Développement de marqueurs spécifiques de ... - Anses€¦ · A-M. Pourcher 1, E. Jardé 2, M-P....

Développement de marqueurs spécifiques de contamination fécale :

• Anne-Marie Pourcher

Développement de marqueurs spécifiques de contamination fécale : application aux profils de baignade

A-M. Pourcher1, E. Jardé 2, M-P. Caprais3, A. Jaffrezic4, N. Wery5,

Projet "Traceurs de contamination fécale "

6 laboratoiresA-M. Pourcher1, E. Jardé 2, M-P. Caprais3, A. Jaffrezic4, N. Wery5, A. Jadas-Hécart6, P-Y. Communal6, R. Marti1, S. Mieszkin3, M. Derrien2, O. Solecki1, L. Jeanneau2, M. Gourmelon3

1 Cemagref - Rennes

2 CNRS Géosciences - Rennes

3 Ifremer - Plouzané3 Ifremer - Plouzané

4 INRA Agrocampus – Rennes

5 INRA LBE – Narbonne

6 Université – LEESA- Angers

effluents et boues issus des stations d'épuration

rejets des habitations non connectées aux réseaux

Source : Cemagrefbiodiversite.wallonie.be/.../pointnoir.htm

déjections d’animauxd’élevages

Source :INRA

Contamination ponctuelle ou diffuse

Directive européenne 2006/7/CE sur la qualité des eaux de baignade Elaboration de profils de baignade (mise en œuvre : mars 2011) �� identifier les sources de pollutions fécales susceptibles de contaminer les zones de baignade.


effluents et boues issus des stations d'épuration

rejets des habitations non connectées aux réseaux

Source : Cemagrefbiodiversite.wallonie.be/.../pointnoir.htm

déjections d’animauxd’élevages

Source :INRA


Directive européenne 2006/7/CE sur la qualité des eaux de baignade Elaboration de profils de baignade (mise en œuvre : mars 2011) �� identifier les sources de pollutions fécales susceptibles de contaminer les zones de baignade.


Quelles méthodes pour identifier l’origine de la pollution (humaine / animale) ?

www.charente.pref.gouv.fr

☺☺☺☺☺☺☺☺

2 indicateurs de contamination fécale

�� méthodes normalisées de détection de pollution fécale

☺☺☺☺☺☺☺☺ origine fécale

E. coli Entérocoques intestinaux

www.ebiologie.fr/upload/Gallery/e_coli-dk.jpg www.cst.cmich.edu/users/alm1ew/enterococci.jpg

�� impossible de différencier humain/ animal

Depuis ≈ 10 ans � méthodes “Faecal source tracking”

Regroupent des méthodes biologiques et chimiques pour identifier les principales sources de contamination fécale dans les eaux de surface

Source : INRAwww.memoclic.com/.../1139-vaches/441-vache.html

ian.umces.edu/imagelibrary

Depuis ≈ 10 ans � méthodes “Faecal source tracking”

Regroupent des méthodes biologiques et chimiques pour identifier les principales sources de contamination fécale dans les eaux de surface

Objectifs du projet “Traces” :

Source : INRAwww.memoclic.com/.../1139-vaches/441-vache.html

ian.umces.edu/imagelibrary

Objectifs du projet “Traces” :

Développer et valider des outils existants et de nouveaux outils analytiques fondés sur l’identification de marqueurs permettant de déterminer l’origine humaine ou animale de la pollution fécale

Différents outils � microbiologiques :

- séquences d’ADN bactérien : flore dominante du tube digestif

microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bifidobacter...

