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Faculté de Médecine Paris-Sud MICROBIOLOGIE DCEM-1 TOME I BACTERIOLOGIE Auteurs ayant contribué à la rédaction de ce cours : Dr N. Fortineau Praticien Hospitalier Hôpital de Bicêtre Dr L. Lebrun, Maître de Conférences des Universités Praticien Hospitalier, Hôpital A. Béclère Dr D. Mathieu, Maître de Conférences des Universités Praticien Hospitalier, Hôpital Paul Brousse Dr T. Naas Maître de Conférences des Universités

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Faculté de Médecine Paris-Sud

MICROBIOLOGIE

DCEM-1

TOME I

BACTERIOLOGIE

Auteurs ayant contribué à la rédaction de ce cours :

Dr N. Fortineau Praticien HospitalierHôpital de Bicêtre

Dr L. Lebrun, Maître de Conférences des Universités Praticien Hospitalier,

Hôpital A. Béclère

Dr D. Mathieu, Maître de Conférences des Universités Praticien Hospitalier, Hôpital Paul Brousse

Dr T. Naas Maître de Conférences des Universités Praticien Hospitalier,

Hôpital de Bicêtre

Pr P. Nordmann Professeur des UniversitésPraticien HospitalierHôpital de Bicêtre

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2004-2005

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CHAPITRE 1

Anatomie fonctionnelle des bactéries, physiologie, classification

La Microbiologie est la science des micro-organismes les plus petits des êtres vivants :

elle groupe la Bactériologie et la Virologie.

Antoine Van Leenwenhoek (1632-1723), drapier hollandais et amateur de loupes et

d’instruments d’optique, découvre et décrit entre 1674 et 1687 le monde microbien.

L’un des véritables fondateurs de la Microbiologie est le chimiste français Louis Pasteur

(1822-1895) dont les études sur les fermentations, les « maladies » du lait, du vin, de la bière,

des vers à soie, lui avaient fait pressentir que les maladies contagieuses de l’homme et des

animaux étaient dues, elles aussi, à des micro-organismes vivants.

En 1886, Haeckel crée le terme de protistes pour désigner, entre le monde animal et le

monde végétal, les êtres unicellulaires et les êtres pluricellulaires sans tissu différencié. Les

protistes sont classés en deux catégories :

- les protistes supérieurs ou eucaryotes possèdent un noyau entouré d’une

membrane, plusieurs chromosomes, un appareil de mitose et une structure cellulaire complexe

(mitochondries notamment),

- les protistes inférieurs ou procaryotes qui ont un chromosome unique sans

membrane nucléaire et sans appareil de mitose. Les bactéries sont des protistes procaryotes.

Bactéries et virus diffèrent par des caractères fondamentaux ;

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Bactéries Virus

Unité de structure la cellule le virion

A. nucléiques deux types : ADN et ARN un seul type ADN ou ARN

Systèmes enzymatique de

biosynthèse

présents absents : « parasite » strict

d’une cellule plus « évoluée »

reproduction par division cellulaire par réplication

croissance présence d’une croissance :

augmentation harmonieuse de

tous les éléments de la cellule

absence de croissance. La

structure du virion est

définitivement organisée

après la synthèse de ses

constituants

1. - Anatomie fonctionnelle

La taille des bactéries varie de 0.2 à 10 m. Visibilité possible au microscope optique (x103) ou au microscope électronique (x106). Elles peuvent être distinguées par divers procédés physiques et chimiques et leurs constituants bactériens libérés, étudiés.

1.1 - Structures constantes

1.1.1 - Appareil nucléaire

ADN bicaténaire (80 %)- support de l’information génétique- libre dans le cytoplasme (absence de membrane nucléaire)- réplication semi-conservative selon le modèle de Watson et Crick précédant la division cellulaire- lieu de mutations chromosomiques-surenroulé et pelotonné dans le cytoplasme

Déplié, le chromosome bactérien a près de 1 mm de long- Autres constituants : 10 % ARN, 10 % de protéines dont ADN gyrases qui déroulent l’ADN pour permettre l’action des polymérases (ARN polymérases- ADN dépendantes) Appareil nucléaire, site d’action de certains antibiotiques :

- Quinolones et ADN gyrases- rifamycines et ARN polymérases- nitro-imidazolés et fragmentation de l’ADN chez les anaérobies stricts.

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1.1.2 - Cytoplasme bactérien

- ne contient pas de mitochondries - 80 % d’eau- limité par une membrane cytoplasmique- riche en ARN solubles (ARNr, ARNm, ARNt) : ribosomes (15 000 par cellule) ; Ils représentent 40 % du poids sec de la bactérie et 90 % de l’ensemble de l’ARN. Les ribosomes sont le site d’action de certains antibiotiques (aminosides, phénicolés, cyclines, macrolides)- contient également de nombreuses inclusions, vacuoles de lipides, granules de carbone, de phosphate... pression osmotique interne considérable (5 à 20 atmosphères)1.1.3 - Membrane cytoplasmique ou membrane interne

- limite le cytoplasme- constituée d’une double couche d’unités de phospholipides (35 %) et de protéines (65 %),- certaines protéines jouent un rôle dans la synthèse du peptidoglycane de la paroi, les protéines liant la pénicilline (PLP), site d’action des -lactamines ; d’autres dans la perméation de substrats,- rôle du transport d’électrons et de la phosphorylation oxydative dans les espèces bactériennes aérobies.

les polymyxines sont des antibiotiques qui agissent comme des détergents de la membrane cytoplasmique

1.1.4 - La paroi bactérienne

Structure rigide polymérique qui assure le maintien de la forme de la bactérie malgré la forte pression osmotique intracellulaire.

1.1.4.1. - Structure

- une substance spécifique : le peptidoglycane- composé de trois éléments : . épine dorsale faite d’alternance de molécules de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétylmuramique . chaînes latérales peptidiques . ponts interpeptidiques- chez les bactéries à Gram positif . nombreuses couches de peptidoglycane (jusqu’à 90 % des constituants de la paroi)associés à des acides téchoïques (polymères de glycérol ou de ribitol phosphate) et faisant saillie à la surface des bactéries . Les acides lipotéchoïques sont placés transversalement et s’enfoncent jusqu’à la membrane cytoplasmique.

en général, peu de protéines dans la paroi des bactéries à Gram positif. Une exception cependant, la protéine A de Staphylococcus aureus.

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- chez les bactéries à Gram négatif :. une à deux couches de peptidoglycane qui représente que 5 à 20 % des constituants de la paroi. associées à trois éléments plus externes

les lipoprotéines qui font le lien entre peptidoglycane et membrane externe la membrane externe : double couche de phospholipides avec au moins deux

types de protéines ; les protéines de structure consolidant la membrane externe et d’autres appelées « porines » permettant le passage de molécules hydrophiles notamment certains antibiotiques.

le lipopolysaccharide (antigène O des BG (-). Le lipide représente l’endotoxine des BG(-).

1.1.4.2. - Fonctions

- assure la morphologie de la bactérie (25-35 % de la masse totale)- rôle dans la coloration de Gram : bactéries à Gram positif, la paroi schématiquement bloque l’extraction du violet de gentiane et de l’iodure par l’alcool.- récepteur de bactériophages- rôle antigénique et activation du complément (LPS)- support de l’action de certaines enzymes exogènes (lysozyme) ou endogènes (autolysines) et de certains antibiotiques comme les -lactamines.

1.2 - Structures inconstantes

1.2.1. - ADN extra-chromosomique : plasmides- petite taille (0.5-5 % du chromosome bactérien). ADN bicatenaire - non indispensable à la vie de la bactérie, réplication autonome- facteur sexuel ou facteur F, facteurs colicinogènes, plasmides de

résistance, de virulence ou de métabolisme.

1.2.2. - Capsule- élément le plus externe, habituellement polysaccharidique- consistance gélatineuse. Synthèse quantitative et qualitative variable en fonction des conditions de culture.- rôle dans virulence : résistance à la phagocytose- utile en sérotypie

1.2.3. - Glycocalyx- feutrage de fibres polysaccharidiques à la surface des bactéries dans leur milieu

naturel « slime » ; ex. P. aeruginosa- favorise l’adhésion de la bactérie : ex : S. mutans et plaque dentaire

1.2.4. - Cils ou flagelles- appendices filamenteux de 6 à 15 microns de long x12-30 m- constitués de sous-unités protéiques : flagellines- antigéniques (antigène H)

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- organes de locomotion présents uniquement chez les bactéries mobiles

1.2.5. - Pili ou fimbriae- essentiellement chez les bactéries à Gram négatif- deux types : . pili commun :. 2-3 m de long. régulièrement disposés à la surface. sous-unités de piline + polypeptides mineurs. rôle de fixation par adhésion (ex. : E. coli). certains ont une propriété hémagglutinante. Pili sexuels. plus longs, en nombre plus faible. codés par des plasmides. rôle d’attachement des bactéries entre elles lors de la conjugaison

1.2.6. - Spores. forme de résistance de certaines bactéries à des conditions de vie défavorable. très résistantes à la chaleur, au froid et aux agents chimiques. métabolisme ralenti . Possibilité de redonner des formes végétatives en milieu favorable ; ex. : Bacillus sp . et Clostridium sp.

2. - Physiologie

2.1. - Besoins nutritifs

- besoins constitutifs élémentaires ; C, H, O, N, essentiellement à partir notamment du glucose- besoins constitutifs spécifiques en plus des éléments précédents ; « facteurs de

croissance pour certaines bactéries.- besoins énergétiques couverts par des réactions d’oxydo-réduction- facteurs physico-chimiques . optimum en général à 37°C pour la plupart desbactéries d’intérêt médical

. pH 7- croissance bactérienne ;. rapidité variable selon bactérie ; division binaire toutes les 20 minutes chez E.coli. phases de croissance : latence, accélération de la croissance, phase exponentielle,

diminution du taux de croissance, plateau.- milieu de culture . liquide : enrichissement . solide : gélose nutritive permet l’isolement des bactéries de différentes espèces.

Intérêt des géloses sélectives. Formation de clones isolés = colonies.

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- pression partielle en oxygène - métabolisme respiratoire strict :* aérobies strictes ; ex. : P. aeruginosa, Acinetobacter, Neisseria,

Mycobacterium sp.* micro-aerophiles (pression partielle en oxygène de l’ordre de 5 %) : ex. :

Campylobacter- métabolisme fermentatif

. aérotolérante : streptocoques, lactobacilles . anaérobie strictes : Bacteroïdes, Clostridium

- métabolisme respiratoire et fermentatif : aéro-anaérobies facultative : entérobactéries, staphylocoques, vibrions.

3. - Classification des bactéries

- Il existe différentes classification des bactéries en fonction de critères phénotypiques (culture, coloration, métabolisme) ou génotypiques (notamment séquence des

rARN16s)- on classe les bactéries en taxons, familles, genres, espèces, sérotypes...- l’une des classifications qui reste la plus utilisée en Microbiologie médicale est basée sur les propriétés tinctoriales des bactéries (coloration de Gram) et sur leur mobilité.

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COLORATION FORME

COQUES

MOBILITE

Gram (+) Staphylocoques (-)

Streptocoques (-)

Entérocoques (-)

Gram (-) Neisseria (-)

BACILLES

Gram (+) Bacillus (+)

Listeria (+)

Corynebacterium (-)

Actinomyces (-)

Gram (-) Entérobactéries (+/-)

Pseudomonas (+)

Acinetobacter (-)

Campylobacter (+)

Vibrio (+)

Pasteurella (+)

Haemophilus (-)

Bordetella (+)

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CHAPITRE 2

Pouvoir pathogène et réponses immunitaires à l’infection bactérienne

1 - Définitions

- Saprophytisme : bactérie et homme sont indépendants ; la bactérie se trouve dans la nature et peut occasionnellement être trouvée à la surface de la peau ou des muqueuses.

- commensalisme : bactérie qui ne peuvent vivre qu’au contact des cellules animales ou humaines. Elles se développent aux dépens du métabolisme cellulaire. Elles ne sont pas habituellement pathogènes pour l’homme.

Commensalisme peut s’accompagner de symbiose où il existe un avantage mutuel : ex. : synthèse de vitamine K et bactéries intestinales ; équilibre des flores et effet de barrière.

- pouvoir pathogène : capacité de la bactérie à entraîner une maladie- pathogène facultatif : bactéries qui peuvent se développer dans la nature ou sur la peau et les muqueuses chez les porteurs sains- pathogène obligatoire incapable de se multiplier hors d’un foyer infectieux : ex. : tuberculose- pathogène opportuniste : bactérie dont le pouvoir pathogène ne peut réellement s’exprimer que s’il y a déficience de l’hôte. Ces bactéries font partie de la flore commensale ou saprophyte.

2 - Facteurs de pathogénicité

2.1. - Envahissement

- colonisation des muqueuses : adhésion- invasion des muqueuses : multiplication au sein de la cellule hôte (Shigella, Listeria), traversée des cellules éphithéliales (salmonelle)- dissémination dans l’organisme. multiplication au sein des tissus :

- variation de la virulence, atténuation in vitro ; exaltation in vivo - variabilité de la vitesse de croissance des bactéries en fonction du site (oxygénation+++) ; disponibilité en fer.

2.2. - Toxinogénèse

- toxines protéiques : . exotoxines ; ++ bactéries à Gram (+). thermolabiles. degré de toxicité élevé

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. très antigéniques

. détoxification par le formol : anatoxine

. antitoxine possible : anticorps. Ex. : toxines de Staphylococcus aureus, Clostridium sp.

- toxines glucido-lipido-protéiques : . endotoxines ; bactéries à Gram négatif . thermostables . toxicité plus faible que les toxines protéiques . faiblement antigéniques . non détoxicables par le formol . pas d’anticorps neutralisants.

3. - Réponses immunitaires à l’infection

Les moyens de défense de l’organisme contre l’infection sont l’ensemble des facteurs non spécifiques (immunité naturelle) et spécifiques (immunité acquise). L’immunité naturelle préexiste au contact de la bactérie alors que l’immunité acquise n’existe qu’après contact entre la bactérie et les cellules phagocytaires et lymphoïdes de l’hôte infecté.

3.1. - Moyens non spécifiques

Non dirigés contre une bactérie donnée. Ils interviennent dès la primo-infection

3.1.1. - Barrières cutanéo-muqueuses (avant la pénétration)

. la peau- rôle de la kératine et de la desquamation- acides gras et sueur qui abaissent le pH

- flore commensale résidente ; effet barrière Rares bactéries traversent la peau saine : Francisella tularensis, leptospires, streptocoque A

- les muqueuses : . péristaltisme. flux liquide (urines, bronches). flore résidente (++ intestinale). lysosyme et oeil ; HCl et estomac, vagin et acidité

3.1.2. - Réaction inflammatoire (après la pénétration)

. altérations du métabolisme cellulaire provoquées par les toxines et par les produits du métabolisme bactérien entraînant la libération de médiateurs chimiques.

3.1.3. - Phénomènes vasculaires

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- dilatation capillaire ; perméabilité accrue par des facteurs protéiques plasmatiques ; complément, transférine, fibrinogène- margination des leucocytes- hyperthermie locale.

3.1.4. - Réaction cellulaire

- facilitée par les phénomènes vasculaires- afflux de polynucléaires, monocytes, lymphocytes B- phagocytose après adhésion (fraction Fc des anticorps, C3 et C4b du complément) phagosome puis phagolysosome.- médiateurs chimiques comme les cytokines, les prostaglandines ou les thromboxanes...- rôle des macrophages du système réticulo-endothélial (foie et rate)- le succès de la phagocytose dépend de facteurs liés à :

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. l’hôte ; - facteurs nutritionnels ; carences en vitamines A, C ; alcool, tabac

. affections intercurrentes ; diabète, neutropénie toxique ou médicamenteuse- traitement par immunosuppresseur : corticoïdes

. la bactérie : - présence d’une capsule- synthèse d’une toxine active sur les leucocidines- possibilité de se multiplier dans le macrophage ex: mycobactéries, Listeria monocytogenes.

3.2 - Moyens spécifiques : immunité acquise

- importants si longue durée de la primo-infection ou deuxième infection- association d’une réponse humorale (anticorps) et cellulaire (macrophages, lymphocytes). Dans tous les cas, le macrophage phagocyte la bactérie et détruit partiellement la bactérie tout en conservant ses déterminants antigéniques à sa surface. Ces macrophages présentent ces déterminants antigéniques aux lymphocytes T helper puis recrutement des lympho B (production d’anticorps) et lymphocytes T cytotoxiques.

3.2.1. - Immunité humorale

- anticorps apparaissent 8 à 10 jours après l’infection ; IgM puis IgG- rôles de :

. la neutralisation des facteurs de pathogénicité, . l’opsonisation qui facilite la fixation de la capsule ou de la paroi bactérienne au

macrophage.- bactéricidie directe lors de la fixation sur la bactérie et l’activation du complément.

3.2.2. - Immunité à médiation cellulaire

. activation non spécifique par les lymphocytes T helper des macrophages, polynucléaires et lymphocytes

. lymphocytes cytotoxiques ont une activité directe.

Immunité spécifique peut-être :- accrue par utilisation d’adjuvants minéraux (BCG), qui retardent l’élimination de l’antigène et favorisent la réaction inflammatoire.- diminuer par des thérapeutiques diverses (corticoïdes...) ou des états pathologiques du système lymphoïde

3.3 - Applications pratiques de la réponse immunitaire

- vaccins antitoxines, vaccins antibactériens tués ou vivants, vaccins avec antigènes bactériens spécifiques (Haemophilus, méningocoque, pneumocoque)

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- sérothérapie et séroprophylaxie- immunité passive d’origine maternelle conférée aux nouveau-nés.

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CHAPITRE 3

Génétique bactérienne et ses applications en Bactériologie médicale

1. - Notions de génétique bactérienne

L'ADN bactérien peut être l'objet de variations qui se traduisent par l'apparition de différences héréditaires dans les structures et/ou les fonctions permanentes des bactéries.

On distingue les variations génétiques ou génotypiques (le génotype est l'ensemble des déterminants génétiques portés par une cellule) affectent le génome bactérien dans sa séquence nucléotidique.

- Les variations phénétiques ou phénotypiques (le phénotype est l'ensemble des propriétés observables d'une cellule) affectent le comportement de la bactérie par modification de l'expression (transcription) du génome bactérien. Ces variations, qui résultent de l'adaptation à diverses conditions extérieures de l'ensemble d'une population bactérienne ayant le même génotype, sont :

- réversibles,- non transmissibles à la descendance - spécifiques (non aléatoires).

- Les variations génétiques qui sont irréversibles et transmises à la descendance seront examinées successivement.

Le matériel génétique peut-être:

- chromosomique- extra-chromosomique (plasmides)

. En effet à côté de l'ADN chromosomique existent des molécules circulaires d'ADN bicaténaire, qui se multiplient de façon régulière et au fur et à mesure de la multiplication cellulaire: les plasmides. Ces plasmides peuvent s'intégrer au chromosome ou rester libres dans le cytoplasme et se répliquer dans l'un ou l'autre état, ce sont des épisomes.

Deux phénomènes génétiques intéressent plus particulièrement le bactériologiste :

- les mutations

- les transferts de matériel génétique.

1.1. - Les mutations

La mutation est un changement :

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- spontané ou provoqué par un agent mutagène, - héréditaire (stable), - brusque (discontinu), - rare (10-6-10-9) -indépendant - lié à une modification du génome bactérien (ADN).

Exemples: utilisation comme source carbonée d'un composé non utilisable par la souche sauvage, résistance aux antibiotiques, résistance à un bactériophage.

1.1.1. - Caractères de la mutation bactérienne

Spontanéité (hasard)

Pour révéler la présence d'un mutant, il est nécessaire d'utiliser un moyen sélectif (par exemple un milieu de culture avec un antibiotique, ou un milieu minimum additionné d'un seul acide aminé). De ce fait, on ne peut distinguer si la mutation est spontanée ou si elle est induite par l'agent sélectif.

Le caractère spontané de la mutation a été formellement établi par le test de fluctuation de Luria et Delbrück, 1943): c’est l'analyse statistique de la distribution des mutants dans des tubes de bouillon de culture ensemencés en parallèle avec une même suspension microbienne : Le test de fluctuation de Luria et Delbrück analyse la résistance de E. coli au bactériophage.

Expérience : Une culture jeune en milieu liquide est divisée en deux parties égales de 10 ml contenant

chacunes1000 cellules bactériennes. - La première partie est gardée telle quelle dans un grand tube,

- la seconde est subdivisée à parties égales en 50 petits tubes. Tous les tubes sont incubés a 37°C.

- Après incubation, le contenu des tubes est étalé sur une gélose recouverte de bactériophages : 50 échantillons égaux sont prélevés du grand tube de 10 ml non subdivisé et étalés séparément; le contenu de chacun des 50 petits tubes est également étalé séparément.

On observe les faits suivants : le nombre de colonies résistantes au phage est à peu près le même, entre 3 et 7 colonies résistantes, sur chacune des cinquante géloses ensemencées à partir de la grande culture. Parmi les géloses ensemencées à partir des 50 petites cultures, certaines ne montrent pas de colonies résistantes, d'autres en montrent une centaine. L'explication du phénomène est la suivante :

- Si le phage induisait la mutation envers la résistance après que les échantillons aient été étalés, toutes les géloses devraient donner le même résultat.

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- Si au contraire, les mutations se produisaient comme des évènements survenant au hasard dans les cultures avant qu'elles ne soient exposées au phage, quelques-uns des petits tubes pourraient ne pas contenir des mutants, tandis que ceux dans lesquels les mutations seraient survenues tôt au cours de la période d'incubation devraient en contenir de nombreux. Donc, s'il y avait mutation, le nombre de bacilles résistants aux phages obtenus à partir des cinquante petits tubes devrait présenter un fort degré de fluctuation comparé au nombre de résistants trouvé dans les échantillons provenant du grand tube. Or c'est exactement ce que l'on observe. Il s'agit donc d’une mutation spontanée et non d’une "variation dirigée."

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Discontinuité (caractère brusque)

- la mutation s'effectue habituellement en une seule étape (loi du tout ou rien). Dans certains cas, cependant, le phénotype mutant (par exemple résistance de haut niveau à la pénicilline) apparaît à la suite de mutations successives au niveau de plusieurs gènes.

Stabilité

- le caractère acquis par la mutation est transmis à la descendance, même en l'absence de l'agent sélecteur

- la stabilité n'exclut cependant pas la réversibilité de la mutation.

Rareté

` - la mutation est un phénomène rare qui n'affecte qu'une faible fraction de l'ensemble des cellules bactériennes au sein d'une large population.

- la proportion ou la fréquence des mutants que l'on peut observer dans une population bactérienne dépend de trois paramètres indépendants:

(1) la probabilité qu'une cellule bactérienne mutée dans une unité de temps donné, par exemple l'espace d'une génération, cette probabilité s'appelle le «taux de mutation»;

(2) la distribution dans le temps des évènements mutationnels durant la période de culture (cf. le test de fluctuation de Luria et Delbruck). Des mutations très

précoces vont produire de très nombreux clones de descendants du mutant (un clone constitue la totalité des descendants d'une cellule unique);

(3) le taux de croissance du mutant comparé à celui du type parental.

Bien que rares, les mutants peuvent être sélectionnés au sein d'une population bactérienne :

- soit spontanément (sélection relative: ils possèdent un avantage physiologique : ex. : en vitesse de croissance ou en taux de létalité),

- soit artificiellement (sélection absolue, ils sont résistants à un antibiotique.

Indépendance ou spécificité

La mutation n'affecte habituellement qu'un seul caractère :

- (ex. : M. tuberculosis sensible à tous les antibiotiques ---> M. tuberculosis résistant à la streptomycine et sensible à tous les autres antibiotiques).

Dans certains cas, lorsqu'elle résulte de la modification d'une séquence de gènes (un opéron), elle peut affecter plusieurs caractères (mutation pléiotrope).

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La mutation d'un caractère donné ne modifie pas la probabilité de mutation d'un autre caractère. Il y a indépendance des mutations. Il en résulte que la probabilité qu’une cellule bactérienne ait une mutation simultanée à l'égard de deux caractères est égale au produit des probabilités individuelles.

Ex. : Si la probabilité de mutation de résistance de M. tuberculosis à la streptomycine est de 10-6 et à l'isoniazide de 10-6 la probabilité d'une mutation double sera de 10-12.

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1.1.2 La mutation à l'échelon moléculaire

Tout changement dans la séquence nucléotidique d'un gène constitue une mutation.

La séquence nucléotidique peut changer de deux manières,

- soit par substitution d'une paire de bases par une autre (ex.: erreur durant la réplication)

- soit par cassures de l'ossature sucre-phoshate de l'ADN avec perte ou inversion du segment d'ADN entre les deux cassures.

a. Changement de séquence consécutif à la substitution d'une paire de base:

Il peut s'agir :

- d'une transition (ex.: AT est remplacé par GC), - d'une inversion ou transversion (AT--> TA),- d'une addition (ex.: ATCG ---> ATGCG) - d'une délétion (ATGCG--> ATCG).

La plupart des mutations par substitution d'une partie de bases sont réversibles (mutations réverses). Certaines sont silencieuses (inapparentes) quand la substitution concerne le 3ème

nucléotide du codon D'autres sont au contraire létales : Ex.: par apparition d'un mutant non-sens lorsque la

mutation crée un codon de terminaison).

b. Changement de séquence consécutive à une cassure des liaisons sucre-phosphate:

La mutation affecte en général une séquence de bases plutôt qu'une simple paire ; Il y a :

- délétion (perte) d'un segment (codon) d'ADN- inversion d'un segment, - insertion d'un nouveau codon.

Dans tous ces cas, la mutation est souvent létale et non réversible.

1.2. - Les variations génétiques autres que la mutation : les transferts de matériel génétique.

La bactérie peut être l'objet de variations génétiques autres que la mutation. Celles-ci peuvent porter sur le transfert de matériel génétique chromosomique ou non chromosomique (plasmidique) d'une bactérie à une autre

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Le transfert peut résulter de processus aussi différents que :

- la transformation ) - la conjugaison ) - qui font intervenir uniquement des éléments bactériens

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- transduction )- conversion ) - qui mettent en jeu un bactériophage

1.2.1 - La transformation

Définition : C'est le transfert passif d'ADN d'une bactérie donatrice à une bactérie réceptrice, dite en état de compétence. Le transfert qui est partiel et limité à quelques espèces bactériennes entraîne l'acquisition par la bactérie réceptrice de nouveaux caractères génétiques stables et transmissibles.

Découverte de la transformation.

En 1928, Frederick Griffith démontre :

- l'inoculation sous-cutanée à la souris d'un mélange de pneumocoques capsulés (virulents) tués par la chaleur et de pneumocoques acapsulés (non virulents) vivants, entraîne une septicémie mortelle à pneumocoques capsulés vivants. Il y a donc eu transformation ou « réversion » des pneumocoques acapsulés ® en

pneumocoques capsulés (S).

En 1944, Avery MacLeod et McCarty démontrent que :

- le "principe transformant" est l'ADN bactérien. Ils réussissent à reproduire in vitro la transformation en présence d'ADN. L'activité transformante est perdue en présence de déoxyribonucléase (enzyme qui dégrade l’ADN).

Caractères de la transformation.

La transformation naturelle ou physiologique exige l'état de compétence :

- n'apparaît qu'à certains stades de la division cellulaire

- seulement dans une fraction de la population bactérienne

La transformation artificielle est précédée du traitement chimique ou enzymatique de la paroi bactérienne avant sa mise en contact avec l'ADN donné.

La transformation naturelle

- peut s'observer chez un nombre limité d'espèces bactériennes à Gram positif (Streptococcus et Bacillus) ou à Gram négatif (Neisseria, Branhamella, Moraxella, Acinetobacter, Haemophilus).

- se produit selon les phases suivantes:

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.apparition de l'état de compétence,

. fixation

. pénétration

. intégration de l'ADN donneur dans le génome de la bactérie réceptrice.

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Chez les bactéries à Gram positif les différentes phases mettent en jeu un activateur spécifique d'espèce, excrété par la bactérie qui se fixe à la surface de la bactérie. Il y a ensuite synthèse d'une protéine fixatrice de l'ADN, d'une autolysine et d’une endonucléase. L'ADN fixé est ensuite, partiellement hydrolysé puis converti en un fragment monocaténaire.

Les bactéries transformables sont capables de fixer des ADNs de multiples sources. Il y arecombinaison génétique que si la bactérie donatrice et la bactérie réceptrice sont génétiquement très proches. L'appariement exige une étroite homologie des séquences nucléotidiques.

Chez les bactéries à Gram négatif, l'état de compétence est aussi en relation avec la synthèse d'un activateur de paroi qui est excrété par la bactérie à la phase exponentielle de croissance (H. influenzae) ou à la phase stationnaire (Acinetobacter). (L'ADN donneur se fixe sur la paroi au niveau de sites récepteurs, dans des conditions strictes de métabolisme cellulaire, de pH, de température et d'osmolarité).

La transformation permet

- le transfert d'une petite fraction du génome bactérien (<1%),- est d'efficacité relative (la fréquence de transfert est de l'ordre de 10-4 à 10-6) - est limitée à quelques espèces bactériennes- La transformation a permis de comprendre le mécanisme de la synthèse de la capsule, le

contrôle génétique de la résistance aux antibiotiques, l'établissement de cartes génétiques, etc...

1.2.2 - La conjugaison.

Définition : La conjugaison est un transfert d'ADN (chromosomique et non chromosomique) entre une bactérie donatrice et une bactérie réceptrice, qui nécessite le contact et l'appariement entre des bactéries :

- Elle repose sur la présence dans la bactérie donatrice ou mâle d'un facteur de sexualité ou de fertilité (facteur F). - Celui-ci permet la synthèse de pili sexuels et donne la polarité au transfert. - Le transfert d'ADN chromosomique qui est à sens unique, orienté, progressif, et quelquefois total, a beaucoup de similitudes avec le transfert d'ADN extrachromosomique (plasmidique).

Mise en évidence de la conjugaison : La découverte de la transformation chez le pneumocoque :

- Dans un milieu de culture liquide, ces auteurs ont mélangé deux types de mutants auxotrophes de E. coli,

- des mutants exigeants seulement en thréonine (T-) et en leucine (L-) et, d'autre part, des mutants exigeants seulement en méthionine (M-) et biotine (B-).

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- Après plusieurs heures de contact entre les mutants T-L-M+B+ et les mutants T+L+M-B-, des E. coli T+L+M+B+ (environ 100 pour 10+8 E. coli) ont été isolés.

Conclusion : La recombinaison s'était produite avec une faible fréquence (10-6) et exigeait en plus le contact entre les deux types de mutants auxotrophes.

Caractères de la conjugaison.

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Spécificité

Le transfert d'ADN chromosomique par conjugaison :

- ne se produit qu'entre bactéries d'une même espèce (spécificité),- surtout chez les bactéries à Gram négatif telles que E. coli, Salmonella et Pseudomonas.

Le transfert d'ADN extrachromosomique (plasmide) : - est plus répandu parmi les espèces bactériennes- moins spécifique d'espèce.

Différentiation sexuelle.

- Le transfert, qui est à sens unique (bactérie donatrice-bactérie réceptrice) repose sur la présence chez la bactérie donatrice du facteur sexuel ou facteur de fertilité (F) à laquelle il confère la polarité ou le caractère mâle (F+). - Le facteur sexuel est le premier plasmide connu. - L'information génétique qu'il porte est d'environ 2% de celle des chromosomes bactériens et code

. pour la biosynthèse de pili sexuels,

. pour son insertion possible dans le chromosome bactérien et pour la mobilisation (le transfert) de ce dernier dans la bactérie réceptrice (F-).

Contact ou appariement

Le transfert chromosomique n'est possible qu'après appariement par couple des bactéries donatrice et réceptrice. Il fait d'abord intervenir les pili sexuels (2 à 3 par bactérie F+) qui reconnaissent par leurs extrémités les zones de contact de la surface des bactéries F- et s'y fixent puis se rétractent en rapprochant les deux types de bactéries. Ils permettent ainsi leur contact et la formation d'un pont cytoplasmique de 100 à 300 µm par lequel va s'opérer le transfert chromosomique.

Transfert de l'ADN

- Le pont cytoplasmique formé, le transfert génétique peut commencer. Il ne porte que sur un brin d'ADN, (ce qui permet de restaurer l'intégrité du génome de la bactérie donatrice par un processus de réplication asymétrique).

- Le transfert du brin d'ADN est à sens unique, orienté, progressif, quelque fois total. (Il dure alors une centaine de minutes a 37°C).

- Son interruption artificielle par agitation mécanique permet de déterminer la séquence des gènes transférés et d'établir la carte chromosomique.

Caractères transférés et fréquence

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Tous les caractères codés par le chromosome peuvent être transférés,

La fréquence avec laquelle le transfert à lieu dépend de la localisation du facteur F.

- Le facteur F peut être intégré dans le chromosome bactérien à un nombre limité de sites. Il permet ainsi le transfert de gènes chromosomiques d'une bactérie à une autre à haute fréquence(on parle de souches à haute fréquence de recombinaison ou Hfr).

- Le facteur peut être autonome dans le cytoplasme : Il ne transmet à la bactérie réceptrice que l'opéron F.

- Lors du passage de l'état intégré à l'état autonome, le facteur F peut emporter avec lui des gènes bactériens. Le résultat en est un plasmide F', c'est -à-dire un véritable plasmide capable de transférer à une nouvelle bactérie réceptrice (F-) de nouveaux gènes: c'est la F-duction ou sex-duction. Si les gènes transférés par le facteur F'

. s'intègrent dans le chromosome de la bactérie réceptrice, on dit qu'il y a eu recombinaison légitime (chromosomique).

