Séance 5.Chapitre 4 : LA BIOLOGIE MOLECULAIRE ET SES APPLICATIONS

I/ Les outils de la génétique moléculaire.

Voir en annexe, un tableau résumant toutes les techniques de la génétique moléculaire.

1. Découverte des enzymes de restriction.(Pages 126/127)

A l'aube des années 1970, bien que les bases de l'expression des gènes soit de mieux en mieuxcomprises, on ne sait pas les isoler pour en faire une étude approfondie. Un pas décisif sur le plantechnique va permettre de mettre au point les "outils du génie génétique".

http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbioch/POLY.Chp.5.3.htmlhttp://www.edu.upmc.fr/sdv/masselot_05001/genes_et_genomes/fragmentation.html

a) Des outils pour étudier les gènes.Des travaux furent menés à bien en 1965 par Werner ARBER, Daniel NATHANS et Hamilton SMITH

qui obtiendront le prix Nobel en 1978: ils découvrent les enzymes de restriction (endonucléases)permettant de découper l'ADN en petits segments à des endroits déterminés. Les enzymes de restriction sont produites par les bactéries lorsqu'elles sont infectées par un bactériophage :http://membres.lycos.fr/carcinus/GENETIQUE/GENBACT/Bacteriophage.htmlUne animation : http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/tpgenetmic/Animation%20flash/propagation.swf

- Aber découvre en 1962 que des bactéries sont capables de se protéger de l'infection par un virus, endécoupant l'ADN viral : phénomène de restriction.

- Smith isole les enzymes responsables : enzymes de restriction.- Nathans transforme les enzymes de restriction en outils.

Mais, contrairementaux DNases connuesjusque là, qui coupentl'ADN au hasard, lesDNases de restrictionsont capables de couperl'ADN en des sitesdéterminés: ellesreconnaissent uneséquence de bases etcoupent l'ADN chaquefois qu'elles larencontrent.

Les chercheurs disposent à l'heure actuelle de plusieurs centaines de telles enzymes, véritables"ciseaux moléculaires" (Eco Ri, Hind III, Taq I...) reconnaissant des séquences de bases spécifiques etengendrant des fragments d'ADN dont les extrémités forment de véritables "bouts collants".

Cette propriété en fait des outils de choix permettant de découper l'ADN pratiquement où l'on veutnon seulement pour isoler des gènes, mais aussi pour les insérer dans des phages ou des plasmides quise révélèrent d'excellents vecteurs pour multiplier des gènes étrangers.

L'hybridation de deux molécules d'ADN provenant de deux espèces différentes nécessite la souduredes fragments obtenus après action des enzymes de restriction. Une enzyme, l'ADN ligase, facilite laréassociation des "bouts collants" par le biais de la complémentarité de leurs bases.

 L'ARN polymérase est un

complexe enzymatique quiassure plusieurs fonctions:

- Reconnaissance surl'ADN des signaux génétiquesqui permettent de commenceret de terminer la synthèsed'ARNm en des sites précis,

- Ouverture de la moléculed'ADN au niveau des liaisonslabiles qui unissent les deuxbrins,

- Polymérisation desnucléotides dans un ordreimposé par la complémentaritédes bases des nucléotides del'ARN et de celles desnucléotides d'une des deuxchaînes transcrites de l'ADN.

 En 1970, Howard Martin TEMIN et David BALTIMORE isolent, à partir de virus, la transcriptase

inverse, une enzyme capable de réaliser l'opération inverse de celle de l'ARN polymérase, qui permetd'obtenir de l'ADN à partir de l'ARN. Ils seront récompensés par le Nobel en 1975 avec RenatoDULBECCO.

Son utilisation rend possible la synthèse d'un gène à partir de l'ARNm gouvernant l'assemblaged'une protéine. On obtient d'abord une copie d'ADN simple brin, puis à l'aide d'autres enzymesspécifiques, une copie double brin d'ADN complémentaire (ADNc).

