Jai fait séquencer mes petits ARN. Et Maintenant ? [email protected] Introduction à...

J’ai fait séquencer mes petits ARN.J’ai fait séquencer mes petits ARN.Et Maintenant ?Et Maintenant ?

[email protected]

Introduction à l’analyse des données de séquençage à haut débit en génomique fonctionnelle.28 mars 2012, 15:30 – 17:00

http://drosophile.org

Les trois principales Les trois principales classes de petits ARNs chez classes de petits ARNs chez

la drosophilela drosophile

metHen1

Produits des snoRNA, tRNA, rRNA.2S Droso (30nt)+

20-30nt RNA gel purification

small RNA deep sequencingsmall RNA deep sequencing

(Biases)

Library “Bar coding”

Que Puis-je Faire avec mes Que Puis-je Faire avec mes séquences de petits ARN ?séquences de petits ARN ?

AnnotationAnnotation VisualisationVisualisation Découverte de lociDécouverte de loci Quantification d’expressionQuantification d’expression Analyse structurale des précurseurs, signatures, …Analyse structurale des précurseurs, signatures, … Mise en évidence de « visiteurs » (virus, …)Mise en évidence de « visiteurs » (virus, …) ……

Informatique Bioinformatique

MatérielMatériel

Un fichier de séquence au format fastqUn fichier de séquence au format fastq Un ordinateur avec ~ 8 Mo RAMUn ordinateur avec ~ 8 Mo RAM Un « Operating System Unix compliant »Un « Operating System Unix compliant » Un maniement confortable de cet OSUn maniement confortable de cet OS Quelques logiciels génériques très utilesQuelques logiciels génériques très utiles

Un « vrai » éditeur de texte (TextWrangler, etc..)Un « vrai » éditeur de texte (TextWrangler, etc..) R, R, GnuplotGnuplot

…… Une bonne connaissance du webUne bonne connaissance du web Le maniement niveau DébutantLe maniement niveau Débutant++++ d’un langage de programmation d’un langage de programmation

PerlPerl PythonPython

Que contient le gros fichier Que contient le gros fichier fastqfastq que j’ai que j’ai téléchargé (et décompressé) ?téléchargé (et décompressé) ?

* Limite max pour ouvrir un gros fichier texte (~1.2 Go)Terminal Unix. Naviguer dans le dossier qui contient le fichierTaper la commande more <nom_du_fichier>

lbcd-05:GKG13demo deepseq$ more GKG-13.fastq @HWIEAS210R_0028:2:1:3019:1114#AGAAGA/1TNGGAACTTCATACCGTGCTCTCTGTAGGCACCATCAA+HWIEAS210R_0028:2:1:3019:1114#AGAAGA/1bBb`bfffffhhhhhhhhhhhhhhhhhhhfhhhhhhgh@HWIEAS210R_0028:2:1:3925:1114#AGAAGA/1TNCTTGGACTACATATGGTTGAGGGTTGTACTGTAGGC+HWIEAS210R_0028:2:1:3925:1114#AGAAGA/1]B]VWaaaaaagggfggggggcggggegdgfgeggbab@HWIEAS210R_0028:2:1:6220:1114#AGAAGA/1TNGGAACTTCATACCGTGCTCTCTGTAGGCACCATCAA+HWIEAS210R_0028:2:1:6220:1114#AGAAGA/1aB^^afffffhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhchhhh@HWIEAS210R_0028:2:1:6252:1115#AGAAGA/1TNCTTGGACTACATATGGTTGAGGGTTGTACTGTAGGC+HWIEAS210R_0028:2:1:6252:1115#AGAAGA/1aBa^\ddeeehhhhhhhhhhhhhhhhghhhhhhhefff@HWIEAS210R_0028:2:1:6534:1114#AGAAGA/1TNAATGCACTATCTGGTACGACTGTAGGCACCATCAAT+HWIEAS210R_0028:2:1:6534:1114#AGAAGA/1aB\^^eeeeegcggfffffffcfffgcgcfffffR^^]@HWIEAS210R_0028:2:1:8869:1114#AGAAGA/1GNGGACTGAAGTGGAGCTGTAGGCACCATCAATAGATC+HWIEAS210R_0028:2:1:8869:1114#AGAAGA/1aBaaaeeeeehhhhhhhhhhhhfgfhhgfhhhhgga^^

………

Combien de séquences dans mon fichier ?Combien de séquences dans mon fichier ?

