHBK314 CHBK315 CHBK316 CHBK318 CHBK319 CHBK320 CHBK323 CHBK325 CHBK326 CHBK327

LA

CT

OB

AC

UL

LU

S

CHM9 1,0 1,2 1,2 0,8 0,9 0,9 1,6 0,9 0 0 0,9 0,7 0,7 1,2 0,6 0,6 0,6 - 0,6 0,7 0,8 0.5 0,7 0,7

CHM18 1,0 1,2 1,2 0,8 1,0 0,9 1,6 0,9 0 0 0,9 0,7 08 1,2 0,6 0,6 0,6 - 0,6 0,7 0,8 0,5 0,8 0,8

CHM19 0,9 0,9 0,7 0,6 0,6 0,9 1,6 0 0 0 0,9 0,7 0.7 1,2 0 0 0 - 0 0,7 0,8 0 0,8 0,7

LVK11 0,8 1,1 1,0 0,8 0,7 0,9 1,6 0,8 0 0 0,9 0,8 0.7 1,2 0,6 0,6 0,6 - 0,6 0,7 0,8 0,5 0,8 0,7

LVK30 0,9 1,1 1,0 0,8 0,7 0,9 1,6 0,8 0 0 0,9 0,7 0,8 1,2 0.6 0,6 0,6 - 0,6 0,7 0,8 0,5 0,8 0,6

LVK31 0,7 1,0 1,0 0,8 0,9 1,0 1,6 0,7 0 0 0,9 0,7 0,8 1,0 0.6 0,6 0,6 - 0,6 0,7 0,7 0,5 0,7 0,7

LVK32 0,9 1,0 1,0 0,8 0,8 0,9 1,6 0,8 - 0 0,9 0,8 0,8 1,0 0,6 0,6 0,6 - 0,6 0,6 0,8 0,5 0,7 0,6

CHTD27 1,2 1,4 1,5 1,0 1,1 0,9 2,4 - 0,6 0,6 0,9 0,8 0,9 1,4 1,0 1,0 0,9 - 0,9 0,9 0,7 1,0 0,8 0,8

CHTD29 1,0 1,4 1,5 1,0 1,2 1,0 2,4 - 0,6 0,6 0,9 0,8 0,9 1,4 0,9 0,9 0,9 - 0,8 0,9 0,7 0,9 0,8 0,9

BH14 1,2 1,4 1,5 1,0 1,2 1,0 2,4 0,9 - 0,6 0,9 0,8 0,9 1,4 1,0 0,9 0,9 - 0,9 0,9 0,7 0,9 0,8 0,9

LE

UC

ON

OS

TO

C

CHBK309 0,8 - 0,7 0,9 - - 0,9 0,9 0 0 0,8 0,6 0,6 0,6 0,6 - 0,6 0,7 0,7 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

CHBK310 1,0 - 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0 0 0,8 0,8 0,6 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,8

CHBK311 1,1 - 0,9 0,9 1,0 1,0 1,0 0,9 0 0 0,7 0,8 0,6 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,8

CHBK312 1,0 - 0,8 1,0 1,0 1,0 1,0 0,9 0 0 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,8

CHBK314 1,1 - 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0 0 0,8 0,7 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,7 0,8 0,7 0,7 0,7 0,8

CHBK315 1,1 - 0,8 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0 0 0 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,7 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7

CHBK316 1,0 - 0,9 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0 0 0 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,7 0,8 0,7 0,7 0,7 0,8

CHBK318 1,0 - 0,8 0,8 1,0 1,1 1,0 0,9 0 0 0,8 0,8 0,6 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 0,8

CHBK319 0,6 - 0,6 0,7 0,8 0,9 0,9 0,8 0 0 0,6 0,6 0,7 0,6 0,6 - 0,6 0,7 0,6 0 0,6 0,6 0,6 0,7

CHBK320 1,0 - 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0 0 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7

CHBK323 1,0 - 0,9 0,8 0,9 0,9 1,0 0,9 0 0 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

CHBK325 1,0 - 1,0 1,1 1,0 0,9 1,0 1,0 0 0 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

CHBK326 1,0 - 1,0 1,0 1,0 0,9 1,0 1,0 0 0 0,9 0,6 0,7 0,8 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 0,8

CHBK327 1,1 - 1,0 1,1 1,0 0,9 1,0 1,0 0 0 0,9 0,7 0,7 0,7 0,6 - 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 0,7 0,8

103

Tableau 12 : L’effet de l’addition du lait à 25% dans du MRS supplémenté de 2,5% d’extrait

de levure sur la production de l’agent inhibiteur par les 24 souches.