. s'ils ne s'intègrent pas, ils deviennent de véritables gènes mobiles.

Conclusion : Le transfert de ces gènes mobiles est un facteur d'évolution du patrimoine génétique, qui joue un rôle essentiel en bactériologie médicale.

1.2.3 - La transduction

Définition : la transduction est le transfert d'ADN bactérien par l'intermédiaire de bactériophages (ou phages).

- Ceux-ci sont des virus de bactéries, qui existent sous une forme dite virulente ou tempérée.

- Les phages virulents se multiplient dans la bactérie ( ou plutôt sont répliqués par la bactérie) et la lysent.

- Les phages tempérés s'intègrent dans le chromosome bactérien et sont répliqués en même temps que lui. Le bactériophage est alors appelé prophage et la bactérie qui en est porteuse, une bactérie lysogène.

- Dans une population de bactéries lysogènes, un prophage se libère de temps à autre du chromosome bactérien, devient virulent, se multiplie, provoque la lyse de la bactérie et peut infecter de nouvelles bactéries. Si, au cours de sa libération, le prophage emporte avec lui plusieurs gènes bactériens, il peut y avoir transfert par le bactériophage de gènes bactériens d'une bactérie (lysogène) à une autre (lysogène). C'est la transduction.

Caractères de transduction

Incidence :La transduction est liée à l'existence de bactéries lysogènes à Gram positif (staphylocoque, streptocoque, Bacillus) ou à Gram négatif (entérobactéries, Pseudomonas).

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Type de transduction

1. - Lorsque les gènes transférés (pas plus de 1 a 2% du génome de la bactérie lysogène) s'intègrent dans le chromosome de la bactérie réceptrice et que celle-ci les transfère à sa descendance, on dit que la transduction est complète ou généralisée.

2. - Lorsque les gènes transférés ne sont pas intégrés dans le chromosome, ce qui est fréquent, on dit que la transduction est abortive. Dans ce cas, les gènes passent de la cellule mère à une seule cellule fille, etc... Il n'y a pas généralisation du caractère transféré à l'ensemble des descendants.

3. - Dans certains cas, notamment avec le phage lambda de E.coli qui transfère la propriété de métaboliser le galactose, le prophage s'insère au voisinage immédiat des gènes responsables du métabolisme du galactose. S'il y a libération et réplication du prophage, celui-ci peut entraîner avec lui les gènes bactériens responsables du métabolisme du galactose mais abandonner une partie de son propre génome. Il devient alors capable de transférer à d'autres bactéries la possibilité de métaboliser le galactose mais a perdu la capacité d'être répliqué puisqu'il a perdu une partie de son génome. On dit que le phage est défectif et que la transduction est spécialisée (ou restreinte, localisée).

4. - La conversion lysogénique. Dans certains cas, le génome du bactériophage apporte lui-même un nouveau caractère. Par exemple, la sécrétion de la toxine diphtérique, la sécrétion de la toxine plus ou moins érythogène du streptocoque A ou la présence de certains facteurs antigéniques. On dit alors qu'il y a eu conversion lysogénique.

La conversion et la transduction sont des phénomènes qui font tous deux intervenir un bactériophage. Mais, dans le premier cas, c'est le génome du bactériophage qui est responsable du nouveau caractère acquis par la bactérie; dans le second cas, le bactériophage a seulement un rôle de vecteur.

Conclusion : Le transfert d'ADN bactérien par transduction a été très utilisé par les généticiens en raison de sa faible fréquence (10-6), de son caractére partiel (1-2% du génome bactérien) et de sa relative non-spécificité. On peut concevoir qu'elle a joué, plus que la transformation mais moins que la conjugaison, un rôle dans l'évolution bactérienne.

1.2.4 - Les plasmides :

- molécules d'ADN bicaténaires,- circulaires et cytoplasmiques, - de petite taille (5 à 4000 fois plus petit que le chromosome), - se répliquent d'une manière autonome et en général plus rapide que le chromosome, - non indispensables au métabolisme normal de cellule-hôte. - se transmettent d'une cellule bactérienne à une autre peut s'effectuer par conjugaison

(Tra+) ou transduction.

Mise en évidence

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Le terme de plasmide a été créé en 1962 par Lederberg pour designer tout élément génétique cytoplasmique, comme le facteur F. Les plasmides de résistance aux antibiotiques ont été découverts en 1956 au Japon à l'occasion d'une épidémie de dysenterie bacillaire.

Propriétés biologiques portées par les plasmides

Les gènes portés pas les plasmides peuvent coder pour la synthèse de protéines qui confèrent des propriétés biologiques diverses :

- résistance aux antibiotiques (béta-lactamines, aminosides, phénicoles, cyclines, macrolides) chez les bactéries à Gram positif ou négatif; - résistance aux agents mercuriels, aux métaux lourds (antimoine, argent, bismuth...); résistance aux rayons ultra-violets, - résistance à divers bactériophages. Les plasmides permettent ainsi aux bactéries de s'adapter à un environnement hostile.

La virulence des bactéries peut aussi être à médiation plasmique: - pouvoir pathogène des colibacilles entéropathogènes (diarrhées des voyageurs),- pouvoir pathogène des staphylocoques dans l'impétigo (exfoliatine).

Les plasmides peuvent également coder pour la synthèse de bactériocines qui inhibent la croissance d'autres bactéries. Ils peuvent aussi porter les gènes qui codent pour le métabolisme du lactose ou de la lysine chez les Proteus, la production de SH2 chez E. coli, etc...

Les plasmides possèdent enfin des gènes qui assurent - leur réplication autonome, - leur transfert par conjugaison, - leur incompatibilité ou leur compatibilité entre eux et leur transposition.

des classifications de plasmides par classes d'incompatibilité (Inc) ont été établies. Deux plasmides s'excluant mutuellement, c'est-à-dire ne pouvant coexister dans la même bactérie, appartiennent au même groupe d'incompatibilité.

Conclusion :

Les plasmides confèrent aux bactéries qui les hébergent de nombreux caractères génétiques par un mécanisme d'addition et non par un mécanisme de substitution.

Ils représentent un élément essentiel d'adaptation bactérienne. Ils sont responsables d'épidémies de gènes (notamment de résistance aux antibiotiques), qui

ont fait découvrir les transposons, appelés encore gènes sauteurs ou mobiles.

1.2.5 - La transposition - Les transposons

Définition : La transposition est l'intégration directe d'une séquence de gènes de taille définie au sein d'un génome (chromosomique ou plasmidique), en l'absence d'homologie de séquence nucléotidique (recombinaison illégitime). Les gènes qui s'additionnent de cette manière sont dits transposables et sont appelés des transposons (Tn). Ils codent pour les déterminants de la

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transposition (excision, intégration, transposition) et pour d'autres fonctions, par exemple la résistance aux antibiotiques.

Mise en évidence de la transposition

La constatation, en 1971, par N. Datta, du passage, d'un gène de résistance aux béta-lactamines d'un plasmide à un autre plasmide appartenant à des classes d'incompatibilité différentes au sein d'une même bactérie a fait découvrir l'existence de gènes sauteurs ou mobiles.

Propriétés des transposons

Les déterminants génétiques transposables comportent : - la résistance à de nombreux antibiotiques (béta-lactamines, aminosides, phénicolés, cyclines, érythromycine, sulfamides et triméthoprime).- la résistance aux sels de métaux lourds,- certains caractères métaboliques, etc...

La majorité des transposons identifiés proviennent des plasmides de bacilles à Gram négatif, mais certains proviennent de cocci à Gram positif comme le transposon de résistance à l'érythromycine chez Staphylococcus aureus.

Structure des transposons

Le transposon est constitué d'un fragment d'ADN limité de part et d'autre par des séquences répétitives inversées (séquences d'insertion). L'ADN porte des gènes nécessaires à la transposition (transposase, et éléments régulateurs de la transposition) et des marqueurs spécifiques (exemple: gènes de résistance aux antibiotiques).

Conclusion : La transposition est un mécanisme d'adaptation génétique particulièrement efficace des bactéries à leur environnement.

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2. - Applications de la biologie moléculaire en bactériologie médicale.

Les techniques classiques, utilisées actuellement procèdent en plusieurs étapes pour faire un diagnostic bactériologique. Elles se caractérisent par :

- leur manque de sensibilité - par la longueur des délais de réponse (entre 24 heures à plusieurs jours ou semaines

selon la nature des espèces bactériennes recherchées). - les cultures peuvent rester négatives consécutivement à l’administration d'une

antibiothérapie avant le prélèvement, justifiée par la nécessité d'un traitement anti-infectieux urgent.

Des méthodes phénotypiques étudiant les propriétés exprimées par les bactéries: . antibiotypie (résistance aux antibiotiques), . biotypie (métabolisme bactérien), . sérotypie (antigène bactérien), . lysotypie (résistance aux bactériophages), .bactériocinotypie (production de toxines), .profils protéiques.

Les techniques de biologie moléculaire appliquées à la bactériologie permettent de pallier, dans certains cas, les inconvénients précités. Ces techniques reposent sur des méthodes génotypiques, s'adressant à l'analyse du génome bactérien: plasmides et chromosome.

2.1. - Les méthodes

Ces techniques reposent sur des outils communs à l'étude de toutes les bactéries: - les enzymes de restriction - l'hybridation moléculaire (sondes nucléiques et amplification génique (PCR))

2.1.1. - Profils plasmidiques

Comparaison du profil plasmidique de différentes souches. Détermination de leur taille par électrophorèse en gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium (examiné sous UV). Deux plasmides différents, pouvant avoir la même taille, seront caractérisés par hydrolyse de restriction (comparaison de la taille des fragments obtenus après hydrolyse de restriction). Cette technique, bien que simple et applicable à de nombreuses bactéries, présente des limites liées à la mobilité des plasmides (perte ou acquisition possible), à la modification génétique possible (transposons) et au pouvoir discriminant, qui est fonction du nombre de plasmides

2.1.2. - Profil de restriction de l'ADN chromosomique

Il s'agit de l'analyse des fragments obtenus après coupure par des enzymes de restriction de l'ADN total: détermination de leur nombre et de leur taille par électrophorèse conventionnelle

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en gel d'agarose. - la lecture est cependant très difficile car le nombre de bande est trop élevé - il y a risque de perturbation du profil due à la présence de plasmides.

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2.1.3. - Etude de l'ADN chromosomique après hybridation

La multiplicité des espèces bactériennes est fonction des différences de séquences d'acides nucléiques qui conditionnent leur identité génétique. La technique d'hybridation moléculaire, par l'utilisation de sondes, permet de mettre en évidence des homologies ou des différences entre les acides nucléiques des micro-organismes à identifier.

- l'ADN bactérien total est hydrolysé par restriction.- les différents fragments sont séparés selon leur taille par électrophorèse conventionnelle

en gel d'agarose. - ces fragments sont ensuite transférés sur une membrane de nylon

- hydridation avec une sonde spécifique et marquée. les sondes utilisées peuvent être complémentaire d'un gène spécifique et unique, de

séquences répétées ou de gènes codant pour les ARNs ribosomiques. - la lecture est plus simple car le nombre de bandes révélées par la sonde et réduit.

2.1.4. - Etude de l'ADN chromosomique par électrophorèse en champs pulsé

L'analyse des profils de restriction obtenus par électrophorèse conventionnelle révèle un trop grand nombre de fragments d'ADN.

- des fragments de plus grande taille peuvent être obtenus avec certaines enzymes faisant peu de coupures.

- ces fragments ne peuvent pas migrer dans des gels d'agarose en électrophorèse conventionnelle en raison de leur trop grande taille.

- l'électrophorèse en champ pulsé, utilisant des champs électriques d'orientations différentes permet cette migration.

2.1.5. - Typage par PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Etude du polymorphisme de restriction d'un gène après amplification (PCR-RFLP).

Le principe de la PCR consiste à dénaturer de l'ADN génomique, d'y hybrider deux amorces oligonucléotidiques permettant la copie de chaque brin d'ADN en présence de désoxyribonucléotides (dNTPs) et d'une enzyme appelée ADN polymérase. Les brins ainsi synthétisés pourront à leur tour servir de matrices pour initier un second cycle de polymérisation. La répétition de ces trois étapes (dénaturation, hybridation, extension) se traduit par une amplification exponentielle de la séquence cible.

La deuxième étape consiste à restreindre l'ADN ainsi amplifié par des enzymes de restriction et de l'analyser par électrophorèse des bandes obtenues. L'interprétation est assez simple mais n'explore qu'une faible partie du génome de la bactérie.

- Amplification au hasard (RAPD) :

Utilise une seule amorce, arbitraire, courte (10 nucléotides), et non spécifique. En

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s'hybridant à différents endroits des deux chaînes d'ADN, elle permet d'obtenir après amplification des fragments de taille différentes. C'est une technique relativement simple a mettre mais peut présenter des problèmes de reproductibilité

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2.1.6. - Séquençage de l'ADN

Il s'agit de la détermination en nucléotides de la molécule d'ADN ainsi amplifiée. C'est une technique lourde et encore du domaine de la recherche.

2.2. - Applications en bactériologie médicale

2.2.1. - L'application des techniques de la biologie moléculaire en bactériologie s'est heurtée à différentes difficultés :

Pour être spécifique, le diagnostic est nécessairement ciblé. Cette spécificité va de pair avec une faible sensibilité liée à la très faible concentration de la séquence cible de la sonde dans l'ADN total. Il s'en suit que l'échantillon à analyser doit comporter au minimum quelques copies:

- Une culture préalable de la bactérie permet d'accroître la quantité de cibles et en conséquence la sensibilité.

- L’analyse de l'ARN ribosomal qui est naturellement une cible amplifiée est un autre moyen d'accroître la sensibilité.

- Finalement un progrès décisif a été accompli par la méthode d'amplification in vitro (PCR).

- L'hybridation moléculaire en milieu solide se prête mal au travail de routine (assez lente, nécessite de nombreuses étapes et du personnel spécialisé). De ce fait, depuis quelques années se développent des réactions d'hybridation en milieu liquide où, comme dans la méthodologie GenProbe, toutes les réactions se font dans le même tube. La réaction d'hybridation est 5 à 10 fois plus rapide que sur support solide, tous les sites sont accessibles, la quantification est excellente et l'automatisation est possible.

2.2.2 - Les applications de la méthode d'hybridation moléculaire en bactériologie sont multiples et particulièrement intéressantes dans

certains domaines :

- Utilisation de sondes pour le diagnostic: Citons par exemple la détection de :

- E. coli entérotoxinogènes, Shigella, Salmonella, ...- Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium

avium-intracellulare , Mycoplasma pneumoniae, - Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, ....

- Identification des différentes espèces au sein d'un même genre bactérien.

Exemple : PCR-RFLP dans le cadre du diagnostic des agents étiologique de la maladies des

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griffes du chat.La méthode permet également de distinguer différentes souches d'une même espèce. Ces

études d'homologie de l'ADN par hybridation ont joué un grand rôle dans la progression de la taxonomie bactérienne.

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- Caractérisation des gènes de résistance aux antibiotiques.Les sondes permettent de préciser la localisation chromosomique ou extrachromosomique

des gènes de résistance, en particulier ceux codant pour les béta-lactamases, les aminoglycosides-transférases. Elles peuvent être utilisées dans un but épidémiologique sur un grand nombre de souches.

2.2.3. - Autres applications

- épidémiologie hospitalière et infection nosocomiales ; intérêt des techniques d’analyse de profils plasmidiques, d’analyse de profil d’électrophorèse en champ pulsé ou de PCR (RAPD).

- PCR-RFLP : exemple ; diagnostic étiologique des agents de la maladie des griffes du chat- séquençage d’ADN des ARN16s-18s : identification de nouvelles bactéries par exemple

les mycobactéries atypiques de l’immunodéprimé ou les bactéries de l’angiomatose bacillaire.

2. 3. - Conclusions

De par leur principe même, les techniques de biologie moléculaire en bactériologie, en particulier la PCR, permettent de pallier certains inconvénients des techniques classiques, en donnant la possibilité d'obtenir en quelques heures de nombreuses copies du fragment spécifique de l'ADN du micro-organisme responsable de l'infection.

L’ensemble des travaux actuels concernant le diagnostic de la tuberculose tend à montrer que la présence d’inhibiteurs de la PCR dans les liquides biologiques peut entraîner la présence de faux négatifs, de même que la présence d’un faible nombre de copies d’ADN dans le prélèvement clinique (tuberculose paucibacillaire). Ces résultats conduisent le microbiologiste à être très prudent dans l’interprétation de ces résultats.

En raison des énormes progrès réalisés, depuis les premiers essais il y a environ une dizaine d'années, l'utilisation de la biologie moléculaire peut être envisagée dans les laboratoires de routine de bactériologie. Toutefois ces techniques impliquent une très grande rigueur dans leur exécution, dans des laboratoires dont la structure a été adaptée pour éviter en particulier les risques de contamination par des ADN étrangers provenant de l'environnement.

L'application de ces techniques a un coût important. Il ne faut pas l'envisager d'une manière systématique, elle doit être ciblée et réservée aux cas difficiles ou litigieux, lorsque, par exemple, l'agent responsable de l'infection n'a pu être isolé.

Le recours aux techniques classiques de mise en culture reste obligatoire, en particulier :

- lorsque plusieurs agents doivent être d'emblée recherchés, par exemple dans des selles diarrhéiques, des sécrétions broncho-alvéolaires, ...

- si l'agent infectieux mis en évidence impose une étude de sa sensibilité aux antibiotiques

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(le gène peut être présent et ne pas s’exprimer ou s’exprimer à un faible niveau).

La PCR, excellent outil de travail en taxonomie et en épidémiologie présente un moyen d’intérêt croissant en bactériologie de routine.

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CHAPITRE 4

Classification des antibiotiques et sensibilité naturelle des bactéries

1. - Définitions

- Les antibiotiques sont des substances d’origine naturelle ou d’hémisynthèse entraînant une diminution de la multiplication des bactéries ou leur destruction.

- ces antibiotiques ont un mode d’action précis inhibant une voie métabolique bactérienne, à l’inverse des antiseptiques qui agissent de manière non spécifique.

- les cibles des antibiotiques sont bactériennes. Ils n’ont pas d’activité sur les virus ou les cellules eucaryotes.

- la sensibilité naturelle d’une bactérie à un antibiotique est définie à partir de la CMI : concentration minimale inhibant in vitro la multiplication d’un germe ; classification en sensible, intermédiaire, résistant (valable également pour la résistance acquise).

les antibiotiques peuvent être classés en familles selon la parenté de leur mécanisme d’action, de leur structure et de leur spectre d’activité.

2. - Antibiotiques agissant sur la synthèse de la paroi bactérienne

2.1. - Les -lactamines

2.1.1. - Mode d’action

. inhibe la synthèse du peptidoglycane en agissant sur l’activité transpeptidasique des protéines liant la pénicille (PLP). Ces protéines sont situées sur la face externe de la membrane cytoplasmique : les -lactamines sont donc actives sans franchir cette membrane cytoplasmique.

. ils sont bactéricides du fait d’enzymes lytiques pour le peptidoglycane libéré sous l’effet de ces -lactamines.

2.1.2. - Les molécules

Classées selon leur spectre d’activité et leur pharmacocinétique

2.1.2.1. - Les pénicillines

2.1.2.1.1. - La pénicilline G

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. structure chimique : noyau -lactame + noyau thiazolidine

. voie IM et IV

. spectre naturel de sensibilité

- staphylocoques- streptocoques (dont pneumocoques)- Listeria monocytogenes, Actinomyces- Clostridium (sauf C. difficile)- méningocoques, gonocoques- tréponèmes, leptospires, Borrelia

. spectre naturel de résistance

- bacilles à Gram (-) ; Haemophilus, entérobactéries, Pseudomonas, Acinetobacter- anaérobies Gram (-) : Bacteroïdes- Chlamydiae, mycoplasmes

Certains dérivés peuvent être administrés par voie orale, pénicilline IV phénoxypénicilline (oracilline) car stable à l’acidité gastrique analogue à la pénicilline G à durée de vie prolongée ; association de péni G et d’un ester de pénicilline : ex. pénicilline G et benzathine : extencilline de durée de vie de 15 jours.

2.1.2.1.2. - Méthicilline et oxacilline

. méthicilline administrable uniquement IV-IM alors que l’oxacilline est administrable également per os.

. active sur les souches de staphylocoques productrices de pénicillinases (résistance acquise, 90 % des souches)

. spectre similaire à celui de la pénicilline G, cependant très faible activité sur entérocoques, Listeria, méningocoque et gonocoque.

2.1.2.1.3. - Pénicillines à spectre élargi

2.1.2.1.3.1. - Aminopénicilline (pénicillines A)

. ampicilline, amoxicilline, per os ou IV

. spectre identique à celui de la péni G ainsi que

- Haemophilus influenzae- E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella, shigella- Helicobacter, Campylobacter

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2.1.2.1.3.2. - Carboxy et ureïdopénicillines

. carbénicilline, ticarcilline, pipéracilline

. IM ou IV

. spectre identique à celui de l’ampicilline mais étendu à certains BG (-) hospitaliers : Pseudomonas, Serratia, Enterobacter, Providencia, Proteus stuartii, Morganella morganii , à certains anaérobies ; Bacteroïdes fragilis).

2.1.2.1.3.3. - Les inhibiteurs de lactamases

. A. clavulanique en association avec de l’amoxicilline (Augmentin) (per os ou parentéral) ou à la ticarcilline (Timentin, parentéral) ; tazobactam (parentéral) en association avec la pipéracilline (Tazocilline)

. inhibition de l’activité des pénicillinases ; ex : résistance acquise de certains staphylocoques, Haemophilus...

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. Très faible activité intrinsèque en tant que -lactamine.

2.1.2.1.4. - Céphalosporines

. structure chimique : cycle dihydrothiazine + cycle -lactame

2.1.2.1.4.1. - Cephalosporines de première génération

. céfalotine (Keflin, IM, IV) ; cefaclor (Alfatil, per os)

. spectre : celui de l’ampicilline + meticilline ;- staphylocoque (y compris producteur de pénicillinases)- streptocoques- pneumocoques- H. influenzae- E. coli, P. mirabilis, Salmonella, Shigella, Klebsiella pneumonia- C. perfringens. résistance aux pénicillinases si production de bas niveau

2.1.2.1.4.2. - Cephalosporines de deuxième génération

. céfuroxime (Zinnat, IM, IV, PO) ; céfamadole (Kefandole IM, IV) céfoxitine (IM, IV)

. plus actives que céphalosporines de première génération sur germes sensibles à ces dernières.

2.1.2.1.4.3. - Céphalosporines de troisième génération

. céfotaxime (Claforan), ceftriaxone (Rocéphine), ceftazidime (Fortum)cefopérazone (Cefobis) ; latamoxef (Moxalactam) ; cefsulodine (Pyocefal)

. activité étendue aux Serratia, Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa (Ceftazidime et Cefsulodine)

. résistance à l’hydrolyse par des céphalosporinases si production de bas niveau.

céphalosporines de « troisième génération » orales ; céfixime (Oroken) cefpodoxime (Orélox) ; sensibilité étendue à Providencia, Citrobacter diversus mais faible activité sur staphylocoques.

2.1.2.1.5. - Monobactames : aztreonam

. spectre limité aux BG (-) aérobies (celui des céphalosporines de troisième génération), IV, IM.

2.1.2.1.6. - Carbapénèmes : imipénème

. IV, IM éventuellement

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. Spectre le plus large parmi celui des -lactamines. Stabilité aux pénicillinases et céphalosporinases. résistance naturelle ; P. cepacia, Stenotrophomonas maltophilia.

2.2. - Les glycopeptides

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2.2.1. - Mode d’action

. Inhibiteur de la synthèse de la paroi bactérienne ; bactéricide.

2.2.2. - Les molécules

. Vancomycine (Vancocine, IV), teicoplanine (Targocid ; IM ; IV)

. spectre : molécules hydrophobes ne passant pas, la paroi des BG (-). Spectre : celui des bactéries à Gram positif ; staphylocoques, entérocoques, streptocoques (dont pneumocoques), Clostridium sp., corynébactéries.

2.3. - Fosfocine, Fosfomycine

. inhibition de la pyruvyl transférase qui agit au niveau de la première étape de la synthèse de peptidoglycane. spectre large : staphylocoques, pneumocoques, méningocoques, H. influenzae, E. coli, P. mirabilis, P. vulgaris, Salmonella, Enterobacter, Serratia.

Résistance naturelle des streptocoques A, B, entérocoques, anaérobies.

3. - Antibiotiques agissant sur la membrane cytoplasmique : les polypeptides cycliques

. mode d’action : hydrophiles, pénètrent à travers les porines et inhibent l’équilibre ionique transmembranaire. IV uniquement ; polymyxine ; colimycine. spectre limité à certains BG (-) ; entérobactéries sauf Proteus, Serratia, Providencia, Pseudomonas

Très mauvaise pénétration intratissulaire

4. - Antibiotiques agissant sur la synthèse protéique

4.1. - Aminoglycosides.

. structure de base polyosidique.

. pénétration transpariétale par des porines (molécules hydrophiles) ; traversée de la membrane cytoplasmique par un processus de transport actif.

. altération de la phase d’élongation lors de la synthèse protéique

. action bactéricide . spectre naturel d’activité : staphylocoque méti S

E. coli, Salmonella, Shigella, P. mirabilis, Klebsiella,Serratia, Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas(amikacine) H. influenzae, L. monocytogenesCampylobacter, Yersinia

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M. tuberculosis (streptomycine)

. résistance naturelle : anaérobiesstreptocoques dont pneumocoques, entérocoques (résistance de

bas niveau par imperméabilité) tréponème

. deux groupes : aminosides administrables par voie généraleStreptomycine (Streptomycine)Kanamycine (Kanamycine)Gentamycine (Gentalline)Tobramycine (Nebcine)Amikacine (Amiklin)Aminosides administrés uniquement par voie locale et per os. Néomycine (Néomycine). Framycétine (Soframycine)

4.2. - Tétracyclines

. noyau de base : tétracyclines ; doxycycline (Vibramycine), minocycline (Minocine)

. pénétration par diffusion passive à travers la paroi bactérienne, transport actif intracytoplasmique.. blocage de la phase d’élongation de la synthèse protéique.. action bactériostatique. spectre naturel : E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, Brucella, Pasteurella, H.

influenzae, Chlamydia, M. pneumoniae, U. urealyticum, Rickettsia, Coxiella, Leptospira, Treponema pallidum, Borrelia, Listeria,

- Résistance naturelle : mycobactéries, Proteus, Providencia, Serratia, Pseudomonas

antibiotique à forte concentration intracellulaire

4.3. - Macrolides et apparentés

. macrolides, lincomycine, streptogramines ou synergistines

. inhibent la synthèse protéique (inhibition du site de fixation de l’ARNt, inhibition de la translocation). bactériostatique

Macrolides (grand noyau lactone (olide) + sucres aminés ou non) :

Erythromycine (Erythromycine) oléandomycine (TAO), spiramycine (Rovamycine)

Lincomycine (acide aminé + sucre) :

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Lincocine (Lincocine), clindamycine (Dalacine).

Streptogramines :

Virginiamycine (Staphylomycine).; pristinamycine (Pyostacine)

Spectre de sensibilité : - macrolides Staphylocoques, streptocoques (sauf B), gonocoques, méningocoque, C. diphteria, Listeria H. pylori, C. jejuni, M. pneumoniae, Coxiella burnetti, Chlamydia, Legionella, Treponema pallidum, Leptospira, Actinomyces, Propionebacterium acnes , anaérobies, M. avium (clarithromycine)..Résistance naturelle : mycobactérie, bacilles à Gram (-) (sauf Campylobacter et Legionella), H. influenzae (dépend des macrolides).

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- lincomycine

spectre large mais utilisation actuelle uniquement réduite aux traitements des infections digestives à Clostridium difficile (traitement local)

- synergistines

sensibilité des staphylocoques, streptocoques (sauf entérocoques), pneumocoques, Legionella, mycoplasmes, Chlamydia, Bacteroides, Clostridium ;spectre très large, utilisation per os.

4.4. - A. fusidique (Fucidine)

. inhibition synthèse protéique.

. spectre : cocci à Gram positif ; C. perfringens, C. difficile.

4.5. - Chloramphénicol (Tifomycine), thiamphénicol (Tiophenicol)

. inhibition de la traduction de l’ARNm (phase d’élongation )

. bactériostatique

. spectre très large ; cocci et bacilles à Gram (+) et (-), Rickettsia et Chlamydiaceae

. extrêmement peu utilisés (toxicité médullaire)

5. Antibiotiques actifs sur le métabolisme de l’ADN ou sur la physiologie de l’ADN.

5.1. - Sulfamides

. Composés de synthèse ; inhibition de la synthèse des acides nucléiques par inhibition de la dihydrofolate synthétase. bactériostatique. nombreuses molécules selon leur pharmacocinétique ;

- à action générale : sulfadoxine (Fansidar)- à action urinaire : sulfamithizol (Rufol)- à action intestinale : sulfasalazine (Salazopyridine)- à usage externe : sulfamilamide (Hexoseptolix)

. spectre large : cocci à Gram positif : staphylocoques et streptocoques cocci à Gram négatif bacilles à Gram positif : Listeria bacilles à Gram négatif : entérobactéries, Haemophilus, Vibrio cholerae mais pas Pseudomonas, Bacteroides, Fusobacterium.

également parasites : Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii

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association ; Triméthoprim (sulfaméthoxazole + triméthoprim ; Bactrim) potentialise l’effet du sulfamide par inhibition en plus de la dihydrofolate réductase.

5.2. - Quinolones

. inhibition de l’ADN gyrase : bactéricide

. pénétration par porines à travers la paroi bactérienne

. quinolones de première génération : a. nalidixique (Negram) a. pipémidique (Pipram)

- diffusion urinaire ++. Spectre d’activité : bacilles à Gram négatif dont entérobactéries.

. quinolones de deuxième génération : fluoroquinolones

à diffusion systémique : péfloxacine (Péflacine) norfloxacine (Noroxine) ofloxacine (Oflocet) ciprofloxacine (Ciflox). per os ou IV (sauf Noroxine per os). spectre large : staphylocoques H. influenzae Neisseria Entérobactéries Campylobacter, Pasteurella Mycoplasmes, Chlamydia, Legionella

Résistance de bas niveau : entérocoques, streptocoques dont pneumocoques.

5.3. - Rifamycines

. inhibition de la transcriptase bactérienne

. action bactériostatique et bactéricide

. spectre limité pour rifamycine S.V. (Rifocine) ; cocci à Gram positif et négatif et bacilles à Gram positiflarge pour rifampicine (Rifadine, Rimactan) : per os et IV ;staphylocoque +/- pneumocoque,Brucella, Legionella, M. tuberculosis, M. atypiques du groupe I, M. leprae

5.4. - Nitro-imidazolés

. métabolites se fixent sur l’ADN. Pénétration active à travers le cytoplasme

. Métronidazole (Flagyl) ; Ornidazole (Tiberal) ; IV et per os

. spectre d’activité : les anaérobies (Bacteroides, Clostridium...) Gardnerella vaginalis.

également antiparasitaire (Trichomonas vaginalis, E. histolytica, Giardia intestinalis)

5.5. - Nitrofuranes

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. métabolites se fixent à l’ADN après une étape de réduction par la nitrofurane réductase

. large spectre mais diffusion tissulaire limitée ;

. à visée urinaire : nitrofurantoine (Furadantine) digestive : nifuroxazide (Ercefuryl)

6. - Autres antibiotiques:

- Novobiocine : formule chimique complexe comportant un phénol substitué, une coumarine et un sucre, le noviose.- Action au niveau de la synthèse des acides nucléiques- spectre étroit limité aux bactéries à Gram positif.

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7. - Médicaments antituberculeux

7.1. - Antituberculeux majeurs

7.1.1. - Isoniazide (Rimifon)

Hydrazide de l’acide isonicotinique (I.N.H.)- action bactéricide- apparition rapide de mutants résistants- excellente diffusion : dans les tissus et macrophages, à travers les méninges- élimination essentiellement urinaire- administration : per os et par voie parentérale- risques :. polynévrites par hyovitaminose B6. accidents neuro-psychiques (rares). gastrites. atteinte hépatique

7.1.2. - Rifampicine (Rifadine)

Le plus actif des antituberculeuxFréquence d’apparition des mutants résistants plus faible qu’avec l’isoniazide.Risque d’hépatites.

7.2. - Antituberculeux de bonne efficacité

7.2.1. - Streptomycine

Activité sur le bacille tuberculeux, dix fois plus faible que celle de l’isoniazide.Peu utilisé actuellement.

7.2.2. - Ethambutol

Isomère dextrogyre du 2,2’ (Ethylène-diamino) di-1-butanol- bonne diffusion tissulaire- élimination surtout rénale- administration : per os et par voie parentérale- risques : atteinte du nerf optique (névrite optique rétro-bulbaire).

7.2.3. - Ethionamide

Dérivé de l’acide isonicotiniqueActivité sur le bacille tuberculeux. supérieure à celle de la streptomycine. inférieure à celle de l’isoniazide

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- bonne diffusion tissulaire- administration : per os et intra-veineux- risques : troubles digestifs, rares ictères.