Terminal Unix. Naviguer dans le dossier qui contient le fichier Taper la commande wc - l <nom_du_fichier>

lbcd-05:GKG13demo deepseq$ wc -l GKG-13.fastq

25703828 GKG-13.fastq

>>> 25 703 828 / 46 425 957 séquences

Mes séquences contiennent-elles le bon adaptateur ?Mes séquences contiennent-elles le bon adaptateur ?

Taper la commande cat <nom_du_fichier> | grep CTGTAGG | wc -l

lbcd-05:GKG13demo deepseq$ wc -l GKG-13.fastq | grep CTGTAGG | wc -l

6355061

6 355 061 sur6 425 957 séquencesPas mal

Séquence de mon adaptateur: CTGTAGGCACCATCAAT

lbcd-05:GKG13demo deepseq$ wc -l GKG-13.fastq | grep ATCTCGT| wc -l

308

A contrario

Quelle est la qualité de mes séquences ?Quelle est la qualité de mes séquences ?

http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

Comment retirer l’adaptateur ?Comment retirer l’adaptateur ?

deepseq$ fastq_to_fasta -r –n -i GKG-13.fastq -o GKG-13.fasta

Séquence de mon adaptateur: CTGTAGGCACCATCAAT

http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html

deepseq$ more GKG-13.fasta >1AATGGCACTGGAAGAATTCACCTGTAGGCACCATCAAT>2TCTCGGTAGAACCTCCACTGTAGGCACCATCAATAGAT>3TTTGTGACCGACACTAACGGGTACTGTAGGCACCATCA>4TGGAATGTAAAGAAGTATGGAGCTGTAGGCACCATCAA>5GTCAGCAACTTGATTCCAGCAATCTGTAGGCACCATCA>6AATGGCACTGGAAGAATTCACGGGCTGTAGGCACCATC>7TGGAAGACTAGTGATTTTGTTCTGTAGGCACCATCAAT>8TGAACACAGCTGGTGGTATCCCTGTAGGCACCATCAAT

deepseq$ fastx_clipper -a CTGTAGGCACCATCAAT -l 18 -i GKG-13.fasta -o GKG-13_clipped.fasta

deepseq$ more GKG-13_clipped.fasta

>18AATGGCACTGGAAGAATTCAC>20TTTGTGACCGACACTAACGGGTA>21TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG>22GTCAGCAACTTGATTCCAGCAAT>23AATGGCACTGGAAGAATTCACGGG>24TGGAAGACTAGTGATTTTGTT>25TGAACACAGCTGGTGGTATCC>26TAAGTACTAGTGCCGCAGGA>27TGAACACAGCTGGTGGTATC>28TAGGAACTTCATACCGTGCTCT

deepseq$ fastq_to_fasta -r -n -i GKG-13.fastq |

fastx_clipper -a CTGTAGGCACCATCAAT -l 18 -o GKG-13_clip-pipe.fasta

J’utilise fastx_clipper et fastQC pour visualiser la J’utilise fastx_clipper et fastQC pour visualiser la distribution de taille de mes séquencesdistribution de taille de mes séquences

deepseq$ fastx_clipper -a CTGTAGGCACCATCAAT -l 0 -i GKG-13.fastq -o GKG-13_clipped.fastq