Les

souches

Les milieux de

culture

CHM19 H2.3

Non TP TP Non TP TP

CHBK312

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSYTp+lait 0 0 0 0

CHBK314

MRSY 0 0 0 0

MRSY tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSY Tp+lait 0 0 0 0

CHBK325

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSYTp+lait 0 0 0 0

CHM9

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0,6 0,6 1,2 1,4

MRSYTp+lait 0,6 0,6 1,0 1,2

CHM18

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0,6 0,6 1,2 1,2

MRSYTp+lait 0,6 0,6 1,2 1,2

LVK11

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSYTp+lait 0 0 0 0

CHBK310

MRSY 0 0 0,6 0,8

MRSY tp 0 0 0,6 0,8

MRSY+lait 0 0,8 0 0

MRSY Tp+lait 0,3 0,3 1,6 1,8

CHBK311

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0,2 0 0,8 0,8

MRSY Tp+lait 0* 0

* 0

* 0

*

CHBK315

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSY Tp+lait 0* 0

* 0

* 0

*

LVK30

MRSY 0 0 0,2 0,2

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSY Tp+lait 0* 0

* 0

* 0

*

LVK31

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0,2 0,4 0 0

MRSTp+lait 0* 0

* 0

* 0

*

LVK32

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSY Tp+lait 0 0*

0 0

104

Tableau 12 (suite) : L’effet de l’addition du lait à 25% dans du MRS supplémenté de 2,5%

d’extrait de levure sur la production de l’agent inhibiteur par les 24 souches.

Les

souches

Les milieux de

culture

CHM19 H2.3

Non Tp Tp Non Tp Tp

CHBK316

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSY Tp+lait 0* 0

* 0* 0

*

CHBK318

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSYTp+lait 0* 0

* 0* 0

*

CHBK320

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSY Tp+lait 0* 0

* 0* 0

*

CHBK323

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSY Tp+lait 0* 0

* 0* 0

*

CHBK327

MRSY 0 0 0 0

MRSY Tp 0 0 0 0

MRSY+lait 0 0 0 0

MRSYTp+lait 0* 0

* 0* 0

*

CHBK326

MRSY - - 0 0

MRSY Tp - - 0 0

MRSY+lait - - 0 0

MRSY Tp+lait - - 0 0,8

CHM19

MRSY - - 0 0

MRSY Tp - - 0 0

MRSY+lait - - 0 0

MRSY Tp+lait - - 0 0,4

CHTD27

MRSY - - 0 0

MRSY Tp - - 0 0

MRSY+lait - - 0 0

MRSYTp+lait - - 0 0

CHTD29

MRSY - - 0 0

MRSY Tp - - 0 0

MRSY+lait - - 0 0

MRSYTp+lait - - 0 0

BH14

MRSY - - 0 0

MRSY Tp - - 0 0

MRSY+lait - - 0 0

MRSYTp+lait - - 0 0

Les diamètres sont mentionnés en cm. 0* : halos trouble - : non déterminé

106

Les milieux de culture

MRS

Peptone 10g

Extrait de viande10g

Extrait de levure 5g

Glucose 20g

Acétate de sodium 5g

Citrate d’ammonium 1g

Sulfate de manganèse 0,05g

Sulfate de magnesium 0,1g

Phosphate dipotassique 2g

Tween80 1ml

pH6,8

Pour 1000 ml de culture

Stériliser à 120°C pendant 20 min (autoclavage).

Mayeux

Tryptone 10g

Saccharose 100g

Citrate de sodium 1g

Glucose 5g

Gélatine 2,5g

Azide de sodium 0,0075g

pH7

pour 1000ml de culture

stériliser à 120°C peandant 20 min (autoclavage)

La procédure de la coloration de Gram

Recouvrir le frottis fixé d’une quantité suffisante de violet de Gentiane, laisser en contact 1 minute.

Entrainer le violet de Gentiane avec le Lugol, Recouvrir la lame de Lugol et laisser agir 1 minute. Ne pas laver à l’eau.

Décolorer aussitôt par L’alcool, pour cela verser l’alcool à la surface de la préparation

placé obliquement et observer sa couleur, la coloration est violet, puis bleuté. Avant

qu’elle soit incolore, laver rapidement à l’eau courante.