L'hybridation ultérieure de ce gène avec un autre ADN exige la formation de nouveaux "boutscollants" à chacune de ses extrémités.

b) Principe d’établissement d’une carte de restriction : étudier les fragments de restriction :

Exercice méthodologique:

L'objectif est de rechercher les positions relatives des sites de coupures par deux enzymes de restrictionsur un échantillon d'ADN de longueur 5 000 pb (paires de bases).

A -Les chercheurs disposent de nombreux exemplaires d'un échantillon d'ADN, obtenus parclonage de l'échantillon initial. Ce matériel est divisé en deux lots équivalents et chaque lot est soumis àl'action d'une enzyme de restriction, l'enzyme A pour un lot, l'enzyme B pour l'autre lot.

On rappelle qu'une enzyme de restriction coupe l'ADN chaque fois qu'elle rencontre un site précis, différentd'une enzyme à l'autre. L'attaque enzymatique est conduite de façon telle que tous les sites spécifiques de l'enzymeA pour un lot, de l'enzyme B pour l'autre lot, sont coupés.

Chaque lot d'ADN est alors soumis à une électrophorèse (page 140) qui sépare les fragmentsd'ADN obtenus selon leur taille. Une électrophorèse témoin consistant à séparer des fragments d'ADNde taille connue permet de disposer d'une échelle des tailles (exprimée ici en paires de bases). Lesrésultats de ces premières électrophorèses sont présentés sur le document.

Combien l'échantillon d'ADN initial présentait-il de sites de coupure pour l'enzyme A ? pourl'enzyme B ?

Montrez à l'aide de schémas simples qu'il n'est pas possible de reconstituer avec certitude ladisposition relative des fragments obtenus par l'action d'une enzyme de restriction (A ou B).

B - Chaque ensemble de fragments obtenus par action de l'enzyme A est alors isolé et traité parl'enzyme B.

Dans chaque cas, une nouvelle électrophorèse sépare les fragments éventuellement obtenus.La même opération est réalisée pour les fragments obtenus au départ par l'action de l'enzyme B qui

sont soumis à l'action de l'enzyme A. Les résultats de ces électrophorèses sont présentés sur ledocument.

  Comparez le résultat de l'action

- de A sur le fragment de 2 500 pb découpé par B ;- de B sur le fragment de 2 100 pb découpé par A.

Illustrez par un schéma la conclusion se dégageant de cette comparaison. Poursuivez cette comparaison méthodique de couples de fragments convenablement choisis

et proposez une "carte" montrant les positions relatives des sites de coupure pour A et B surl'échantillon d'ADN initial.

Exercice 2 page 145.TP ANAGENE.

2.Le clonage et le séquençage des gènes.

a) La technique du southern blot.(Page 127)

- L'ADN est traité par une enzyme de restriction: plusieurs milliers de fragments de taillesdifférentes sont ainsi produits.

- Le mélange est disposé dans un puits d'une plaque de gel d'agarose et soumis à une électrophorèsequi provoque la migration des fragments, d'autant plus vite qu'ils sont petits.

- Après dénaturation de l'ADN (séparation des brins complémentaires), la plaque est mise au contactd'un filtre de nitrocellulose qui recueille une empreinte ("blot") du gel.

- Le filtre est immergé dans une solution contenant une sonde moléculaire radioactive (fragmentd'ADN reconnaissant une séquence du génome) pendant quelques heures à 65°C: celle-ci se fixe sur lesfragments complémentaires. Le filtre est ensuite rincé pour éliminer les sondes non fixées.

- On procède à la révélation de l'emplacement de la sonde et donc des fragments complémentairespar une technique appropriée : autoradiographie pour les sondes radioactives, photographie pour les

sondes fluorescentes, réactions enzymatiques pour les ligands reconnus par des protéines spécifiques.

