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Cytopathologie non gynécologique

Accepté pour publication le 4 octobre 2006

Tirés à part : E. Piaton, voir adresse en début d’article. e-mail : eric.piaton@chu-lyon.fr

L’immunocytochimie dans les épanchements néoplasiques des séreuses

Eric Piaton(1), Serge Vancina(2), Michèle Cottier(3)

(1) Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, Hôpital Édouard Herriot, 3 place d’Arsonval, 69437 Lyon Cedex 03.

(2) Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, Centre Hospitalier, 42328 Roanne Cedex.(3) Service d’Histologie-Embryologie, Hôpital Nord, 42055 Saint-Étienne Cedex.

Piaton E, Vancina S, Cottier M. L’immunocytochimie dans les épanchements néoplasiques des séreuses. AnnPathol 2006 ; 26 : 327-31.

SummaryImmunocytochemistry in malignant serous effusions

Immunocytochemistry may be of valuable help intyping most malignant serous effusions. Various pre-paratory methods are described including centrifuga-tion and smearing, cytocentrifugation, cell blocks and

liquid based cytology. The value and usefulness ofimmunocytochemistry depends on the experienceof each pathologist. The use of a panel of antibodiesassociating markers of carcinomas with markers ofmesothelial cells is recommended. ✦

Key words: serous fluid, malignant cells, cytopathology,immunocytochemistry.

Résumé

L’immunocytochimie est une techniqued’appoint utile au typage de la plupart desépanchements néoplasiques des séreuses.Les auteurs décrivent les différentes tech-niques utilisables : étalements directs aprèscentrifugation, cytocentrifugation, inclusiondes culots, cytologie en milieu liquide. La

fiabilité des immunomarquages dépend del’expérience et des mises au point faites parchaque utilisateur. Les panels d’anticorpsles plus couramment utilisés associentmarqueurs des carcinomes et des cellulesmésothéliales. ✦

Mots-clés : séreuses, cancer, cytologie, immunocyto-chimie.

Introduction

Depuis de nombreuses années, desanticorps dirigés contre des glycopro-téines membranaires, des antigènes degroupes sanguins, des récepteurs oudes oncoprotéines ont été testés surles épanchements des séreuses, maisaucun ne s’est encore révélé spécifi-que pour un type de cellules, notam-ment celles issues des mésothéliomesmalins (MM). Le recours à des panelsd’anticorps, chacun étant plus ou moinssensible et spécifique, est donc indis-pensable [1-3]. Parmi les anticorps dis-ponibles, certains déjà anciens gardentun intérêt tels l’EMA, la vimentine, l’ACE,

le TAG-72, l’HBME-1, tandis que d’autres,décrits plus récemment, sont réelle-ment utiles au diagnostic mais plus dif-ficiles à mettre en œuvre : il s’agit descytokératines 5 et 6 (CK5/6) [2], de lacalrétinine [4, 5] et du TTF-1 [6, 7].L’approche cytologique pose des pro-blèmes spécifiques liés à une richessevariable en matériel, à une conservationproblématique des antigènes, à uneperte d’information parfois liée audémasquage antigénique, et à une faiblereproductibilité par rapport aux étudestissulaires. Pour ces diverses raisons, denombreux pathologistes préfèrent tra-vailler sur coupe de culots inclus.Les discordances observées entrel’approche tissulaire et cellulaire

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peuvent résulter de modifications de lastructure tertiaire des glycoprotéines indui-tes par la fixation et le traitement des cou-pes. Les coupes autorisent un contact directdes anticorps avec les sites antigéniques,alors que les groupements vus en cytologiegardent une cohésion limitant l’accessibilitéaux antigènes. De ce fait, il est difficiled’appliquer à la cytologie le même raisonne-ment qu’à l’immunohistochimie.Alors même que la plupart des travaux ana-lysent des marquages effectués sur du maté-riel biopsique, chirurgical ou sur des culotsinclus en paraffine, les taux de positivitépour un même marqueur sont très variablesd’une étude à l’autre. Par ailleurs, il est difficilede tirer des conclusions d’un seul marquage :un panel d’anticorps est plus pertinent qu’unou deux marqueurs ciblés, et on disposemaintenant de marqueurs fiables des cellu-les mésothéliales, notamment les CK5/6 et lacalrétinine. D’autre part il existe de nombreuxmarqueurs des cellules glandulaires qu’ilest nécessaire d’associer aux précédents.Un marquage doit néanmoins toujours êtreinterprété en fonction du type cellulaire, dela localisation du signal et de la validité destémoins. Rappelons aussi que la morpholo-gie reste la base de la démarche diagnosti-que, l’ICC ne venant que pour essayer deconfirmer ou d’infirmer une hypothèse.