Recouvrir la lame de la solution Fushine laisser agir 20 à 30 secondes, laver et sécher par exemple.

L’observation au microscope :

Les bactéries à Gram +, sont colorées en violet noir.

Les bactéries à Gram -, prennent la couleur rose.

La préparation des tampons et solutions

Tampon K/Na2 à 0,2M, pH7, pour 600ml de tampon :

107

La solution A : la solution de KH2PO4 à 0,2 M. Dissoudre 5,44g (136,96g/mole) dans 200ml

d’eau distillée.

La solution B : La solution de Na2HPO4 à 0,2 M. Dissoudre 11,35g (141,96g/mole), ou

28,65g (358,14g/mole) dans 400ml d’eau distillée.

Mélanger les deux solutions A et B en vérifiant le pH du mélange.

Pour 0,05M de ce même tampon, une dilution de 4 fois est pratiquée.

Tampon Na2/Na à 0,1M, pH7 :

La solution A : la solution de NaH2PO4 à 0,2M. Dissoudre 27,8g (139g/mole) dans 1L.

La solution B : la solution de Na2HPO4 à 0,2M. Dissoudre 28,37g (141,96g/mole) ou 71,62g

(358,14g/mole) dans 1L d’eau distillée.

Mélanger 39ml de A+61ml de B, ajouter l’eau pour avoir 200ml de volume final.

Tampon d’acide citrique à 0,05M, pH2,0 :

Dissoudre 0,21g de l’acide citrique dans 20 ml d’eau distillée. Vérifier le pH.

La préparation des gels (4, 10 et 16%) d’acrylamide pour Tricine SDS-PAGE

Tableau 23 : préparation des gels à 16, 10 et 4% d’acrylamide

Le gel de séparation

16%, (11cm)

Le gel d’espace

10%, (1cm)

Le gel de concentration

4%, (2,4cm)

AB-3 - 0,6 ml 1 ml

AB-6 10 ml - -

Tampon de gel 10ml 1 ml 3 ml

Glycérol 2,5 ml 0,3 ml

ED ajusté à 30 ml 3 ml 12 ml

APS (10%) 250 µl 15 µl 90 µl

TEMED 30 µl 1,5 µl 9 µl

La préparation de la solution AB-3 :

Pour 50 ml de solution : (49,5% T, 3% C), dissoudre 24g d’acrylamide+0,75g de

bisacrylamide dans 50ml d’eau distillée.

La préparation de la solution AB-6 :

Pour 50 ml de solution : (49,5% T, 6% C), dissoudre 23,25g d’acrylamide+1,5g de

bisacrylamide dans 50ml d’eau distillée.

108

La préparation du tampon de gel (1x):

Pour 200ml :

Tris 72,68g

HCl (1/3M) 19,45ml

SDS 0,6ml

pH 8,45

La préparation du tampon de cathode (1x):

Pour 500ml :

Tris 6,08g (+3g)

Tricine 8,95g

SDS 0,5g

pH ≈8,25 (le pH de cette solution doit être égale 8,25 sans correction de pH).

La préparation du tampon d’anode (1x) :

Pour 500ml :

Tris : 0,1 M : 6,08g

HCl : 0,0225 M

pH : 8,9

La solution HCl est préparée pour ajuster le pH de la solution Tris préparée.

La préparation du tampon de charge

Pour 100ml :

SDS 3g

Glycerol 30ml

Bleu de Coomassie G-250 0,05g

Tris/HCl (pH7) 150mM

Mercaptoéthanol 6ml

La préparation de la solution de fixation

Pour 200ml :

Méthanol 100ml

Acide acétique 20ml

Acétate d’ammonium 100mM

La préparation de la solution de coloration

Pour 500ml :

Bleu de Coomassie R250 0,125g


La préparation de la solution de décoloration

Pour 1L :


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Résumé

La production de bactériocines est l’une des activités les plus recherchées, chez les bactéries lactiques, vu son

intérêt dans différentes industries. Notre travail a pour objet de détecter les bactéries bactériocinogènes, dans un

échantillon de 24 souches (10 lactobacilles et 14 leuconostocs), de réaliser une optimisation de la production de

leurs bactériocines et de caractériser ces dernières. Le criblage des interactions négatives, par une méthode

directe, a indiqué que les lactobacilles (91,6%) sont plus inhibiteurs que les leuconostocs (77%). Par une

méthode indirecte, l’effet inhibiteur des surnageants de culture a été mis en évidence puis les agents en cause ont

