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description
Effets du sommeil et de la privation de sommeil
sur le protéome hippocampique de rat
après apprentissage topographique
Jean-Etienne Poirrier24 mars 2010
Centre de Recherches du Cyclotron& Giga-Neurosciences
Université de Liège
Fonctions du sommeil
SommeilSommeil
Thermorégulation
Restaurationtissulaire
Défenseimmunitaire
Conservationde l’énergie
Plasticitésynaptique
…
…
Consolidation
Bennington 1999 & 2003, Brown 2004, Walker 2006
Consolidation mnésique
Mémoire à court terme Mémoire à long terme
minutes joursheures
Switch
Induction :requiert synthèse d’ARNm et de protéines
Maintenance :ARNm – synthèse de protéines
Stickgold 2007
Hippocampe
d’après Ikonen 2002, Cheung 2005
Labyrinthe de Morris
Quadrants de départ aléatoires :N, E, S, W, E, W, N, S, E, N, W, S
Latence d’échappementDistance parcourue
t(s)
essai4 81
Apprentissage120
20
Morris 1984, D’Hooge 2001
Fenêtre de sommeil paradoxal
ConsolidationConsolidation
Smith 1996
Fenêtre de sommeil paradoxal
ConsolidationConsolidation
Smith 1996
Fenêtre de sommeil paradoxal
Smith 1996, 1997
Effet de la privation de sommeil paradoxal sur l’apprentissage spatial
Période de privation de sommeil paradoxal(heures suivant le dernier apprentissage)
Late
nce
d’éc
happ
emen
t (s
)Essais apprentissage Tests rétention
Thèses
1. La consolidation de la mémoire est liée au sommeil
2. La consolidation de la mémoire nécessite une néo-
synthèse de protéines
3. L’hippocampe est spécifiquement impliqué dans
l’induction de la consolidation mnésique
Hypothèse
L’hippocampe devrait être leL’hippocampe devrait être le
siège d’une modification et/ou néo-synthèse de protéines siège d’une modification et/ou néo-synthèse de protéines
nécessaire à la consolidation mnésiquenécessaire à la consolidation mnésique
et dépendante de certaines phases du sommeilet dépendante de certaines phases du sommeil
Questions
Modification rapide de l’abondance des
protéines hippocampiques de rat suite à
un apprentissage ?
Modification de l’abondance des protéines
hippocampiques et des surrénales de rat
après privation de sommeil ?
Latéralisation de l’expression des protéines de
l’hippocampe de rats ?
Ensemble complet des protéines expriméesEnsemble complet des protéines exprimées
par une cellule, un tissu ou un organismepar une cellule, un tissu ou un organisme
à un moment donné,à un moment donné,
et dans des conditions définieset dans des conditions définies
Le protéomeLe protéome
Analyse du protéome
1. Préparation échantillon
2. Séparation(électrophorèsebi-dimensionnelle)
3. Identification(spectrométrie de masse)
pI 4 7
Mw
m/z
Gel 2DpH 4 7
Mw
2D-DiGE
Ünlu 1997, Patton 2000 & 2002
1 échantillon (pooling)Echantillon 1
+ Cy3
Echantillon 2+ Cy5
Standardinterne+ Cy2
2D-DiGE :
1.1. CyaninesCyanines (Cy dyes) comme marqueurs de protéine
2. Co-migration de 2 échantillons 2 échantillons différents dans le même geldifférents dans le même gel
3. Co-migration d’un standard standard interne et normalisationinterne et normalisationM
w
Lectureà 570nm
Lectureà 670nm
Lectureà 506nm
pH 4 7
SDS-PAGE
Focalisation isoélectriqueMeilleure analyse des patrons de distribution
Meilleure quantification des différences
Meilleure analyse des patrons de distribution
Meilleure quantification des différences
11Protéomede l’hippocampede rat
Asymétries comportementales
l’hippocampe
Asymétries morphologiques
Latéralisation biochimique
Expression différentielle de
transcrits
Résultats : hippocampes gauche et droit
Pas de latéralisation de l’abondance de protéines dans l’hippocampe de rat naïf
Contrôle positif
Différence d’expressiondes protéines hippocampiques
à deux stades du développement :
nouveaux nés (3 jours) etadultes (3 mois)
Fountoulakis 1999, 2000 & 2002, Weitzdorfer 2008
Résultat : adultes & nouveaux nés
Abondance protéique différente entre l’hippocampe des nouveaux nés et des adultes
Résultat : adultes & nouveaux nés
• 44 spots adulte > nouveau né• 50 spots nouveau né > adulte• 34 protéines identifiées• 18 protéines uniques
possibles modificationspost-traductionnelles
Fonctions adultes > nouveaux nés abondance
Fonctions nouveaux nés > adultes abondance
Conclusions – partie 1
G = D
Nouveau né ≠ Adulte
croissancesynthèse ARNm
synthèse protéines
maturation du cytosquelettematuration de voies métaboliques(glycolyse, respiration, fourniture ATP)