7.2.3. - Prothionamide

Homologue de l’éthionamide

7.3. - Antituberculeux mineurs

. Acide para-amino-salycylique (P.A.S)

Peu utilisé actuellement- administration I.V.- risque : troubles digestifs, réactions allergiques

. Kanamycine

Voir chapitre précédent

. Cycloserine

Structure chimique D-4 amino-3-Isoxazolidonerisque : troubles neuro-psychiques

. Pyrazinamide (Piraldine, Piazoline)

Agit uniquement sur les bacilles intracellulairesrisque : toxicité hépatique, augmentation de l’uricémie (manifestations de type goutte)

. CapréomycneStructure d’un peptiderisque : troubles rénaux, auditifs, allergiques

. ThiosemicarbazonesActivité voisine de celle du P.A.S.Risques : rashs allergiques, cutanés ou plus graves, troubles digestifs.

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CHAPITRE 5

Le diagnostic direct et indirect en Bactériologie

Le rôle du laboratoire de bactériologie doit être d’aider le clinicien dans sa démarche diagnostique de certitude en faisant la preuve du rôle pathogène de l’agent causal par un faisceau d’arguments biologiques qui compléteront les arguments cliniques.

* Le diagnostic direct par isolement du ou des agents suspectés doit toujours être fait en priorité car il constitue la meilleure preuve. Une interprétation est néanmoins nécessaire. Certains agents infectieux sont pathogènes spécifiques et leur isolement est toujours significatif: Salmonella typhi, Neisseiria gonorrhoeae. Par contre, en cas d’isolement d’un agent opportuniste (staphylocoque à coagulase négative, Candida albicans), on doit tenir compte du lieu d’isolement (site stérile, foyer « ouvert ») des signes cliniques et de l’état immunitaire de l’hôte.

* Le diagnostic indirect par la mise en évidence de la réponse immune de l’hôte consiste à rechercher soit les anticorps spécifiques, soit un état d’hypersensibilité de type retardé. Il présente un intérêt particulier lorsque l’agent infectieux nécessite des techniques d’isolement longues et délicates ou s’il n’a pas pu être isolé à ce jour.

Dans tous les cas, le diagnostic direct est toujours préférable au diagnostic indirect car il permet, de plus, l’étude de la sensibilité aux antibiotiques.

1. - Diagnostic bactériologique direct

Cette étape nécessite : la réalisation du prélèvement dans les meilleures conditions (au moment d’un pic

fébrile, avant toute antibiothérapie, délais de transport rapide...). une orientation diagnostique en précisant dans certains cas le ou les germes à

rechercher (brucellose, leptospirose, tréponèmes...).

On distingue deux grands types de prélèvements : les uns correspondant à des produits biologiques normalement stériles. En cas

d’infection, leur culture est en règle monomicrobienne et le résultat définitif en général rendu en 24 à 48h. Ex: LCR, sang, urines...

les autres présentant, à l’état physiologique, une flore commensale polymicrobienne , d’où il faudra isoler la bactérie responsable de l’infection. Les résultats définitifs sont rendus en 48h ou plus. Ex: expectorations, prélèvements rhinopharyngés, selles, prélèvements génitaux.

1.1. - Examen microscopique

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L’examen direct permet d’apprécier la morphologie des bactéries, leurs groupements, leur abondance. Différentes techniques peuvent être utilisées:

- l’état frais: recherche de Treponema pallidum

- la coloration de Gram à partir du produit pathologique qui permet de différencier la majorité des bactéries et de faire le diagnostic d’une infection dans certains cas particuliers: urétrites à gonocoques, diagnostic d’une angine de Vincent (association.fuso-spirochètenne).

- des colorations spéciales: coloration à l’auramine et coloration de Ziehl-Neelsen pour la mise en évidence des mycobactéries.

- L’immunofluorescence directe par l’utilisation d’anticorps spécifiques marqués par un fluorochrome (isothiocyanate de fluorescéine) à l’aide d’un microscope à UV. Cette technique permet d’emblée l’identification de certaines bactéries: recherche de Chlamydia trachomatis dans des prélèvements génitaux, de Legionella pneumophilia dans les sécrétions bronchiques ou les épanchements pleuraux et aussi de déterminer le sérotypage au sein d’une espèce bactérienne (E. coli des GEI).

Parallèlement, il est important d’effectuer une étude cytologique des prélèvements pour interpréter correctement un résultat d’analyse bactériologique . C’est le cas du liquide céphalo-rachidien et du prélèvement d’urines pour mettre en évidence l’existence d’une réaction cellulaire de défense de l’hôte, signe d’une infection. Cette étude peut être quantitative (dénombrement des éléments figurés présents dans le liquide biologique) et qualitative après coloration de May Grunwald-Giemsa.

1.2. - Mise en culture des prélèvements

Seule la culture avec isolement bactérien permet l’identification complète des bactéries et l’étude de la sensibilité aux antibiotiques.Le produit pathologique est ensemencé dans des milieux favorables simples ou enrichis, en aérobiose ou en anaérobiose, et éventuellement sur des milieux sélectifs lorsqu’on soupçonne la présence d’un germe particulier au sein d’un produit pathologique polymicrobien. On utilise principalement des milieux solides qui permettent d’isoler les bactéries et de reconnaître l’existence éventuelle d’une flore microbienne mixte. Après 24 ou 48h d’étuve, les différents germes présent donneront naissance à une colonie bactérienne constituant un clone homogène. L’origine, l’analyse directe du prélèvement et les renseignements cliniques permettent d’orienter l’examen vers tel ou tel type de bactérie.Il est indispensable dans certaines situations , d’effectuer une étude quantitative des bactéries pour différencier une infection d’une colonisation: numération bactérienne dans les urines, dans les liquides de lavage broncho alvéolaire, dans les sécrétions vaginales (Mycoplasmes par exemple).

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1.3. - Identification des bactéries à partir d’une culture pure par la mise en évidence

- des caractères culturaux : nécessite ou non de l’oxygène, exigences nutritives, aspect des colonies, pigmentation, hémolyse sur gélose au sang, odeur particulière.

- des propriétés biochimiques qui consistent à définir l’équipement enzymatique de la bactérie: métabolisme glucidique, lipidique, protéique (« galerie biochimique »).

- si pour certaines bactéries l’identification s’arrête à ce stade, pour d’autres il est important de préciser les constituants antigéniques au moyen de sérums spécifiques agglutinants ou précipitants ou de particules sensibilisées (agglutination latex, coagglutination). C’est la sérotypie ou le sérogroupage (streptocoques, Salmonelles..).

- dans un contexte épidémiologique particulier, il peut être utile de pousser l’identification de la souche en utilisant des bactériophages, c’est la lysotypie.L’inoculation à l’animal n’est plus utilisé pour le diagnostic clinique.

1.4. - Mise en évidence du génome microbien

Les techniques d’amplification génique comme la « Polymérase chain réaction » (PCR) peuvent mettre en évidence le génome microbien dans certains cas. Elles sont d’utilisation récente. Elles sont particulièrement intéressantes pour des germes à croissance lente ou difficile comme les mycoplasmes, les mycobactéries, Chlamydiae et Bartonella.Cette méthodologie ne permet pas d’obtenir la souche bactérienne et donc d’étudier l’expression phénotypique de sa sensibilité aux antibiotiques.

2. - Diagnostic bactériologique indirect

Compte tenu de l’amélioration des techniques de diagnostic direct, l’utilisation diagnostique de l’immunité humorale et/ou cellulaire n’est réservée en bactériologie qu’à des cas particuliers.

2.1. - Recherche des anticorps spécifiques : sérodiagnostic

Principe: il consiste à mettre en présence le sérum du malade contenant les anticorps (Ac) avec l’antigène spécifique (Ag) et à mettre en évidence la formation d’immunocomplexes.Différentes techniques peuvent être utilisées :

Immunoagglutination en tube comme la réaction de Widal et Félix (fièvre typhoïde) et la réaction de Wright (brucellose).

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Réaction d’agglutination passive à l’aide de suspension d’hématies ou de particules inertes « sensibilisées » avec un antigène bactérien. (Ex: détection des anticorps syphilitiques ou Rose bengale pour la brucellose).

Réaction de neutralisation quand l’antigène possède une activité toxique, décelable in vitro ; cette activité se trouve neutralisée par l’anticorps spécifique (ex: détection des anticorps antistreptolysine O, ASLO ou antistreptodornases ASDornase B).

Réaction détectant les anticorps fixés aux bactéries ou aux antigènes bactériens à l’aide d’anti-globulines humaines marquées, soit par de la fluoresceine (Immunofluorescence), soit par une enzyme (ELISA). Cette technique est de plus en plus utilisée notamment pour les infections à Chlamydiae, à mycoplasmes.

Autres réactions: il existe des sérodiagnostics propres à certaines maladies bactériennes; c’est le cas de la réaction d’immobilisation des tréponèmes dans la syphilis (test de Nelson).

2.2. - Recherche d’une hypersensibilité spécifique de type retardée : intradermo-réaction

La réaction la plus commune reste le test d’hypersensibilité retardée dont le type est l’intradermo-réaction à la tuberculine. Elle consiste à introduire dans la peau (voie épidermique ou intradermique) l’antigène bactérien, dit allergène, et de noter, 2 à 4 jours après, l’apparition d’une réaction cellulaire locale sous forme de papule érythémateuse: une réaction positive signe une hypersensibilité spécifique.Des test cutanés d’hypersensibilité sont exceptionnellement utilisés dans d’autres maladies bactériennes.

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CHAPITRE 6

Méthode d’étude et de surveillance par le laboratoire d’un traitement antibiotique

Lorsque le clinicien est en possession des résultats de l’antibiogramme, il doit adapter le traitement en fonction de la sensibilité aux antibiotiques du germe isolé, de la gravité de l’infection, et de l’état du malade. En effet, l’efficacité d’un antibiotique dépend d’un ensemble de paramètres liés :

à la bactérie responsable de l’infection: sa sensibilité à l’antibiotique utilisé. (antibiogramme, CMI, CMB éventuellement).

au site et à la nature du foyer infectieux (bonne diffusion de l’antibiotique choisi) à l’état du malade: tenir compte des tares viscérales et des capacités de défense du

patient. La surveillance d’un traitement antibiotique reposera donc sur un ensemble de critères

cliniques et biologiques permettant le contrôle de l’évolution sous traitement.

1. - Etude de la sensibilité aux antibiotiques

Le laboratoire détermine la « Concentration Minima Inhibitrice » (CMI) pour chaque antibiotique: c’est la plus faible concentration d’antibiotique capable d’inhiber toute culture visible de la souche étudiée. Pour cela, il utilise en pratique courante, la méthode de diffusion en gélose (antibiogramme : méthode des disques). Elle consiste à déposer à la surface de la gélose d’une boîte de pétri des disques de papier buvard imprégnés de concentrations fixes des antibiotiques testés. Chaque antibiotique diffuse au sein de la gélose à partir du disque et y détermine des concentrations inversement proportionnelles à la distance du disque. Si, avant de déposer les disques, on a ensemencé uniformément la surface de la gélose avec le germe à étudier, les disques apparaissent, après 24h d’étuve, entourés d’une zone d’inhibition dont le diamètre permet de mesurer la CMI.

La réponse est formulée par l’un des trois termes: souche « sensible », « résistante » ou « intermédiaire ».

On peut donc définir trois catégories de souches :

une souche est dite « résistante » quand la concentration d’antibiotique qu’elle est capable de « supporter » est notablement plus élevée que la concentration qu’il est possible d’obtenir in vivo, quel que soit le traitement.

à l’opposé, une souche dont la CMI est nettement inférieure aux concentrations sériques obtenues avec un traitement à doses usuelles sera dite sensible, et pourra être atteinte par un traitement par voie générale à doses usuelles.

entre les deux catégories, il existe des souches que l’on qualifie « de sensibilitŽ intermédiaire » qui ne répondront pas à un traitement général à doses habituelles mais

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qui pourront peut-être être atteintes par un traitement par voie générale à doses élevées ou par voie locale.

Parallèlement à la technique classique de diffusion, il existe actuellement des techniques automatisées: elles sont basées sur l’étude de la croissance bactérienne en milieu liquide en présence d’une ou de plusieurs concentrations d’antibiotiques.

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2. - Contrôles bactériologiques d’efficacité d’un traitement antibiotique

2.1. - La première preuve d’efficacité du traitement est apportée par la négativation des prélèvements bactériologiques

Lorsque ces contrôles bactériologiques ne sont pas réalisables, d’autres méthodes peuvent être utiles à la surveillance du traitement au cours d’infections graves.

2.2. - L’étude du pouvoir inhibiteur du sérum ou test de Heilman

2.2.1. - Principe

Ce test vérifie que les antibiotiques administrés sont présents dans le sérum à un taux suffisant pour obtenir un effet bactériostatique ou bactéricide sur le germe responsable.. Il peut également être appliqué à la mesure du pouvoir inhibiteur de divers liquides biologiques (LCR, liquide d’épanchement...).

2.2.2. - Conditions techniques

Il nécessite l’isolement de la bactérie responsable de l’infection. Les prélèvements de sérum sont effectués au moment du pic sérique suivant l’administration de l’antibiotique, soit généralement :

dès la fin d’une perfusion 1/2h après IV 1h après IM 1 à 3h après prise orale

On réalise dans une série de tubes des dilutions croissantes du sérum du malade (1/2, 1/4, 1/8, 1/16...etc.). Chacune des dilutions est ensuite ensemencée par un même inoculum (105 bactéries par ml) de la bactérie isolée chez le malade.L’activité bactériostatique du sérum est déterminée après 24h de croissance à 37°C. Elle est exprimée par la plus grande dilution inhibitrice de la croissance bactérienne.L’activité bactéricide du sérum est déterminée par dénombrement des bactéries survivantes dans les tubes présentant une activité bactériostatique. La bactéricidie est définie par un nombre de survivants inférieur ou égal à 0,01% de l’inoculum initial.

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2.2.3. - Interprétation

Indications Temps Titre Evolution

. Endocardite pic 1/64 Prédit l’efficacité clinique

vallée 1/8 Prédit l’efficacité clinique

. Bactériémie staphylococcique ; ostéomyélite

pic 1/8 Pas de corrélation

vallée 1/4 1/4 prédit l’efficacité clinique

< 1/4 prédit l’échec

. Infections de l’immunodéprimé

pic 1/8 Prédit l’évolution plutôt favorable

2.3. - Etude des associations d’antibiotiques

Cette technique présente théoriquement les intérêts suivants :

recherche d’une action synergique diminution du nombre de mutants résistants éventuellement élargissement du spectre d’action de chacun des antibiotiques utilisés.

Elle consiste à apprécier le pourcentage de bactéries survivantes après un contact de 6 à 24 heures de la bactérie causale avec l’antibiotique seul ou une association de deux antibiotiques.L’évaluation du pourcentage de survivants se fait en comparant les stries du repiquage (à partir des tubes contenant les antibiotiques) à celles effectuées 24 heures auparavant à l’aide de diverses dilutions de l’inoculum (pur à 1/10 000).On admet qu’un effet bactéricide correspond à une strie avec un nombre de colonies < 0,01%.

2.4. - Mesure des concentrations sériques ou tissulaires d’antibiotique

Des méthodes microbiologiques, faciles à mettre en oeuvre, peu coûteuses mais de sensibilité variable peuvent être utilisées. Elles nécessitent l’établissement d’une courbe d’étalonnage, reliant les concentrations d’une gamme étalon de l’antibiotique à doser aux diamètres des zones d’inhibition obtenus pour chaque concentration dans une gélose

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ensemencée avec une bactérie test. Le diamètre d’inhibition de chaque échantillon donne, par référence à la courbe d’étalonnage, la concentration correspondante. Actuellement, le dosage des antibiotiques fait appel à des techniques biochimiques ou immunoenzymatiques, permettant un suivi plus fréquent (ex: dosage des taux sériques des aminosides ou des glycopeptides).

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CHAPITRE 7

Cocci à Gram Positif : Staphylocoques

Ce sont des bactéries de forme arrondie (cocci), immobiles, Gram positif.

On distingue :

- les staphylocoques,- les streptocoques dont le pneumocoque (ou Streptococcus pneumoniae) et les

entérocoques (genre Enterococcus)

Les bactéries anaérobies strictes telles que Peptococcus et Peptostreptococcus qui appartiennent à la flore de Veillon n'ont rien de commun avec ces germes, si ce n'est la morphologie.

Les staphylocoques :

Ils se caractérisent par :- leur morphologie : cocci à Gram +, groupés en amas,- leurs caractères culturaux : aéro-anaérobies.

Les streptocoques :

Cocci à Gram + groupés typiquement en chaînettes plus ou moins longues.

Le genre Streptococcus est constitué d'un grand nombre d'espèces très différentes. Si la notion d'espèce, est pour la plupart des bactéries, définie par un ensemble de caractères métaboliques, s'y adjoint, pour les streptocoques, la notion d'appartenance à des groupes antigéniques, caractérisés par la présence ou non d'un polysaccharide pariétal, le polyoside C.

Streptococcus pneumoniae est caractéristique par sa morphologie : aspect lancéolé, encapsulé dans les produits pathologiques.

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S T A P H Y L O C O Q U E S

Définition

Ils appartiennent au genre Staphylococcus.

Staphylococcus aureus est le plus souvent responsable des infections humaines.

Staphylococcus epidermidis, habituellement saprophyte, peut, dans certaines circonstances devenir pathogène (sujets immunodéprimés, greffes de valves cardiaques).

1. - Habitat

C'est un germe très répandu dans la nature (air, eau, sol). De plus, c'est un commensal habituel de la peau et des muqueuses de l'homme et des animaux.

2. - Pouvoir pathogène

2.1. -Suppurations :

- furoncle, anthrax, abcès, panaris,

- suppuration des séreuses : pleurésie, méningite, péritonite,

- phlegmon périnéphrétique,

- ostéomomyélite,

2.2. - Septicémies avec possibilité de localisations secondaires (septicopyohémies) atteignant électivement l'os, le rein, le poumon.

2.3. - Manifestations digestives

Elles sont dues à la production d'entérotoxine et peuvent revêtir deux formes :

- L'entérocolite staphylococcique, maintenant exceptionnelle, observée après l'administration d'antibiotiques à large spectre, mal absorbés au niveau de l'intestin, qui sélectionnent une flore abondante de staphylocoques entérotoxiques.

- Les toxi-infections alimentaires dues à l'absorption de l'entérotoxine préalablement produite dans l'aliment. Thermostable et non attaquée par les sucs digestifs, son action sur

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la muqueuse digestive va entraîner vomissements et diarrhée profuse cause parfois de déshydratation importante.La durée d'incubation est brève (en moyenne 3 heures après le repas).

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2.4. - Autres manifestations :

. choc toxique staphylococcique, du à la diffusion systémique de la toxine du choc toxique staphylococcique (TSST-1) et observé lors d’infection post-opératoires ou encore chez des femmes en période menstruelle, lors de l’utilisation de tampons vaginaux.

staphylococcies cutanées bulleuses (Syndrome de Ritter) provoquées par les toxines exfoliatives A et B.

3. - Physiopathologie

La porte d'entrée est variable : peau, muqueuse.

La pénétration se fait habituellement après rupture du revêtement cutané.La pénétration dans les muqueuses peut se faire à l'occasion d'une infection virale

concomittante.

Dès leur pénétration, les germes sont phagocytés par les polynucléaires après opsonisation par des anticorps de type IgG. Un déficit leucocytaire ou de l'immunité humorale favorise donc l'infection.

Lorsque la multiplication bactérienne peut se poursuivre, les germes vont secréter des enzymes permettant :

- l'extension du foyer (hyaluronidase),- la nécrose cellulaire (toxine, phosphatase, nucléase, lipase), - la diminution des défenses de l'hôte : leucocidine,- la constitution d'un foyer de thrombophlébite (coagulase).

Ce foyer de thrombophlébite sera lui-même partiellement lysé par la fibrinolysine, causant des embolies septiques.

Ostéomyélite

La métaphyse a une circulation terminale, ce qui explique son atteinte élective.Un traumatisme peut favoriser l'infection par la constitution d'un micro-hématome local.L'infection s'étend à l'os et au périoste par un mécanisme ischémique.

Arthrite

Le germe gagne d'abord la synoviale créant des phénomènes inflammatoires. Le liquide articulaire, d'abord stérile, ne sera infecté que secondairement.

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4. - Diagnostic bactériologique

4.1. - Morphologie

Cocci à Gram+ groupés en amas dans un produit pathologique; on examinera la cytologie (polynucléaires altérés).

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4.2. - Culture

- Elle est facile sur tous les milieux,

- Sur gélose ordinaire, les colonies sont assez grosses, arrondies, lisses, bombées. Elles peuvent être blanches ou pigmentées (ex. Staphylococcus aureus).

- En gélose profonde, c'est un germe aéro-anaérobie.

- Sur milieu de Chapman, milieu hypersalé, sélectif, il se développe en hydrolysant ou non le mannitol.

4.3. - Critères bactériologiques du pouvoir pathogène

Certains critères ne sont que des éléments d'orientation :

- pigment doré,- hydrolyse du mannitol en milieu de Chapman,

Les caractères qui permettent d'affirmer le pouvoir pathogène sont :

- la présence d'une staphylocoagulase coagulant le plasma de lapin (détection de la coagulase libre).- la présence d'une désoxyribonucléase attaquant le DNA.- la présence de récepteurs protéiques pour des fragments de fibrinogène permettant d'agglutiner des hématies de mouton sensibilisées (détection de la coagulase liée).

L’absence de ces critères (staphylocoques “ non dorés ”, n’élimine pas le caractère pathogène du staphylocoque isolé).

4.4. - Substances élaborées par les staphylocoques pathogènes

4.4.1. - Toxines

Hémolysines : Les appellations "alpha" et "bêta", employées pour caractériser les types d'hémolyse des staphylocoques sont différentes de celles utilisées pour caractériser les hémolyses des streptocoques.

- Hémolysine alpha hémolysant complètement les globules rouges de lapin et de mouton.

- Hémolysine bêta donnant une hémolyse incomplète.

- Leucocidine attaquant les polynucléaires, très antigénique.

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- Entérotoxine protéique, thermostable, insensible aux sucs digestifs, responsable des toxi-infections alimentaires.

-Toxines exfoliative A et B à tropisme cutanée

- Toxine du choc toxique staphylococcique (TSST-1).

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4.4.2. - Enzymes

- Coagulase : elle est à l'origine de la formation des caillots.

- Fibrinolysine : qui contribue à fragmenter le caillot et à provoquer les embols septiques.

- Désoxyribonucléase.

- Bêta-lactamases inactivant les bêta-lactamines. Secrétées par de très nombreuses souches, elles sont l'un des facteurs essentiels de la résistance à ces antibiotiques.

4.5. - Structure antigénique

4.5.1. - Les antigènes essentiels sont pariétaux :

- le peptidoglycane commun aux bactéries à Gram + et -, pouvant entraîner fièvre, thrombocytopénie.- l'acide teichoïque.- la protéine A.- de nombreux agglutinogènes spécifiques de type.

4.5.2. - Il existe aussi à la surface des staphylocoques des récepteurs bactériophagiques.

4.6. - Classification

- Selon les caractères biochimiques et culturaux (Staphylococcus aureus, epidermidis,...).

. Les staphylocoques sont souvent classés en staphylocoques à coagulase positive et staphylocoques à coagulase négative (SCN). Parmi ceux-ci, S. epidermidis est le plus souvent responsable d'infections ou de colonisations des cathéters.

- Selon le sérotype déterminé, par agglutination à l'aide de sérums spécifiques (5 sérotypes principaux) par lysotypie, par génotypie (voir marqueurs moléculaires)

4.7. - Infections nosocomiales à staphylocoques résistants à la méticilline

Le taux d'incidence des staphylocoques résistants à la méticilline (SARM) était en France parmi les plus élevés d'Europe (48 %).En rjaison de la politique de maîtrise des bactéries multirésistantes, ce taux d’incidence a diminué (36 % en 1997).

La stratégie de maîtrise de la diffusion comprend 3 étapes :- identification des malades infectés ou colonisés,- isolement géographique et technique,- traitement de l'infection,

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- dans certains cas, traitement de la colonisation,- la transmission des SARM se fait essentiellement par voie manuportée d’où l’importance du lavage des mains en milieu hospitalier.

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4.8. - Traitement

4.8.1. - Traitement curatif

Plusieurs cas schématiquement peuvent se présenter ;

- le staphylocoque ne produit pas de -lactamase : pénicilline, amoxicilline et un aminoside (gentamicine)- le staphylocoque produit une pénicillinase : méticilline, amoxicilline + a. clavulanique et un aminoside (gentamicine)- le staphylocoque est résistant à la méticilline ; il est alors résistant à toutes les -lactamines et souvent aux aminosides : traitement par de la vancomycine. Il a été rapporté récemment des résistances à la vancomycine (trois souches cliniques : une au Japon et deux aux USA).- les antibiotiques souvent actifs et de bonne diffusion tissulaire sont également les fluoroquinolones (péfloxacine), la rifampicine, l’acide fusidique ou la fosfomycine.

4.8.2. - Traitement préventif

Il repose avant tout sur l'application des mesures d'asepsie et d'hygiène.L'antibioprophylaxie doit être réservée à des cas particuliers (orthopédie par exemple).

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CHAPITRE 8

Cocci à Gram Positif : Streptocoques

1. - Généralités

Cocci à Gram positif groupés typiquement en chaînettes plus ou moins longues. Les principales espèces rencontrées en pathologie humaine appartiennent à deux genres récemment séparés :

- genre Streptococcus dont S. pneumoniae- genre Enterococcus

La classification des streptocoques repose sur plusieurs caractères :. culturaux: germes très fragiles nécessitant pour leur isolement des milieux enrichis au sang sur lesquels ils donnent en 24/48h à 37°C, différents types d'hémolyse permettant une classification utile mais insuffisante :

. hémolyse totale ou hémolyse bêta (): colonies de streptocoques entourées d'une auréole claire, transparente correspondant à une lyse totale des hématies.. hémolyse alpha (): colonies de streptocoques entourées d'une auréole floue, verdâtre correspondant à une hémolyse incomplète des hématies (streptocoques « viridans »).. absence d'hémolyse.

. biochimiques: absence de catalase.

. antigéniques:. certaines souches de streptocoques possèdent un polysaccharide pariétal antigénique (le polyoside C) dont la spécificité permet de classer ces streptocoques dits groupables en 19 groupes (classification de Lancefield) désignés par des lettres A,B,C...U.. d’autres streptocoques ne possèdent pas ce polyoside C: ce sont les streptocoques non groupables, le plus souvent rencontrés comme commensaux. Leur identification repose sur des caractères biochimiques.

La plupart des streptocoques sont très sensibles aux bêta-lactamines. Tous les streptocoques sont "résistants de bas niveau aux aminosides", mais l'association bêta-lactamine plus aminoside est synergique (traitement des endocardites). Les entérocoques posent des problèmes thérapeutiques en raison de leur multirésistance aux antibiotiques (Pénicilline G, céphalosporines de 3ème génération, lincosamides et fluoroquinolones).

2. - Streptocoques du groupe A : Streptococcus pyogenes

2.1. - Habitat, épidémiologie

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- Bactérie strictement humaine (présente chez 10% des sujets indemnes d'infection). - L'infection humaine est exceptionnelle avant l'âge de 2 ans.- Localisation au niveau des amygdales et du pharynx.- Contamination par voie aérienne.

2.2. - Pouvoir pathogène naturel

Le streptocoque du groupe A est une bactérie responsable de nombreuses infections aigu‘s dont certaines sont spécifiques. Il peut également entraîner des complications non suppurées souvent appelées post-streptococciques.

2.2.1. - Infections aiguës non spécifiques

- Sphère ORL: angines bactériennes érythémateuses et érythémato-pultacées parfois compliquées d’abcès périamygdaliens. Multiplication de la bactérie in situ. Seule la bactériologie permet un diagnostic de certitude.- Infections cutanées: impétigo, cellulite, pyodermites et de nombreuses autres suppurations fermées (panaris, arthrite) ou ouvertes (ulcères cutanés) pouvant entraîner une septicémie.

2.2.2. - Infections aiguës spécifiques

- Scarlatine: éruption cutanéo-muqueuse suivie de desquamation. Le streptocoque (lysogénisé par un bactériophage spécifique) reste localisé dans l'amygdale ou le pharynx et les manifestations générales sont dues à la dissémination de la toxine érythrogène et des enzymes streptococciques véhiculées par voie hématogène (maladie à déclaration obligatoire n°4).- Erysipèle: point de départ orificiel (narine, lèvre, plaie) à partir duquel se développe une intense réaction inflammatoire extensive par un mécanisme infectieux et allergique.

2.2.3. - Complications post-streptococciques non suppurées

Toutes les infections à streptocoques de groupe A insuffisamment traitées peuvent être suivies, après une période de latence, de maladies dites post-streptococciques:Le rhumatisme articulaire aigu (RAA) généralement suite à une infection pharyngée. Il est devenu rare en France en raison d'un traitement antibiotique correct des angines. La glomérulonéphrite aiguë (GNA) suite à une infection cutanée ou pharyngée, la chorée de Sydenham, l'érythème noueux. Tous les sérovars des streptocoques du groupe A peuvent être en cause dans le RAA alors que certains sérotypes seulement ont un potentiel néphritogène.Le mécanisme des complications post-streptococciques non suppurées n'est pas encore parfaitement élucidé. La période de latence de 2 à 6 semaines entre l'infection aiguë et l’apparition de ces manifestations est en faveur de processus immunoallergiques. Dans le RAA, les lésions cardiaques et articulaires seraient la conséquence d’une antigénicité croisée entre certaines structures de l’endocarde et des synoviales et le polyoside C. Dans la GNA les lésions glomérulaires rénales s'expliquent par l'action toxique d’immuns complexes circulants ainsi que par l'apparition secondaire d'auto-anticorps vis-à-vis des structures lésées.

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2.3. - Caractères bactériologiques

2.3.1. - Caractères culturaux :

- présence d'une hémolyse de type bêta sur gélose au sang.

2.3.2. - Structure antigénique :

2.3.2.1. - La capsule (variable) favorise la virulence en s’opposant à la phagocytose.

2.3.2.2. - Le polysaccharide C: antigène polyosidique spécifique de groupe, à la base de la classification de Lancefield. Il permet l'identification immunologique du streptocoque de groupe A par agglutination sur lame de particules de latex sensibilisées.

2.3.2.3. - Les protéines M, R et T permettent de différencier plusieurs sérotypes. La protéine M est la plus intéressante. Spécifique de type elle permet la distinction de 6O sérotypes (intérêt épidémiologique) et constitue le facteur majeur de virulence du streptocoque de groupe A protégeant la bactérie de la phagocytose. Fixée sur des fibrilles elle intervient dans l'adhésion des bactéries aux cellules épithéliales des muqueuses. Elle confère une immunité durable spécifique du sérotype M.

2.3.3. - Substances élaborées

Elles sont très nombreuses et rendent compte de la grande variété des infections provoquées par les streptocoques du groupe A. Certaines sont antigéniques et provoquent l'apparition d'anticorps spécifiques utilisés pour le diagnostic.

2.3.3.1. - Les toxines érythrogènes: exotoxines de nature protéique responsables de l'éruption scarlatineuse. Synthétisées par certains streptocoques de groupe A qui ont subi une conversion lysogénique par un bactériophage spécifique. Immunité anti-toxique et non anti-bactérienne.

2.3.3.2. - Les streptolysines: substances protéiques hémolytiques et toxiques. Site d'action au niveau de la membrane cytoplasmique des cellules sensibles.- la streptolysine S: bêta-hémolyse observée en culture. N'est pas antigénique.- la streptolysine O est antigénique. L'élévation du titre d'antistreptolysines 0 (ASLO) permet un diagnostic sérologique rétrospectif utilisé pour le diagnostic des complications post-streptococciques. 2.3.3.3. - La streptodornase B (désoxyribonucléase de type B) est antigénique. Intérêt pour le diagnostic sérologique des complications post-streptococciques. Dans le cas de glomérulonéphrites consécutives à une pyodermie, l'élévation des ASLO peut être nulle ou faible, alors que le taux d'antistreptodornase B (ADNase B) peut être très significatif.

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2.3.3.4. - La streptokinase: fibrinolysine. Apparition d'antistreptokinase (ASK). Elle est synthétisée par les streptocoques des groupes A, C et G.

2.3.3.5. - La hyaluronidase joue un rôle dans la diffusion de l'infection en hydrolysant l'acide hyaluronique du tissu conjonctif. La recherche d'anti-streptohyaluronidase (ASH) peut parfois être utile pour le diagnostic de complication post-streptococcique.

Le diagnostic sérologique des complications post-streptococciques repose principalement sur la détermination du taux des :- antistreptolysines (ASLO)- antistreptodornases (ADNase B)

2.4.- Diagnostic bactériologique

2.4.1. - Diagnostic direct

Il est applicable au diagnostic des infections aiguës, la bactérie n’étant pas retrouvée au cours des complications post-streptococciques.

2.4.1.1. - Les prélèvements seront pratiqués en fonction du type de l’infection:- prélèvement de gorge pour une angine- prélèvement au niveau des lésions cutanéo-muqueuses- liquides d’épanchements- hémocultures.

2.4.1.2. - examen microscopique direct: coques à Gram positif en chaînettes. Ce dernier ne présente aucun intérêt pour les prélèvements de gorge car les streptocoques commensaux sont très nombreux.

2.4.1.3. - culture: isolement sur gélose au sang.