- Phages F-RNA spécifiqueswww.scienceclarified.com/As-Bi/Bacteria.html

� microbiologiques :



Différents outils

� chimiques :

- molécules spécifiques des effluents urbains


caféine




Différents outils

� chimiques : � chimiques :



caféine

- empreintes moléculaires des stérols et stanolsCoprostanol

24-ethylcoprostanol

Cop

rost

anol

Epi

-Cop

rost

anol

Cop

rost

anon

e

Cho

lest

erol

Cho

lest

anol

Eth

yl-C

opro

stan

olC

ampe

stan

ol

Sito

stan

olS

itost

erol

Exemples de profils de stérols et de stanols

Lisier de porc

Source : INRA

Fumier de bovin

www.memoclic.com/.../1139-vaches/441-vache.html

Sito

ster

olS

itost

anol

Cho

lest

erol

Cho

lest

anol

Cam

pest

anol

Cam

pest

erol

R1 (%) : coprostanol

(coprostanol+24-ethylcoprostanol)

R2 : sitostanolcoprostanol

2 ratios de stéroides :




Différents outils

� chimiques : � chimiques :



caféine

- caractérisation de la matière organique

- empreintes moléculaires des stérols et stanolsCoprostanol

24-ethylcoprostanol

typical fluorescence EEM425

Exc

itatio

n W

avel

engt

h

La matrice EEM est divisée en 2 régions fluorescentes

Caractérisation de la matière organique

300 500Emission Wavelength (nm)

250

Fulvic matterMostly from natural organic matterTryptophan- intensity

Humic-like mostly from natural organic matter

Exc

itatio

n W

avel

engt

h (n

m)

régions fluorescentes (biochimique et géochimique) elles mêmes subdivisées en différentes zones

2 ratios :

biochimique/géochimique : bio-géo

Geochemical Fluorescence Index : GFI

Marqueurs bactériens et viraux

hôte marqueurs publications

Pig-2-Bac

(Bacteroidales)Mieszkin et al., 2009

(Bacteroidales)Lactobacillus amylovorus Marti et al., 2010



Pig-2-Bac



Rum-2-Bac




Pig-2-Bac



Rum-2-Bac


HF183 (Bacteroidales)

Bifidobacterium adolescentis

Seurinck et al., 2005

Gourmelon et al., 2010Bifidobacterium adolescentis

bactériophages F-RNA spécifiques (groupes II et III)

Gourmelon et al., 2010

Gourmelon et al., 2010


Marqueurs chimiques

Ratios de stanols R1 et R2 Jardé et al., 2007

Ratios de stanols R1 et R2 Jardé et al., 2007Ratios de stanols R1 et R2 Jardé et al., 2007


Marqueurs chimiques

Ratios de fluorescence bio-géo et GFI Bilal et al., 2010



Marqueurs chimiques



Caféine, benzophénoneTCEP tri(2-chloroethyl)phosphate) Gourmelon et al., 2010

33 échantillons4 effluents de stations d’épuration

3 eaux de ruissellement après épandage de fumier de bovin

23 eaux de rivières

3 eaux de ruissellement après épandage de lisier de porc

Materiel et méthodes








2 zones de baignade (eau douce et eau de mer)7 points en amont des deux zones de baignade







3 marqueurs chimiques

14 marqueurs

2 zones de baignade (eau douce et eau de mer)7 points en amont des deux zones de baignade

3 marqueurs chimiques

2 ratios de fluorescence

2 ratios de stanols

2 groupes de phages F-RNA

5 marqueurs bactériens

Analyse des Correspondances Multiples

Classification Ascendante Hiérarchique

WW4

WW3

WW1

WW2

P3

P2 P11

1,5

Eaux contaminées

Application des outils à 33 échantillons d’eaux

WW3

R5

R1

R15

R12 R6 R8

R20

R19R16

R11

R18R17

R14R13

C3C2

C1

B3

B2

B1

-0,5

0

0,5

F2

(23,

40 %

)

Eaux contaminées par du lisier de porc

Eaux usées urbainesEaux contaminées par des déjections bovines

??