été caractérisés. Trois souches se sont avérées bactériocinogènes : Lactobacillus sp CHM9 (Bactériocine

CHM9), Lactobacillus sp CHM18 (Bactériocine CHM18) et Leucocnostoc mesenteroïdes subsp dextranicum

CHBK310 (Mésentéricine CHBK310). Cultivées, en milieu MRS supplémenté en extrait de levure et en lait, ces

souches bactériocinogènes voient leur effet inhibiteur amplifié. L’optimisation de la production de la

bactériocine CHM9 a été faite dans un MRS modifié (MRSm) en source d’azote et en source de potassium. Cette

production reste sensiblement stable à différentes températures (25, 30, 35 et 40°C). La meilleure diffusion de

cette bactériocine dans une gélose tamponnée à pH7, a permis une meilleure évaluation de son effet inhibiteur.

La quantité de la bactériocine CHM9, produite en milieu MRSm Tp (pH7) est estimée à 1250 AU/ml. Cette

bactériocine est un métabolite primaire. De manière générale, l’activité de la bactériocine CHM9 n’est affectée

ni par les pH acides ou basiques, ni par les traitements thermiques. Les détergents testés n’ont pas affecté

l’activité de la bactériocine CHM9 qui a été précipitée par le sulfate d’ammonium à 50%. La chromatographie en

gel filtration, a permis de collecter quelques fractions présentant un effet inhibiteur. Par électrophorèse en tricine

SDS-PAGE, le poids moléculaire de la bactériocine CHM9 a été estimé nettement inférieur à 14,4 KDa.

Mots clés : Lactobacillus- Leuconostoc – bactériocine – optimisation – gel filtration – Tricine SDS-PAGE.

Abstract

Bacteriocin production is one of the most studied activities, in lactic acid bacteria, given its interest in various

industries. The aim of our study is to detect the bacteriocinogenic bacteria in a sample of 24 strains (10

lactobacilli and 14 leuconostoc), to optimize bacteriocins production and characterize them. Screening of

negative interactions by a direct method indicated that the lactobacilli (91.6%) are more inhibitors than

leuconostocs (77%). By an indirect method, the inhibitory effect of culture supernatants was shown, and then

inhibiting agents have been characterized. Three strains were found bacteriocinogenics, Lactobacillus sp CHM9

(Bacteriocin CHM9), Lactobacillus sp CHM18 (Bacteriocin CHM18) and Leucocnostoc mesenteroïdes subsp

dextranicum CHBK310 (Mesentericin CHBK310). Cultivated in MRS medium supplemented with yeast extract

and milk, these bacteriocinogenic strains have shown an amplified inhibitory effect. The optimization bacteriocin

CHM9 production was made in a modified MRS (MRSm) in the nitrogen and potassium sources. This

production remains substantially stable at different temperatures (25, 30, 35 and 40°C). The best diffusion of this

bacteriocin in an agar buffered at pH7, allowed a better evaluation of its inhibitory effect. The quantification of

bacteriocin CHM9, produced in MRSm Tp (pH 7) is estimated at 1250 AU/ml. This bacteriocin is a primary

metabolite. In general, the activity of the bacteriocin CHM9 was neither affected by acidic or basic pH nor by

heat treatments. Detergents tested did not affect the activity of the bacteriocin CHM9 which was precipitated by

ammonium sulphate to 50%. The gel filtration chromatography has raised some fractions having an inhibitory

effect. By electrophoresis in tricine SDS-PAGE, the molecular weight of the bacteriocin CHM9 was estimated

clearly below 14.4 kDa.

Keywords: Lactobacillus- Leuconostoc – bacteriocin – optimization –filtration gel – Tricine SDS-PAGE.

ماخص

الهدف من دراستنا . صناعاتمن ال العديدبكتريا حمض اللاكتيك نضرا لاهتمام في سةادر نشاطات الأكثرهو من ضمن ال اتباكتريوسينالإن إنتاج

. إنتاجها و دراستهاتحسين lactobacilles ) 01و (leuconostocs 14 سلالة بكترية 42لباكتريوسين ضمن لعن بكتريا منتجة البحثهو

. leuconostocs (77%)لبكتريا ا من هي أكثر تثبيطا lactobacilles (91,6%)استعمال وسيلة مباشرة لكشف التفاعلات السلبية أن سلالة أظهر