2.4.1.4. - l’identification du streptocoque du groupe A repose sur l’hémolyse de type bêta et surtout sur le groupage antigénique indispensable. L’hémolyse bêta doit être très grande (2 à 3 mm) car il existe des espèces de streptocoques (S. milleri ) qui possèdent l'antigène de groupe A, C ou F mais qui ont une hémolyse bêta très petite (0,5 mm).

2.4.1.5. - antibiogramme

2.4. - Diagnostic indirect

Il permet de porter un diagnostic de complication post-streptococcique. L’infection streptococcique initiale ayant pu être négligée ou inaperçue, on recherchera l’élévation du titre des anticorps.Les antistreptolysines O (ASLO) qui, à l’état normal ne dépassent pas 200 UI/ml, atteignent ou dépassent 800 UI/ml. Une variation significative du titre entre deux prélèvements effectués à 7 ou 15 jours d'intervalle a une grande valeur diagnostique.

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Cependant le taux d’ASLO peut rester normal malgré un tableau clinique post-streptococcique (GNA secondaire à un impétigo). Il faut alors rechercher l’élévation du titre des antistreptodornases B dont les valeurs normales dépendent des réactifs utilisés.

2.5. - Traitement

Le traitement correct et suffisamment prolongé des infections à streptocoques de groupe A représente la prévention des maladies post-streptococciques. Il n’y a pas de résistance acquise notable aux antibiotiques.Les streptocoques de groupe A sont toujours sensibles à la pénicilline G (CMI : 0,005 - 0,2 g/ml) qui constitue le traitement de choix et à l'érythromycine (en cas d'allergie aux bêta-lactamines). La voie d'administration, la dose et la durée du traitement sont fonction du tableau clinique.La prophylaxie des rechutes, chez les malades atteints de RAA se fait par un traitement par la pénicilline retard (extencilline) ou un macrolide.

3. - Streptocoques du groupe B : Streptococcus agalactiae

- Streptocoque bêta-hémolytique appartenant au groupe B de Lancefield.- Il colonise l’intestin et le tractus génital féminin, le plus souvent de façon

asymptomatique. Le risque d’infection néonatale est lié à l’existence d’une colonisation vaginale maternelle (près de 20% des femmes enceintes sont colonisées au moment du travail).

- Place croissante dans les septicémies et méningites néonatales. Les infections peuvent être de type précoce (24 premières heures) ou tardives (après le 7è jour). Le pronostic en est très grave. Le diagnostic fait en urgence repose sur la mise en évidence rapide de la bactérie au niveau du liquide amniotique, du sang et du LCR. La recherche d’antigènes solubles spécifiques du groupe B manque de sensibilité, la culture doit toujours être pratiquée. La recherche dans le liquide gastrique permet de mettre en évidence les colonisations.

- Plus rarement après avortement ou accouchement (endométrite suivie de septicémie) et infections variées chez des sujets aux défenses affaiblies.

- La prophylaxie est mal définie. Les traitements antibiotiques pendant la grossesse ne permettent pas d'éradiquer le portage vaginal. L'attitude actuelle tend à faire une antibioprophylaxie pendant le travail chez les femmes enceintes colonisées à streptocoque du groupe B (dépistage en fin de grossesse) et à la naissance des enfants à haut risque. Ils sont un peu moins sensibles à la pénicilline G que le streptocoque de groupe A. Pénicilline G ou ampicilline doivent être associées à un aminoglycoside dans le traitement des infections néonatales.

4. - Streptocoques des groupes C et G

- Streptocoques bêta-hémolytiques, appartenant au groupe C ou au groupe G de Lancefield. - La plupart des streptocoques de groupe C sont d' origine animale.- Pouvoir pathogène très proche du streptocoque du groupe A (angines, infections cutanées)

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- Réponse immunitaire semblable au streptocoque du groupe A (ASLO,).- Pénicilline : antibiotique de choix.

5. - Streptocoques du groupe D

- Streptococcus bovis est l'espèce la plus fréquemment rencontrée en pathologie humaine.- Hôte commensal de la flore intestinale humaine et animale. - Responsable d'endocardites et de septicémies qui semblent être en relation avec une lésion du tube digestif.- Très sensible à la plupart des antibiotiques: pénicilline (CMI de 0,06-0,5g/ml) et macrolides.

6. - Entérocoques

- Ils réagissent avec un immunserum du groupe D mais s’en distinguent par des études d’hybridation et par une résistance aux antibiotiques et sont donc actuellement classés dans le genre Enterococcus. Les espèces les plus souvent isolées sont: E. faecalis, E. faecium, E. durans.

- Commensaux de l'intestin.- Peuvent provoquer des infections urinaires, des infections biliaires, des septicémies, des

suppurations profondes et surtout des endocardites.- Ils sont généralement plus résistants aux antibiotiques que les autres groupes de

streptocoques (pénicilline CMI de 2 à 8 mg/l).- Ampicilline et ureido-pénicillines sont en général plus actives. Association avec un

aminoglycoside (si résistance à bas niveau) pour le traitement d'endocardites.- En cas d'allergie ou de résistance aux béta-lactamines choix d'un glycopeptide associé à

un aminoglycoside. Surveiller l’apparition de résistance aux glycopeptides chez E. faecium (0,5%) principalement dans les services d’hématologie.

7. - Streptocoques non groupables

- Streptocoques alpha hémolytiques (viridans), dépourvus d'antigène de groupe: S. mitis, sanguis, salivarius, mutans.

- Commensaux de la cavité buccale.- Responsables de la majorité des endocardites humaines et de caries dentaires

(S. mutans ).- Très sensibles à la plupart des antibiotiques : pénicilline (CMI : 0,5 g/ml) et macrolides.

8. - Pneumocoque: Streptococcus pneumoniae

8.1. - Habitat, épidémiologie

- hôte normal de l'oropharynx de l'homme- germe très fragile qui ne survit pas dans le milieu extérieur- responsable de pneumococcies : maladies le plus souvent à point de départ endogène, peu épidémiques, notion de terrain (jeunes enfants, personnes âgées, splénectomisés, cirrhotiques....).

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- prédominance pendant la saison froide.

8.2. - Pouvoir pathogène naturel

8.2.1. - Infections bronchopulmonaires :

- il est responsable de près de 50% des pneumonies bactériennes. C’est l’agent de la pneumonie franche lobaire aiguë mais aussi de bronchopneumonies, bronchites et de pleurésies. Ces pneumonies se compliquent de septicémies dans près de 30% des cas.

8.2.2. - Infections de la sphère ORL :

- il est responsable de 50% des otites moyennes aiguës du nourrisson et du jeune enfant susceptibles de se compliquer de mastoïdites, méningites et sinusites.

8.2.3. - Méningites purulentes d'origine ORL: gravité des séquelles.

8.2.4. - Endocardites, péritonites, arthrites, conjonctivites....

8.3. - Caractères bactériologiques

8.3.1. - Morphologie :

- diplocoques à Gram positif lancéolés, encapsulés (en flamme de bougie).

8.3.2. - Culture :

- la culture est délicate en raison de sa tendance à la lyse spontanée et exige des milieux nutritifs enrichis au sang sur lesquels il donne une hémolyse verdâtre ().- les colonies de bactéries virulentes, capsulées sont lisses, bombées (smooth). En culture il perd facilement sa capsule donnant des colonies rugueuses (rough).- ils sont sensibles à l'optochine.

8.3.3. - Structure et propriétés antigéniques :

- Les antigènes capsulaires (polyosides) sont les plus importants. Ils sont responsables de la virulence.- Leur spécificité antigénique permet de distinguer près de 90 sérotypes. Le typage présente un intérêt épidémiologique.- Ils sont antigéniques et provoquent par immunisation active l’apparition d’anticorps protecteurs spécifiques. Ceci a permis la réalisation de vaccins polyvalents associant des extraits capsulaires des sérotypes les plus fréquemment rencontrés.

8.3.4. - Pouvoir pathogène expérimental :

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L'injection intra-péritonéale d'une culture de pneumocoque entraîne la mort de la souris en un à deux jours. Le germe capsulé est retrouvé dans le sang du coeur et la rate.

8.4. - Physiopathologie

La virulence du pneumocoque est liée à la présence de la capsule qui le met à l’abri de la phagocytose. Le pneumocoque se multiplie abondamment, suscite une réaction inflammatoire riche en polynucléaires et en fibrine, ce qui explique la gravité des infections (pleurésies et méningites).

8.5. - Diagnostic bactériologique

Mise en évidence directe de la bactérie. Pas de diagnostic indirect

8.5.1. - Les prélèvements varient en fonction de la localisation de l’infection (expectorations, prélèvements dirigés des voies respiratoires basses, pus d’otites, L.C.R, sang)

8.5.2. - L'examen microscopique du prélèvement après coloration de Gram est primordial étant donné que la morphologie de diplocoques à Gram positif capsulés est caractéristique.

8.5.3. - La culture sur milieu enrichi au sang est réalisée rapidement afin d'éviter la lyse des bactéries.

8.5.4. - L'identification se fait par agglutination à l'aide de particules de latex sensibilisées, ou par l'étude de la sensibilité à l'optochine. Le sérotypage peut être réalisé seulement dans un but épidémiologique.

8.5.5. - Nécessité de réaliser un antibiogramme et de déterminer la CMI à la pénicilline. Les diamètres d'inhibition des souches de pneumocoques intermédiaires ou résistantes à la pénicilline G sont très variables et celles-ci peuvent être considérées à tort sensibles à la pénicilline G. La détection de cette moindre résistance se fait par l'utilisation systématique d'un disque complémentaire d'oxacilline.

8.5.6. - Pour les souches de pneumocoque montrant une sensibilité diminuée à l’oxacilline, la détermination précise de la CMI à la Pénicilline G doit être faite soit par le E-test (utilisation de bandelettes imprégnées d'antibiotique) soit par les méthodes de dilutions à l'aide d'une poudre de pénicilline titrée. Les souches sont classées en fonction de la sensibilité à la pénicilline G en:- sensibles CMI <0.1 mg/l- intermédiaires 0.1 <CMI <1 mg/l- résistantes CMI>1 mg/lRésistance croisée à un certain degré avec d’autres béta-lactamines. En cas de méningite, il est conseillé de déterminer de façon précise la CMI à la Pénicilline G, l’amoxicilline, et les céphalosporines de troisième génération.

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8.5.7. - Des techniques immunologiques permettent de mettre en évidence les antigènes pneumococciques dans les produits biologiques (LCR, liquides pleuraux, urines). Ces techniques manquent de sensibilité et leur intérêt est de plus en plus discuté.

8.6. - Traitement

8.6.1. - Préventif

Il existe un vaccin anti-pneumococcique composé de polysaccharides capsulaires des 23 sérotypes les plus fréquents (vaccination des sujets fragiles: splénectomisés, immunodéprimés et adultes de plus de 65 ans). L’immunité conférée à la suite d’une seule injection apparaît après 3 semaines et semble satisfaisante bien que partielle pendant 3 ans au moins.

8.6.2. - Curatif

L'antibiotique de choix est la pénicilline G (CMI de 0,005 à 0,04 ug/ml). L'augmentation croissante de la prévalence des pneumocoques résistants ou de sensibilité diminuée aux bêta-lactamines par modification des PLP (jusqu'à 50% dans les pus d'otites en région parisienne) oblige à modifier l'attitude thérapeutique de première intention en particulier dans les méningites (Céfotaxime ou Ceftriaxone à dose élevée). La résistance aux macrolides (érythromycine) est également en progression (30%).

Certains sérotypes (23, 9, 14) sont plus fréquemment associés à des hauts niveaux de résistance à la pénicilline G. Ces souches sont le plus souvent résistantes aux cyclines, chloramphénicol, érythromycine et cotrimoxazole. Elles restent sensibles à la pristinamycine, la vancomycine et la rifampicine.

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CHAPITRE 9

Cocci à Gram Négatif

Ce sont des bactéries aérobies strictes ou anaérobies, de forme arrondie, Gram négatif.Les espèces aérobies strictes appartiennent au genre Neisseria.Le genre Branhamella ne comprend qu'une seule espèce, Branhamella catarrhalis, qui a été récemment transférée dans le genre Moraxella.Les espèces anaérobies composent la famille des Veillonellaceae (flore de Veillon).

Méningocoques et gonocoques

Appartenant au genre Neisseria, meningocoques et gonocoques sont les deux principales bactéries pathogènes pour l'homme, à côté de nombreuses autres espèces du genre, habituellement commensales, mais pouvant être pathogènes opportunistes.

Les Neisseria ont en commun :

- leur morphologie : cocci à Gram négatif, groupés en diplocoques,

- leur caractère culturaux : aérobies stricts, oxydases + ; méningocoques et gonocoques exigent des milieux enrichis. Les Neisseria commensales poussent sur des milieux ordinaires.

Méningocoques et gonocoques se différencient par leur pouvoir pathogène chez l'homme.

1. - Méningocoques

1.1. - Habitat

L'homme est le seul porteur connu. Ce portage au niveau du rhinopharynx est dans la règle, totalement asymptomatique. Ce germe, très fragile, ne peut être transmis que par contact direct (voie rhinopharyngée).

1.2. - Pouvoir pathogène

Le méningocoque est l’un des agents étiologique majeur de la méningite de l'enfant d'âge scolaire, mais peuvent également atteindre l'adulte.

Après une phase d'invasion caractérisée par une rhinopharyngite d'aspect banal, l'infection se manifeste en règle par un début d'une extrême brutalité.

- Méningite cérébro-spinale avec parfois des manifestations associées :

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- septicémies,- purpura fulminans qui représente en France, plus de 20 % des méningococcies avec une mortalité de 33 %.- manifestations articulaires (arthrites).

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1.3. - Diagnostic bactériologique

1.3.1. - Prélèvements

- liquide céphalo-rachidien- hémocultures- au niveau de la porte d’entrée : gorge pour les sujets contacts

Le LCR doit être rapidement adressé au laboratoire et en évitant tout froid (germe fragile sensible au froid).

1.3.2. - Examen du LCR

- Aspect du liquide : - typiquement trouble - rarement xanthochromqiue (jaune) ou même clair- En biochimie, analyse des constantes biochimiques normalement : CL- : 120 +/- 10 millimoles/l

Albumine : 0,42 +/- 0,15 g/l Glycorachie : 3 +/-1 millimoles/l

( à comparer à la glycémie : normalement la glycorachie est égale à la moitié de la glycémie).

En cas de méningites à méningocoques : . augmentation des protéines . baisse de la glycorachie . CL- normaux (abaissés dans les méningites tuberculeuses)

- en bactériologie :

. numération des éléments cellulaires : normalement un liquide céphalo-rachidien contient moins de deux éléments par mm3. Ici, quelques centaines à plusieurs éléments cellulaires avec une majorité de polynucléaires altérés.

. coloration de Gram : présence de petits diplocoques à Gram négatif avec une face aplatie. Parfois abondants, souvent peu nombreux ; leur présence intracellulaire est très évocatrice.

1.3.3. - Culture :

. Sur milieux riches (gélose au sang cuit) placés en aérobie et en atmosphère riche en CO2.

Les méningocoques nécessitent pour leur croissance des milieux très riches : gélose au sang cuit. La présence de C02 favorise la culture.

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Dans ces conditions, après 24 à 48 heures à l’étuve à 37°C apparaissent des colonies transparentes, oxydase +.

Une idenfication complémentaire par la recherche des caractères biochimiques est cependant nécessaire (fermentations de sucres).Le sérogroupage par agglutination sur lames est basé sur l'identification immunologique des polyosides capsulaires du méningocoque. Il permet d'indentifier huit sérogroupes : A, B, C, D, W, X, Y, Z . Il doit être systématiquement effectué. Le sérogroupe B reste prédominant en France et représente plus de la moitié des cas.

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Cas particuliers

Méningites "décapitées" dont l'évolution est modifiée par un traitement antibiotique "aveugle" commencé avant la ponction lombaire et généralement à doses insuffisantes, plusieurs éventualités se présentent :

- Diplocoques à Gram négatif intraleucocytaires vus à l'examen microscopique, mais culture négative. Le diagnostic étiologique peut être posé, mais le sérogroupage et l'antibiogramme ne peuvent être effectués.

- Liquide céphalo-rachidien purulent, bactéries non observées. On ne peut parler que de méningite purulente sans préciser l'étiologie. On peut rechercher alors la présence d'antigènes spécifiques du méningocoque dans le liquide céphalo-rachidien (recherche d'antigènes solubles). On utilise maintenant des particules de latex sensibilisées par des anticorps soit polyclonaux (A, C, Y), soit monoclonaux (B).

La recherche de ces antigènes est, en pratique, d’un intérêt extrêmement limité compte-tenu de son absence de sensibilité.

1.4. - Traitement

La plupart des souches isolées en Europe restent sensibles aux bêta-lactamines. De nombreuses souches de Neisseria meningitidis sont résistantes aux sulfamides.

Le traitement antibiotique doit tenir compte de la sensibilité du germe et également de sa diffusion dans le liquide céphalo-rachidien. Il repose essentiellement sur l’utilisation d’une aminopénicilline ou de céphalosporines de troisième génération (doute sur une méningite à Haemophilus influenzae)

1.5. - Vaccination

Un vaccin efficace, constitué de poysaccharides extraits des méningocoques a pu être réalisé pour les sérogroupes A et C.En revanche, la préparation extraite du sérogroupe B est inefficace. Or, c'est actuellement le méningocoque de sérogroupe B qui est le plus fréquemment trouvé en France.La vaccination se fait par voie sous-cutanée. L'injection du vaccin est suivie de l'ascension des anticorps à des taux protecteurs en 5 à 8 jours, la vaccination s'étant révélée efficace chez environ 90% des sujets vaccinés, dès l'âge de 3 mois pour le sérogroupe A et à partir de 1 an pour le C. L'immunité obtenue après la vaccination dure environ 2 ans.

1.6. - Précautions à prendre après la mise en évidence d’un cas de méningite à méningocoques

- isoler le sujet,

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- déclarer la maladie (maladie à déclaration obligatoire),

- la désinfection rhinophryngée, le prélèvement rhinopharyngé des sujets-contacts sont inutiles,

- prévention des cas secondaires chez les sujets-contacts :

Chimioprophylaxie : choisir un antibiotique efficace et ne créant pas d'émergence de souches résistantes et ne décapitant pas une méningite en cours d’évolution. Les mesures prophylactiques sont d'autant plus efficaces qu'elles sont instituées plus rapidement.En application d'une circulaire en date du 05 février 1990 sont préconisées :

Rifampicine pendant 2 jours :• adultes : 600 mg, 2 fois/jour,• enfants de 1 mois à 12 ans : 10 mg /kg, 2 fois/jour,• enfants de moins d'un mois : 5 mg/kg, 2 fois/jour.

En cas de contre-indication à la rifampicine (grossesse, atteintes hépatiques sévères, alcoolisme, porphyries, hypersensibilité à la rifampicine) :Spiramycine administrée pendant 5 jours à la dose de :• 3M. d'U. I., 2 fois /jour chez l'adulte,• 75.000 U. I., / kg 2 fois/jour chez l'enfant.

Quand un méningocoque du groupe A ou C est isolé, une vaccination des sujets-contacts est proposée conjointement à la chimiohtérapie.

2. - Gonocoques

De la famille des Neisseria caractérisés par :- leur morphologie : cocci à Gram - , groupés en diplocoques.- leurs caractères culturaux : aérobies stricts, oxydase +.Comme les méningocoques, ils exigent pour leur croissance des milieux enrichis.

2.1. - Habitat- Pouvoir pathogène

C'est un parasite strict de l'homme. Il possède un tropisme particulier pour les muqueuses génitales :- Chez l'homme : il peut être responsable d'urétrite, d'épididymite, de prostatite. L'incubation est courte et asymptomatique (classiquement de 1 à 3 jours).- Chez la femme :

- cervicite, bartholinite, salpingite.Il peut être responsable aussi de manifestations extra-génitales :

- conjonctivite purulente du nouveau-né,- arthrites, en général monoarticulaires,

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- exceptionnellement septicémie, endocardite.

2.2. - Diagnostic bactériologique

2.2.1. - Prélèvements

- Chez l'homme, dans la forme aiguë, prélever une goutte purulente avant miction. Dans la forme subaiguë, on fera une réactivation (massage prostatique)- Chez la femme, le prélèvement sera effectué au niveau du méat urétral, des glandes de Skene et de Bartholin et au niveau du col, mais jamais au niveau du vagin où le pH est trop acide. Il existe une réactivation spontanée au moment des règles.- Eventuellement : prélèvement de gorge, prélèvement anal ou prélèvement articulaire.Les prélèvements seront effectués si possible au laboratoire. En cas d'impossibilité, on utilisera un milieu de transport contenant des substances réductrices tel l'acide thioglycolique.

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2.2.2. - Morphologie

Les frottis seront colorés par la méthode de Gram et au bleu de méthylène : on peut voir des cocci à Gram - en diplocoque et des polynucléaires altérés.Les germes peuvent être extra- ou intra-cellulaires. La présence de germes intra cellulaires, quand elle existe, est très évocatrice.

2.2.3. - Culture L'isolement sera fait sur milieu riche telle la gélose chocolat enrichie de facteurs de croissance, et contenant des antibiotiques pour inhiber la croissance des autres germes (gélose au sang cuit + facteurs de croissance + vancomycine, colistine et nystatine).- Une atmosphère contenant 10% de CO2 est nécessaire.

- En 24 à 48 heures apparaissent des colonies, petites, fines, transparentes.L'identification sera faite :- sur le caractère oxydase positif,

- par la vérification de la morphologie des germes : petits, cocci à Gram négatif mais ayant

perdu en culture leur aspect typique de diplocoque.

- par les fermentations sucrées : le germe fermente le glucose.

Immunité

Les anticorps mis en évidence ne donnent pas d'immunité (infection locale). Il n'y a pas de vaccin anti-gonococcique.- 15-20 % des souches produisent une pénicillinase : 20-28 % sont résistantes aux tétracyclines- traitement « minute »  ne doit pas être utilisé dans la gonococcie extragénitale- traitement « minute » ; ceftriaxone 500 mgIM ; spectinomycine 2 g en IM ; pefloxacine (800 mg) : ofloxacine (400 mg) ; ciprofloxacine (250 mg) per os,- traitement des formes extragénitales de la femme enceinte ; ceftriaxone pendant 5 à 15 jours selon les cas.

Rechercher et traiter d’autres MST éventuellement associées : Chlamydia, mycoplasmes, syphilis notamment.

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CHAPITRE 10

Bacilles à Gram positif non sporulés

Les principales espèces bactériennes de ce groupe sont les corynébactéries et apparentés, et Listeria monocytogenes.

1. - Corynébactéries et apparentés

Les corynébactéries sont des bacilles à Gram positif, immobiles et asporulés, granuleux, à extrémités élargies. Leur groupement en palissades ou en lettres de l’alphabet est assez caractéristique. De nombreuses espèces font partie de la flore commensale de l’arbre respiratoire ou de la peau.

1.1. - Corynebacterium diphteriae

1.1.1. - Historique

. 1883 : découverte par Klebs et Loeffler à partir de fausses membranes d’angine diphtérique.

. 1888 : découverte par Roux et Yersin de la reproduction expérimentale de la diphtérie par diffusion de la toxine à partir du point d’inoculation.

. 1890 : Behring et Kitasato : immunisation d’un animal avec des doses faibles de toxines ; obtention d’un sérum antitoxique.

. 1913 : Schick : test d’immunité par injection intradermique de toxine.

. 1922 : Ramon transforme la toxine en anatoxine -> vaccin antidiphtérique

1.1.2. - Habitat

C. diphteriae, parasite strict de l’homme. Transmission directe par voie respiratoire, d’homme à homme.

1.1.3. - Pouvoir pathogène

. multiplication dans les voies respiratoires (pharynx, parfois larynx)

. sécrétion d’une toxine : réaction inflammatoire locale, formation d’un exsudat riche en hématies et fausses membranes.. diffusion de la toxine dans l’ensemble de l’organisme : paralysies et syndrome toxique.

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1.1.4. - Clinique

. angine fébrile pseudomembraneuse avec réaction ganglionnaire

. diffusion possible au pharynx : croup : asphyxie possible

. syndrome toxique ; prostration ; paralysie.

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1.1.5. - Caractères bactériologiques

1.1.5.1. - Microscope

. bacilles à Gram positif sans spore ni capsule

. incurvé, extrémités arrondies, groupement « en lettres »

. granulations métachromatiques caractéristiques.

1.1.5.2. - Culture

. culture sur la majorité des milieux usuels ; favorisée par le sang ou le sérum ; milieu de Loeffler au sérum de boeuf coagulé; culture plus rapide en 18-20 heures à 36 ° C. aéro-anaérobie facultatif.

1.1.5.3. - Substances élaborées

La principale : la toxine diphtérique

. toxine commune à tous les bacilles diphtériques donnant naissance à un seul type d’anticorps neutralisants

. exotoxine protéïque ; synthèse codée par un prophage

. thermolabile

. après action du formol et de la chaleur, formation d’une protéine non toxique stable, mais ayant gardé ses propriétés antigéniques : anatoxine.

C. diphteriae reste localisée au point d’inoculation : diffusion systémique uniquement de la toxine.

1.1.6 - Diagnostic bactériologique

. ne doit pas faire retarder la mise en route du traitement

. prélèvements des fausses membranes. Milieu sélectif au tellurite de potassium (évite la croissance de la flore oropharyngée).

. colonies noires suspectes, en « taches de bougie » ; identification biochimique

. mise en évidence de la toxine :- inoculation au cobaye- inoculation in vitro : test d’Elek. boîte de Pétri avec gélose nutritive. disposer au centre l’antitoxine. à distance, souche suspecte et témoins (-) et (+) : la présence d’un arc de

précipitation affirme le diagnostic.

1.1.7. - Traitement

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. Curatif :- injection de sérum antidiphtérique- antibiothérapie : -lactamines ou macrolides pour arrêter la synthèse de la

toxine.. Prophylactique : vaccination obligatoire avec une anatoxine brute ; efficace à 100 % (DT Coq)

Actuellement maladie extrêmement rare ; cependant, apparition d’épidémies en Europe de l’Est en Russie et isolement en France de souches non toxinogènes dans des syndromes septicémiques chez l’immunodéprimé (SDF, éthylisme...)

1.2. - Autres corynébactéries et apparentés

. corynébactéries pseudo-diphtériques

. C. urealyticum (groupe D2) : infections urinaires

. C. jeikeium (groupe JK) : septicémies de l’immunodéprimé

. Rhodococcus equi : infections pulmonaires récidivantes du sujet immunodéprimé (++ SIDA)

Problèmes du rapport entre l’isolement d’une corynébactérie non diphtérique et son caractère pathogène, notamment chez l’immunodéprimé.

2. - Listeria monocytogenes

Les Listeria sont des petits bacilles à Gram positif, non sporulés, mobiles à 20-25 ° C. Seule L. monocytogenes est pathogène.

2.1. - Habitat

. Germe ubiquitaire trouvé dans le sol mais aussi dans le tube digestif (portage sain)

2.2. - Pouvoir pathogène

- bactérie opportuniste : diffusion hématogène:. méningite, méningo-encéphalite, septicémie ; ++ immunodéprimé chez l’adulte et

l’enfant. avortement, mort in utero, accouchement prématuré chez la femme enceinte après une infection inapparente (angine, fièvre). septicémie : méningite néonatale après contamination au moment ou juste après l’accouchement.

2.3. - Bactériologie

. petit bacille immobile à 37° C, mobile à 22-25 °C. Aéro-anaérobie facultatif. Culture facile sur milieux usuels à pH de 5 à 10, de 4° à 45° C.

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. prélèvements : sang, LCR, placenta.

. examen microscopique et culture facile en 24 H. possibilité d’enrichissement par culture à 4° C ; sérologie d’intérêt discuté.

2.4. - Traitement

. Traitement habituel ; amoxicilline + gentamicine

L. monocytogenes est résistant aux céphalosporines, notamment celle de troisième génération.

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CHAPITRE 11

Bacilles à Gram positif sporulés

Les bacilles à Gram (+) sporulés sont aérobies (Bacillus sp) ou anaérobies (Clostridium sp).

1. - Les Bacilles à Gram (+) aérobies : Bacillus

. la plupart sont des saprophytes du sol, de l’eau, de l’air et des plantes comme Bacillus cereus ou Bacillus subtilis

. ces bactéries peuvent être pathogènes chez l’immunodéprimé par production de toxines (entérotoxine) ou par elles-mêmes.

. la seule espèce systématiquement pathogène en l’absence d’immunodépression est B. anthracis responsable de la maladie du charbon :

- infection consécutive à la pénétration de spores par des blessures ; chez l’animal par la bouche et le tube digestif. Pénétration facilitée par une blessure chez l’homme.

- germination des spores au point d’inoculation. Multiplication locale puis libération dans la circulation générale. Formation d’une pustule au point d’inoculation ; formes pulmonaires possibles après inhalation.

- diagnostic bactériologique :

. prélèvement de sang, de crachats ou pus du point d’inoculation

. gros bacilles immobiles à Gram positif, à extrémités carrées ; culture possible sur milieux usuels.

- traitement :

. en curatif : -lactamines

. en préventif : décontamination des carcasses d’animaux : vaccination d’efficacité variable.

2. - Bacilles à Gram (+) anaérobies sporulés

. Il s’agit des Clostridium. Saprophytes le plus souvent ; habitat naturel le sol ou le tube digestif des animaux et de l’homme.

. Clostridium sp. sont des gros bacilles à gram (+) qui peuvent donner des spores plus larges que le diamètre des bacilles ; le plus souvent mobiles, anaérobies strictes, le plus souvent hémolytiques.

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. production de nombreuses toxines.

2.1. - Clostridium botulinum

. agent du botulisme dû à l’injection de la toxine de cette bactérie : 70 cas en 1996.

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2.1.1. - Habitat

. la terre ; rarement l’intestin des animaux

. possibilité de contamination de légumes, fruits et conserves (+++)

2.1.2. - Pouvoir pathogène

. intoxication survenant 18 à 96 heures après le contage alimentaire

. paralysies bilatérales et symétriques de l’accomodation, des muscles bucco- pharyngés ; dysphagie ; paralysie de déglutition : nausées, vomissements ; constipation ; température normale en l’absence de surinfection.

2.1.3. - Morphologie

. bacille à Gram (+) aux extrémités arrondies ; mobile ; rarement retrouvé dans l’aliment

. spore thermorésistante (3 à 5 heures à 100° C).

2.1.4. - Toxines botuliniques

. synthétisées par le germe au cours de la croissance ; libérées par son autolyse. Six variétés antigéniquement distinctes de toxines ; A, B, C, D, E et F: les variétés A, B et F sont le plus couramment associées à la maladie humaine.

. très toxiques à petites doses : 1 mg contient plus de 20 millions de doses minimales mortelles pour la souris. Inhibition de la synthèse ou, de la libération d’acetylcholine au niveau des synapses et des plaques neuromusculaires.

. de nature protéïque : antigéniques, peuvent être transformées en anatoxines et être neutralisées par des immuno-sérums (anti-toxines), codées par un prophage spécifique.

2.1.5. - Diagnostic

. clinique + contamination

. recherche de la toxine dans l’aliment contaminant et dans les sérums des malades (méthode des souris protégées avec des immuno-sérums).

2.1.6. - Traitement

. sérothérapie polyvalente puis monovalente

. anatoxinothérapie en un point différent de l’organisme

. traitement symptomatique ; réanimation ; anti-cholinesterasique

. prévention : mesures légales de préparation des conserves alimentaires.

2.2 - Clostridium tetani

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Agent du tétanos ; découvert par Nicolaier en 1885. L’anatoxine spécifique a été mise au point par Ramon en 1926.

2.2.1. - Habitat

. Le sol où il survit sous sa forme sporulée

. Commensal du tube digestif de plusieurs espèces animales (cheval, ovin, caprin) ; éliminé dans les selles.

2.2.2. - Pouvoir pathogène naturel et physiopathologie

C. tetani n’est pas un germe invasif

. L’infection reste limitée dans les tissus dévitalisés (blessures, brûlures, cordon ombilical ligaturé, suture chirurgicale) où les spores ont été introduites.

. sporulation favorisée par l’anaérobiose et par l’infection concomitante par des germes pyogènes.

. incubation 6 à 15 jours ; diffusion systémique de la toxine ; trismus et contractures, fièvre secondaire ; complications respiratoires (asphyxie).

. la toxine : exotoxine composée de deux éléments

- tétanolysine, hémolytique, nécrosante et cardiotoxique- tétanospasmine ; fixation sur les gangliosides de la moëlle épinière et du cerveau où elle

empêche la libération d’un inhibiteur des synapses des neurones moteurs.

. diffusion de la toxine (identique pour toutes les souches, par voie rétrograde neuronale, sanguine ou lymphatique).

tous les mammifères sont sensibles au tétanos.

2.2.3. - Caractères bactériologiques et diagnostic

- bacille à Gram (+) anaérobie, mobile ; spore déformante donnant au bacille un aspect en clou ou en baguette

- diagnostic essentiellement clinique : rarement on retrouve le bacille au point d’inoculation

. la toxine peut être transformée en anatoxine par chauffage ou formolisation.

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2.3. - Traitement

2.3.1. - Curatif

- sérum antitétanique ; anatoxine ; pénicilline G- myorelaxants ; sédatifs ; assistance respiratoire

2.3.2. - Préventif

- Vaccination efficace : DT Coq ; 3 injections sous-cutanée à un mois d’intervalle ; rappel un an puis tous les 7 ans ; vaccination obligatoire. Le statut immunologique s’apprécie

par la mesure du taux d’anticorps sériques.- nettoyage des plaies souillées de terre

Vaccination à surveiller tout particulièrement dans les professions exposées : jardiniers, cultivateurs, éleveurs, cordonniers. Cependant, environ 39 cas par an en 1996.