deepseq$ more GKG-13_clipped.fastq @HWIEAS210R_0028:2:1:1313:1120#AGAAGA/1AATGGCACTGGAAGAATTCAC+HWIEAS210R_0028:2:1:1313:1120#AGAAGA/1fe\gggd\fgeeeggdaggag@HWIEAS210R_0028:2:1:1387:1119#AGAAGA/1TCTCGGTAGAACCTCCA+HWIEAS210R_0028:2:1:1387:1119#AGAAGA/1gggggeggfffgggfff@HWIEAS210R_0028:2:1:1849:1120#AGAAGA/1TTTGTGACCGACACTAACGGGTA+HWIEAS210R_0028:2:1:1849:1120#AGAAGA/1hhhhhhhhhfhgfhhhhgehhha

http://bowtie-bio.sourceforge.net/

Bowtie aligne des reads sur un génome de référence préalablement préparéJe télécharge Bowtie, je l’installe, et je lis le manuel

Je télécharge mon génome au format FASTAJe prépare mon « index » Bowtie

deepseq$ bowtie-build fasta_libraries/dmel-all-chromosome-r5.37.fasta dmel-r5.37

~5 mindeepseq$ ls –laht-rw-r--r-- 1 deepseq staff 49M Mar 24 17:24 dmel-r5.37.rev.1.ebwt-rw-r--r-- 1 deepseq staff 19M Mar 24 17:24 dmel-r5.37.rev.2.ebwt-rw-r--r-- 1 deepseq staff 49M Mar 24 17:20 dmel-r5.37.1.ebwt-rw-r--r-- 1 deepseq staff 19M Mar 24 17:20 dmel-r5.37.2.ebwt-rw-r--r-- 1 deepseq staff 331K Mar 24 17:16 dmel-r5.37.3.ebwt-rw-r--r-- 1 deepseq staff 39M Mar 24 17:16 dmel-r5.37.4.ebwt

deepseq$ bowtie ~/bin/bowtie/indexes/5.43_Dmel/5.43_Dmel -f GKG-13_clip-pipe.fasta -v 1 -k 1 -p 12 --al droso_matched_GKG-13.fa --un unmatched_GKG13.fa > GKG13_bowtie_output.tabulated

J’aligne mes reads avec bowtieJ’aligne mes reads avec bowtie

~/bin/bowtie/indexes/5.43_Dmel/5.43_Dmel-f GKG-13_clip-pipe.fasta-v 1-k 1-p 12--al droso_matched_GKG-13.fa--un unmatched_GKG13.fa> GKG13_bowtie_output.tabulated

# reads processed: 5997502# reads with at least one reported alignment: 5045151 (84.12%)# reads that failed to align: 952351 (15.88%)Reported 5045151 alignments to 1 output stream(s)

… … et je récupèreet je récupèredeepseq$ ls -laht-rw-r--r-- 1 deepseq staff 351M Mar 24 17:46 GKG13_bowtie_output.tabulated-rw-r--r-- 1 deepseq staff 156M Mar 24 17:46 droso_matched_GKG-13.fa-rw-r--r-- 1 deepseq staff 28M Mar 24 17:46 unmatched_GKG13.fa

deepseq$ more GKG13_bowtie_output.tabulated21 + 2L 20487495 TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG 30 - 3L 15836559 GTGAATTCTCCCAGTGCCAAG 25 + 3R 5916902 TGAACACAGCTGGTGGTATCC 23 - 2L 11953462 CCCGTGAATTCTTCCAGTGCCATT 27 + 3R 5916902 TGAACACAGCTGGTGGTATC 26 - 3R 9289997 TCCTGCGGCACTAGTACTTA 18 - 2L 11953465 GTGAATTCTTCCAGTGCCATT 22 - 3R 8377246 ATTGCTGGAATCAAGTTGCTGAC 20 + 3L 11650036 TTTGTGACCGACACTAACGGGTA 24 + 2R 16493585 TGGAAGACTAGTGATTTTGTT 28 + 3L 10358380 TAGGAACTTCATACCGTGCTCT 35 + X 18022302 CTTGTGCGTGTGACAGCGGCT 41 - 3RHet 138608 TGGCGACCGTGACAGGACCCG 42 + 3R 5916902 TGAACACAGCTGGTGGTATCC