Cette technique est très sensible et permet de reconnaître un fragment sur les milliers au départ. Ellepermet ainsi de faire la recherche simultanée chez plusieurs individus et de procurer une carte génétiqued'une grande spécificité et fiabilité, par construction d'une carte de restriction. L'analyse est appeléepolymorphisme de longueurs de fragments de restriction (RFLP: "restriction fragment lengthpolymorphism).

b) Le clonage d’un gène (page 128)

Les enzymes de restriction ont ouvert la voie au clonage des gènes à partir de 1972, dans le but de lesreproduire.

 Supposons que l'ADN d'une cellule humaine ait été découpé et ses fragments transférés chez E.coli:

on dispose ainsi d'une "banque génomique" constituée de milliers de clones bactériens différents, chacunayant multiplié un fragment du génome humain. La technique du Southern blot permet de repérer leclone ayant incorporé le gène recherché.

Une fois le gène isolé, il est introduit dans un vecteur qui permet son amplification et son stockagedans une cellule vivante, généralement une bactérie.

De nombreusesbactéries contiennentun ou plusieursplasmides: la plupartsont des moléculesd'ADN circulairesdouble-brin,beaucoup plus petitequ'un chromosome de3 à 10 kb (milliers depaires de bases). Les plasmidessont largement utilisésdans les techniques del'ADN recombinant

On sait depuis quelques années introduire et faire exprimer de l'ADN dans des cellules eucaryotes(levure, cellules de Mammifères en culture, cellules résultant des premières divisions de l'oeuf d'unmammifère par exemple). On peut ainsi, après un clonage dans Escherichia coli, réintroduire le gènecloné dans des cellules eucaryotes et le faire exprimer.c) le séquençage de l’ADN. (Page 129)

Le séquençage de l'ADN consiste à déterminer l'ordre des nucléotides sur la molécule d'ADN. C'est lemoyen le plus précis pour rechercher la présence de mutations ponctuelles dans un gène.La méthode utilisée aujourd'hui, proposée par F. SANGER en 1977, qui a obtenu le prix Nobel de chimieen 1980, est devenue aujourd'hui une technique rapide et fiable utilisée fréquemment dans le diagnosticdes maladies héréditaires.http://www.cns.fr/externe/Francais/Questions/

Annexe : les outils du génie génétique :

Couper l'ADN Les endonucléases ou enzymes de restriction peuvent, in vitro, couperspécifiquement une séquence d'ADN (double brin)

Coller l'ADN

(recombiner)

Les ligases sont des enzymes capables in vitro de lier deux molécules d'ADN parliaisons covalentes (une sur chaque brin). Si leurs extrémités sont cohésives etcomplémentaires, on peut ainsi former une molécule d'ADN hybride avec deuxADN provenant d'organismes différents (ADN chimère). C'est notamment le casde l'insertion d'un ADN étranger, isolé par une enzyme de restriction, dans unplasmide coupé par cette même enzyme de restriction.

Dupliquer(multiplier, cloner)

l'ADN

* Multiplication in vivo par l'ADN polymérase.- La multiplication d'une séquence d'ADN était auparavant conditionnée par soninsertion dans un vecteur d'insertion (virus ou plasmide) que l'on introduisait àson tour dans un vecteur de multiplication (bactérie ou cellule eucaryote commela levure) qui, en se multipliant, reproduisait la séquence d'ADN insérée (géniegénétique). Cette technique est connue sous le nom de clonage d'un gène(isolement, insertion, multiplication). http://www.edumedia-sciences.com/m218_l1-biologie-moleculaire.html

*Multiplication in vitro par amplification enzymatique par l'ADN polyméraseextraite d'une bactérie thermophile. C'est notamment la technique de l'APR(amplification en chaîne par polymérase: ce terme doit remplacer en français laPCR (polymérisation en chaîne de l'ADN)): qui permet de produire de grandesquantités d'un fragment d'ADN sans le cloner.http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htmhttp://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

Synthétiser del'ADN

Cette synthèse d'ADN artificiel peut être contrôlée de façon à obtenir de l'ADNde séquence déterminée. Cette technique n'est au point que pour desoligonucléotides (quelques dizaines de nucléotides).