3. - Autres Clostridi

3.1. - Clostridium perfringens

- agent de la grangrène gazeuse (comme C. novyi et C. septicum)- habitat : sol, tube digestif de l’homme et des animaux, voies génitales féminines (5 % des cas)

- physiopathologie :

. plaie contaminée, phlegmon gazeux avec crépitation et nécrose progressive, fièvre hémolytique, syndrome toxique.. autres formes : entérites gangréneuses, syndrome septicémiques puerpéraux, intoxications alimentaires

- bactériologie :

. bacille à Gram (+) anaérobie, spore centrale; immobile capsulé

. synthèse de nombreuses toxines à activités létales, hémolytiques, nécrosantes dont une entérotoxine et des enzymes qui jouent un rôle dans la diffusion des lésions de nécrose (collagénases, protéases, hyaluronidases).- diagnostic : . hémoculture ; prélèvement du tissu infecté. culture, après examen direct, en anaérobie ; aspect hémolytique + production de gaz

sont très évocateurs.. traitement : parage des plaies ; -lactamines ; +/- réanimation. épidémiologie : infections à C. perfringens et origine endogène (interventions

chirurgicales; avortement). plus rarement plaie infectée (+++ sans domicile fixe)

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3.2. - Clostridium difficile ; Colites pseudomembraneuses

. C. difficile (++) par production d’une toxine antigénique nécrosante

. par sélection au niveau du tube digestif de C. difficile producteur de toxines après traitement par de nombreux antibiotiques dont la clindamycine

. diagnostic : recherche de la toxine dans les selles (méthodes immuno-enzymologiques)

- arrêt de l’antibiothérapie sélectionnante- metronidazole per os (éradication de la bactérie du tube digestif).

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CHAPITRE 12

Flores microbiennes normales de l’organisme et infections à bactéries anaérobies non sporulées

1. Flores microbiennes

. De nombreuses bactéries sont normalement présentes sur la peau et les muqueuses des sujets sains = flore commensale résidente.

. intérêts variables : - gêne à la colonisation par des pathogènes stricts- synthèse vitaminique K...

1.1. - flore cutanée

- flore résidente :. staphylocoque à coagulase négative. microcoque. corynébactéries. Bacillus sp.

- flore de transit polymorphe

. entérobactéries et Pseudomonas sp.

. staphylocoque à coagulase positive

les mains et les zones humides ou péri-orificielles comportent souvent une flore de transit.

1.2. - Flore de l’arbre respiratoire

- abondante au sein du rhinopharynx- contient des opportunistes majeurs :

. staphylocoque à coagulase positive (++ narines)

. streptocoques (groupables ou non), S. pneumoniae.

. Haemophilus sp.

. Neisseria (dont parfois N. meningitidis) ; Branhamella catarrhalis

. anaérobies, corynébactéries, lactobacillus

- au nivau de la trachée : flore peu abondante du fait de la présence de cellules ciliées et de macrophages. L’arbre respiratoire inférieur est stérile.

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1.3. - Flore génitale

. Importante chez la femme, rôle protecteur

. B. de Döderlein (lactobacille acidophile)

. streptocoques

. corynébactéries

. Bifidobacterium

1.4. - Flore digestive

- la plus abondante et la plus importante- variable selon l’étage du tube digestif :

- bouche : germes présents dans le rhinopharynx,++ streptocoques non groupables, entérobactéries, anaérobies - estomac : flore très pauvre du fait de son acidité - intestin grêle : flore pauvre, streptocoques, staphylocoques lactobacilles - flore colique (+++) 10 11-10 12 germes, ++ anaérobies stricts et surtout Bacteroides

(10 7- 10 10 par gramme de selles), Bifidobactéries, Clostridium : entérobactéries 10 8 - 10 9.

2. Bactéries anaérobies non sporulées

. Bactéries pathogènes le plus souvent en association avec d’autres espèces bactériennes.

. Clinique ; .état septicémique . suppurations : abdominales petit bassin pleuro-pulmonaires buccales abcès du cerveau

. Espèces bactériennes importantes

- Fusobacterium sp. : septicémies thrombophébites angine de Vincent (F. naviforme)

- Actinomyces israeli : suppurations ORL

- Bifidobacterium sp. : flore du nouveau-né

- Bacteroïdes (++ fragilis). états septicémiques. infections de la moitié inférieure du corps(++ en liaison avec une pathologie du tube digestif)

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- diagnostic bactériologique. ponction suivie d’une aspiration à l’aiguille. transport rapide du prélèvement au laboratoire. polymorphisme fréquent des espèces identifiées.

une négativité de la culture n’élimine pas la présence de ces germes assez fragiles.

Traitement :

. la plupart des espèces sont sensibles au mitronidazole ; un grand nombre également à l’Augmentin ou à l’association Pipéracilline/Tazobactam.

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CHAPITRE 13

Entérobactéries et bacilles à Gram (-) non exigeants

1. - Entérobactéries

1.1. - Caractères généraux et classification

. Hôtes normaux ou pathologiques du tube digestif de l’homme et des animaux

- bacilles à Gram négatif- mobiles avec ciliature péritriche ou immobiles- poussant sur milieux de culture ordinaires- aéro-anaérobies facultatifs- fermentant le glucose avec ou sans production de gaz- réduisant les nitrates en nitrites- test d’un oxydase négatif

Famille hétérogène, distinction en genres selon les caractères biochimiques

. On distingue :

- entérobactéries commensales du tube digestif (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsellia) ou saprophytes (Serratia, Enterobacter)- occasionnellement pathogène par déséquilibre de la flore intestinale ou pénétration puis multiplication au niveau des organes normalement stériles.

- entérobactéries pathogènes spécifiques . Salmonelles ; fièvres typhoïdes, toxi-infections alimentaires, septicémie à Salmonella « mineures ». Shigelles ; dysenteries bacillaires. E. coli dits « pathogènes ». Yersinia

. Caractères antigéniques ; permettent la classification en sérotypes ; indispensables à l’identification des salmonelles, shigelles et colibacilles des gastro-entérites infantiles ;

- antigène O : antigène de paroi : correspond à l’endotoxine des entérobactéries : ces lipopolysaccharides à l’origine de fièvre, leucopénie, bradycardie; possibilité d’anticorps anti-O et mise en évidence par agglutination (++ fièvres typhoïdes)`

- antigène H ; non toxique : antigènes des flagelles protéïques, présents uniquement chez les bactéries mobiles. Les anticorps anti-H ne sont pas neutralisants ; utilisés autrefois pour le diagnostic des fièvres typhoïdes

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- antigène K : antigène capsulaire qui entoure la paroi de certaines bactéries : il peut masquer l’antigène O

1.2. - Entérobactéries commensales et saprophytes

. ++ E. coli , 80 % des bactéries de la flore aérobie du tube digestif ; Proteus mirabilis, Klebsiella, Serratia, Enterobacter.. responsable de : - méningite du nouveau-né - infection urinaire - infection génitale - infection hépatobiliaire ou digestive - infection nosocomiale (++ saprophyte)

Germes souvent sélectionnés par une antibiothérapie préalable. Multirésistants chez les sujets immunodéprimés ; milieu de réanimation (++).

1.3. - Entérobactéries pathogènes spécifiques

1.3.1. - Salmonella

1.3.1.2. - Fièvres typhoïdes et paratyphoïdes

. Quatre sérovars de Salmonella strictement humaines. S. typhi, Salmonella para A, para B, para C ; salmonelles dites « majeures » du fait de la gravité de l’infection.

70 cas confirmés en 1996. ++ importation de l’étranger Physiopathologie

- Ingestion d’aliment contaminé (coquillages ++)- Traversée de la barrière entérique : multiplication dans les ganglions des plaques de Peyer (hémorragies intestinales, perforations) ; passage dans le sang (hémocultures) et élimination intermittentes dans les selles (coprocultures). L’organisme infecté produit des anticorps contre les antigènes bactériens (sérodiagnostic).

Diagnostic :

. hémoculture ; ++ 1ère semaine

. coproculture : pendant toute la maladie ; milieux de culture sélectifs

. sérodiagnostic Widal et Félix : présence des anti-O et anti-H : dilution - inactivation par sérum du malade au contact d’une suspension de bacilles inactivés (antigènes O l’alcool

; antigènes H (inactivation par le formol))

- les anticorps O : apparaissent au 7-8ème jour : maximum au 14ème jour. Plateau pendant 4 semaines, disparition rapide.

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- les anticorps H : apparaissent au 10ème jour, maximum au 14ème jour. Plateau - diminution de leur taux progressive à l’inverse des anticorps anti-O, ne disparaissent pas complètement.

Persistance en cas de vaccination ; anti-TH, AH et BH.

Sérodiagnostic peu utile actuellement pour diagnostic

. Traitement curatif ; amoxicilline ; ceftriaxone ou fluoroquinolones.

1.3.1.3. - Gastro-entérites à Salmonella

. dues à des salmonelles dites mineures (S. typhimurium, enteritidis...)

. très fréquentes chez l’enfant

. contamination alimentaire - épidémies des collectivités (8500 malades en 1996 - diarrhée, vomissement, fièvre

. possibilité de portage sain

. diagnostic : coproculture, culture de l’aliment suspect.- possibilité de syndrome septique chez l’immunodéprimé (+++ HIV). traitement : gastro-entérite simple : traitement symptomatique ; syndrome septique,

amoxicilline.

1.3.2. - Shigelles

. immobiles, parasites stricts de l’homme et des primates

. pouvoir pathogène naturel ; dysenterie bacillaire, douleurs abdominales, diarrhées très fréquentes : contamination digestive, diagnostic par coproculture.. pénétration digestive, envahissement de l’iléon terminal et du colon, microabcès,

virulence liée à des plasmides de grande taille et à la production de toxines.. S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei (les plus fréquentes en Europe (++ Europe du Sud) se différencient selon des caractères biochimiques et sérotypiques.. traitement : - lactamines et réhydratation. Prévention (+++) . L’homme est le principal

réservoir. Pas de vaccin actuellement.

1.3.3. - E. coli « pathogènes intrinsèques »

. infections entériques - sérogroupes particuliers

. on différencie les E. coli entéropathogènes (ECEP)E. coli entérotoxinogènes (ECET)E. coli entéroinvasifs (ECEI)E. coli entérohémorragiques (ECEH)

. ECEP. épidémies de diarrhées du nouveau-né (rares actuellement). sérotype 0111 B4 le plus fréquent. diagnostic, coproculture - sérotypage des E. coli isolés des selles.

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. ECET . diarrhées infantiles cholériformes ; diarrhées des pays à hygiène déficiente

« tourista », . adhérence à la bordure en brosse des entérocytes grâce à des adhésines (CFA) ;

production d’entérotoxine thermostable (ST) et thermolabile (LT) ; fuite hydro- électrolytique de 1 à 3 jours,

. plasmides porteurs des gènes de ces toxines.

. ECEI- diarrhées aiguës « dysenterie like »- produisent une toxine proche de celle de S. dysenteriae

. ECEH- colites hémorragiques et diarrhées sanglantes- peuvent se compliquer de syndrome hémolytique et urémique- non invasives; ces souches produisent une toxine- O157 : H7, le sérotype le plus fréquent ; maladie de Hamburger

1.3.4. - Yersinia

1.3.4.1. -Yersinia pestis

. agent de la peste ; réservoir : le rat ; transmission par les puces, ou directement d’homme à homme.. deux formes : peste bubonique et peste pulmonaire. diagnostic par prélèvement du bubon , hémoculture ou culture des expectorations.

1.3.4.2. - Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica

. adénite mésentérique - diarrhée - fièvre

. contage souvent animal et alimentaire

. diagnostic ; coproculture (+/- sérodiagnostic)

fréquence du portage notamment chez l’immunodéprimé (rôle pathogène ?)

2. - Autres bacilles à Gram négatif aérobies non exigeants

2.1. - Pseudomonas

. aérobies stricts, oxydase positive, mobiles

. résistance naturelle à de nombreux antibiotiques

. saprophytes (eau +++)

. l’espèce principale : P. aeruginosa (ou bacille pyocianique)

- commensal du tube digestif- produit deux pigments pyocyanine et pyoverdine

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- opportuniste majeur, il est responsable de :- suppurations, septicémies- infections locales : cutanées, urinaires, broncho-pulmonaires (première cause en

Réanimation)- fréquence des infections sur matériel étranger (prothèses, cathéters, sondes).

fréquence de ces infections chez l’immunodéprimé et notamment dans le cas de mucoviscidose

. diagnostic : prélèvement local : traitement en fonction de l’antibiogramme.

. autres Pseudomonas et apparentés

- Pseudomonas mallei (agent de la morve) et pseudo-mallei (agent de la méloïdose)- Pseudomonas fluorescens, stutzeri, putida dont la pathogénie est proche de celle de P. aeruginosa comme Stenotrophomonas maltophilia qui est très résistant aux -lactamines et aux aminosides.

2.2. - Acinetobacter

. bacilles immobiles, groupés en diplobacilles courts, aérobies stricts, oxydase négative

. saprophytes et commensales de la peau et des muqueuses

. pas de pouvoir pathogène naturel défini

. pathogène opportuniste (++ milieu de réanimation)

. Acinetobacter calcoaceticus le plus fréquemment isolé ; Acinotobacter baumannii le plus résistant aux antibiotiques.

2.3. - Campylobacter et Helicobacter pylori

- petits bacilles à Gram négatif, en virgule, mobilité dite en « vol de mouche », microaérophiles.

- habitat : zoonose (commensal du tube digestif). contamination : aliments, lait, eau

- pathogénie :

. Campylobacter jejuni et coli ; entérites avec diarrhée dite invasive (++ enfant et HIV)

. Campylobacter fetus : avortement chez la femme enceinte et septicémies

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. Helicobacter pylori : isolé de la muqueuse gastrique en cas d’ulcère duodénal (en 1982). Co-facteur principal ou unique de l’ulcère sur terrain prédisposé. Culture non réalisée en pratique si l’on désire avoir une idée de la sensibilité de la bactérie aux antibiotiques. Le traitement antibiotique fait partie intégrante du traitement actuel de la maladie ulcéreuse.

2.4. - Vibrio cholerae

. agent du choléra ; bacille à Gram (-) ; incurvé, aéro-anaérobie facultatif, mobile, découvert en 1854 à Florence par Pacini et cultivé en 1883 par R. Koch au Caire

. habitat : selles des malades et porteurs sains. Il survit dans les eaux polluées et sur les objets contaminés.

. Pouvoir pathogène

. multiplication dans l’intestin grêle : synthèse de mucinases

. libération d’une exotoxine protéïque (entérotoxine) qui active l’adénylcyclase. Hypersécrétion d’eau et de Cl (-) dans la lumière intestinale après augmentation

d’AMPc ; inhibition de la réabsorption du sodium ; les gènes de l’entérotoxine sont chromosomiques.

. Clinique :

- incubation : de 1 à 4 jours- début brutal : nausées, vomissements, diarrhée et crampes abdominales. Selles dites

« eau de riz »- mort par déshydratation plus que par syndrome septique.

. le choléra bien localisé dans certaines régions du globe

- Inde (golfe du Bengale), Indonésie, Iran, Irak ;- Afrique et Amérique du Sud (Pérou)

- Diagnostic :

. coproculture sur milieux sélectifs à pH alcalin

. Bacille à Gram négatif mobile dit « en vigule »

. aspect lisse et transparent des colonies à test d’oxydase positif

. agglutination avec des anticorps spécifiques - Sérogroupe 01, est divisé en 2 biotypes : . Vibrio cholerae . Vibrio El Tor

et 3 sérotypes Ogawa, Inaba, Hikogana possibilité de porteurs sains

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- Traitement :

. curatif : réhydratation ; antibiothérapie des porteurs (cyclines)

. préventif (+++) hygiène de l’eau des pays sous-développés vaccin efficace à 50 % actuellement

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CHAPITRE 14

Bacilles à Gram (-) exigeants

1 - Bordetella

Définition

Coccobacilles à Gram - , aérobies stricts.

Trois variétés sont pathogènes pour l’homme:

* Bordetella pertussis, agent de la coqueluche (bacille de Bordet et Gengou)

* Bordetella parapertussis, syndromes coquelucheux bénins et de l’immunodéprimé (SIDA)

* Bordetella bronchiseptica

1. - Pouvoir pathogène

La coqueluche est une infection aiguë du tractus respiratoire, très contagieuse.Précédée par une phase catarrhale d'une durée de 8 à 15 jours, elle est caractérisée, à la période d'état, par des quintes de toux spasmodiques (pouvant durer 3 à 6 semaines).Elle peut s'aggraver chez le nourrisson et le jeune enfant (complications pulmonaires et cérébrales parfois mortelles).

Sous sa forme virulente en phase I, le bacille de Bordet Gengou possède des antigènes capsulaires polyosidiques et des antigènes somatiques lipopolysacchasidiques correspondant à l'endotoxine des bactéries à Gram négatif. De plus, il élabore plusieurs toxines dont l’une, protéique, à une action dermonécrotique et léthale.

2. - Diagnostic bactériologique

La coqueluche étant une maladie à signes cliniques caractéristiques, le diagnostic bactériologique n'est que secondaire.

2.1. - Prélèvement en phase catarrhale ou au début des quintes.

- faire tousser directement l'enfant sur un milieu spécial coulé en boite de pétri.- ou écouvillonnage naso-pharyngé- ou aspiration des mucosités bronchiques.

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2.2. - Ensemencement : culture difficile

- il faut utiliser des milieux riches : le milieu de Bordet-Gengou contenant une forte proportion de sang frais (15%) additionné de pénicilline G (0,5 unités/ml) pour éliminer la flore commensale associée.

- culture lente (jusqu'à 4 jours). L'aspect des colonies varie suivant la constitution antigénique (existence de différentes phases) :

* colonies typiques : (phase I) rondes, lisses, bombées, luisantes (aspect en goutte de mercure) entourées d'une zone d'hémolyse, correspondant aux germes capsulés et virulents.

* après repiquages successifs, le bacille peut cultiver sur des milieux ordinaires avec des modifications de sa morphologie et de l'aspect des colonies. C'est la phase IV : les colonies rugueuses correspondent à des bactéries non capsulées et avirulentes.

Les diagnostics direct par PCR ou indirect par recherche d’anticorps spécifiques notamment dirigés contre l’adenylate cyclase pourraient avoir un intérêt important.

3. - Traitement

3.1. - Préventif

Il repose sur la vaccination.

Le bacille de Bordet et Gengou pouvant se présenter sous quatre phases différentes, il est indispensable d'utiliser la souche en phase I pour la préparation des vaccins, les autres phases n'étant pas vaccinantes.

Ceci explique les premiers échecs de la vaccination qui était effectuée avec des vaccins préparés sans tenir compte de la phase de la souche employée.

Les vaccins anticoquelucheux sont des vaccins tués, souvent associés à d'autres vaccins (D.T., polio). La vaccination doit être effectuée tôt (dans les premiers mois de la vie), à raison de 3 injections à un mois d'intervalle suivies de rappels après 1 et 5 ans. Elle confère une immunité forte et durable qui a permis de réduire de façon importante la morbidité coquelucheuse.

3.2. - Curatif

C'est un traitement symptomatique associé à des antibiotiques (ampicilline, tétracyclines) pour éviter les complications pulmonaires.

Une sérothérapie est possible chez le nouveau-né.

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C'est une maladie à déclaration obligatoire nécessitant l'isolement des malades pour éviter la dissémination, en particulier dans les crèches et les collectivités d'enfants (maladie très contagieuse).

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2 - Brucella

Les Brucella sont de petits bacilles à Gram -, immobiles, aérobies stricts, responsables de la brucellose, maladie affectant de nombreuses espèces animales et transmissibles à l'homme. Le genre Brucella comporte trois espèces principales :

* Brucella abortus,* Brucella melitensis,* Brucella suis

mais d'autres espèces et de nombreux biotypes ont été décrits.

1. - Pouvoir pathogène

1.1. - Les brucelloses animales

La brucellose est avant tout une maladie animale, touchant, en particulier : les ovins, les caprins, les bovins mais également, les chevaux, les chiens, les porcs, les animaux sauvages. Si chaque espèce a des hôtes de prédilection (Brucella melitensis pour les ovins et les caprins ; Brucella abortus pour les bovins ; Brucella suis pour les porcins, aucune n'a de spécificité d'hôte et toutes sont transmissible à l'homme.

La maladie animale se traduit le plus souvent par :

- des avortements épizootiques chez les femelles gestantes,- une atteinte des glandes génitales chez les mâles, mais les formes inapparentes sont

fréquentes, sources de dissémination des germes.

1.2. - la brucellose humaine

Elle est appelée encore fièvre de Malte, fièvre ondulante ou mélitococcie.

c’est une septicémie à point de départ lymphatique qui évolue en plusieurs stades:- une phase d’incubation silencieuse d'une durée de 15 jours à un mois.- une phase septicémique à laquelle correspond le tableau clinique de la brucellose aiguë avec fièvre typiquement ondulante, sueurs profuses, algies diverses, hépato-splénomégalie, polyadénopathie.- une phase subaigu‘ avec formation de foyers secondaires divers (ostéo-articulaires,neuro-méningés, génitaux, viscéraux) qui peuvent survenir soit en cours d'évolution d'une brucellose aiguë, soit le plus souvent après une guérison apparente.

Quant à la brucellose chronique, elle peut survenir soit rapidement, soit au contraire tardivement (des mois, voire des années après une brucellose aiguë). Les lésions brucelliennes chroniques sont très diverses (articulaires, viscérales).

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L'évolution de la maladie est longue et le pronostic variable selon les cas et les localisations.

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2. - Epidémiologie

Le réservoir de germe est représenté essentiellement par les ovins, les caprins et les bovins. Ces animaux excrètent les Brucella par le lait, le placenta lors de la mise bas, les produits d'avortements, les urines qui souillent le sol et éventuellement les eaux où les germes peuvent survivre jusqu'à deux mois.

l'homme peut se contaminer :

* soit par contact direct avec les animaux infectés :

C'est le cas le plus fréquent expliquant le caractère souvent professionnel et rural de la maladie qui touche avec prédilection les éleveurs, les bergers, les vétérinaires, les bouchers. La porte d'entrée est le plus souvent cutanée (germe pouvant traverser la peau saine) mais également muqueuse (conjonctivale) digestive ou respiratoire (inhalation de poussières provenant du fumier des étables ou même des chemins empruntés par les troupeaux).

* soit par ingestion :

De lait cru, de fromages frais contaminés ou plus rarement de légumes souillés par le fumier.

En France, la brucellose sévit essentiellement dans la région méditerranéenne (Sud de la France, Corse).

3. - Caractères des germes

- Petits bacilles à Gram -, immobiles asporulés,- Aérobies stricts. Brucella abortus exige à l'isolement une atmosphère enrichie en CO2.- Leur culture est lente, jusqu’à 3 semaines- Sur milieux ordinaires, les Brucella poussent mal et nécessitent de ce fait des milieux enrichis (milieu additionné de sérum, foie, extrait de levure, ascite, glycérine).- Toutes les Brucella possèdent en commun un certain nombre de caractères biochimiques qui permettent d'identifier le genre Brucella.- La différenciation entre les trois espèces principales qui a un intérêt surtout épidémiologique repose sur une série de tests complémentaires (caractères biochimiques, sérotypage, lysotypie).

4. - Diagnostic de la brucellose humaine

4.1. - Diagnostic direct : isolement et identification du germe :

a) Dans les brucelloses aiguës et subaiguës : les germes doivent être recherchés essentiellement dans le sang.

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Les hémocultures sont classiquement réalisées dans des flacons à double milieu liquide et solide, mis au point par Castaneda et permettant l'ensemencement quotidien de la gélose par simple inclinaison du flacon. Elles poussent rarement avant 4 jours et il faut parfois attendre 2 à 3 semaines pour pouvoir isoler les Brucella à partir du sang ; plus rarement, elles pourront être isolées à partir de culture de moëlle, de ganglions ou du L.C.R.

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b) Dans les brucelloses chroniques : la recherche des Brucella dans le sang est plus aléatoire.

4.2. - Diagnostic indirect : il repose sur :

a) La recherche des anticorps anti-brucella dans le sérum, laquelle peut se faire :

- par la réaction de Wright (ou sérodiagnostic de Wright) qui est basée sur l'agglutination d'une suspension de Brucella par les anticorps anti-brucella présents dans le sérum des malades.

Brucella A. agglutinants Agglutination anti-Brucella

La réaction est effectuée en présence de dilutions croissantes de sérum (1/20............1/5.120).

Le sérodiagnostic de Wright est considéré comme positif si > 1/80.

Les anticorps agglutinants apparaissent vers le 10ème - 15ème jour de la maladie et persistent 5 à 6 mois, voire plus.

De fausses réactions négatives dues à la présence dans le sérum de certains malades d'anticorps non agglutinants ou anticorps bloquants sont possible. Ces anticorps incomplets provoquent la saturation spécifique des sites antigéniques des germes sans entraîner leur agglutination.

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Brucella Ac. non agglutinants pas d’agglutination anti-brucella

Ces anticorps bloquants peuvent être décelés par différents procédés :

- Blocking-test = qui consiste à ajouter à chaque tube d'une réaction de Wright négative un sérum contenant des anticorps anti-brucella agglutinants.

* si l'agglutination se produit : la réaction était réellement négative,

* s'il n'y a pas d'agglutination, c'est qu'elle est empêchée par des anticorps bloquants déjà fixés sur les germes.

- Test de Coombs = qui consiste à ajouter à chaque tube d'une réaction de Wright négative un sérum anti-immunoglobulines humaines qui en se fixant sur les anticorps incomplets provoque l'agglutination des bactéries.

Phénomène de zone

Certaines réactions peuvent être également faussement négatives en raison d'un excès d'anticorps par rapport à l'antigène donnant un phénomène de zone, la réaction étant négative aux faibles dilutions du sérum (par exemple : au 1/40 et 1/80) et positive aux plus fortes dilutions.

A signaler enfin, la possibilité de fausses réactions positives au cours de la tularémie et du choléra.

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Parmi les autres méthodes sérologiques, il faut citer:

* la réaction de fixation du complément qui se positive un peu plus tard que le sérodiagnostic de Wright mais le reste plus longtemps. Peut être positive dans certaines brucelloses chroniques.

* l'immunofluorescence indirecte qui a surtout un intérêt pour le diagnostic des brucelloses chroniques.

* l'épreuve à l'antigène tamponné au Rose Bengale ou Card-test qui se positive elle-aussi, un peu plus tard que le sérodiagnostic de Wright mais qui reste souvent positive dans les brucelloses chroniques.

La recherche de l'hypersensibilité retardée par l’intradermo-réaction à la mélitine (filtrat de culture de Brucella melitensis) pour le diagnostic de la brucellose chronique n’est pas utilisée.

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5. -Traitement

5.1. - Curatif

* dans les brucelloses aiguës ou subaiguës : le traitement repose sur tétracycline + rifampicine ; tétracycline + quinolones.

* dans les brucelloses chroniques : antigénothérapie.

5.2. - Préventif

* prophylaxie individuelle : désinfection soigneuse des mains, précautions diverses pour toutes les personnes en contact direct avec les animaux.

* pasteurisation des produits laitiers : meilleur moyen de lutter contre la contamination alimentaire.

* prophylaxie de la maladie animale basée sur le dépistage et l'éradication des animaux malades. Vaccination des jeunes animaux.

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3 - Francisella tularensis

Francisella tularensis est un très petit bacille à Gram -, responsable de la tularémie (zoonose).

1. - Habitat

En France, le réservoir de germes est constitué essentiellement par les rongeurs sauvages (lièvre surtout). Exceptionnellement d'autres espèces animales peuvent héberger cette bactérie : chien, chat, sanglier.

2. - Pouvoir pathogène

2.1. - Chez l'animal

La tularémie est avant tout une maladie de l'animal, qui sévit par épizooties souvent meurtrières. Les animaux malades présentent une septicémie avec splénomégalie et adénopathies.

2.2.- Chez l'homme

La tularémie est une affection peu fréquente, en France.

Cliniquement après une période d'incubation silencieuse de 3 à 4 jours, un syndrome pseudo-grippal marque la phase d'invasion. Les symptômes varient ensuite selon la porte d'entrée du germe :

- forme ulcéro-ganglionnaire des membres, consécutive à une contamination cutanée avec chancre d'inoculation et adénopathies pouvant évoluer vers la suppuration (la forme la plus fréquente).

- forme pharyngée, avec amygdalite et adénite cervicale et sous-maxillaire, secondaire à une porte d'entrée digestive.

- forme conjonctivale avec conjonctivite et adénite prétragienne (syndrome de Parinaud).- forme fébrile isolée.

3. - Epidémiologie

L'homme se contamine le plus souvent au contact du gibier infecté (ramassage et dépouillement du gibier) le germe pouvant pénétrer à travers la peau et les muqueuses saines en l'absence de toute excoriation.

La contamination par piqûres, morsures d'insectes ou par des aliments est exceptionnelle en France. Pas de contamination interhumaine.

4. - Caractères du germe

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*Bacilles à Gram -, de très petite taille, immobiles, asporulés.*Aérobies stricts.*Ne cultivant pas sur milieux usuels, exigeant pour pousser du jaune d'oeuf (milieu de Mac

Coy et Chapin) ou des milieux additionnés de Cystine ou de Cystéine + du sang (milieu de Francis).

5. - Diagnostic de la tularemie

5.1. - Diagnostic direct

Mise en évidence de Francisella tularensis dans les premiers jours de la maladie au niveau de la porte d'entrée et dans les ganglions satellites avant la période de suppuration mais jamais à partir du sang.

5.2. - Diagnostic indirect

a) la recherche de l'état d'hypersensibilité retardée par lÕintradermo-rŽaction à la tularine (autolysat chauffé de Francisella tularensis) est l’examen privilégié. Elle est très spécifique et très précoce (5-6 jours de la maladie) et persiste plusieurs années.

b) recherche des agglutinines spécifiques dans le sérum (sérodiagnostic). Les agglutinines apparaissent entre le 8ème et le 10ème jour de la maladie. Elles atteignent leur titre maximum après 2 mois environ et décroissent ensuite lentement.

6. - Traitement

6.1. - Prophylactique

*déclaration obligatoire de la maladie.

*dépistage des épizooties chez le lièvre.

*précautions lors de la manipulation d'un cadavre d’animal suspect.

6.2. - Curatif

* avant le stade de suppuration : traitement antibiotique (tétracyclines, fluoroquinolones) efficace.

* au stade de suppuration : ponction évacuatrice ou ablation chirurgicale des lésions.

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4 - Haemophilus sp.

Definition

Petits bacilles à Gram négatif exigeant pour leur croissance la présence de certains facteurs contenus dans le sang :

- soit le facteur V (= N.A.D. ou Nicotinamide-Adénine-Dinucléotide)

- soit le facteur X (= hématine)

- soit les deux à la fois, présents dans le sang et les extraits globulaires.

Une différence dans l’exigence de ces facteurs permet de différencier des espèces dans ce genre.

1. - Haemophilus influenzae

1.1. - Pouvoir pathogène

Commensal du rhinopharynx (50% des enfants porteurs).

Il est responsable :

* d'infections primitives : pharyngites, sinusites, otites, bronchopneumonies, méningites aiguës purulentes (gravité chez l'enfant de moins de 6 ans).

* d'infections secondaires compliquant des maladies virales (grippe, rougeole) et certaines maladies bactériennes (par exemple : coqueluche).

1.2. - Morphologie

Coccobacilles à Gram -, immobiles, parfois capsulés (6 types sérologiques différents dont le plus fréquent est le type f).

1.3. - Diagnostic bactériologique

- prélèvement : expectorations, L.C.R. et plus rarement le sang.

- culture sur gélose au sang car germe exigeant pour sa croissance les facteurs V et X. En 24 heures : colonies caractéristiques. L’identification se fait par biotypage.

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Le diagnostic indirect sérologique n’est pas utilisŽ. La recherche d’antigènes capsulaires de Haemophilus influenzae (antigènes solubles) dans le bilan étiologique d’une méningite décapitée ne revêt pas beaucoup d’intérêt compte-tenu du manque de sensibilité des techniques d’agglutination par particules de latex actuellement utilisées.

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1.4. - Traitement

Germe sensible en général à de nombreux antibiotiques. Mais des souches résistantes productrices de bétalactamases (20 %) sont de plus en plus souvent isolées, ce qui a remis en question le traitement de première intention par l’ampicilline des méningites de l’enfant. Cette résistance est souvent associée à celles aux cyclines et du chloramphénicol. Ces souches restent cependant sensibles aux céphalosporines de 3ème génération et aux fluoroquinolones.

2. - Autres Haemophilus voisins de Haemophilus influenzae

* Haemophilus para-influenzae responsable d'infections pulmonaires et endocardites.

* Haemophilus aegyptus responsable de conjonctivites.

3. - Haemophilus ducreyi

3.1. - Pouvoir pathogène

Entraîne le chancre mou (maladie sexuellement transmissible).Parasite strict et obligatoire de l'homme

Clinique très évocatrice, à ne pas confondre avec le chancre syphilitique : ulcération purulente non indurée, douloureuse, apparaissant après une durée d'incubation de deux jours en moyenne, accompagnée d'un bubon inguinal pouvant évoluer vers la suppuration.

