Post on 13-Sep-2018
Microbiologie BIOL 3253
Étude de la structure
microbienne: microscopie et
préparation des échantillons
Les lentilles et la déviation de la lumière
Quand un rayon lumineux passe d’un milieu à un autre, il est réfracté; il est dévié à l’interface entre les deux milieux par rapport à sa direction d’incidence.
Indice de réfraction Mesure de combien une substance ralentit la vitesse de la lumière (par exemple, le verre a un indice de réfraction supérieur à celui de l’air).
La direction et l’angle de déviation sont déterminés par les indices de réfraction des deux milieux formant l’interface.
Les lentilles
Une lentille convexe focalise des rayons lumineux en un point spécifique, le foyer (F).
La distance entre le centre de la lentille et le foyer est appelée distance focale (f)
La puissance d’une lentille dépend de la distance focale.
Distance focale courte agrandit plus un objet
Le microscope optique
Plusieurs types:
Le microscope à fond clair
Le microscope à fond noir
Le microscope à contraste de phase
Le microscope à fluorescence
Les microscopes modernes, comme ceux
mentionnés ci-haut, sont tous des
microscopes composés.
L’image agrandie est formée par 2 lentilles
Le microscope à fond clair
Produit une image foncée sur un fond brillant.
Possède plusieurs objectifs.
Les microscopes compensateurs produisent des images qui demeurent au focus quand on change l’objectif.
Le grossissement total est calculé en multipliant le grossissement de l’objectif par celui de l’oculaire.
Le microscope à fond clair
Le trajet lumineux dans le microscope
La résolution du microscope
Résolution: Capacité d’une lentille à séparer ou distinguer des petits objets qui sont près l’un de l’autre.
Un facteur important dans la résolution est la longueur d’onde de la lumière utilisée.
Longueur d’onde plus courte plus grande résolution
d = 0.5λ λ = longueur d’onde
n sin θ d = distance minimale entre 2 points
n sin θ = ouverture numérique
θ = ouverture angulaire
L’ouverture numérique d’un microscope
L’ouverture angulaire θ est la moitié de l’angle du cône de lumière
qui vient de l’échantillon et pénètre dans la lentille et l’ouverture
numérique est n sin θ. À droite de l’illustration, la lentille a une
ouverture angulaire et numérique plus grande, sa résolution est
plus grande et sa distance de travail plus petite.
L’objectif à immersion
L’huile à immersion possède un indice de réfraction similaire à
celui du verre. En substituant l’huile à l’air, il en résulte en une
augmentation de l’ouverture numérique et de la résolution.
Les propriétés des objectifs du microscope
La distance de travail d’un objectif est la distance entre
la surface antérieure de la lentille et la surface de la lame
couvre-objet (si on en utilise) ou de l’échantillon après
une mise au point fine.
Le microscope à fond noir
Le champ qui entoure l’échantillon
apparaît noir, tandis que l’objet lui-même
est brillant.
Utilisé pour observer des organismes
vivants non colorés.
Érythrocytes observés à l’aide d’un
microscope à fond noir
Le microscope à fond noir
Le microscope à contraste de phase
Transforme de légères différences d’indice
de réfraction et de densité cellulaire en
différences d’intensité lumineuse
observables.
Excellent moyen pour observer des
cellules vivantes.
Le microscope à contraste de phase
Chlamydomonas en microscopie
à contraste de phase
La production de contraste dans un
microscope à contraste de phase
Le microscope à fluorescence
On éclaire l’échantillon avec une lumière ultra-violette, violette ou bleue.
Habituellement, les échantillons sont contrastés par un colorant appelé fluorochrome.
Permet d’obtenir une image de l’objet résultante de la lumière fluorescente émise par le spécimen.
Le microscope à fluorescence
Observations au microscope à fluorescence
Protozoaire flagellé Crithidia luciliae
coloré à l’aide d’anticorps fluorescents
pour montrer le kinétoplaste
Un mélange de Micrococcus luteus et
Bacillus cereus. Les bactéries vivantes
ont une fluorescence vertes, les
mortes sont rouges
La préparation et la coloration des échantillons
Augmenter la visibilité.
Accentuer les particularités
morphologiques spécifiques.
Préserver les échantillons en vue d’études
ultérieures.
La Fixation
Fixation: Procédé par lequel les structures internes et externes des cellules et des organismes sont conservées et fixées en place.
Le micro-organisme est habituellement tué et fermement fixé à la lame porte-objet durant la fixation.
Fixation à la chaleur
Conserve la morphologie générale mais pas les structures intracellulaires.
Fixation chimique
Protège les structures cellulaires fines et la morphologie de micro-organismes plus grands et plus délicats.
Les colorants et la coloration simple
Colorants
Rend les structures internes et externes de la cellule plus visibles en augmentant le contraste avec l’arrière-plan.
Ont deux propriétés en commun:
Groupes chromophores
Possèdent des doubles liaisons conjuguées.
Donnent la couleur au colorant.
Peuvent se lier aux cellules par interaction ionique, covalente ou hydrophobe.