Dénaturer l'ADN La dénaturation de l'ADN est la séparation des deux brins (par rupture desliaisons hydrogène) ; elle s'obtient par simple chauffage modéré (vers 60°C) et estalors réversible. A plus haute température il peut y avoir rupture des liaisonscovalentes entre et à l'intérieur des nucléotides et les brins sont altérés; ladénaturation est alors irréversible.

Hybrider l'ADN

(Apparier desséquences d'ADN

ou d'ADN etd'ARN

complémentaires)

On peut hybrider (c'est-à-dire associer artificiellement) des brins d'ADN (qu'ilfaut donc avoir séparé auparavant par dénaturation) venant de molécules.

C'est encore l'hybridation mais cette fois c'est son caractère spécifique qui estemployé pour l'hybridation d'une sonde (courte séquence marquéeradioactivement (sonde chaude) ou non (sonde froide, par exemple sondefluorescente, FISH(http://www.pasteur.fr/recherche/unites/biophyadn/f-Ffish.html) avec une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire au sein d'ungrand nombre de molécules d'acides nucléiques.

Les techniques de Northern et Southern blot appliquées respectivement auxmolécules d'ARN et d'ADN simple brin permettent de visualiser rapidementl'hybridation entre une sonde radioactive et des acides nucléiques simple brinséparés par électrophorèse sur gel et transférés par effet buvard sur une feuille denitrocellulose. On qualifie de "Western blot" une technique assez similaire à partirde protéines.

Transcrire l'ADNen ARN

la transcription est réalisée in vivo par de gros complexes enzymatiquescontenant une ARN polymérase, in vitro elle peut être obtenue avec unrendement plus faible.

« Retro-transcrire"l'ARN en ADN =

"transcriptioninverse"

Les enzymes de type transcriptase inverse (ou reverse, capables de catalyser lasynthèse d'un ADN monobrin (dit ADNc ou ADN complémentaire à partir d'unARN).

"transcriptioninverse"

ARN).

Insérer l'ADN dansune cellule

(Transformer unorganisme partransgenèse)

ADN peut être inséré :* chez les procaryotes et quelques cellules eucaryotes comme la levure de bière,par l'intermédiaire d'un vecteur d'insertion de type phage, virus, plasmide,* chez les eucaryotes par micro-injection (à l'aide d'une micropipette et d'unmicromanipulateur), électroporation (exposition brève à un courant électrique detrès haut voltage de cellules de mammifères ou de plantes en présence d'ADN àinsérer), bombardement (fusil à gènes avec des microprojectiles couverts d'ADN,utilisé notamment pour obtenir des maïs transgéniques), agitation ou parl'intermédiaire d'un vecteur d'insertion bactérien.

Exprimer un gèneL'insertion du vecteur dans la cellule transformée qui se multiplie n'implique pasque le gène inséré soit exprimé. On utilise des vecteurs d'expression qui sontsouvent des dérivés du plasmide pBR322 d'E. coli qui contient les signauxnécessaires à la transcription et à la traduction

Séparer séquencer

La méthode diffère totalement selon la longueur de la molécule d'ADN que l'onveut séquencer.

*La cartographie de restriction : l'action d'une (ou de plusieurs) enzyme(s) derestriction sur des molécules d'ADN données fournit un ensemble de fragmentsde tailles variées qui dépend de la séquence de l'ADN coupé. Les fragments (dits"fragments de restriction" d'une taille de quelques milliers à quelques dizainesde milliers de paires de nucléotides) peuvent être séparés et leur taille évaluée.Ce qui permet, par comparaison de l'action de plusieurs enzymes de restriction,l'établissement de ce que l'on appelle une carte de restriction. On peut doncpenser que deux cellules possédant la même information génétique aurontexactement la même carte de restriction. De la même manière, deux cellules defonction identique mais prise chez deux individus différents, sont supposéesavoir des cartes de restriction différentes mais voisines.* L'électrophorèse sur gel.