3.2. - Diagnostic bactériologique

Le diagnostic direct est difficile:

* prélèvement : sérosité du chancre après raclage ou ponction,

* l'examen direct peut permettre d’évoquer le diagnostic (présence de petits bacilles à Gram - en chaînettes). En fait, l'abondance de la flore de surinfection rend l'observation souvent difficile.

*culture sur gélose enrichie (sang).

3.3. - Traitement

Sulfamides ou tétracyclines ou fluoroquinolones par voie générale.

Maladie à déclaration obligatoire

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Remarques

Un autre bacille a été longtemps classé dans ce groupe sous l'appellation de Haemophilus vaginalis. En raison de certains de ses caractères morphologiques (Gram variable) et culturaux sa position taxonomique a varié. C'est un bacille à Gram positif facilement décoloré par l'alcool. Cette bactérie appelée successivement Corynebacterium vaginale puis Gardnerella vaginalis (dénomination actuelle), est responsable de 10 à 25% des vaginites.

Le diagnostic bactériologique repose sur l'examen microscopique des leucorrhées qui sont en général abondantes : présence de nombreuses cellules épithéliales contenant des bacilles à Gram positif, disposés en paquets avec une flore associée peu abondante (aspect caractéristique dites en « cellules cloutées »).

Traitement : Sulfamides et tétracyclines par voie locale chez la femme, éventuellement tétracyclines ou amoxicilline + a. clavulanique par voie générale.

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5 - Legionella pneumophila

1. - Découverte de la maladie

Durant l'été 1976, à Philadelphie, lors du congrès de l'American Legion, une épidémie d'infections respiratoires aiguës accompagnées dans 40% des cas de troubles gastro-intestinaux (diarrhée et vomissements) s'est installée, frappant 220 des participants et entraînant 34 décès.

Une enquête a rapidement été menée pour trouver l'agent responsable de cette épidémie. Elle a permis d'écarter une intoxication alimentaire, une épidémie de grippe porcine, une quelconque affection bactérienne, virale, parasitaire ou mycosique connue.

En Janvier 1977, Mac Dade annonce que chez 4 sujets décédés de cette maladie, une même bactérie à Gram - a été isolée de fragments de tissus pulmonaires. Par inoculation de ces prélèvement au cobaye, il a montré qu'après une incubation de 1 à 2 jours, l'animal présentait une infection fébrile mortelle en 3 à 6 jours. L'examen des frottis de rate et de foie a révélé dans tous les cas, la présence de nombreux bacilles à Gram -. Enfin, il a confirmé le rôle étiologique de cette bactérie par une réaction d'immunofluorescence indirecte avec les sérums de convalescents de cette maladie.

2. - Pouvoir pathogène

La maladie des légionnaires, due à Legionella pneumophila, se présente sous deux aspect différents :

- « La maladie des légionnaires »: pneumopathie grave.

* incubation : 2 à 10 jours avec céphalées et myalgies, température en plateau (40°C) + frissons.

* puis apparition d'une toux sèche accompagnée de signes neurologiques (confusion mentale, léthargie) et digestifs (vomissements, diarrhées).

* évolution :- soit spontanément vers la guérison.- soit aggravation : pneumonie multilobaire avec hypoxie et mort par insuffisance respiratoire aiguë.

- La « fièvre de Pontiac »: forme bénigne fébrile.

* incubation: 36 heures avec fièvre à 40°C, tachycardie sans signe pulmonaire.

* évolution favorable en 2 à 5 jours.

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3. - La bactérie

Legionella pneumophila est une bactérie à multiplication intracellulaire obligatoire qui peut échapper aux défenses de l’hôte en parasitant les monocytes et les macrophages dans lesquels elle survit.

- Morphologie

bacille à Gram -, immobile,coloration la plus sensible : imprégnation argentique.coloration la plus utilisée pour le diagnostic: immunofluorescence directe.

- Culture

-Impossible sur les milieux couramment utilisés (explication de la négativité des examens bactériologiques standards des expectorations).

-utilisation de milieux synthétiques enrichis permettant la culture en 3 à 5 jours (milieu Cysteine Yeast Extract:CYE)

- Identification

Certains caractères biochimiques (catalase, oxydase, lécithinase) permettent de confirmer le diagnostic.D'autre part, la souche possède une hémolysine active sur les globules rouges de cobaye.Il existe 6 sérotypes différents mis en évidence avec des sérums spécifiques fluorescents. Le sérotype 1 est le plus fréquent (60 à 70% des cas).

4. - Diagnostic bactériologique

4.1. - Diagnostic direct

- la recherche de la bactérie par immunofluorescence directe avec sérotypage permet un diagnostic rapide. Elle doit être complétée par la culture sur milieux CYE pour augmenter la sensibilité de cette recherche.

Les prélèvements à effectuer sont essentiellement d’origine pulmonaire (expectorations, liquide pleural, aspiration trachéale, biopsie).

- la recherche de l’antigène urinaire de Legionella pneumophila serogroupe 1 peut être effectuée par des techniques immunoenzymatiques. Elle est spécifique et sensible. L’excrétion de l’antigène Legionella peut commencer trois jours après l’apparition des symptomes et persister durant une année.

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4.2. - Diagnostic indirect

Recherche des anticorps spécifiques de la maladie par immunofluorescence indirecte. Appparition tardive des anticorps souvent 2 semaines après le début des signes cliniques. Seule l'augmentation significative du taux des anticorps à 10 jours d'intervalle est en faveur de ce diagnostic étiologique.

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5. - Traitement

- Antibiotiques actifs :

*Erythromycine (antibiotique de choix)*Rifampicine.*Quinolones

- Antibiotiques inactifs :

*Pénicillines et ampicilline*Aminosides.

6. - Remarques importantes

*Legionella pneumophila semble être particulièrement fréquente dans l'environnement : elle a été retrouvée dans le sol, l'eau et surtout dans les évaporateurs d'air conditionné (transmission par aérosols). Ceci expliquerait sa grande diffusion et son rôle important dans les épidémies.

* Il existe des terrains prédisposant à cette maladie : immunodéprimés (greffés, cancéreux, hémodialysés), malades porteurs d'une tare (diabète, alcoolisme, maladie cardio-vasculaires) et fumeurs importants....

*Prévention: nettoyage et désinfection des circuits d’eau, des réservoirs, des systèmes de climatisation ou bien en portant l’eau à 60°C ou bien en maintenant le taux de chlore de l’eau à 2 à 5 ppm.

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6 - Pasteurella multocida

Pasteurella multocida est l'espèce la plus répandue du genre Pasteurella et la plus rencontrée en pathologie humaine.

1. - Habitat

Commensal fréquent du tube digestif et des voies respiratoires de nombreuses espèces animales : chat surtout, mais aussi boeuf, cheval, mouton, porc, chien, lapin.... animaux sauvages et même volailles.

2. - Pouvoir pathogène

2.1. - Chez l'animal

Oiseaux et mammifères sont fréquemment atteints par Pasteurella multocida chez lesquels le germe est souvent commensal. Il peut être responsable de septicémies hémorragiques et d'infections pulmonaires.

2.2. - Chez l'homme

La contamination est le plus souvent directe à partir d'un animal, après morsure de chien ou griffure de chat, mais peut être indirecte par piqûre ou blessure avec des supports inertes souillés par des déjections animales (épines, ronces, instruments agricoles). Possibilité aussi d'inhalation ou d'ingestion de poussières, débris de poils ou de plumes véhiculant Pasteurella multocida.

Cliniquement, l'aspect habituel de la pasteurellose humaine est celle d'une infection cutanée consécutive à une morsure ou une griffure animale. Elle se caractérise par l'apparition rapide d'un oedème local très douloureux avec lymphangite, adénopathie, signes généraux plus ou moins marqués. La précocité de la douleur, dans les heures suivant l'inoculation est très caractéristique. Possibilité d'évolution vers la chronicité avec apparition de syndrome neurotrophique.

Des formes généralisées septicémiques, des formes respiratoires ou méningées peuvent être décrites,surtout chez des sujets au terrain déficient, atteints de maladie intercurrente grave (diabète, cancer....)

3. - Caractères du germe

*Bacilles de petite taille, à Gram -, immobiles, asporulés, parfois encapsulés.

*Aéro-anaérobie facultatif.

*Poussant sur milieux ordinaires.

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*Il existe plusieurs sérotypes de Pasteurella multocida.

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4. - Diagnostic de la pasteurellose

4.1. - Diagnostic direct : mise en évidence du germe.

a) Dans les formes après griffure ou morsure, le germe peut être mis en évidence dans la sérosité présente au point d'inoculation à condition d'effectuer le prélèvement dans les premières heures d'évolution.

b) Dans les formes généralisées, Pasteurella multocida peut être isolée à partir d'hémocultures, d'expectorations ou de L.C.R.

Quelle que soit la nature du prélèvement, l'examen comportera :

* un examen microscopique après coloration.

* une mise en culture sur milieux ordinaires sur lesquels la bactérie pousse rapidement en donnant de très petites colonies translucides.

4.2. - Diagnostic indirect

Il reposait sur la recherche d'une hypersensibilité à la pasteurelline de Reilly (filtrat de culture) injectée en intradermique ; non utilisé actuellement.

5. - Traitement

*uniquement curatif,

*A la phase aiguë : antibiotiques dont les plus actifs sont l'ampicilline, les aminosides ou les tétracyclines.

*Dans les formes chroniques : antigénothérapie à la pasteurelline d’efficacité discutée.

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7 - Bartonella - Afipia felis

Les Bartonella (anciennement nommés Rochalimaea) et Afipia felis sont des petits bacilles à Gram négatif difficilement cultivables, responsables de plusieurs pathologies dont les deux principales sont la maladie des griffes du chat et l’angiomatiose bacillaire.

1. - La maladie des griffes du chat

1.1. - Clinique

.ou lymphoréticulose bénigne d’inoculation

. après morsure ou griffure par un chat ou transmission par un objet inerte comme une épine, apparition d’une pustule prurigineuse dont l’évolution se fait sur plusieurs semaines, puis apparition d’une adénopathie chronique satellite, le plus souvent axillaire d’évolution fréquente vers la suppuration. Contexte peu fébrile.

1.2. - Diagnostic

- clinique très évocatrice- examen histologique du ganglion : coloration spécifique à l’argent ; présence de petits bacilles à Gram négatif.- culture du ganglion ou de la ponction ganglionnaire :

. milieux riches en sang, en atmosphère riche en CO2. Culture lente et difficile (2 à 4 semaines) petites colonies avec petits bacilles à Gram négatif. L’espèce essentiellement en cause est Afipia felis ; Bartonella henselae est plus rarement ; leur identification repose essentiellement sur des techniques de biologie moloéculaire (séquence ARN 16s...)

- examen de PCR à la recherche de ces agents étiologiques à partir du ganglion ou de la ponction ganglionnaire.

- diagnostic indirect par immunofluorescence indirect ou ELISA. Mise en évidence d’une séroconversion (anticorps anti-B.henselae essentiellement). Sensibilité et spécificité discutées.

1.3. - Traitement

. antibotiques et efficacité très discutée - drainage par ponctions évacuatrices du ganglion.. quelques succès thérapeutiques dans les formes suppurées ou systémiques avec le cotrimoxazole, la ciprofloxacine, la rifampicine ou les aminosides.

2. - L’angiomatose bacillaire

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2.1. - Clinique

. lésions cutanées diffuses chez patients VIH (+) ; papules ou nodules sous-cutanés ayant une tendance à s’ulcérer et à saigner.. formes systémiques fréquentes : atteinte osseuse, hépatiques ou splénique

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2.2. - Diagnostic

- examen histologique des lésions cutanées après coloration argentique : petits bacilles à Gram négatif.- culture à partir de lésions cutanées ou d’hémocultures : cf maladie des griffes du chat mais les agents étiologiques sont : Bartonella quintana et Bartonella henselae.- sérologie de sensibilité et de spécificité discutées.

2.3. - Traitement

- non codifié actuellement - classiquement macrolides pendant au moins 1 mois- mais possibilité d’une plus grande efficacité des aminosides.

avec ces bactéries, on note une dissociation entre l’activité des antibiotiques testés in vitro et leur efficacité thérapeutique in vivo.

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CHAPITRE 15

Mycobactéries

1. - Généralités

1.1 - Les mycobactéries constituent une vaste famille (Mycobacteriaceae) de bactéries comportant un seul genre: le genre Mycobacterium.

1.2 - Il s'agit de bacilles dont la mise en évidence ne peut se faire par la technique de coloration de Gram. Ils sont caractérisés par:

1.2.1. - l’acido-alcoolo-résistance: ils sont colorés à chaud par la fuschine et retiennent ce colorant en résistant au lavage par une solution décolorante d'acide-alcool (BAAR). Après surcoloration par le bleu de méthylène, les mycobactéries apparaissent rouges sur fond bleu. C'est la coloration de Ziehl-Neelsen qui met en évidence cette propriété fondamentale des mycobactéries, liée à l'abondance des lipides de la paroi.

1.2.2. - la lenteur de leur multiplication: Mycobacterium tuberculosis se développe en 3 semaines sur milieu de Loewenstein-Jensen.

1.3 - Le genre Mycobacterium comprend trois catégories et de nombreuses espèces.1.3.1. - bacilles de la tuberculose ou mycobactéries du complexe tuberculosis, qui se

subdivise en trois sous-espèces: - M. tuberculosis ou bacille de Kock (BK), pathogène spécifique strict de l'espèce humaine qui est l'agent de la tuberculose humaine; - M. africanum, proche de M. tuberculosis fréquemment isolé de cas de tuberculose en Afrique de l'Ouest et en Afrique Centrale; - M. bovis, agent de la tuberculose des bovidés mais qui peut infecter l'homme.

1.3.2. - M. leprae ou bacille de Hansen, pathogène spécifique strict de l'espèce humaine qui est l'agent de la lèpre.

1.3.3. - Espèces dites « mycobactéries atypiques »: habituellement saprophytes ou commensales. Certaines espèces ont un pouvoir pathogène potentiel et sont responsables d'infections humaines opportunistes (M. avium)

2. - Mycobacterium tuberculosis ou bacille de Koch (BK).

2.1. - Habitat

Pathogène spécifique strict de l'homme. Ce sont les malades porteurs de lésions pulmonaires bacillifères qui jouent le rôle essentiel dans la dissémination de la tuberculose. Ce germe très résistant est généralement transmis par voie aérienne. Il résiste au froid, à la dessication et peut demeurer vivant plusieurs jours dans les produits contaminés. Il est tué rapidement par l'alcool dilué (70°). Malgré la vaccination par le BCG, la tuberculose est un problème de santé publique sérieux en France aggravé par l'épidémie actuelle de SIDA.

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2.2. - Pouvoir pathogène naturel

M. tuberculosis n'est jamais retrouvé à l'état de saprophyte ou de commensal. La tuberculose est avant tout (90%) une maladie qui affecte l'arbre respiratoire: poumon, plèvre, ganglions médiastinaux.Les principales localisations extra-respiratoires de la tuberculose sont ganglionnaires, méningées, ostéo-articulaires et génito-urinaires. 2.3. - Physiopathologie

Après contamination, le plus souvent aérienne, parfois digestive les bacilles sont phagocytés par les macrophages et se multiplient. Plusieurs éventualités:- si la multiplication des bacilles est limitée (contamination par un petit nombre de bactéries, forte immunité naturelle du patient) on voit apparaître en 3 à 6 semaines un petit tubercule fait de cellules épithélioides et de cellules géantes entourées d'une couronne de lymphocytes, et centré par une zone de nécrose (caséum). Les bacilles se trouvent alors dans un environnement défavorable et le plus grand nombre meurent progressivement. C'est la primo-infection latente qui se traduit seulement par le virage de la réaction cutanée à la tuberculine. - si la multiplication des bacilles est importante, les ganglions efférents pourront être envahis et les bacilles pourront même essaimer dans tout l'organisme par voie lymphatique et sanguine. Les lésions nécrotiques pulmonaires seront plus étendues et des lésions radiologiques seront visibles. La primo-infection sera patente. Deux éventualités peuvent alors se produire: . la plus fréquente, favorable, est l'encapsulement de la nécrose caséeuse, avec tendance à l'autostérilisation spontanée. . la plus rare (environ 10% des cas), défavorable, est le ramollissement du caséum qui entraîne son évacuation et la formation d'une caverne avec pullulation bactérienne. 2.4. - Immunité et allergie

Dans un organisme neuf la multiplication du bacille de la tuberculose entraîne deux réactions importantes: - un état de sensibilisation vis à vis des protéines du bacille de la tuberculose ou allergie tuberculeuse qui se traduit par une hypersensibilité de type retardé. - un état de plus forte résistance de l'organisme à l'égard du bacille; c'est l'immunité anti-tuberculeuse. Ces 2 réactions ont un support cellulaire et non humoral. Elles ont pour base expérimentale le phénomène de Koch.

2.4.1. - Le phénomène de Koch

Suite à l'inoculation de M. tuberculosis le cobaye sain fait une réaction tardive qui dure jusqu'à la mort alors que le cobaye déjà infecté fait une réaction précoce (état d'hypersensibilité à l'égard de M. tuberculosis ou allergie tuberculeuse) et transitoire (état d'immunité de surinfection).

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2.4.2. - L'hypersensibilité tuberculinique

Elle peut être mise en évidence par l'injection de bacilles vivants, mais aussi par l'injection de bacilles morts ou même d'extraits bacillaires (tuberculine). L’apparition de l'allergie signifie seulement que le sujet a fait sa primo-infection avec M. tuberculosis.

2.4.3. - L'immunité antituberculeuse

- L'immunité acquise est une immunité imparfaite. En effet, on peut constater qu'un certain pourcentage de sujets infectés font, malgré le développement de l'immunité acquise, une tuberculose-maladie. Comme l'allergie, l'immunité antituberculeuse n'a pas de support humoral mais un support cellulaire (macrophages activés par les T-lymphocytes). Les anticorps circulants que l'on trouve dans le sérum ne semblent jouer aucun rôle immunitaire. - La seule possibilité de provoquer un état artificiel d'immunité anti-tuberculeuse est l'inoculation de bacilles vivants suffisamment virulents pour engendrer l'immunité mais suffisamment atténués pour que leur inoculation ne provoque qu'une infection spontanément régressive. La souche vaccinale est le bacille de Calmette et Guérin ou BCG.

2.5. - . Diagnostic biologique de la tuberculose

2.5.1. - Diagnostic direct

2.5.1.1. - Prélèvements

- il faut répéter les prélèvements et les effectuer avant la mise en route de l'antibiothérapie qui peut supprimer toute possibilité d'apporter la preuve de la maladie.

- en cas de suspicion de tuberculose pulmonaire: si le sujet crache, on recueille les crachats autant que possible le matin au réveil. Si le sujet ne crache pas, on procède à un tubage gastrique qui a pour but de recueillir les mucosités bronchiques dégluties pendant le sommeil. Eventuellement, on recueille les mucosités bronchiques par fibroscopie: aspiration, lavage broncho-alvéolaire. Il est également recommandé de recueillir des crachats ou d'effectuer des tubages gastriques les trois jours qui suivent une fibroscopie.

- en cas de suspicion de tuberculose extra-pulmonaire il faut recueillir les liquides de ponction (liquide céphalo-rachidien, liquide pleural, liquide articulaire...), les urines, pus... pour y rechercher M. tuberculosis à l'examen microscopique et en culture.

2.5.1.2. - Examen microscopique

- les frottis sont colorés par la méthode de Ziehl-Neelsen. Les mycobactéries apparaissent comme des bâtonnets rouges, fins, légèrement incurvés, isolés ou groupés en amas, cordes et torsades.

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- ils peuvent aussi être coloré par une méthode en fluorescence non immunologique (auramine). Par rapport à la coloration de Ziehl-Neelsen (observation des lames à l'objectif 100, à l'immersion), la coloration par l'auramine s'observe à l'objectif faible, d'où une plus grande rapidité d'observation.

- la coloration de Ziehl-Neelsen et la coloration par l'auramine permettent seulement de conclure à la présence ou à l'absence de BAAR, mais les caractères morphologiques ne permettent pas d'identifier M. tuberculosis.

- le résultat doit être répondu de façon quantitative (nombre de BAAR par frottis ou par champ microscopique) pour apprécier l'efficacité du traitement. Il doit être réalisé le plus rapidement possible afin d'isoler les patients bacillifères et éviter la contagiosité. Il n'est positif que dans 50% des tuberculoses pulmonaires d'où la nécessité de réaliser systématiquement la culture.

2.5.1.3. - Culture

- ne poussent pas sur les milieux de culture usuels mais sur milieux de Lowenstein Jensen (milieu solide à l'oeuf coagulé contenant du vert malachite).

- les produits non contaminés par une flore associée (liquide céphalo-rachidien, liquide pleural...) sont ensemencés directement. - les produits contenant une flore associée (crachats, tubages...), doivent subir une décontamination préalable. Ce résultat est obtenu en traitant avant culture les prélèvements par des agents chimiques (soude) plus toxiques pour les autres bactéries que pour les mycobactéries. On ensemence ensuite un milieu de Loewenstein-Jensen.

- la croissance est lente: M. tuberculosis se développe en 3 semaines en donnant des colonies caractéristiques rugueuses, de couleur crème beige (aspect en chou-fleur). - il existe actuellement une technique plus rapide de mise en évidence des mycobactéries en culture par la méthode radiométrique Bactec. La croissance de M. tuberculosis peut être détectée en 8 jours par détection de C14O2 libéré dans le milieu de culture. Cette technique n'est pas généralisée en France car elle nécessite l'utilisation de radioéléments - l’identification de l’espèce par étude des caractères biochimiques ou génétiques par hybridation avec des sondes spécifiques d'espèce, permet de porter un diagnostic de certitude.

2.5.1.4. - Antibiogramme

- Il est réalisé sur le milieu solide de Loewenstein-Jensen imprégné d'antibiotique (méthode des proportions). Du fait de la lenteur de la croissance du BK, l'antibiogramme n'est obtenu que très tardivement (minimum 8 semaines). Il permet de vérifier le bon choix du traitement ou d'apporter des modifications en cas de résistance.

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- L’étude de la sensibilité des bacilles de la tuberculose peut également être réalisée en milieu liquide (radiométrique ou non). Elle permet d'obtenir des résultats dans des délais plus rapides (5 à 8 jours). - Avec l'épidémie de Sida et la diffusion des souches, des souches multirésistantes sont actuellement signalées (principalement aux USA), ce qui justifie une réponse rapide de cet examen. L'incidence en France reste faible (1%).

2.5.1.5 - Biologie moléculaire

- La technique PCR (Polymerase Chain Reaction) est un moyen rapide (un jour) de faire la preuve du diagnostic de tuberculose en cas d'examen direct négatif et peut s'avérer intéressante pour suppléer le manque de sensibilité du diagnostic par coloration et la lenteur des cultures. Cette méthode est actuellement discutée car elle manque de sensibilité par rapport aux cultures pour les tuberculoses paucibacillères.

- Elle permet de différencier rapidement l'espèce M. tuberculosis des mycobactéries atypiques dans les prélèvements à frottis positif.

2.5.2. - Diagnostic indirect

- Il n'y a pas de sérodiagnostic de la tuberculose.

- On peut rechercher l'hypersensibilité cutanée à la tuberculine. Le test le plus fiable reste l'intradermo-réaction avec 10 unités de tuberculine purifiée. La dose injectée est connue et la lecture du diamètre de la réaction quantifiable (7 mm en 72 heures). La positivité indique que le sujet a déjà fait sa primo-infection. Interprétation délicate en France (BCG).

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2.6. - Traitement

2.6.1. - Traitement prophylactique

2.6.1.1. - Vaccination

- Elle est possible mais implique obligatoirement l'utilisation d'une souche vivante. C'est le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) qui est utilisé. Le BCG est une souche de M. bovis dont la virulence s'est atténuée à la suite de repiquages multiples pendant 12 ans. Cette souche avirulente a conservé la propriété de se multiplier chez le receveur et d'y induire une certaine immunité. Le BCG s'administre par voie intradermique. La vaccination est indiquée chez les sujets ne réagissant pas positivement à l'injection intradermique de tuberculine. 2.6.1.2. - Chimioprophylaxie

- Chez un sujet qui vient de virer ses réactions tuberculiniques ou qui a été contaminé accidentellement (personnel de laboratoire): isoniazide pendant 6 mois.

2.6.2. - Traitement curatif

- Isoniazide (INH), Rifampicine (R), Ethambutol (E), Pyrazinamide (PZA), Streptomycine. - Nécessité d'associer au moins trois antibiotiques pour éviter la sélection de mutants résistants (résistance primaire éventuelle) - Les résultats de l'antibiogramme permettent ensuite de choisir deux antibiotiques certainement actifs afin d'éviter la sélection de mutants résistants (résistance secondaire ou acquise).

- En pratique le traitement recommandé est d'une durée de 6 mois ou de 9 mois:

- traitement de 6 mois: - pendant 2 mois 4 antibiotiques (INH, R, E, PZA)- pendant 4 mois 2 antibiotiques (INH, R)

- traitement de 9 mois: - pendant 2 mois 3 antibiotiques (INH, R, E)- pendant 7 mois 2 antibiotiques (INH, R)

- La négativation progressive des examens microscopiques et des cultures signe l'efficacité du traitement.

3. - Mycobacterium bovis

- Agent de la tuberculose bovine. La transmission de la maladie à l'homme se fait surtout par absorption de lait de vache contaminé (mammite tuberculeuse) et plus rarement par voie aérienne en contact avec les bovidés. Le contrôle vétérinaire et la pasteurisation des produits laitiers ont considérablement réduit la fréquence des infections à M. bovis.

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- Le pouvoir pathogène de M. bovis est chez l'homme identique à celui de M. tuberculosis. Cependant, le mode de contamination habituellement digestif, explique la grande fréquence des adénopathies buccopharyngées et mésentériques.

- Il est résistant au pyrazinamide.

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4. - Mycobacterium africanum

- Variété africaine du bacille de la tuberculose humaine. Il se développe lentement en 4 à l0 semaines et les colonies sont lisses. L'antibiogramme est toujours indispensable car de nombreuses souches présentent une résistance primaire.

5. - Mycobactéries dites atypiques

5.1. - Les mycobactéries dites atypiques sont à l'inverse de M. tuberculosis et M bovis, des bactéries de l'environnement (saprophytes).- Elles sont responsables d'infections opportunistes localisées (pulmonaires, ganglionnaires ou cutanées) chez le sujet immunocompétent. Pour attribuer un rôle pathogène à ces espèces de mycobactéries, il faut que la souche soit isolée a plusieurs reprises et en grand nombre d'un site approprié, et en l'absence du bacille de la tuberculose. - Chez le sujet immunodéprimé et notamment chez le sujet atteint du SIDA ces mycobactéries peuvent être responsables d'infections généralisées. La recherche doit se faire dans: - les hémocultures (technique spéciale Dupont Isolator suivi de l'isolement sur le milieu de Lowenstein-Jensen ou méthode radiométrique Bactec). - les biopsies médullaire et hépatique.

5.2. - Quatre groupes principaux de mycobactéries atypiques sont décrits: . Groupe I ou photochromogènes (les colonies se pigmentent en jaune à la lumière):

- M. kansasii responsable d'infections pulmonaires, ostéo-articulaires.- M. marinum responsable d'infections cutanées (granulome des piscines).

. Groupe II ou scotochromogènes (les colonies se pigmentent en jaune-orange à l'obscurité):

- M. gordonae (saprophyte fréquemment rencontré dans l'eau)- M. scrofulaceum responsable d'infections ganglionnaires chez le jeune enfant.

. Groupe III ou non photochromogènes (colonies non pigmentées):- M. avium-intracellulare responsable d'infections pulmonaires mais aussi ganglionnaires, osseuses et articulaires. C'est l'agent essentiel des infections généralisées à mycobactéries atypiques qui s'observent chez les sujets atteints de SIDA- M. xenopi est l'espèce la plus fréquemment trouvée parmi les mycobactéries atypiques responsables d'infections en France chez les sujets immunocompétents (principalement chez les anciens tuberculeux et les patients atteints de néoplasie).

. Groupe IV ou mycobactéries à croissance rapide: les colonies apparaissent en trois jours sur milieux ordinaires). Pas de véritable pouvoir pathogène:

- M. fortuitum-chelonae responsable d'abcès localisés après injection.

5.3. - Les mycobactéries atypiques se recherchent dans les produits pathologiques de la même façon que M. tuberculosis. Selon les espèces, les colonies apparaissent plus ou moins rapidement, de 3 à 6 jours pour les mycobactéries atypiques du groupe IV à 6 semaines et plus pour les autres mycobactéries atypiques, en particulier M. xenopi. - La plupart des espèces sont naturellement résistantes aux antibiotiques actifs sur M. tuberculosis:

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- M. kansasii et M. xenopi: résistance au pyrazinamide mais généralement sensibles à la rifampicine, éthambutol, isoniazide.- M. avium-intracellulare: résistance naturelle à tous les antibiotiques sauf à la clarithromycine, rifabutine et éthambutol. Détermination de la CMI à la clarithromycine car apparition de résistances en cours de traitement. De nouvelles molécules sont en cours d'étude: fluoroquinolones.

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6. - Mycobacterium leprae

6.1. - Habitat, épidémiologie

M. leprae ou bacille de Hansen est un pathogène spécifique strict de l’espèce humaine qui est incapable de croître sur les milieux de culture artificiels. L'homme malade est à la fois le réservoir de germes et l'agent vecteur du bacille. La transmission se fait par les sŽcrŽtions des muqueuses pituitaires, bucco-pharyngée et laryngée, ainsi que par les lésions cutanées ulcérées. La voie principale de pénétration du bacille est encore imprécise (peau, voies aériennes). Le sous-développement, malnutrition, niveau sanitaire bas, favorisent la transmission du bacille et le passage de l'infection latente à la maladie clinique.

6.2. - Pouvoir pathogène

6.2.1. - naturel

- La lèpre est observée à l'état endémique en Afrique noire, Extême-Orient, Inde, Antilles, Amérique Centrale et du Sud. Quelques foyers au Portugal, Espagne, Italie, Grèce et Turquie. - La lèpre est une maladie chronique à évolution lente dont plusieurs aspects cliniques peuvent être observés selon le degré de résistance immunitaire des sujets:

6.2.1.1. - La forme indéterminée est une forme de début qui associe des tâches claires, hypopigmentées et des troubles sensitifs (fourmillements). L'évolution peut se faire vers la guérison ou une des formes cliniques décrites ci-dessous.

6.2.1.2. - La lèpre tuberculoïde dite bénigne comporte des atteintes cutanées sous forme de lésions infiltrées micro- ou macro-papuleuses (léprides) et des atteintes nerveuses de type névritique avec des troubles sensitifs, moteurs et trophiques. Les lésions histologiques sont de type folliculaire (lymphocytes, cellules géantes) comme dans la tuberculose. M. leprae est pratiquement absent des lésions. L'IDR à la lépromine est positive. L'ensemble traduit un état de forte résistance de l'organisme au bacille de Hansen.

6.2.1.3. - La forme lépromateuse dite maligne est caractérisée par une infiltration tissulaire polyviscérale et des nodules cutanés indurés (lépromes). Les bacilles sont éliminés en abondance avec les sécrétions nasales (rhinite lépreuse). L’histologie montre un granulome macrophagique constitué de nappes d'histiocytes vacuolaires dans lesquels la coloration de Ziehl-Neelsen fait apparaître des bacilles en abondance groupés en amas intracellulaires ou en globi. L'IDR à la lépromine est négative, ce qui traduit la déficience des défenses immunitaires.

6.2.1.4. - La lèpre borderline ou intermédiaire est une forme de passage pouvant évoluer vers les lèpres tuberculoïdes ou lépromateuses.

6.2.2. - expérimental

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- La multiplication expérimentale du bacille de la lèpre a été obtenue chez l'animal: le temps moyen de division du bacille est de 12-14 jours.

- L’inoculation. dans le coussinet plantaire de la souris montre: - souris normale: multiplication limitée n'entraînant aucune lésion macroscopique. Permet l'étude de substances antibiotiques ou immunisantes. - souris thymectomisée et irradiée ou souris nue athymique: lèpre extensive avec lésions macroscopiques et multiplication des bacilles, comme dans la lèpre lépromateuse humaine.

- Multiplication chez le tatou: lépromes

6.3. - Diagnostic biologique

6.3.1. - Diagnostic direct

- Il repose sur le seul examen microscopique après coloration de Ziehl-Neelsen des produits prélevés. On recherche des bacilles acido-alcoolo-résistants dans:. les frottis ou les biopsies de lésions cutanées.. au niveau des muqueuses pituitaires (prélèvement par mouchage dans une feuille de plastique).

- On évalue la richesse en bacilles (index bactériologique) qui est plus ou moins importante selon la gravité de la maladie et l'uniformité de la coloration (index morphologique) témoin de la viabilité des bacilles.

- Impossibilité de cultiver ce germe in vitro.

6.3.2. - Diagnostic indirect

6.3.2.1. - Réaction de Mitsuda

- Etude de l'état immunitaire du malade par la réaction de Mitsuda ou intradermo-réaction à la (suspension de bacilles de la lèpre récoltés chez le tatou et tués par la chaleur). L'injection est faite par voie intradermique. Quand la réaction est positive, une petite infiltration chronique atteint son maximum en 3 à 5 semaines. Elle est positive dans la lèpre tuberculoïde et négative dans la lèpre lépromateuse. Cette réaction ne permet pas le diagnostic de la maladie, mais seulement le classement des formes cliniques de la maladie.