deepseq$ more droso_matched_GKG-13.fa>21TGGAATGTAAAGAAGTATGGAG>26TAAGTACTAGTGCCGCAGGA>24TGGAAGACTAGTGATTTTGTT>23AATGGCACTGGAAGAATTCACGGG>27TGAACACAGCTGGTGGTATC

deepseq$ more unmatched_GKG13.fa>29AGGGGGCTATTTCACTACTGGA>33CGATGATGACGGTACCCGTAGA>37GCTAGTCGGTACTTGAAAC>59TGGTTGCAATAGCTTCTGGCGGA>61GATGAGTGCTAGATGTAGGGA

Un fichier d’alignement

Un fichier des séquences alignéesUn fichier des séquences non alignées

Sequence reads (fasta format)

Bowtie Pre-miRNAs (miRBase)

Unmatched reads

Unmatched reads

Transposons

Unmatched reads

Genes

Unmatched reads

Unmatched reads

Remaining unmatched sequences

Bowtie

Bowtie

Non coding RNAs

Bowtie

Bowtie

Bowtie

Intergenic regions

Viruses, transgenes, etc…

hierarchical

annotation

of

sequence

datasets

Un pipeline d’annotations « génomiques »Un pipeline d’annotations « génomiques »

Matched reads(fasta)

Read Count


Read Count


Read Count


Read Count


Read Count


Read Count

Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Browser »Browser »

http://samtools.sourceforge.net/

Un pipeline sommaire pour préparer un fichier de visualisationdeepseq$ bowtie -v 1 -M 1 --best /Users/deepseq/bin/bowtie/indexes/5.37_Dmel -p 12 -f GKG-

13_clip-pipe.fasta -S | samtools view -bS -o GKG-13_clip-pipe.fasta.bam - ; samtools sort GKG-

13_clip-pipe.fasta.bam GKG-13_clip-pipe.fasta.bam.sorted ; samtools index GKG-13_clip-

pipe.fasta.bam.sorted.bam

306K GKG-13_clip-pipe.fasta.bam.sorted.bam.bai

42M GKG-13_clip-pipe.fasta.bam.sorted.bam

80M GKG-13_clip-pipe.fasta.bam

Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Je veux visualiser mes reads dans un « Genome Browser » (2)Browser » (2)

J’upload mes fichiers bam et bai sur un serveur accessibleJ’indique l’URL du fichier bam à Ensembl (Gbrowse, Modencode, etc..)


Je navigue dans les régions d’intérêt, après avoir indiqué au Browser d’inclure mon « track »


Encore un…

Un “profiler” maison pour les micros ARNsUn “profiler” maison pour les micros ARNs


BowtiePre-miRNAs (miRBase)Indéxé pour Bowtie

Bowtie Output

Analyse “textuelle”

Cartes des reads par miRNA Liste de comptage par miR_5p et miR_3p

deepseq$ miRNA_bowtie_profiler.py GKG-13_clip-pipe.fasta ~/bin/bowtie/indexes/dme_miR_r17.1.ebwt

# bowtie -v 1 -M 1 --best --strata -p 12 --norc --suppress 2,6,7,8 /Users/deepseq/bin/bowtie/indexes/dme_miR_r17 -f GKG-13_clip-pipe.fasta

# reads processed: 5997502# reads with at least one reported alignment: 3886779 (64.81%)# reads that failed to align: 2060565 (34.36%)# reads with alignments sampled due to -M: 50158 (0.84%)Reported 3886779 alignments to 1 output stream(s)