R3

R4R2

R9

R7 R10

-1-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5

F1 (46,22 %)

Analyse des correspondances multiples

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6Sim

ilarit

é

R19

R16

R15

R20

R14

R13

R11

R18

R17C1

B3

B2

C3

C2

B1

P2

P1

P3

R6

R8

R7

R10R9

R4

R2

R3

R5

R1

WW

3

WW

2

WW

1

WW

4

R12

0,6

0,7

0,8

0,9

Sim

ilarit

é

R1< 50E. coli >1000 E. coli >1000

bio geo > 0,17

R12

WW

4

WW

1

WW

2

WW

3

R1

R5

R3

R2

R4

R9

R10 R

7

R8

R6

P3

P1

P2

B1

C2

C3

B2

B3

C1

R17

R18

R11

R13

R14

R20

R15

R16

R19

E. coli >1000/ 100 mL

R1 > 60 R1< 50R2 > 1

Rum-2-Bac > 105B. adolescentis 104 à 105

bio geo > 0,17 GFI > 1,2

Pig-2-Bac > 105L. amylovorus >107

R1 > 60 bio geo > 0,17 et GFI < 0,9

B. adolescentis > 105

HF 183 >105Phages FRNA II et III

Caféine ≥≥≥≥ 0,3Benzophenone ≥≥≥≥ 0,2TCEP 0,08 à 0,5

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6Sim

ilarit

é

R19

R16

R15

R20

R14

R13

R11

R18

R17C1

B3

B2

C3

C2

B1

P2

P1

P3

R6

R8

R7

R10R9

R4

R2

R3

R5

R1

WW

3

WW

2

WW

1

WW

4

R12

0,6

0,7

0,8

0,9

Sim

ilarit

é

E. coli < 500 / 100 mLmarqueurs bactériens non détectés

caféine < 0,1 µg/L

?

R12

WW

4

WW

1

WW

2

WW

3

R1

R5

R3

R2

R4

R9

R10 R

7

R8

R6

P3

P1

P2

B1

C2

C3

B2

B3

C1

R17

R18

R11

R13

R14

R20

R15

R16

R19

marqueurs bactériens non détectéscaféine < 0,1 µg/L

ratios non spécifiques

Origine ?

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6Sim

ilarit

é

R19

R16

R15

R20

R14

R13

R11

R18

R17C1

B3

B2

C3

C2

B1

P2

P1

P3

R6

R8

R7

R10R9

R4

R2

R3

R5

R1

WW

3

WW

2

WW

1

WW

4

R12

0,6

0,7

0,8

0,9

Sim

ilarit

é

E. coli >1000

R1 < 50

?

R12

WW

4

WW

1

WW

2

WW

3

R1

R5

R3

R2

R4

R9

R10 R

7

R8

R6

P3

P1

P2

B1

C2

C3

B2

B3

C1

R17

R18

R11

R13

R14

R20

R15

R16

R19

R1 < 50Rum-2-Bac > 105

Caféine > 0,1Benzophenone > 0,1TCEP 0,05 à 0,1

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6Sim

ilarit

é

R19

R16

R15

R20

R14

R13

R11

R18

R17C1

B3

B2

C3

C2

B1

P2

P1

P3

R6

R8

R7

R10R9

R4

R2

R3

R5

R1

WW

3

WW

2

WW

1

WW

4

R12

0,6

0,7

0,8

0,9

Sim

ilarit

é

?

HF 183 104E. coli >1000

R12

WW

4

WW

1

WW

2

WW

3

R1

R5

R3

R2

R4

R9

R10 R

7

R8

R6

P3

P1

P2

B1

C2

C3

B2

B3

C1

R17

R18

R11

R13

R14

R20

R15

R16

R19

HF 183 104Rum-2-Bac >105

Phages II et III : 100%

Caféine 0,05 à 0,17+/-Benzophenone +/- TCEP

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6Sim

ilarit

é

R19

R16

R15

R20

R14

R13

R11

R18

R17C1

B3

B2

C3

C2

B1

P2

P1

P3

R6

R8

R7

R10R9

R4

R2

R3

R5

R1

WW

3

WW

2

WW

1

WW

4

R12

0,6

0,7

0,8

0,9

Sim

ilarit

é

E. coli > UFC 1000 / 100 mL E. coli < UFC 500 / 100 mL

?

