COLORATION DE GRAM & COLORATION DE GRAM & OBSERVATION AU OBSERVATION AU

MICROSCOPEMICROSCOPE

Boughammoura Aïda

COLORATION DE GRAM COLORATION DE GRAM 

1. REALISATION D'UN FROTTIS 2. COLORATION DE GRAM3. OBSERVATION AU MICROSCOPE

REALISATION D'UN FROTTISREALISATION D'UN FROTTIS

- nettoyer une lame de verre à l'éthanol / acétone- déposer sur une lame propre une goutte de suspension bactérienne- réaliser le frottis à partir du centre de la lame en décrivant un mouvement circulaire- sécher le frottis en passant la lame à la flamme du bec bunsen (2 à 3 fois)- fixer la préparation en flambant la lame avec l'éthanol / acétone- sécher la lame à la flamme

COLORATION DE GRAMCOLORATION DE GRAM- Coloration développée en 1884 par un médecin danois Christian Gram- méthode de coloration la plus largement utilisée en bactériologie- mise en évidence de différences de nature de la paroi bactérienne (bactéries à Gram négatif ont un peptidoglycane plus fin que celles à Gram positif)- se déroule en 3 temps :1. coloration au violet de gentiane et fixation de la coloration par le lugol2. traitement à l'éthanol (dissolvant le violet de gentiane décolorant les bactéries à Gram négatif) 3. contre-coloration à la fushine ou safranine (colorant en rose les bactéries précédemment décolorées)

COMPOSITION DE LA PAROI BACTERIENNECOMPOSITION DE LA PAROI BACTERIENNEGram + Gram-

Peptidoglycane épais Peptidoglycane fin90% de la paroi 10% de la paroi

L'éthanol traverse uniquement la paroi des bactéries à Gram négatif (dissolution des lipides de la membrane externe) et décolore le cytoplasme !

COLORATION DE GRAM : COLORATION DE GRAM : PROTOCOLEPROTOCOLE

- verser quelques gouttes de violet de gentiane sur le frottis- attendre 1 minute- éliminer l'excès de violet de gentiane puis avec un peu d'eau sans insister- plonger la lame 1 minute dans le lugol- rincer abondamment à l'eau- rincer à l'éthanol / acétone des 2 côtés de la lame- rincer abondamment à l'eau- plonger la lame 1 minute dans la fushnine ou safranine- rincer abondamment à l'eau- sécher la lame à la flamme

COLORATION DE GRAM : COLORATION DE GRAM : RESULTATSRESULTATS

- les bactéries à Gram positif apparaissent violettes

- les bactéries à Gram négatif apparaissent roses

- les vieilles cultures bactériennes peuvent donner des résultats de Gram variables en raison de la dégradation de la paroi cellulaire

OBSERVATION AU MICROSCOPEOBSERVATION AU MICROSCOPE

- grossissement x100 à immersion dans l'huile de paraffine- ouverture maximale du diaphragme