6.3.2.2. - Anticorps sériques

- Ils sont présents uniquement chez les patients atteints de lèpre lépromateuse. Leur recherche ne présente aucun intérêt diagnostique.

6.4. - Prophylaxie et thérapeutique

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- dépistage et traitement des sujets contagieux- vaccin associant BCG vivant et M. leprae tué par la chaleur en cours d'essai- antibiotiques actifs: - sulfones (diamino-diphenylsulfone)- thionamides- rifampicine (bactéricide mais onéreux)- clofazimine et fluoroquinolones.- Les difficultés principales de la lutte anti-lépreuse résident dans le dépistage précoce de la maladie avant que les lésions nerveuses ne soient définitives et dans la prise régulière et prolongée (6 mois à 2 ans) de 2 à 3 antibiotiques en fonction de la forme clinique de la lèpre.

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CHAPITRE 16

Spirochètes

1. - Généralités

- Les spirochètes sont des bactéries de forme hélicoïdale, flexibles et mobiles grâce à des fibrilles internes. Les spirochètes comportent trois genres auxquels appartiennent des espèces pathogènes pour l’homme: - le genre Treponema qui comprend les agents de la syphilis, du bejel, du pian et de la pinta ;- le genre Borrelia au sein duquel sont rassemblés les agents des fièvres récurrentes et de la borréliose de Lyme ;- le genre Leptospira qui comprend les agents responsables de leptospiroses.

2. - Treponema

2.1. - Treponema pallidum

2.1.1. - Habitat

T. pallidum, ou tréponème pâle, est l’agent de maladies strictement humaines: la syphilis à transmission directe au cours des rapports sexuels et le bejel ou syphilis endémique à transmission non vénérienne. Bactéries très fragiles. Pas de porteurs sains.

2.1.2. - Morphologie

T. pallidum est une bactérie très fine, hélicoïdale, formée de 6 à 12 spires serrées, régulières. Sa mobilité est caractéristique: rotation du corps bactérien et flexion sinusoïdale. T. pallidum ne se colore pas par la technique de Gram: son observation à l’état vivant est réalisée par examen au microscope équipé d’un fond noir.

2.1.3. - Caractères culturaux

T. pallidum n’a pas encore pu être cultivé in vitro, en milieu acellulaire. Quelques souches sont régulièrement entretenues dans le testicule de lapin; les suspensions de tréponèmes, ainsi obtenues, peuvent demeurer mobiles et pathogènes pendant près de 72 heures dans le milieu de survie de Nelson.

2.1.4. - Structure antigénique

Elle est très complexe et encore mal connue.- L’haptène lipidique de Wassermann (ou cardiolipide) est l’antigène le plus anciennement identifié. Il est également présent dans le tissu cardiaque des mammifères.- Les peptides ou glycopeptides de l’enveloppe externe sont les antigènes les plus spécifiques des tréponèmes pathogènes.

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- D’autres antigènes protéiques (spécifiques de groupe) sont communs aux tréponèmes pathogènes et à des tréponèmes non pathogènes.

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2.1.5. - Pouvoir pathogène naturel

2.1.5.1. - La syphilis de l’adulte

. Incubation en moyenne de 3 semaines. Au point d’inoculation, le plus souvent génital, apparaît une ulcération à base indurée mais indolore, le chancre. Il est accompagné d’une adénopathie satellite indolore et non suppurative, habituellement inguinale. Cette période de syphilis primaire dure 4 à 8 semaines. Le chancre guérit spontanément avec ou sans cicatrice.. Une phase secondaire de dissémination septicémique suit immédiatement. Manifestations cutanées et muqueuses très polymorphes et contagieuses (roséole, syphilis érosives ou papuleuses, plaques muqueuses génitales, anales, buccales, tâches pigmentées, alopécie en clairière, etc) accompagnées d’adénopathies et d’un état infectieux discret. Tous les organes peuvent être atteints. Ces manifestations surviennent par vagues successives, précoces puis tardives; elles peuvent s’étaler sur plusieurs mois (1 à 2 ans) et régressent spontanément.. Suit une phase de syphilis latente ou sérologique, asymptomatique. La sérologie fait le diagnostic. Cet état dure indéfiniment chez la majorité des patients.. Certains malades vont présenter, 2 à 20 ans après le contage, des complications tardives, graves de syphilis viscérale. C’est la syphilis tertiaire (rare dans les pays industrialisés). Les manifestations sont cardiovasculaires (aortite, anévrismes), neurologiques (paralysie générale, tabes), cutanées et osseuses (gommes).

2.1.5.2. - La syphilis congénitale

La syphilis peut être transmise de la mère à l’enfant, à partir du 4e mois de la grossesse jusqu’à l’accouchement. En milieu de grossesse, l’infection peut provoquer la mort du foetus par atteinte polyviscérale. L’infection, en fin de grossesse, peut provoquer les manifestations de la syphilis acquise (dentaires, osseux, oculaires...).

2.1.6. - Physiopathologie

Le chancre apparaît après multiplication des tréponèmes au point d’inoculation. Très rapidement les tréponèmes se disséminent par voie lymphatique (adénopathie satellite) et sanguine. La guérison spontanée du chancre résulte de la réponse immunitaire locale.La syphilis secondaire correspond à une septicémie. Les réponses immunitaires générales font disparaître toutes les manifestations en 1 à 2 ans.Au stade de la syphilis latente, il est probable que quelques tréponèmes demeurent à l’état quiescent, à l’intérieur de cellules, entretenant la synthèse d’anticorps.Les lésions vasculaires de syphilis tertiaire, destructives et sclérosantes, sont très pauvres en tréponèmes et relèvent de l’immunité à médiation cellulaire.

2.1.7. - Immunité

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La syphilis détermine, après guérison spontanée, une immunité très partielle, transitoire, et une hypersensibilité retardée persistante. Le traitement de la syphilis à un stade précoce aboutit à une guérison rapide.

2.1.8. - Epidémiologie

Les résultats des dépistages sérologiques indiquent que de nombreux cas sont méconnus au stade de début, le plus contagieux. La transmission est presque exclusivement sexuelle: les chancres génitaux et anaux représentent 99 % des cas de syphilis primaire. La seconde localisation est buccale. Il importe de diagnostiquer et de traiter précocement les lésions primo-secondaires très contagieuses. L’interruption de la chaîne de transmission implique le contrôle des partenaires.

2.1.9. - Diagnostic biologique

2.1.9.1. - Diagnostic direct

. Le diagnostic de la syphilis doit être envisagé en présence de toute ulcération ou érosion génitale, ou anale quel que soit son aspect, tout particulièrement chez les homosexuels et les adolescents.. La recherche directe des tréponèmes se fait uniquement dans la sérosité prélevée sur les lésions primaires et secondaires.. Les prélèvements se font au niveau du chancre syphilitique, plus exceptionnellement par ponction du ganglion lymphatique associé (lors de la phase primaire) et au niveau des plaques muqueuses à la phase secondaire. Nettoyer le chancre à l’eau stérile et prélever à l’aide d’un vaccinostyle ou d’une pipette Pasteur la sérosité de seconde venue. La mélanger sur une lame à une goutte de sérum physiologique et l’examiner immédiatement au microscope à fond noir.. Examen à l’état frais au microscope à fond noir: les tréponèmes apparaissent mobiles à spires régulières et réfringentes. Il est possible également de procéder à une recherche par immunofluorescence. La PCR est en cours d’étude.. La recherche microscopique des tréponèmes peut être perturbée par un traitement antibiotique ou par la présence de tréponèmes commensaux; aussi sera-t-elle systématiquement complétée par une étude sérologique.

2.1.9.2. - Diagnostic indirect: sérologie de la syphilis

Les anticorps antitréponémiques apparaissent dans le sérum au cours de la phase primaire, en moyenne 10 à 20 jours après l’apparition du chancre, soit 20 à 40 jours après la contamination. Deux groupes de réactions sérologiques sont utilisées: les réactions à antigènes cardiolipidiques et les réactions à antigènes tréponémiques.

2.1.9.2.1. - Réaction avec l’antigène cardiolipidique.

L’anticorps anticardiolipide (ou réagine) n’apparaît qu’au cours des infections produites par les tréponèmes pathogènes. La réaction d’agglutination du VDRL (Venereal Disease

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Research Laboratory) est le test le plus utilisé. Elle est rapide, facile à faire et possède une sensibilité et une spécificité satisfaisantes,quoique parfois en défaut. Fausses réactions observées au cours du lupus érythémateux disséminé, paludisme..

2.1.9.2.2. - Réactions avec antigènes tréponémiques.

Plus spécifiques et plus sensibles que les réactions à antigènes cardiolipidiques. Trois méthodes sont utilisées:. TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay): réaction d’hémagglutination passive avec un lysat de T. pallidum fixé sur des globules rouges.. FTA (Fluorescent Treponemal Antibody): réaction d’immunofluorescence indirecte à l’aide d’une suspension de T. pallidum fixée sur lame.. TPI (Treponema pallidum Immobilisation): Test de Nelson (test de référence). Les tréponèmes vivants sont immobilisés par les IgG de sujets atteints de tréponématoses. Il ne permet pas de distinguer les diverses tréponématoses. La prescription de ce test doit être limitée à des indications très précises.Recherche des IgM spécifiques: techniques dérivées du TPHA ou du FTA.

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2.1.9.2.3. - Evolution des anticorps

- La réaction du FTA se positive la première (8ème jour) suivie du TPHA (12ème jour) et du VDRL (18ème-20ème jour). La positivité de la réaction de Nelson apparaît la dernière, au début de la période secondaire (en moyenne deux mois après le contage). Les IgM peuvent être mises en évidence au cours de toute la durée des périodes primaires et secondaires.- En l’absence de traitement, le taux des anticorps commence à diminuer lentement et progressivement après 6 à 24 mois d’évolution. Le VDRL peut se négativer complètement. Les autres réactions restent positives à des taux bas.- Après traitement, une négativation de toutes les réactions est possible. Le VDRL se négative en premier (intérêt de ce test pour la surveillance des traitements). En cas de traitement très précoce, avant un mois, le test de Nelson peut ne pas se positiver.- Les rechutes ou les recontaminations se traduisent par une ascension accélérée du taux des anticorps, accompagnée de la réapparition d’IgM spécifiques.- Syphilis nerveuse: les anticorps peuvent être recherchés dans le liquide céphalo-rachidien (taux plus faible que dans le sérum).- Sérologie du nouveau-né: la présence d’anticorps du type IgM signe l’atteinte de l’enfant car les IgM ne franchissent pas le placenta.- Sérologie chez un sidéen : la syphilis secondaire peut être séronégative ou s’accompagne d’une réponse faible et retardée.

En résumé: le diagnostic biologique de la syphilis doit toujours comporter:- la recherche de tréponèmes sur les lésions muqueuses aux stades primaires et secondaires;- la recherche des anticorps sériques: les laboratoires sont légalement obligés de faire une réaction à antigène cardiolipidique et une réaction à antigène tréponémique; la majorité des laboratoires pratiquent les sérologies du VDRL et du TPHA.

- Les quatre situations suivantes sont possibles :1 - VDRL - et TPHA - : syphilis exclue, sauf cas de contamination très récente. On peut alors demander un FTA, ou refaire une sérologie dix à quinze jours plus tard ;2 - VDRL + et TPHA + : syphilis probable. Sérologie quantitative et anamnèse permettront de situer le stade de l’infection.- si IgM+ et TPI - : syphilis primaire ;- si IgM + et TPI + : syphilis secondaire ;- si IgM - et TPI + : syphilis latente ;3 - VDRL - et TPHA + : syphilis récente traitée ou syphilis ancienne traitée ou non traitée. Sérologie quantitative, anamnèse et éventuellement les autres réactions sérologiques indiqueront s’il faut ou non traiter le malade ;4 - VDRL + et TPHA - : les fausses réactions positives en VDRL existent et il faut confirmer le TPHA négatif par les autres réactions sérologiques. Si ces réactions sont négatives, c’est qu’il s’agissait d’une fausse réaction positive en VDRL.

2.1.10. - Mesures de prophylaxie

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Elles reposent sur le dépistage systématique (examens sérologiques prénuptiaux, prénataux, etc.) et le traitement précoce des sujets porteurs de lésions contagieuses. Penser à l’association possible de syphilis avec la blennorragie et le chancre mou. Rechercher les sujets contaminateurs.

2.1.11. - Thérapeutique

La pénicilline G est l’antibiotique de choix. Son efficacité est démontrée par la disparition des tréponèmes des lésions contagieuses en 24 à 48 heures, l’effacement des lésions cutanées, muqueuses en 8 à 15 jours, la négativation des réactions sérologiques cardiolipidiques (VDRL). Son incidence sur les syphilis latentes est mise en évidence par la raréfaction des manifestations viscérales tardives, la sérologie n’étant que peu ou pas modifiée.En cas d’allergie à la pénicilline, les cyclines, ou l’érythromycine sont utilisées.

3. - Agents des autres tréponèmatoses

A côté de la syphilis, transmise sexuellement, rencontrée partout à travers le monde, il existe d’autres infections tréponémiques localisées à certaines régions chaudes du globe.

1 - La syphilis endémique (bejel), due à T. pallidum, à transmission non vénérienne, provoque des lésions cutanées dans le bassin méditerranéen et les zones d’Afrique sèches et désertiques.

2 - Le pian, dû à Treponema pertenue, observé dans les régions tropicales et humides, est la plus fréquente des tréponématoses. Les lésions primaires, rencontrées souvent chez les enfants au niveau des chevilles, sont ulcéreuses puis végétantes. Les lésions secondaires, parfois récurrentes, atteignent la peau et les os. Pas d’atteinte viscérale profonde, ni de transmission de la mère à l’enfant. Le pian confère une certaine immunité vis-à-vis de la syphilis vénérienne (réactions sérologiques croisées). Il est très sensible à l’action de la pénicilline G.

3 - La pinta ou carate, due à Treponema carateum (Amérique Centrale et du Sud) se manifeste par une lésion primaire papuleuse suivie de la formation de tâches d’abord pigmentées puis dépigmentées avec hyperkératose plantaire. Les atteintes viscérales sont exceptionnelles.

Ni l’étude morphologique des germes, ni la sérologie ne permettent de faire la différence entre les diverses tréponématoses et la syphilis.

4. - Borrelia

La borréliose de Lyme, découverte en 1975 est connue depuis 1909, date à laquelle un médecin suédois décrivit la manifestation principale de cette affection, l’Erythema chronicum migrans (ECM). La responsabilité des morsures de tiques a été soupçonnée. C’est seulement en 1982 que Burgdorfer a isolé de certains tiques le spirochète responsable, Borrelia burdorferi.

4.1. - Habitat

Il est essentiellement animal (mammifères, oiseaux, arthropodes).

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4.2. - Morphologie et culture

Examiné au microscope à fond noir, B. burgdorferi est un spirochète de 4 à 30 microns de long, flexible, très mobile, avec des mouvements de translation et de rotation.Germe exigeant, microaérophile, sa culture est possible mais difficile entre 34 et 37°, sur des milieux complexes utilisés pour la culture des tissus. Le germe pousse lentement en 4 à 6 jours, parfois plus tardivement en 2 à 3 semaines.

4.3. - Physiopathologie

Rappelle celle de la syphilis avec trois phases classiques. La phase primaire, localisée au point d’inoculation, est révélée par l’érythème chronique migrant (ECM): lésion inconstante qui guérit spontanément. La phase secondaire est septicémique: l’isolement du germe est possible dans le sang et le LCR; elle guérit également. Plus redoutable, la phase tertiaire survient des mois ou même des années après la contamination, et comporte des signes articulaires, nerveux ou cardiovasculaires; le germe peut être isolé de toutes ces localisations.Il semble que la persistance du germe dans l’organisme puisse être extrêmement prolongée, que la transmission foeto-maternelle soit possible et que le sang présente un risque de contamination (transfusions).

4.4. - Pouvoir pathogène

- La phase primaire est marquée par l’ECM (lésion maculopapuleuse érythémateuse). Elle débute de 3 à 30 jours après la contamination, s’étend de façon centrifuge, et guérit spontanément en quelques semaines. Elle siège le plus souvent au tronc, à l’aine ou aux creux poplité. Cette éruption n’est retrouvée que dans 50 % des cas.- La phase secondaire apparaît quelques semaines à quelques mois plus tard. Diverses manifestations y sont présentes, isolées ou associées: manifestations cutanées, neuro-méningées, articulaires et atteinte cardiaque- La phase tertiaire survient des mois ou des années après le début. Rappelle cliniquement la phase secondaire. Les manifestations sont plus graves: rhumatisme chronique invalidant, tableau de démence progressive. Certaines localisations tardives peuvent entraîner la mort.

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4.5. - Epidémiologie

L’existence de la borréliose de Lyme est reconnue dans le monde entier. Elle est répandue dans la plupart des pays d’Europe. En France elle est présente dans tous les départements surtout méditerranéens ou agricoles. La maladie est possible à tout âge, même chez l’enfant. Elle sévit surtout entre mai et octobre.Le réservoir de germes comporte de nombreuses espèces de mammifères et d’oiseaux, sauvages et domestiques. Les vecteurs sont essentiellement les tiques mais le germe a été trouvé chez d’autres arthropodes (puces).

4.6. - Diagnostic biologique

4.6.1. - Diagnostic direct

La culture du spirochète à partir des malades et de leurs lésions est possible mais difficile. Le germe a pu être isolé dans les lésions cutanées, le sang, le LCR et le liquide articulaire.

4.6.2. - Diagnostic indirect

Diagnostic sérologique par immunofluorescence indirecte. Un taux d’anticorps supérieur à 1/256 est considéré significatif. Positif une fois sur deux seulement à la phase primaire, il est pratiquement toujours positif aux deux phases suivantes. Réactions croisées avec Treponema, Leptospira et les autres Borrelia.

4.7. - Thérapeutique

Aminopénicilline (ampicilline, amoxicilline...) ou cycline (minocycline, doxycycline...). Le résultat du traitement est souvent spectaculaire, aux deux premières phases ; mais à la phase tertiaire, arthropathies et signes nerveux régressent beaucoup plus lentement.

5. - Autres borrelia

Responsables des borrélioses ou fièvres récurrentes, infections transmises par des arthropodes hématophages. En fonction de l’arthopode vecteur, on distingue deux groupes:. Borrelia transmise par le pou (B. recurrentis) ;. Borrelia transmise par les tiques (B. duttonii, B. hispanica, B. persica...).Le diagnostic biologique est difficile. Recherche des Borrelia à l’examen microscopique du sang et du LCR, et par inoculation à l’animal sensible (souriceau nouveau-né). Aucun test sérologique sûr. Les cyclines sont les antibiotiques de choix.

6. - Leptospira

Très répandus dans la nature, les lepstospires sont des bactéries qui peuvent infecter de nombreuses espèces animales (zoonoses) et déterminer accidentellement chez l’homme des infections plus ou moins sévères, dont la plus grave est la leptospirose ictéro-hémorragique.

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Deux espèces de leptospires: Leptospira interrogans, pathogène pour l’homme et les animaux, et Leptospira biflexa, espèce saprophyte.

6.1. - Habitat

Le réservoir naturel est constitué par les rongeurs (rats) et les animaux domestiques (chien, cheval, porc, bovins). Ces bactéries survivent longtemps hors des organismes animaux dans le sol, les eaux, les boues.

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6.2. - Morphologie

Les leptospires sont des bactéries spiralées, très fines et flexueuses, terminées en crochets à leurs extrémités, animées de mouvement d’hélice ou de vrille, très mobiles. Ils se colorent mal et doivent être examinés au microscope à fond noir.

6.3. - Caractères culturaux

La culture est lente (plusieurs jours à quelques semaines) et nécessite des milieux spéciaux: milieu de Reiter et Rame, incubés à 30°.

6.4. - Structure antigénique

Complexe: antigènes majeurs (23 sérogroupes) et antigènes mineurs (130 sérovars). Des communautés antigéniques provoquent des réactions croisées entre de nombreux sérotypes. Une dizaine de sérovars sont rencontrés chez l’homme: L. icterohaemorrhagiae, canicola, grippotyphosa, pomona...

6.5. - Pouvoir pathogène naturel

L’infection humaine la plus typique et la plus sévère est l’ictère infectieux à recrudescence fébrile, avec signes d’atteinte rénale et méningée, dû le plus souvent en France à L. interrogans serovar icterohaemorrhagiae (75 % des cas).A partir d’une porte d’entrée située au niveau de la peau ou des muqueuses, (les leptospires sont capables de traverser la peau ou les muqueuses saines), les leptospires se disséminent par voie sanguine. L’incubation dure une dizaine de jours, puis la maladie débute brutalement par la fièvre, des frissons, un syndrome méningé. Au 5ème jour, apparaît un ictère très intense qui dure une dizaine de jours, tandis que la fièvre baisse. Les signes rénaux s’accentuent. Puis les symptômes régressent et la température redevient normale. Vers le 15ème jour, survient une rechute fébrile qui dure environ 5 jours. L’évolution, habituellement favorable, comporte généralement une longue convalescence; dans de rares cas, l’hépatonéphrite s’aggrave, aboutissant à la mort.A côté de cette forme majeure ( 5 % des cas), il existe de nombreuses formes anictériques, fébriles, pseudo grippales, parfois accompagnées de signes méningés.

6.6. - Pouvoir pathogène expérimental

Au laboratoire, le cobaye jeune est l’animal le plus sensible au sérovar ictero-haemorrhagiae. L’inoculation, par voie intra-péritonéale ou sous cutanée, provoque une hyperthermie avec ictère et mort de l’animal. Les autres sérovars pathogènes pour l’homme provoquent chez le cobaye une infection beaucoup moins franche.

6.7. - Immunité

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La leptospirose confère une immunité solide et durable, spécifique du sérogroupe auquel appartient la bactérie causale, associée à la présence d’anticorps sériques.

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6.8. - Epidémiologie

Les animaux infectés éliminent abondamment les bactéries dans leurs urines et leurs selles et contaminent le milieu extérieur (rivières, marais, égouts). La transmission à l’homme peut être directe, par manipulation d’animaux infectés, ou indirecte, par les eaux souillées. Les leptospiroses sont souvent des maladies professionnelles (Žgoutiers). Le camping au bord de l’eau, les baignades et la pêche en rivière ou en étang, sont à l’origine des cas sporadiques observés en août ou septembre.

6.9. - Diagnostic biologique

Le diagnostic biologique des leptospiroses est important en raison de la fréquence des formes cliniquement peu caractéristiques, évoquant par exemple, une infection grippale, une méningite lymphocytaire (le LCR est clair) ou une hépatite virale.

6.9.1. - Diagnostic direct

- Au cours de la phase aiguë fébrile (12 premiers jours), rechercher les bactéries dans le sang et le LCR. Plusieurs hémocultures spéciales (le signaler au laboratoire) sont nécessaires car la présence des leptospires est intermittente. Le sang doit être recueilli sur anticoagulant (oxalate de sodium). Il est pratiqué :. une recherche des leptospires au microscope à fond noir (LCR). La réponse est rarement positive ;. une mise en culture sur des milieux spéciaux à 30°C (milieu de Reiter et Ramme) examinés régulièrement au microscope à fond noir après le 6ème jour, jusqu’à 2 mois. Les cultures se positivent entre le 5ème et le 15ème jour d’incubation; en cas d’isolement l’identification est faite par réaction d’agglutination-lyse. . une inoculation au cobaye éventuellement.- A la période d’apyrexie (5ème, 12ème jour), les chances d’isoler les leptospires du sang et du LCR sont réduites.- Du 15ème au 25ème jour, les leptospires sont éliminés, dans les urines où ils sont recherchés soit par examen microscopique (fond noir), soit par culture (peu de résultats positifs),.

6.9.2. - Diagnostic indirect

Les sérovars étant nombreux, la recherche d’anticorps ne peut être entreprise d’emblée vis-à-vis de chacun d’eux. Le sérodiagnostic est réalisé par une réaction d’agglutination de dépistage à l’aide d’un antigène spécifique de groupe. S’il est positif, il faut recourir à la réaction d’agglutination-lyse de Martin et Pettit qui met en évidence les anticorps spécifiques des principaux sérovars pathogènes (laboratoire spécialisé).Le sérodiagnostic commence à se positiver à partir du 6ème jour de la maladie. Au stade tardif un nouvel examen sérologique a toutes chances de révéler un taux d’anticorps élevé. La sérologie est un examen important pour le diagnostic des leptospiroses.

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6.10. - Mesures de prophylaxie

. La prévention individuelle de la maladie professionnelle consiste à appliquer des mesures d’hygiène strictes sur les lieux du travail: port de bottes, de gants, etc. La lutte contre les rongeurs (dératisation), et la surveillance des plans d’eau (baignades) peuvent réduire les foyers sources de contamination humaine. Il existe un vaccin formolé, actif vis-à-vis du sérovar icterohaemorrhagiae, particulièrement destiné aux égoutiers et efficace.

6.11. - Thérapeutique

De nombreux antibiotiques (pénicillines G, tétracyclines, chloramphénicol, macrolides), sont actifs in vitro sur les leptospires, mais l’antibiothérapie n’est efficace que si le traitement est institué précocement, avant la constitution des lésions hépatiques et rénales.

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CHAPITRE 17

Chlamydia

Les Chlamydia sont de petites bactéries qui ne peuvent se développer qu’à l’intérieur du cytoplasme d’une cellule hôte. Elles présentent un cycle complexe de multiplication:

- l’élément virulent appelé corps élémentaire résiste aux conditions extérieures mais ne se divise jamais. Il pénètre par phagocytose à l’intérieur de la cellule hôte. Son acide désoxyribonucléique est condensé en position paracentrale.

- à l’intérieur de la vacuole de phagocytose il se transforme en un élément plus grand dont l’ADN est réticulé d’où le nom de corps réticulé. C’est lui qui assure la multiplication du germe. Il se forme ainsi une inclusion intracytoplasmique dont la composition d’abord faite uniquement de corps réticulés va se diversifier par transformation des corps réticulés en corps élémentaires.

- l’inclusion occupe une partie importante du cytoplasme et va entraîner l’éclatement de la cellule (36 à 72 heures après l’infection) avec libération de corps réticulés qui mourront et de corps élémentaires capables de pénétrer à l’intérieur d’autres cellules et d’amorcer un nouveau cycle de développement.

Cette multiplication intracellulaire obligatoire a pour conséquence:- physiopathologique: importance des phénomènes d’hypersensibilité de type retardé,- diagnostique: nécessité d’utiliser des cultures cellulaires pour cultiver les Chlamydia,- thérapeutique: obligation d’utiliser des antibiotiques pénétrant à l’intérieur des cellules.

Le genre Chlamydia comprend trois espèces pathogènes pour l’homme :- C. trachomatis,- C. psittaci - C. pneumoniae.

L’étude de la structure antigénique permet de distinguer :- un antigène de genre glycolipidique et thermostable, commun aux trois espèces;- un antigène d’espèce, protéine thermolabile, différent selon les espèces;- un antigène de type, protéine thermolabile, caractérisant des sérovars.

1. - Chlamydia trachomatis

1.1. - Habitat

Le réservoir du germe est l’homme. Infection par contact direct soit lors de maladies transmises sexuellement soit par les mains, les linges sales ou les bains en piscine lors d’atteintes conjonctivales.

1.2. - Pouvoir pathogène naturel

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1.2.1. - Maladies sexuellement transmissiblesElles sont d’importance croissante par leur nombre et leurs complications: stérilité, grossesse extra-utérine.- Chez l’homme, la manifestation première est une urétrite mucopurulente, traînante pouvant se compliquer d’épididymite.- Chez la femme, la cervicite passe souvent inaperçue et peut se compliquer de salpingite aiguë clinique ou silencieuse pouvant entraîner stérilité et grossesse extra-utérine.- Le nouveau-né peut se contaminer au passage de la filière génitale et présente quelques jours après la naissance une conjonctivite généralement bénigne puis plus tard une pneumopathie interstitielle.- C. trachomatis est incriminée dans l’étiologie du syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter (arthrite + conjonctivite + urétrite).

1.2.2. - TrachomeLa conjonctivite trachomateuse évolue en 4 stades: 1er stade: conjonctivite folliculaire avec surinfection bactérienne fréquente; 2e stade: conjonctivite granulaire; 3e stade: complications mécaniques par cicatrices, ulcérations et surinfections; 4e stade: guérison avec sclérose de la conjonctivite palpébrale, ulcère cornéen et cécité.La maladie, endémique dans les zones inter-tropicales, touche environ 500 millions de personnes.

1.2.3. - La maladie de Nicolas et Favre : lymphogranulome vénérien ou 4e maladie vénérienneMaladie rare en France, strictement humaine. Contamination lors des rapports sexuels. L’incubation dure de 10 à 15 jours. On observe d’abord un micro-chancre sur le gland, dans le vagin ou à l’anus. Puis, apparaît une polyadénopathie inguinale qui se fistulise donnant un abcès en pomme d’arrosoir. Des localisations extra-génitales peuvent survenir ensuite: anorectales, lymphatiques, neurologiques, articulaires ou oculaires.

1.3. - Diagnostic biologique

1.3.1. - Diagnostic direct

Il est souhaitable que les prélèvements soient effectués au laboratoire car la bactérie est fragile. Les prélèvements doivent être riches en cellules épithéliales car elles renferment les Chlamydia (écouvillon spécial en alginate ou brosse).- Chez l’homme, le prélèvement doit être endo-urétral, à l’aide d’un écouvillon enfoncé de 3 à 4 cm dans l’urètre.- Chez la femme, le prélèvement est réalisé au niveau de l’endocol; les cellules vaginales ne sont pas réceptrices à C. trachomatis.- Pour les prélèvements conjonctivaux, il faut éliminer les exsudats purulents puis passer l’écouvillon avec fermeté sur les conjonctives.. Chez le nouveau-né atteint de pneumopathie, on effectue un prélèvement rhino-pharyngé postérieur ou une aspiration des sécrétions broncho-pulmonaires.Pour la mise en culture, les écouvillons doivent être placés dans un milieu de transport spécial conservé à +4°C.

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1.3.1.1. - Culture

Elle nécessite des cellules McCoy ou HeLa 229. Les inclusions caractéristiques sont recherchées en immunofluorescence après 48 heures d’incubation. Technique délicate réalisée dans des laboratoires spécialisés.

1.3.1.2. - Techniques de diagnostic rapide

- L’immunofluorescence directe révèle spécifiquement la présence des corps élémentaires sur les frottis (lecture délicate, laboratoires spécialisés).- Les méthodes Elisa peuvent manquer de sensibilité et de spécificité.Ces méthodes ne permettent pas de connaître la viabilité des corps ce qui constitue un inconvénient pour juger de l’efficacité d’une antibiothérapie.

1.3.1.3. - Techniques de biologie moléculaire

La PCR est de plus en plus appliquée au diagnostic des infections génitales à C. trachomatis. Nécessité de placer les écouvillons dans des milieux de transport spécifiques. Cette technique peut également être utilisée directement sur les urines dans le cadre du diagnostic de chlamydioses génitales.

1.3.2. - Diagnostic indirect

La réaction de micro-immunofluorescence est la méthode de choix pour mettre en évidence les anticorps et permettre un diagnostic d’espèce. Elle permet la recherche des IgM spécifiques. La techniques Elisa utilise l’antigène de genre mais présente l’avantage d’être automatisable.

1.3.3. - Conduite du diagnostic biologique selon les manifestations cliniques

- Lorsqu’il s’agit d’une infection de surface (urètre, endocol, conjonctivite) l’affirmation de l’étiologie chlamydienne repose essentiellement sur la mise en évidence du germe.- Lorsqu’il s’agit d’une infection profonde (épididymite, salpingite, périhépatite, pneumopathie), un taux élevé d’anticorps anti-Chlamydia est très évocateur d’une infection avec ce germe (titre > 64 en immunofluorescence).

1.4. - Thérapeutique

Cyclines, macrolides ou fluoroquinolones.

2. - Chlamydia psittacci

2.1. - Habitat

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Le seul réservoir de germes est l’animal : oiseaux d’agrément (perruches, perroquets) et domestiques (pigeons, poules, dindes), mammifères (ovins, mais aussi vaches et chats). Ces animaux, notamment les oiseaux, peuvent contaminer l’homme.

2.2. - Pouvoir pathogène naturel

Le germe introduit par voie respiratoire se multiplie au niveau du poumon et passe dans la circulation sanguine pouvant entraîner des manifestations à distance à type d’endocardite. L’incubation est de 2 à 3 semaines. La maladie appelée psittacose ou ornithose, affecte diverses formes dont le degré de gravité varie de la forme sévère de pneumopathie atypique à celle discrète d’infection pseudo-grippale ; il existe également des infections inapparentes.Les femmes enceintes en contact avec des brebis infectées peuvent présenter des avortements avec présence de Chlamydia dans le placenta.

2.3. - Diagnostic biologique

2.3.1. - Diagnostic direct

La culture sur cellules, à partir des produits d’expectoration, se heurte à de nombreuses difficultés. La recherche par PCR commence à être appliquée.

2.3.2. - Diagnostic indirect

La sérologie révèle la présence d’anticorps dans le sérum des malades et des convalescents. On utilise la réaction de fixation du complément ayant une spécificité de genre (taux significatif 64) ou la réaction de micro-immunofluorescence qui permet de préciser l’espèce en cause.

2.4. - Prophylaxie

La prophylaxie relève des services vétérinaires qui dépistent les chlamydioses aviaires, décident la suppression des élevages ou l’importation des perroquets et perruches.

