Chercheur de Métaphases au CHU de REIMS

Organisation du laboratoire de cytogénétique et génétique du CHU REIMS

Secteur constitutionnel , hématologique et fish (4,5 techniciennes)

En 2009: 600 caryo constit métaphasiques

/prométaphasiques 800 caryo hémato 1100 FISH hémato et constit

Secteur prénatal et tumeur (1,8 techniciennes)

En 2009 : 900 caryo

Secteur BM (1,5 techniciennes + 1 ingénieur « puce CGH array »)

Évolution des caryotypes en 5 ans

hématologie FISH constitutionnel

2004 500 720 690

2009 800 1100 600

évolution 60% 53% 15%

Equipement et imagerie

Un chercheur de métaphase + chargeur 80 lames

4 microscopes « captures manuelles » + logiciels d’analyse d’images Ikaros® et Isis®

2 microscopes lecture de FISH « captures manuelles »équipé d’une platine de relocalisation de mitose

Utilisation du Métafer®

Tous les caryo hémato bandes G et R

80% des lames de FISH (métaphasique et interphasique), sondes commerciales, bac.

Peu de caryo constitutionnels…

Station metafer® + chargeur 80 lames ( 2m10 en longueur x 80 cm en profondeur)

Temps de capture

Plateau de 8 lames en lumière blanche1) Recherche des mitoses obj x10 2) Choix des mitoses + autocapture à l’obj x603) Transfert des images

± 1h30 FISH métaphasique

De 10 min à 30 min / lame en fonction du nombre de mitoses voulu

FISH interphasique± 30 min / lame (pour une recherche min de 200 à 300 noyaux)

Entrées des dossiers

Paramètres de calibration et d’entraînements des lames

Création de programmes de recherches

Recherche obj x10 , détection des mitoses– Lames bandes G et R (classifiers hémato,

constit, LA ,etc…)

– Lames de FISH (dapi)

Autocapture obj x63 : relocalisation des mitoses– ≠ classifiers pour les mitoses très étalées (HRC)– Classifiers pour les différents types de

fluorochromes en FISH

Création de programmes de recherches

FISH interphasique (objx40)

– Types de cellules à détecter (lymphocytes , LCR ,cellules buccales )

– Sondes monolocus monocolore ou bicolore (break- appart)

– Sonde de fusion– Type de fluorochrome

Paramètres variant en FISH interphasique

Sensibilité (seuil de détection)Largeur des spots Limite d’espacement entre 2 spots d’une sonde bicolore (impliquant ou non une translocation ou une inversion)Nombre de champs à screenerPrise en compte ou non des noyaux avec 0 spot (double délétion)

MLL IGH

Clone 1

Clone 2

Clone 3

AVANTAGES

Moins de lecture au microscope et dégagement de temps souplesse d’organisation au microscope

Sensibilité et détection ++

Souplesse d’utilisation pour les confirmations de petits clones hématologiques ++

Possibilité de relocaliser facilement des mitoses Rendu plus rapide des caryo hémato « screenés » le jour même de la coloration

AVANTAGES

Utilisation du chargeur de lames la nuit notamment en FISH interphasique (30 min /lame)Choix de la zone de lecture notamment en FISH (plusieurs sondes sur une lame)Lecture « rapide » des M-FISHProgrammes adaptés aux ≠ sondes (sonde de fusion ,M-FISH , type de fluorochrome)Compte rendu d’analyse précis en FISH interphasique avec les ≠ clones hématoToutes les recherches sont stockées dans le disque dur

INCONVENIENTS

Plusieurs mois d’adaptation et de paramétrageNécessité de mettre à jour les logiciels de traitement d’image sur chaque poste d’analyseProximité de l’automate indispensable Qualité des étalements importante (étaleur)Huile +++Mitoses incomplètes en constitutionnel et prénatal ++

INCONVENIENTS

Difficulté d’interprétation pour certaines sondes Diagramme interphasique parfois assez fastidieux à corrigerFISH ou lumière blanche prévoir une organisation au sein du labo

conclusion

Après 2 ans d’expérience:

Devenu indispensable en cytogénétique hématologique et en FISH

A optimiser pour nos caryotypes constitutionnels et prénatals