Les différentes techniques applicables

On peut obtenir de bons marquages grâceau Kit LSAB2* (réf. K0676, Dakocytomation)à la phosphatase alcaline (figure 1). La qua-

lité du marquage dépend des délais : 1) deréalisation des étalements et 2) de mise enœuvre de la technique ICC : plus les délaisseront courts, meilleurs seront les résultats.Dans tous les cas, les suspensions cellulairesdoivent être centrifugées dans des tubes àfond conique (1 200 tours/minute, 10 minu-tes). Le culot cellulaire peut ensuite êtretraité de différentes façons :

Étalements séchés à l’air

Ils sont bien adaptés à une prise en chargerapide. Pour les liquides paucicellulaires(moins de 50 éléments/mm3 après numéra-tion sur une cellule de Thoma), le culotcellulaire est repris avec 500 μl de surna-geant et cytocentrifugé sur 2 lames pen-dant 10 minutes à 600 tours/minute. Dans cecas, l’utilisation de lames électronégativesou silanisées est indispensable. L’usaged’albumine est proscrit en raison de l’obten-tion d’un marquage de fond non spécifique.Pour les liquides riches, le culot sera directe-ment étalé. Les meilleurs résultats sont obte-nus avec une technique rapide du liquidefrais, sans congélation. Éventuellement, unculot abondant peut être conservé dans unmilieu de culture cellulaire comme le RPMIpendant quelques heures à + 4 °C avant la réa-lisation des étalements. D’après la littératurerécente, les lames ainsi préparées pour ICCpeuvent être emballées dans du papier alumi-nium sans fixation et placées à – 20 °C pen-dant 12 mois au maximum.

Étalements fixés

Les étalements doivent être immédiatementfixés pendant 10 minutes à températureambiante, soit dans l’éthanol à 95 % pourla recherche de marqueurs épithéliaux, soitdans l’acétone pour la recherche de mar-queurs lymphoïdes. On peut ensuite conser-ver les lames à + 4 °C pendant une à deuxsemaines en présence de dessicant. Leslames peuvent également être immédiate-ment fixées dans un mélange méthanol/acé-tone (V/V) à + 4 °C pendant 1 minute 30 puiscongelées à – 20 °C dans une boite sansemballage individuel sous aluminium. Pourla recherche de marqueurs nucléaires (RE/RP) une fixation par le paraformaldéhyde à4 % ou le formol tamponné à 3,7 % est pré-férable, suivie d’une perméabilisation douce(solution à 0,2 % de Triton X100 dans le PBSou le TBS, 5 à 10 minutes) [8].

FIG. 1. — Cellules mésothéliales marquées par HBME-1, asso-ciées à des cellules carcinomateuses négatives. Étalement direct congelé (PAAP, × 630).

FIG. 1. — HBME-1 labelling of reactive mesothelial cells associa-ted with negative tumor cells. Smearing and rapid freezing (PAAP, ×630).

Imunocytochimie dans les séreuses

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Inclusion des culots et coupes

Les coupes de blocs obtenus après fixationformolée ou en AFA et inclusion en paraffinedonnent de très bons résultats si elles sonttraitées rapidement [4, 6] (figures 2 et 3). Lekit Cytoblock® de Shandon utilisé avec unefixation au formol sans tampon phosphate(ou à l’éthanol à 50 %) donne également desrésultats satisfaisants. Les procédures deconcentration, de fixation et de solidificationdu culot peuvent être réalisées dans le mêmetube de centrifugation [9].L’inclusion des culots permet d’éviter la plu-part des problèmes de réactivité non spéci-fique (bruit de fond) et autorise l’utilisationd’un large panel d’anticorps. Les coupes sontmontées sur lames prétraitées et séchées.Selon les anticorps, un démasquage antigé-nique par digestion enzymatique et un trai-tement par micro-ondes ou autoclave peutêtre nécessaire. Des études comparativesmontreraient une meilleure qualité pourl’ICC obtenue après inclusion du culot parrapport à la cytologie en milieu liquide utili-sant la méthode ThinPrep® [10].

Cytologie en milieu liquide

Le culot de centrifugation doit être rincé dansdu PBS deux fois pour éliminer les protéineset placé dans 30 ml de Cytolyt® (techniqueCytyc) pendant 15 minutes à températureambiante. Après centrifugation, le culot estplacé dans le PreservCyt®. Dans l’éventualitéd’immunomarquages, le reliquat de prélè-vement est systématiquement conservé à

+ 4 °C. Les lames sont préparées le jour de laréalisation des marquages et sont fixées dansle méthanol-acétone pendant 1 minute 30.La dilution des anticorps doit être adaptée àla technique en milieu liquide. De même,l’hématoxyline devra être diluée pour facili-ter l’interprétation [11].