2.5. - Thérapeutique

Cyclines, macrolides et fluoroquinolones.

3. - Chlamydia pneumoniae

3.1. - Pouvoir pathogène naturel

Pneumonies atypiques, bronchites, sinusites et pharyngites. La différence essentielle avec C. psittaci est l’absence de réservoir animal : la transmission est exclusivement interhumaine.

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3.2. - Diagnostic biologique

3.2.1. - Diagnostic direct

- Le germe peut être recherché à partir d’écouvillonnage pharyngé en immunofluorescence directe sur frottis à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique. La culture sur cellules HL ou Hela est lente et difficile.- La recherche par PCR est en cours d’évaluation.

3.2.2. - Diagnostic indirect

- Recherche des anticorps spécifiques par la microtechnique en immunofluorescence. Les anticorps apparaissent au bout de trois semaines lors d’une primo-infection. Un titre > 512 en IgG est évocateur d’infection et/ou de réinfection (tenir compte des réactions croisées et des conditions épidémiologiques). Son intérêt est cependant discuté.

3.3. Thérapeutique

Cyclines, macrolides et fluoroquinolones.

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CHAPITRE 18

Mycoplasma

Les mycoplasmes sont des bactéries dépourvues de paroi, ce qui explique leur polymorphisme et leur insensibilité totale aux béta-lactamines. Ils ont une grande affinité pour les muqueuses. De nombreuses espèces existent à l’état commensal. Seules quelques espèces appartenant aux genres Mycoplasma et Ureaplasma ont un pouvoir pathogène certain:

- Mycoplasma pneumoniae, mycoplasme respiratoire dont le pouvoir pathogène est le plus important- Ureaplasma urealyticum, mycoplasme génital.- Mycoplasma hominis, mycoplasme génital.

D’autres espèces de découverte récente ont un pouvoir pathogène mal défini:

- Mycoplasma genitalium(tractus génital et prélèvements respiratoires).- Mycoplasma fermentans et Mycoplasma penetrans (patients atteints de SIDA).

1. - Mycoplasma pneumoniae

1.1. - Morphologie et caractères culturaux

- Bactérie polymorphe avec une extrémité effilée. Peu colorable, elle est difficile à observer en microscopie optique.- Elle cultive difficilement, en 5 à 21 jours, sur des milieux complexes. Les colonies ont un aspect en « oeuf sur le plat ». Identification par ses caractères biochimiques et l’inhibition de sa croissance en présence d’anticorps spécifiques.

1.2. - Structure antigénique

M. pneumoniae possède un antigène glycolipidique utilisé dans la réaction de fixation du complément, qui n’est pas absolument spécifique, et des antigènes protéiques (adhésine). Il existe un seul sérotype.

1.3. - Pouvoir pathogène naturel

- infections respiratoires fréquentes, bénignes ( trachéobronchites).- la pneumonie atypique primitive du sujet jeune qui se traduit par un tableau clinique polymorphe, une symptomatologie respiratoire discrète contrastant avec des anomalies radiologiques souvent marquées. L’évolution est bénigne.- manifestations ORL, cutanées, hématologiques, neurologiques, cardiaques, pancréati-ques. Son rôle est beaucoup moins bien connu dans ces cas.

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1.4. - Physiopathologie

- Il pénètre par voie aérienne, se fixe sur les cellules épithéliales des voies respiratoires par son adhésine, puis produit des péroxydes qui vont stopper le mouvement ciliaire et léser les cellules. L’infection reste superficielle, le mycoplasme n’envahit pas les tissus, mais s’accompagne de l’apparition d’infiltrats lymphoplasmocytaires péribronchiques (anomalies radiologiques).

1.5. - Epidémiologie

- L’infection sévit à l’état endémique, plus fréquente en automne et en hiver, avec de petites poussées épidémiques tous les 4 ou 5 ans. Elle atteint surtout les sujets jeunes (maximum de fréquence vers 10 ans) et n’est pas très contagieuse. Son incidence exacte est difficile à apprécier en raison de la bénignité habituelle de la maladie et de la très grande fréquence des formes inapparentes.- Les infections à M. pneumoniae entraînent une immunité protectrice partielle liée surtout à la présence d’anticorps spécifiques dans les sécrétions respiratoires.

1.6. - Diagnostic biologique

1.6.1. - Diagnostic direct

- isolement difficile et rarement pratiqué (bactérie fragile à croissance lente).- les expectorations ne constituent pas un bon prélèvement pour cette recherche.- utiliser des prélèvements dirigés (brossage endobronchique, lavage broncho-alvéolaire).- la technique PCR a été appliquée aux Mycoplasma. Des sondes nucléiques, en cours de commercialisation, permettront peut-être un diagnostic direct rapide dans l’avenir.

1.6.2. - Diagnostic indirect

- essentiel pour le diagnostic: réaction de fixation du complément: -infection récente: augmentation significative du taux d’anticorps à deux prélèvements sucessifs-si examen unique: titre 1/64 (diagnostic présomptif)- mise en évidence d’agglutinines froides inconstante et non spécifique- réactions croisées au cours d’affections neurologiques ou pancréatiques.- autres réactions sérologiques (Elisa), agglutination de particules de latex sensibilisées. Certaines permettent de séparer IgM et IgG pour dater une infection.

1.7. -Traitement

- Tétracyclines ou macrolides. Toutes les souches sont sensibles aux tétracyclines et aux fluoroquinolones. La résistance à l’érythromycine est exceptionnelle.

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2. - Mycoplasmes génitaux

Deux mycoplasmes sont responsables d’infections génitales: Mycoplasma hominis et surtout Ureaplasma urealyticum (mycoplasme possédant une uréase). Leur rôle est moins bien connu que celui de M. pneumoniae.

2.1. - Pouvoir pathogène naturel

La présence potentielle de ces deux espèces à l’état commensal chez l’individu sain rend difficile l’appréciation de leur pouvoir pathogène.U. urealyticum est responsable d’environ 15 % des cas d’urétrites non gonococciques. Il ne joue pas de rôle évident dans les infections gynécologiques survenant hors de la grossesse. Son rôle dans la survenue de stérilités, d’avortements spontanés, d’hypotrophies néonatales est aléatoire.M. hominis est responsable d’infections gynécologiques (abcès de la glande de Bartholin, salpingites). Souvent retrouvé dans les vaginites non spécifiques, sa responsabilité est mal définie.Les 2 espèces provoquent des infections au cours de la grossesse, chorioamniotites, endométrites, épisodes septicémiques avec poussées fébriles survenant après accouchement ou avortement. Elles peuvent provoquer des infections néonatales (pneumopathies, septicémies, méningites) survenant chez des nouveau-nés très hypotrophiques.Ces deux mycoplasmes peuvent plus rarement provoquer des atteintes extragénitales (infections de plaies post-opératoires, arthrites purulentes).

2.2. - Diagnostic direct

- La culture sur milieux riches est facile et rapide (18 à 48 heures). Le prélèvement doit être placé dans un milieu de transport spécial.- L’identification se fait sur l’aspect des colonies et sur les caractères biochimiques.- Les mycoplasmes génitaux étant des commensaux des voies génitales basses, il apparaît difficile d’affirmer leur responsabilité dans une infection. Une appréciation quantitative est indispensable. Pour U. urealyticum, le seuil de positivité retenu au cours d’uréthrites est de 104 unités formant colonies (UFC) /ml dans les prélèvements urétraux ou le 1er jet d’urines, - L’isolement a par contre une valeur significative s’il est fait à partir de prélèvements normalement stériles (hémocultures, prélèvements tubaires).- pas de diagnostic sérologique.

2.3. - Traitement

- Cyclines et macrolides sont les antibiotiques de choix. Cependant, 5 % des souches d’U. urealyticum et quelques souches de M. hominis résistent aux tétracyclines.- M. hominis a une sensibilité dissociée aux macrolides (résistance à l’érythromycine, sensibilité aux nouveaux macrolides).

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- Certaines fluoroquinolones peuvent représenter une alternative intéressante pour les souches résistantes.

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CHAPITRE 19

Résistance des bactéries aux antibiotiques

1. Définitions

- Spectre d’activité d’un antibiotique : espèces bactériennes sensibles dont la croissance peut être inhibée par des concentrations de cet antibiotique atteintes in vivo au site de l’infection après une utilisation de posologies usuelles.

- résistance naturelle : une espèce non sensible naturellement à un antibiotique donné. Il s’agit d’un caractère d’espèce commun à toutes les souches de cette même espèce. Les caractères de résistance naturelle sont portés par des gènes chromosomiques dont les produits entraînent une diminution de la pénétration, une production d’enzyme d’inactivation ou une absence de cible de l’antibiotique.

- résistance acquise : elle concerne un pourcentage variable de souches d’une même espèce bactérienne habituellement sensible. Cette résistance acquise varie, pour un antibiotique donné, dans le temps et en fonction du milieu environnant (hospitalier ou communautaire). Un germe responsable d’une infection est dit résistant à un antibiotique quand le traitement usuel par cet antibiotique aboutit à un échec thérapeutique. Cette définition clinique doit être complétée par une définition bactériologique ; une bactérie résiste à un antibiotique quand elle peut croître en présence d’une concentration plus élevée de cet antibiotique que la concentration tolérée par les autres souches sensibles de la même espèce. Le support génétique de la résistance acquise est chromosomique ou plasmidique.

2. - Mécanismes de la résistance

2.1. - Mécanismes biochimiques

2.1.1. - Productions enzymatiques. enzymes modifiant la cible de l’antibiotique (ex. : méthylation, de l’ARNr des macrolides). enzymes modifiant l’antibiotique (-lactamases des -lactamines)

2.1.2. - Diminution de perméabilité membranaire. perméabilité plus ou moins diminuée empêchant le passage transmembranaire de l’antibiotique. il peut s’agir d’une modification des lipopolysaccharides de paroi ou d’une modification qualitative ou quantitative des porines.. concerne les bacilles à Gram négatif

exceptionnellement, il a été décrit des mécanismes d’expulsion active des antibiotiques (tétracyclines, chloramphenicol).

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2.1.3. - Modification de la cible de l’antibiotique. variable en fonction de la nature de la cible.- modifications qualitatives ou quantitatives des PLP (protéines liant les pénicillines). Les

modifications de ces protéines membranaires entraînent une perte d’affinité des -lactamines pour leurs cibles. Ce mécanisme touche essentiellement les bactéries à Gram positif. Cette résistance est souvent croisée entre -lactamines

. altération de la protéine cible ribosomale ; ex. : diminution de l’affinité de la streptomycine chez les staphylocoques,. altération de l’ADN-gyrase ; résistance aux quinolones. méthylation de l’ARN ribosomal entraîne une diminution de l’affinité des macrolides pour le ribosome. Ce mécanisme est fréquent, responsable d’une résistance croisée entre macrolides, streptogramines et lincosamides.

3. - Supports génétiques de la résistance

Le support génétique de cette résistance est bien évidemment situé sur l’ADN. Il peut s’agir de mutations chromosomiques ou d’acquisition de gènes.

3.1 - Mutations chromosomiques. une mutation entraîne une modification de l’expression qualitative et/ou quantitative (mutation sur un gène de régulation) d’une protéine (enzyme, protéines de transport transmembranaire, cible de l’antibiotique).. comme toute mutation, phénomène :- rare (10-7 - 10-9)- spontané ; non induit par l’antibiotique- discontinu : obéit à la loi du tout ou rien- stable ; le caractère muté devient héréditaire- spécifique ; n’affecte qu’un caractère sauf si ce caractère intéresse plusieurs familles d’antibiotiques : ex. : résistance croisée aux tétracyclines et aminosides chez certains bacilles à Gram négatif.- indépendant ; une mutation ne frappe qu’un caractère sans affecter les autres et la probabilité est très faible pour que deux mutations frappent deux caractères simultanément.

en raison des caractères de ces mutations, les bactéries résistantes préexistent au sein d’une population sensible en l’absence de tout traitement.

Le risque d’apparition de ces mutants peut être diminué par l’association de deux antibiotiques de familles différentes ; ex. : association de rifampicine et d’isoniazide dans le traitement de la tuberculose.

3.2. - Acquisition de gènes

3.2.1. - Plasmides. ADN, bicaténaire, circulaire de réplication autonome

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. transfert de gènes de résistance par transformation ou conjugaison

. co-résistance à plusieurs familles d’antibiotiques

. 80-90 % de résistances acquises

. décrits chez toutes les espèces bactériennes ; possibilité de transfert d’un même plasmide de résistance à des bactéries phylogénétiquement proches.

3.2.2. - Transposons- structure d’ADN mobile qui peut s’insérer d’un réplicon à un autre réplicon (chromosome ou plasmide).- comme les plasmides, possibilité de transfert de co-résistance à plusieurs familles d’antibiotiques différentes.- les transposons peuvent « fixer » des gènes de résistance d’un plasmide sur un chromosome et alors être transmis héréditairement sans risque de perte plasmidique.

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4. - Résistance par famille d’antibiotique

4.1. - Résistance aux -lactamines

4. 1. 1. - Résistance naturelle

4.1.1.1. - Imperméabilité

Bacilles à Gram négatif : résistance à la pénicilline G et M (oxacilline, cloxacilline)

4.1.1.2. - Faible affinité des PLP. Résistance d’Enterococcus faecium et E. faecalis aux pénicillines G, M et aux

céphalosporines de première génération.. insensibilité de Listeria sp aux céphalosporines.

4.1.1.3. - -lactamases- Pénicillinases. hydrolysant amino et uréïdopénicillines. inhibée par l’acide clavulanique. gène chromosomique. synthèse constitutive (à taux constant) et non inductible. Klebsiella sp, Citrobacter diversus, Yersinia sp.,. Bacteroides, Legionella,- Céphalosporinases. hydrolysent les aminopénicillines, la céfalotine et les céphamycines. non inhibées par l’acide clavulanique. gène chromosomique. synthèse inductible. présent chez Enterobacter sp, Citrobacter freundii, Morganella, Providencia, Serratia, Proteus vulgaris, Pseudomonas sp, Acinetobacter sp.

4.1.2. - Résistance acquise

4.1.2.1. - Diminution de perméabilité . possible chez toute bactérie à Gram négatif

4.1.2.2. - Modification du PLP. fréquente chez bactérie à Gram positif, plus rare chez bactérie à Gram négatif- résistance à la méticilline chez Staphylococcus sp- résistance à la pénicilline chez S. pneumoniae.

4.1.2.3. - -lactamases- hyperproduction d’une -lactamase naturellement produite par dérépression de l’expression du gène de la céphalosporinase de Enterobacter, Serratia, Pseudomonas

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- acquisition de gènes de -lactamase en position chromosomique ou plasmidique (notamment pénicillinases).

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4.2. - Résistance aux aminosides

4.2.1. - NaturellePar imperméabilité chez les bactéries anaérobies strictes, strepotocoques et entérocoques.

4.2.2. - Acquise. modification par mutation chromosomique de la protéine cible ribosomale. .

résistance à la streptomycine chez Staphylococcus sp.. diminution de la perméabilité membranaire ; ex. : P. aeruginosa, E. coli.. synthèse d’enzymes, support plasmidique. trois types d’inactivation : phosphorylation, acétylation, adénylation ; résistance croisée à un ou plusieurs aminosides ; ex. :

entérobactéries.

4.3. - Résistance aux quinolones

4.3.1. - Naturelle. absence d’inhibition de la cible, l’ADN gyrase.. résistance aux quinolones de première génération : cocci à Gram (+). résistance aux quinolones de deuxième génération : bactéries anaérobies strictes, entérocoques, Listeria.

4.3.2. - Acquise. altération de l’ADN gyrase. diminution de perméabilité

4.4 - Résistance aux macrolides

4.4.1. - Naturelle

. imperméabilité : tous les bacilles à Gram négatif, sauf Legionella, Campylobacter, Haemophilus sp. modification de la cible chez E. faecalis ; résistance aux lincosamines et auxstreptogramines A.

4.4.2. - Acquise

. méthylation de l’ARN ribosomal.

4.5. - Autres antibiotiques

. mutations chromosomiques dans des gènes dont les produits sont la cible habituelle de l’antibiotique ;- rifampicine- a. fusidique- polymyxines- nitrofuranes

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- sulfamides et triméthoprime ; diminution de perméabilité et/ou modification de la cible.. chloramphénicol : acétylase inactivant la molécule ; support souvent plasmidique.

5. - Principaux phénotypes de résistance et aspects épidémiologiques

5.1 -Staphylococcus aureus- phénotype sauvage : sensibilité aux -lactamines (sauf aztreonam), aux aminosides, macrolides, tétracyclines, rifampicine, fluoroquinolones, glycopeptides.- phénotype pénicillinase : 90 % des souches : synthèse d’une pénicillinase entraînant une résistance à l’amoxicilline mais sensibilité à l’oxacilline et à l’association amoxicilline + a. clavulanique.

- phénotype résistant à la méticilline : 40 % des souches hospitalières : modification d’une PLP entraînant une inactivité de toutes les -lactamines. Résistance croisée (mécanisme non relié génétiquement) avec les aminosides et les fluoroquinolones.

pas de résistance aux glycopeptides ; diminution de la sensibilité de quelques souches.

5.2. - Entérobactéries

5.2.1. - -lactamines

5.2.1.1. - Phénotypes sauvages

Résistance par imperméabilité aux pénicillines G et M. Quatre groupes d’entérobactéries ;

phénotypes définis au minimum à partir de 5 antibiotiques : amoxicilline (AMX),

amoxicilline + a. clavulanique (AMC), ticarcilline (TIC), cefalotine (CEF), céfotaxime

(CTX)

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AMX AMC TIC CEF CTX Mécanisme Fréquence

Groupe 1E. coliP. mirabilis S S S S S - 50 %Salmonella 69 %Shigella -

Groupe 2-

KlebsiellaCitrobacter diversus

R S R I S pénicillinasechromosomique

70 %

Groupe 3 EnterobacterSerratiaCitrobacterfreundii

R R S R S céphalosporinase bas niveauchromosomique

70 %50 %

Proteus vulgarisMorganella

Groupe 4YersiniaEnterocolitica

R R R R I/R pénicillinase+ céphalosporinase chromosomique

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5.2.1.2. - Phénotypes de résistance

A partir des résistances naturelles peuvent se surajouter différents mécanismes par synthèse de -lactamases « acquises » :

AMX AMC TIC CEF CTX Fréquence

Pénicillinase plasmidique

R S R I/R S 43 % chez E. coli30 % chez P. mirabilis20 % chez K. pneumoniaeRares dans espèces du groupe 3

Pénicillinase résistante aux inhibiteurs

R R R S S 5 % chez E. coli,nouveauté des année 90

-lactamases (pénicillinases à spectre élargi, plasmidiques

R I/R R R R 10 % chez K. pneumoniaenosocomiaux ;résistance souvent associée à une résistance aux aminosides Problème hospitalier.

Hyperproduction de céphalosporinases

R R R R R Espèces des groupes 3 et 4

Résistance par imperméabilité touche toutes les -lactamines (sauf imipénème). Résistance à l’imipénème reste exceptionnelle chez les entérobactéries.

5.2.2. - Autres antibiotiques

- Aminosides : . sensibilité naturelle aux aminosides de type kanamycine, tobramycine, amikacine, gentamicine, sisomicine, netilmicine, 95 % P. mirabilis ; 80 % E. coli. résistance acquise par des mécanismes enzymatiques essentiellement.- Quinolones :. sensibilité naturelle. résistance acquise 5-15 % chez E. coli, K. pneumoniae et E. cloacae. Co-résistance aux aminosides et -lactamase à spectre élargi chez K. pneumoniae (même plasmide) ; mécanisme relié épidémiologiquement uniquement.

5.3. - P. aeruginosa

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--lactamines

. phénotype sauvage : - résistance aux pénicillines G et M par imperméabilité- présence d’une céphalosporinase chromosomique (cf groupe 3)

70 % des souches

. résistance acquise : pénicillinase plasmidique (cf entérobactérie) cephalosporinase déréprimée (cf entérobactérie) (10 % des souches) imperméabilité membranaire : possibilité de résistance isolée à l’imipénème : 18 % des souches hospitalières

- autres antibiotiques. aminosides : résistance naturelle à la kanamycine : 60 % des souches, résistance acquise par

production variable d’enzymes. quinolones : résistance naturelle aux quinolones de première génération résistance acquise aux fluoroquinolones : 30 % des souches (imperméabilité et/ou

modification de gyrase). Résistance naturelle aux macrolides et glycopeptides par imperméabilité

5.4. - Streptocoques et entérocoques

. S. pneumoniae- résistance naturelle aux fluoroquinolones de bas niveau- résistance acquise à la pénicilline : 20 % des souches, plus ou moins croisée avec lesautres lactamines et corésistance fréquente avec macrolides ; modification de PLP.

. Entérocoques- résistance naturelle aux céphalosporines ; résistance acquise aux autres -lactamines rarement par production de pénicillinases, plus souvent par modification de PLP.- résistance naturelle de bas niveau aux aminosides (imperméabilité) ; résistance acquise enzymatique : 15 % des souches (insensibilité de l’association -lactamines + aminosides).- résistance naturelle de E. faecalis aux lincosamides- exceptionnelles souches résistantes aux glycopeptides (support plasmidique)

. Streptocoques A et B- résistance acquise aux macrolides et tétracyclines.- quelques rares souches avec une diminution de sensibilité aux -lactamines.

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CHAPITRE 20

Les infections nosocomiales bactériennes

Les infections nosocomiales sont des infections bactériennes, parasitaires ou virales acquises à l'hôpital. En termes d'incidence économique, les infections bactériennes sont les plus importantes.Ces infections nosocomiales évoluent souvent selon un mode épidémique. L'augmentation du nombre de ces épidémies est due en grande partie à:- une concentration importante de malades à haut risque infectieux du fait des procédures invasives ou de traitements immunosuppresseurs,- la présence de patients et d'un personnel soignant infectés ou colonisés susceptibles de disséminer des micro-organismes,- l'utilisation massive d'antibiotiques qui sélectionnent les micro-organismes les plus résistants.

1. - Les principales espèces responsables des infections bactériennes acquises à l'hôpital en fonction des sites infectieux

1.1. - Sang

Staphylocoques à coagulase nég. 28%Staphylocoques dorés 16%Entérocoques 8 %E. coli 5%

1.2. - Plaie chirurgicale

Staphylocoque doré 17%Entérocoques 13%Staphylocoques à coag. nég. 12%E. coli 9%Enterobacter sp. -

1.3. - Tractus respiratoire (soins intensifs)

P. aeruginosa 20%Staphylocoque doré 17%Enterobacter sp. 11%Acinetobacter sp. 6%K. pneumoniae 5 %

1.4 - Arbre urinaire

E. coli 33 %

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Entérocoques 8 %

P. aeruginosa 13 %K. pneumoniae 7 %Proteus sp. 10 %

Parmi les autres germes décrits, on note Legionella sp., , X. maltophilia, Alcaligenes denetrificans, Corynebacterium groupe JK..., Acinetobacter sp. Mycobacterium chelonei, M. fortuitum et M. tuberculosis. La recrudescence des cas d'infections tuberculeuses liés à l'épidémie de SIDA peut faire craindre l'apparition d'épidémies hospitalières au sein de malades non immunodéprimés.

Les réservoirs habituels des bactéries des infections nosocomiales sont;- l'écosystème du malade: tube digestif et peau++- le matériel et les produits contaminésLe mode de transmission de ces infections est très souvent les mains du personnel soignant.

2. - Résistance des bactéries entraînant les infections nosocomiales

Deux tendances:- la sélection de bactéries naturellement très résistantes aux antibiotiques- la sélection d'espèces naturellement sensibles mais ayant acquis, à l'hôpital, un haut degré de résistance.

2.1. - Les bactéries naturellement résistantes

Les espèces pathogènes strictes, pathogènes spécifiques responsables d'infections bien particulières (ex. gonocoque, méningocoque) ont tendance à être naturellement plus sensibles aux antibiotiques que les espèces commensales dont le réservoir principal est l'homme (ex; staphylocoque doré) qui sont responsables d'infections opportunistes acquises en ville ou à l'hôpital. Ces espèces commensales ont elles-mêmes tendance cependant à être naturellement plus sensibles que les espèces dites saprophytes (dont le réservoir est l'environnement) qui sont responsables d'infections opportunistes acquises essentiellement à l'hôpital. Parmi les espèces saprophytes, on retiendra; Pseudomonas sp., Enterobacter sp., Serratia sp., Acinetobacter sp., Bacillus sp., S. maltophilia, Alcaligenes sp., Mycobacterium chelonei, M. fortuitum, Flavobacterium sp. et Bacillus sp.

Parmi ces bactéries, les bacilles à Gram négatif sont souvent résistants à la plupart des -lactamines et des aminosides.

2.2 - Les espèces naturellement sensibles mais ayant acquis un haut degré de résistance aux antibiotiques

Il existe une grande variété de souches résistantes aux antibiotiques et isolées en milieu hospitalier. Parmi celles- ci, on note :

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- Staphylocoques:Résistance à la méticilline, de support chromosomique, croisée avec toutes les -

lactamines et statistiquement liée à la résistance aux quinolones et aux aminosides. En moyenne, ces souches représentent 40% des isolats de ces espèces en milieu hospitalier en France alors que l'incidence de cette résistance est beaucoup plus faible dans les pays nordiques et anglo-saxons.

- Entérocoques

Résistance aux glycopeptides dont le support est plasmidique. Elle est surtout rencontrée chez E. faecium mais n’est présente actuellement que dans 0.5% des souches. Ces souches se trouvent essentiellement chez les malades neutropéniques (Hématologie et Oncologie ++)

- Entérobactéries

Le support des résistances acquises est surtout plasmidiques. Parmi les problèmes actuels on relève une résistance accrue aux -lactamines;

- Pénicillinase plasmidique- -Lactamase à spectre élargi qui entraîne une résistance à toutes les -lactamines sauf les

céphamycines, le moxalactam et l'imipénème. La détection de ces souches et la lutte contre ces infections est l'une des priorités de l'AP-HP. Le plus souvent il s'agit de K. pneumoniae. Le réservoir est urinaire et digestif. Les plasmides porteurs des gènes de ces -lactamases diffusent facilement d'une entérobactérie à une autre. On peut assister à des épidémies de souches mais aussi de plasmides. Le danger lié à la diffusion de ces souches tient également à la résistance aux aminosides dont les gènes sont souvent associés sur le même plasmide et à la résistance aux fluoroquinolones associés statistiquement (mutation chromosomique).

- Dérépression de la synthèse de céphalosporinase pour les espèces qui possèdent naturellement une céphalosporinase chromosomique; Enterobacter sp., Serratia sp., C. freundii et Morganella morganii. Ce mécanisme entraîne une résistance à toutes les -lactamines sauf à l'imipénème.

- P. aeruginosa

En milieu hospitalier, les souches produisent souvent des quantités importantes de céphalosporinases et sont également parfois résistantes à l'imipénème (par imperméabilité).

3. - Les moyens de détection d'une épidémie d'infections nosocomiales

L'isolement de souches appartenant à une même espèce bactérienne pose le problème de leur identité.

3.1. - Les marqueurs classiques

Ces marqueurs sont essentiellement des marqueurs phénotypiques- biotype- antibiotype

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- lysotype- sérotype, voir la production de toxines

Ces marqueurs sont actuellement utilisés de 1 ère intention pour faire un premier tri. Ils ont un pouvoir discriminant faible. Une même souche peut avoir une variation dans l'expression phénotypique de ces marqueurs. Dans le cas de la lysotypie et de la sérotypie, ces techniques nécessitent que le laboratoire possède une batterie de phages ou d'anticorps dont le coût est élevé.

3.2. - Les marqueurs plus récents

- le profil électrophorètique de protéines Les protéines totales, de membrane externe ou des isoenzymes sont extraites des souches à comparer et révélées après migration électrophorètique. Ces techniques sont discriminantes mais difficile à mettre en oeuvre dans un laboratoire non spécialisé.- les marqueurs génotypiquesIls sont basés sur l'analyse de la nature des acides nucléiques• profil plasmidiqueAprès leur extraction, les plasmides sont digérés ou non par des enzymes de restriction. L'identité d'isolement d'un plasmide au sein de deux souches n'indique pas l'identité de ces deux souches. Il peut s'agir d'une épidémie de plasmides. Cette méthode permet également de rechercher un gène particulier après hybridation avec une sonde spécifique.• ADN total- L'isolement de l'ADN de la bactérie est suivi de sa coupure par des enzymes de restriction. Les profils de bandes d'ADN obtenus après migration électrophorètique sont analysés directement ou après fragmentation en champ pulsé. Cette méthode est discriminative mais difficile à mettre en oeuvre.- On peut également réaliser sur cet ADN total, des études de ribotypage. Cette méthode est basée sur le fait que le génome de toutes les bactéries comporte des séquences identiques codant pour l'ARN ribosomal et que ces séquences sont présentes en un nombre de copies de quelques unités à quelques dizaines réparties en divers lieux du génome. Cette méthode est intéressante pour différencier des espèces très proches.- Amplification au hasard par PCRCette technique utilise des amorces de séquences d'ADN choisies au hasard. Ces amorces dont les séquences sont complémentaires à certaines parties de l'ADN bactérien s'hybrident en des positions données pour une bactérie donnée. Après hybridation, la PCR permet d'amplifier les fragments d'ADN qui séparent deux hybridations par amorce. On compare les bandes d'ADN obtenues après migration électrophorètique de des souches responsables d'un possible infection nosocomiale. Cette méthode est actuellement l'une des résolutives pour différencier deux souches.

4. - La lutte contre les infections nosocomiales Elle est l'une des priorité de l'AP-HP à cause de la mortalité et du coût induits. Cette lutte

passe par;- une identification clinique et microbiologique de l'infection et de la souche en cause,

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- une identification du mode de contamination-une amélioration des conditions d'hygiène et avant tout le lavage des mains de l'ensemble du personnel soignant- une durée d'hospitalisation courte, une limitation des gestes invasifs- une utilisation adaptée de l'antibiothérapie afin de diminuer la pression de sélection - l'isolement des malades infectés et la surveillance du portage des souches épidémiques et multirésistantes aux antibiotiques- une décontamination sélective d'efficacité discutée

L'ensemble de ces mesures ne peut être appliqué et être efficace que lorsqu'il existe une excellente collaboration entre cliniciens et microbiologistes notamment au sein des CLINs (Comité de Lutte contre les Infections Nosocomiales) mis en place dans chaque hôpital.

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CHAPITRE 21

Bactéries et situations cliniques particulières

1 - Méningites purulentes

. On distingue les méningites primitives (communautaires) des méningites secondaires (souvent nosocomiales)

1.1. - Méningites primitives

1.1.1. - Nouveau-né (0-1 mois)

. Streptocoque du groupe B

. Listeria monocytogenes

. Streptococcus pneumoniae

. Entérobactéries

1.1.2. - Nourisson (1-12 mois)

. Streptococcus pneumoniae

. Neisseria meningitidis

. Streptocoque du groupe B

1.1.3. - Enfant

. Neisseria meningitidis

. Streptocoque du groupe B

1.1.4. - Adulte

. Streptococcus pneumoniae

. Neisseria meningitidis

. Listeria monocytogenes

1.1.5. - Fréquence

Incidence ; ++ nouveau-né

Streptocoque du groupe B : 125/100 000Listeria mnocytogenes 39/100 000Streptococcus pneumoniae : 16/100 000

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par rapport par exemple > 60 ans :

Streptococcus pneumoniae : 2/100 000Listeria monocytogenes : 0,6/100 000

1.1.6. - Tendance épidémiologique

- disparition de H. influenzae ; vaccin- Streptococcus pneumoniae : résistance à la pénicilline G mais vaccin récent.- N. meningitidis ; bouffées épidémiques ; augmentation lente et graduelle des niveaux de résistance à la pénicilline G ; pas de vaccin contre méningo B

- L. monocytogenes ; cas isolés plus qu'épidémies réelles.

1.2 - Méningites secondaires :

- après intervention chirurgicale, traumatisme crânien (communication entre espace méningé et la sphère ORL, malformation neuro-méningée).

- germes les plus fréquents : . Staphylocoques ; coagulase (+) et (-), souvent résistants à la méthicilline. Pseudomonas spp., entérobactérie. Acinetobacter spp., corynebactéries.

fréquence des multirésistances aux antibiotiques de ces germes nosocomiaux.

2 - Méningites bactériennes à liquide clair

. M. tuberculosis

. plus rarement méningite à pyogènes décapité ; méningite à Brucella spp. ou à L. monocytogenes

3 - Endocardites

Etude nationale 1999 Nombre %

Streptococcaceae 225 58Streptocoques oraux 68 17Streptocoques du groupe D 98 25Streptococcus bovis (n=96)non précisé (n=2)Streptocoques pyogènes 22 6Enterococci 29 7

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Autres Streptococcaceae 8 2

Staphylococcaceae 115 29Staphylococcus aureus 90 23Staphylocoques à coagulase négative 25 6Autres micro-organismes 18 5 2 micro-organises 13 3Pas de micro-organisme identifié 19 5

4 - Infections ostéo-articulaires

4.1. - Arthrites bactériennes

Staphylocoques : 61 %Streptocoques : 18 %Bacilles à Gram (-) : 10 %

4.2. - Spondylodiscites

Staphylocoques : 42 %Brucella sp. : 16 %E. coli : 15 %

4.3. - Ostéites et ostéomyélites chroniques

Staphylocoques : 58 %Entérobactéries : 11 %P. aeruginosa : 6.5 %M. tuberculosis : 3 %Polymicrobienne : 20 %

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