Coloration simple Un seul colorant est utilisé.
Des colorants basiques sont souvent utilisés.
Colorants avec des charges positives qui se fixent à des molécules chargées négativement (i.e. acides nucléiques et de nombreuses protéines).
i. e., crystal violet, bleu de méthylène, fuchsine basique, safranine, vert de malachite.
Des colorants acides sont aussi utilisés.
Colorants avec des charges négatives qui se fixent à des molécules chargées positivement.
i. e., éosine, rose bengale, fuschine acide.
Les colorants et la coloration simple
La coloration différentielle
Divise les bactéries en groupes distincts
basés sur des propriétés de coloration.
i.e., Coloration de Gram
i.e., Coloration acido-alcoolo-résistante
La coloration de Gram
Méthode de coloration la plus largement
utilisée en bactériologie.
Divise les bactéries en deux classes:
Gram-négatives et Gram-positives.
Premier colorant:
crystal violet
mordant
Contre-coloration:
safranine
decoloration
Bactéries Gram-positives
Bactéries Gram-négatives
La coloration de Gram
Escherichia coli – bâtonnets gram-négatifs
Exemples de coloration de Gram
Gram- Gram+
Coques gram-positives
La coloration acido-alcoolo-résistante
Particulièrement utile pour identifier des espèces acido-alcoolo-résitantes du genre Mycobacterium
i.e., Mycobacterium tuberculosis – cause la tuberculose.
i.e., Mycobacterium leprae – cause la lèpre.
Cette coloration est
principalement dûe au
contenu en lipides (l’acide
mycolique en particulier
apparaît responsable de la
résistance à l’acide) très
élevé de la paroi des cellules.
A. Bactéries non acido-alcoolo-
résistantes (en bleu)
B. Bactéries acido-alcoolo-
résistantes (en rouge)
La coloration de structures spécifiques
La coloration négative
Technique qui révèle la
présence de capsules
autour de nombreuses
bactéries.
On utilise habituellement de
l’encre de chine ou de la
nigrosine afin de réaliser la
coloration et permettre de
visualiser la capsule.
La coloration de structures spécifiques
La coloration de spores Technique qui fait appel à l’utilisation de deux colorants.
Les endospores apparaissent vertes ou bleues dans une cellule rose ou rouge.
La coloration de flagelles Un mordant est utilisé afin d’épaissir les flagelles qui
sont des structures fines.
La microscopie électronique
Un faisceau d’électrons est utilisé pour produire une image.
La longueur d’onde d’un faisceau d’électron est plus courte que celle de la lumière, résultant en une meilleure résolution.
Le microscope électronique à transmission
Les électrons sont diffractés lorsqu’ils traversent l’échantillon.
Le faisceau d’électron est focalisé par des lentilles
magnétiques pour former une image visible agrandie de l’échantillon sur un écran fluorescent.
Les régions plus épaisses de l’échantillon diffracteront plus d’électrons et apparaîtront plus sombres.
Le microscope électronique à transmission
Comparaison entre un microscope optique et un
microscope électronique à transmission
La préparation des échantillons
En microscopie électronique à
transmission, l’échantillon doit être
coupé en une couche mince de 20 à 100
nm d’épaisseur.
Les échantillons sont chimiquement
fixés et colorés à l’aide de produits
opaques aux électrons.
D’autres méthodes de préparation des échantillons
Ombrage métallique L’échantillon est enduit d’une
fine couche de métaux lourds.
Cryodécapage Des échantillons congelés sont
fracturés le long des lignes de
plus grande fragilité (i.e., le milieu
des membranes internes)
La technique du cryodécapage
Le microscope électronique à balayage
Produit une image à partir des électrons réfractés par
la surface de l’objet plutôt qu’à partir des électrons
transmis.
Produit une image tridimensionnel de la surface du
micro-organisme avec une grande profondeur de
champs.
Le microscope électronique à balayage
Les nouvelles techniques en microscopie
Microscopie confocale et microscopie à balayage de sonde.
Possèdent une résolution très élevée.
Peuvent être utilisées pour observer des structures très petites, et ce, jusqu’au niveau atomique.
La microscopie confocale
Un rayon laser focalisé
touche un point de
l’échantillon.
Un ordinateur compile les
images générées par
chaque point afin de
reconstruire une image
tridimensionnelle.
La microscopie confocale
La microscopie à balayage de sonde
Microscope à balayage
et effet tunnel
Détermine les caractères
de surface en balayant la
surface de l’objet avec
une sonde ponctuelle.
Il peut atteindre des
grossissements de 100
millions et permet de
voir les atomes à la
surface d’un solide. Surface de silicone
La microscopie à balayage de sonde
Microscope atomique Déplace une sonde effilée à la surface de l’échantillon tout en
maintenant constant la distance entre la pointe de la sonde
et cette surface.
Au contraire du microscope
à balayage et effet tunnel,
le microscope atomique
peut servir à l’étude de
surfaces qui ne conduisent
pas bien l’électricité.
Molécule d’ADN