Lactobacillus sp CHM9 : باكتريوسينلللقد وجد ثلاثة سلالات منتجة . إبراز مفعول المادة المثبطة و دراستها مباشرة تم بواسطة طريقة غير

mesenteroïdes subsp dextranicum و CHM18) باكتريوسين( CHM9 , Lactobacillus sp CHM18) باكتريوسين(

Leucocnostoc ) ميزنترسين(CHBK310. الغذائي في الوسط عندما زرعت البكتريا MRS أدى إلى ,إليه خلاصة الخميرة و الحليب فمضا

من حيث مصدر النيتروجين و MRS (MRSm) المتغير الغذائي تم في الوسط CHM9 باكتريوسينالتحسين إنتاج . الباكتريوسينتضاعف انتاج

pH7في وسط باكتريوسينالإسهاب سمح. )درجة مئوية 22و 02 , 42,01 (هدا الإنتاج يبقى مستقر في درجات حرارة مختلفة . مصدر البوتاسيوم

باكتريوسينيعتبر . مل/وحدة كيفية 0421ب MRSm Tp (pH7)المنتجة في الوسط باكتريوسينلليقدر القياس الكمي . هابتقييم أفضل لمفعول

CHM9 باكتريوسيناللا يتأثر نشاط ,بشكل عام. أولي مستقلب CHM9 إن . معالجته حراريا بعدالأساسي ولا في الوسط الحمضي ولا في

كروماتوغرافيا باستعمال هلام تقنية ال أشارت. %21إلى بكبريتات الامونيوم اي تم ترسيبهالت CHM9 باكتريوسينالالمنظفات لم تؤثر على مفعول

باكتريوسينلل الجزيئي إلى أن وزن SDS-PAGE Tricineالتهجير الكهربائي تقنية أبرزت. ترشيح أن بعض أجزاء المجموعة لهم تأثير مثبط

CHM9 دالتونكيلو 14,4اقل بكثير من.

Tricine SDS-PAGE -كروماتوغرافيا هلام ترشيح -إنتاج تحسين -باكتريوسين – Lactobacillus – Leuconostoc : الكلمات الأساسية

Résumé

La Production de bactériocines est l’une des activités les plus recherchées, chezles bactéries lactiques, vu son intérêt dans différentes industries. Notre travail apour objet de détecter les bactéries bactériocinogènes, dans un échantillon de 24souches (10 lactobacilles et 14 leuconostocs), de réaliser une optimisation de laproduction de leurs bactériocines et de caractériser ces dernières. Le criblage desinteractions négatives, par une méthode directe, a indiqué que les lactobacilles(91,6%) sont plus inhibiteurs que les leuconostocs (77%). Par une méthodeindirecte, l’effet inhibiteur des surnageants de culture a été mis en évidence puisles agents en cause ont été caractérisés. Trois souches se sont avéréesbactériocinogènes : Lactobacillus sp CHM9 (Bactériocine CHM9), Lactobacillussp CHM18 (Bactériocine CHM18) et Leucocnostoc mesenteroïdes subspdextranicum CHBK310 (Mésentéricine CHBK310). Cultivées, en milieu MRSsupplémenté en extrait de levure et en lait, ces souches bactériocinogènes voientleur effet inhibiteur amplifié. L’optimisation de la production de la bactériocineCHM9 a été faite dans un MRS modifié (MRSm) en source d’azote et en sourcede potassium. Cette production reste sensiblement stable à différentestempératures (25, 30, 35 et 40°C). La meilleure diffusion de cette bactériocinedans une gélose tamponnée à pH7, a permis une meilleure évaluation de son effetinhibiteur. La quantité de la bactériocine CHM9, produite en milieu MRSm Tp(pH7) est estimée à 1250 AU/ml. Cette bactériocine est un métabolite primaire.De manière générale, l’activité de la bactériocine CHM9 n’est affectée ni par lespH acides ou basiques, ni par les traitements thermiques. Les détergents testésn’ont pas affecté l’activité de la bactériocine CHM9 qui a été précipitée par lesulfate d’ammonium à 50%. La chromatographie en gel filtration, a permis decollecter quelques fractions présentant un effet inhibiteur. Par électrophorèse entricine SDS-PAGE, le poids moléculaire de la bactériocine CHM9 a été estiménettement inférieur à 14,4 KDa.

Mots clés :

Lactobacillus; Leuconostoc; Bactéries lactiques; Bactériocines; Optimisation;

Purification; Caractérisation biochimique; Gel filtration; Tricine SDS-PAGE.

Zahia BENMOUNA - univ-oran1.dz

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