Les marqueurs utilisables en pratique

De nombreux anticorps sont utilisables :certains, déjà connus, (ACE, HBME-1…) sontfaciles à mettre en œuvre et rendent tou-jours service. D’autres, plus récents, sontassez spécifiques mais difficiles à manipuler,notamment les marqueurs nucléairescomme le TTF-1 et la calrétinine.Concernant les marqueurs des carcinomes,l’ACE garde un certain intérêt : il est exprimédans plus de 85 % des adénocarcinomes etgénéralement pas dans les cellules méso-théliales réactionnelles ni dans les MM [12].Les MM sont généralement négatifs avec lesanti-ACE monoclonaux comme le A5B7 [1].Le Ber-EP4 est exprimé dans les cellules épi-théliales (30 à 95 % des adénocarcinomes)mais pas dans les cellules mésothéliales(rares cas de MM positifs) [13]. L’anticorpsB72.3 (TAG-72) est réactif au niveau membra-naire dans de nombreux adénocarcinomes,alors que 10 % des MM sont marqués (réac-tivité faible et focale). Les hyperplasies méso-théliales sont négatives, aussi bien dans lesétudes tissulaires que dans les épanche-ments [8]. Le TTF-1 doit s’exprimer par un

FIG. 2. — Marquage par les CK5/6 dans un cas de mésothéliome malin épithélioïde pleural. Inclusion du culot (UltraView TM DAB system, Ventana, × 400).

FIG. 2. — CK5/6 labelling in a case of malignant mesothelioma, epithelioid type. Inclusion of the cell pellet (UltraViewTM DAB sys-tem, Ventana, ×400).

FIG. 3. — Marquage par la calrétinine dans une tumeur pleurale évoquant un mésothéliome malin également positive avec l’EMA. Inclusion du culot (UltraViewTM DAB system, Ventana, × 400).

FIG. 3. — Calretinin labelling in a pleural tumor suspicious for malignant mesothelioma also stained with EMA. Inclusion of the cell pellet (UltraViewTM DAB system, Ventana, ×400).

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marquage exclusivement nucléaire pour êtreinterprétable (figure 4). Plusieurs études por-tant sur des pleurésies et ascites néoplasiquesmontent qu’il existe un marquage nucléairedans plus de 85 % des adénocarcinomesd’origine pulmonaire, alors que ceux prove-nant d’adénocarcinomes extrapulmonairessont négatifs [6, 7].Parmi les marqueurs mésothéliaux bienconnus, la vimentine est exprimée par lescellules normales et réactionnelles, maisaussi par un certain nombre d’adénocarci-nomes [3]. La desmine pourrait être utiliséedans le diagnostic différentiel entre hyper-plasie mésothéliale réactionnelle et proli-fération cancéreuse : en effet elle seraitexprimée dans 80 % des hyperplasies envi-ron [1] contre moins de 10 % des MM et 2 %des adénocarcinomes. La desmine et lacalrétinine peuvent être utiles conjointe-ment, avec une expression commune dansplus de 90 % des hyperplasies mésothélialeset MM, et dans seulement 3 % des adéno-carcinomes [8, 13]. Les mucines épithélialesde type EMA donnent un marquage mem-branaire, soulignant le glycocalyx associéaux microvillosités. La plupart des experts,notamment ceux du groupe Mésopath utili-sent la positivité membranaire et focale del’EMA comme un critère présomptif de mali-gnité dans les proliférations mésothélialesatypiques [15]. L’HBME-1 est facile à utiliseret permet un bon repérage des cellulesmésothéliales (figure 1). La calrétinine montreun marquage double nucléaire et cytoplas-mique avec un aspect en « œuf frit » mieuxvisible sur les étalements qu’après inclusion(figure 3) [4, 5]. Les CK5/6, selon les études,marqueraient jusqu’à 90 % des MM contreseulement 0 à 15 % des adénocarcinomes,

ces chiffres étant rapportés sur matérielchirurgical [2, 13]. Le marquage est typique-ment péricellulaire (figure 2).

Conclusion

Diverses techniques préparatoires sontapplicables aux épanchements des séreu-ses, et l’ICC reste utile en complément del’examen morphologique standard. Les anti-corps disponibles sur le marché sont nom-breux, mais malgré les nombreuses étudespubliées, il n’existe pas encore de panelconsensuel de fiabilité diagnostique suffi-sante dans l’exploration des épanchementsnéoplasiques. ■

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FIG. 4. — Marquage par le TTF-1 dans un cas d’adénocarcinome papillaire pulmonaire avec extension pleurale. Cytocentrifugation (PAAP, × 630).

FIG. 4. — TTF-1 labelling in a case of papillary pulmonary adeno-carcinoma metastatic to the pleura. Cytocentrifugation (PAAP, ×630).

Imunocytochimie dans les séreuses

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