# Parsing completed in 1 minutes and 36.7 seconds

miRNA_bowtie_profiler.py : Cartes des reads, par miRmiRNA_bowtie_profiler.py : Cartes des reads, par miR

offsets

counts

sizes

miRNA_bowtie_profiler.py : Attribution des reads “5p” et “3p”miRNA_bowtie_profiler.py : Attribution des reads “5p” et “3p”

987 reads 16003 reads = 16990, ~ 17009 reads+

miRs « 5p » miRs « 3p »

*

miRNA_bowtie_profiler.py : Liste de comptage des miRsmiRNA_bowtie_profiler.py : Liste de comptage des miRs

......

......

Analyse d’expression différentielleAnalyse d’expression différentielle


BowtiePre-miRNAs (miRBase)Indéxé pour Bowtie

Bowtie Output

Analyse “textuelle”

Cartes des reads par miRNA Liste de comptage par miR_5p et miR_3p

deepseq$ miRNA_bowtie_profiler.py GKG-13_clip-pipe.fasta ~/bin/bowtie/indexes/dme_miR_r17.1.ebwt

DESeq

Heatplus

edgeR

(Bioconductor)

http://www.r-project.org/

days

L3 PF PF+12h

Ecdysone titer

Read count table

Profiling des miRNAs Profiling des miRNAs durant la durant la métamorphose de la métamorphose de la drosophiledrosophile

days

L3 PF PF+12h

Clustering of miRNA read counts Clustering of miRNA read counts after normalizationafter normalization

Ecdysone titer

DESeq Heatplus

Analyse d’expression différentielleAnalyse d’expression différentiellePF PF+12h

Larva

Metamorphosis

Up-regulated 27

Down_regulated 27

Metamorphosis

Up-regulated 0

Down_regulated 0

« Differential calling » avec le jeu complet de données

« Differential calling » sans replicats

Message:

Le Deep Seq n’échappe pas au tests statistiques

Les réplicats sont nécessaires pour estimer le bruit biologique

Naive and primed murine pluripotent stem cells have distinct miRNA signatures Naive and primed murine pluripotent stem cells have distinct miRNA signatures

ESC1 ESC2 EpiSC2EpiSC1EpiSC3

miR-290-295

miR-302/367

miR17-92

28/40

M. Cohen-Tannoudji (Institut Pasteur)A.Jouneau (INRA Jouy en Josas)E. Heard (Institut Curie)C. Antoniewski (Institut Pasteur)

Normalized miR read count profilesNormalized miR read count profiles

29/40

A lattice of miR read profiles for rapid, visual annotationA lattice of miR read profiles for rapid, visual annotation

30/40

““Stereo” lattice reveals changes in miR biogenesis between ES and EpiSCsStereo” lattice reveals changes in miR biogenesis between ES and EpiSCs

% length

ESC EpiSC

32/40

Small RNA signaturesSmall RNA signatures

AUGCUUUCAUGGCAUCCUUACUUUACGAAAGUACCGUAGGAA-100 +100

AUGCUUUCAUGGCAUCCUUACAUGCUUUCAUGGCAUCCUUACAUGCUUUCAUGGCAUCCUUACAUGCUUUCAUGGCAUCCUUACAUGCUUUCAUGGCAUCCUUACAUGCUUUCAUGGCAUCCUUACAUGCUUUCAUGGCAUCCUUAC

UUUACGAAAGUACCGUAGGAAUUUACGAAAGUACCGUAGGAAUUUACGAAAGUACCGUAGGAAUUUACGAAAGUACCGUAGGAA

|||||||||||||||||||||

123456789.........19...

Signature piRNASignature piRNA

UUGCUUUCAUGGCAUCCUUACCGAUCAGCUUCUUUACGAAACGAAAGUACCG-100 +100|||||||||||||||||||||

12345678910.............

P-element

Cartographie des ARN de 24-26nt d’ovaires de drosophile

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