R12

WW

4

WW

1

WW

2

WW

3

R1

R5

R3

R2

R4

R9

R10 R

7

R8

R6

P3

P1

P2

B1

C2

C3

B2

B3

C1

R17

R18

R11

R13

R14

R20

R15

R16

R19

E. coli > UFC 1000 / 100 mL E. coli < UFC 500 / 100 mL

marqueurs indiquent 1 ou plusieurs origines

Origine non déterminée

Directive (2006/7/EC) eaux de bonne qualité : 1000 E. coli / 100 mL en eau douce500 E. coli / 100 mL en eau de mer

Application des outils à deux zones de baignades

Zone de baignade

p 0

p 1p 2p 3

d 2

d 3t 1

d 5

e 1

d 3

e2

1 km

Zone de baignade p 1p 3

p4p 5p 6

p 7

Zone de baignade

5 km

em

Eau de mer : bassin versant du PenerfEau douce: le Loir

e2L1

rejet step

D2

rejet IAA*

1,9 103

Eau de mer : bassin versant du Penerf

rejet step

E. coli 100/ mL

E1D5

D4

D3D2

L13,2 103

E2

1,4 1051,4 103

6,1 103

8,4 102

1,9 10

5,9 102

Caractéristiques :zones de pâturages

épandages de lisiers de porc

rejet step

rejet IAA*

Em

L1

2 km

L1E1

D5

D4

0

0,5

1F2

(3,7

3 %

) ?E1

D5D4

D3D2

L1

2 km

E2

rejet step

Eau de mer : bassin versant du Penerf

E2

D3

D2

-1

-0,5

-1,5 -0,5 0,5 1,5 2,5F1 (92,76 %)

F2 (3

,73

%)

E. coli R1 R2 Bio/géo GFI caféine TCEPPhages humains HF183 B. ado L. amy Rum-2

D2

Origine supposée de la pollution:

humaine

bovine

porcine

2 km

D2 810 31 4,1 0,18 1,1 0,07 0,04 0 0 0 0 0D3 840 43 2,5 0,15 1,1 0,05 0 0 0 0 D 0D4 2,2 103 52 2,1 0,14 1,1 0,18 0 0 0 0 0 0D5 1,4 103 57 1,7 0,14 1,1 0,22 0 0 0 0 0 DE1 1,4 105 88 0,1 0,23 0,9 12,4 0,29 4,3 103 7,3 105 1,2 104 200 0E2 3,2 103 61 1,0 0,11 1,0 0,08 0,05 0 0 0 0 0L1 590 55 2,6 0,11 1,1 0 0 0 0 0 0 0

Conclusion (1/3)

Caractéristiques et limites de la boîte à outils


Très spécifiques, excepté B. adolescentis

Non détectés E. coli

Conclusion (2/3)

Présence simultanée de caféine, TCEP et /ou benzophénonetrès spécifique d’une pollution humaine

Marqueurs chimiques



Conclusion (2/3)


Marqueurs chimiques



Ratios des stanols et de fluorescence

Difficilement interprétables en cas de pollutions mixtes

Interprétables lorsque qu’une pollution est dominante(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)

Conclusion (2/3)


Marqueurs chimiques



Ratios des stanols et de fluorescence

Difficilement interprétables en cas de pollutions mixtes

Interprétables lorsque qu’une pollution est dominante(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)(ex: zone de pâturage intensif, rejet de station d’épuration)

Étude d’un bassin versant sur une année�� Continuer l’acquisition de données pour valider les marqueurs

Bacteroidales Pig-2-Bac Bacteroidales HF183,

Conclusion (3/3)

Caractérisation de 3 types de pollution à l’aide de la boîte à outils (E. coli> 1000 / 100 mL)

Bacteroidales Pig-2-Bac Lactobacillus amylovorus

Bio/géo>0.17 et GFI>1.2

Bacteroidales Rum-2-Bac

R11Bio/géo>0.17 et GFI>1.2

Bacteroidales HF183,Phages F-RNA II etIICaféine >0,1 TCEP, benzophenone

R1>65 % et R20.17 et GFI

Merci de votre attention

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