Fountoulakis 1999, 2000 & 2002, Weitzdorfer 2008
22Protéome de l’hippocampeet des surrénales de rat
suite à une privation de sommeil
hippocampesurrénales
sommeilprivation de
Transcrits du sommeil
F3
Grp94
GABA B3
Rxt1
JNK1
BiP
ERP70
CHOP
N-ras
LMO-4
Vgf
IER5
HSP60
BDNF
TIMP-1
GRP75
Glut1
NTT4Calmodulin
NGFI-A
NADH2
NGFI-B
Vin-1
Stat3
TrkBr
KIAA0313
HSP70
CytCOx
Neuroglycan
BiPStripeA
aaNAT1b
Cirelli 2002, 2005
Arc
SWI2
12s rRNA
NFGI-A
c-fos
SNF2
rlf
Homer1a
Protocole
Poirrier et al. 2006 Journal of Circadian Rhythms 4:10
Privation de sommeil – manipulation douce
Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
• 64 spots privation > sommeil• 23 spots sommeil > privation• 16 spots envoyés en MS• 12 protéines identifiées
Hippocampe : privation - sommeil
Hippocampes: Privation > Sommeil abondance
Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14 ; Cirelli 2000 & 2006
(NSF)
Confirmations – α-SNAP
Anticorps anti-α-SNAP (monoclonal souris, conc. 1µg/ml)Rapport : -1.15 (-1.37) ; n = 3
Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
Confirmations – NSF
Anticorps anti-NSF (monoclonal souris, dil. 1/2000)Rapport : -1.28 (-1.33) ; n = 3
Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
Trafic vésiculaire – plasticité synaptique
Ungermann 2005
Surrénales : privation - sommeil
• 18 spots privation > sommeil• 39 spots sommeil > privation• 13 protéines identifiées• 12 protéines uniques
Surrénales : Privation < Sommeil
abondance
Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
Confirmations – G6PD
Anticorps anti-G6PD (polyclonal lapin, dil. 1/1000)Rapport : -1.47 (-1.49) ; n = 6
Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
Conclusions
• Courte privation totale de sommeil : stress physiologique / comportemental ensembles de protéines /
• Hippocampes en privation : activation de mécanismes impliqués dans transport et trafic vésiculaire– α-SNAP– NSF– Rab GDI α
• Glandes surrénales en sommeil : activation de mécanismes impliqués dans le métabolisme
Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14
Où est le stress ?
• Aucun indice physiologique classique de stress• Aucun indice comportemental classique de stress
G6PD : synthèse NADPH (voie des pentoses phosphates)
NADPH contre le stress oxydatif suivant privation de sommeil
CLIC4 maintenance du volume cellulaire et du potentiel de repos membranaire
33Protéome de l’hippocampe de rat
suite à un apprentissage
Protocole
Groupes
G1
G3
G2
G4
G5
G6
G7
G1b
G2b
Rat
s 3
moi
sR
ats
6 m
ois
non-privation
privation
privation
privation
privation
non-privation
non-privation
non-privation
Lab. Morrisentraînement
4h 20hLab.Morris
test rétention
t0 phase claire sacrifice
20
Latence d’échappement rats 3 mois
Dur
ée t
ota
le (
s)120
60
40
Série
Tests 1 Tests 2 Tests 3 Rétention
Apprentissage +Non-privation (G2)
Apprentissage +Privation (G1)
Tests 1 : séries 1, 2, 3 et 4 ; Tests 2 : séries 5, 6, 7 et 8 ; Tests 3 : séries 9, 10, 11 et 12 ; Rétention : re-tests 1, 2, 3 et 4 (24h)
Distance parcourue rats 3 mois
1000
Dis
tanc
e to
tale
(cm
)
Série
Tests 1 Tests 2 Tests 3
Apprentissage +Non-privation (G2)
Apprentissage +Privation (G1)
Rétention Sans PF
4000
Tests 1 : séries 1, 2, 3 et 4 ; Tests 2 : séries 5, 6, 7 et 8 ; Tests 3 : séries 9, 10, 11 et 12 ; Rétention : re-tests 1, 2, 3 et 4 (24h)
Et pourtant …
Smith 1997
Analyse en composantes principales
Ensemble des spots de protéines dans l’expérience
Apprentissage > Apprentissage + Sommeil
abondance
Apprentissage + privation ~ Privation
abondance
Apprentissage + privation > Apprentissage + sommeil
abondance
Rat, hippocampe & apprentissage
Apprentissage tâche spatiale
Rétention tâche spatiale
Apprentissage + privation de sommeil Apprentissage + sommeil>>
Apprentissage Apprentissage + privation~~
Sommeil suivant apprentissage
Conclusions
• Etude du protéome d’hippocampe– privation de sommeil– apprentissage tâche mnésique
• Importance du protocole expérimental
• Privation de sommeil : transport et trafic vésiculaire
• Apprentissage = stress, métabolisme
Remerciements
• Professeurs G. Moonen & A. Luxen• Drs. P. Leprince & P. Maquet• Professeur C. Smith• Professeur PH. Luppi, Dr. R. Goutagny• Professeurs P. De Deyn, R.G. Morris, P. Meerlo,• Drs. A.M. Strijkstra, C. Robert• L. Cambron, JM. Klein• Professeur J. Destiné, Dr. F. Senny, N. Marique, T. Libert• Drs. A. Plenevaux, J. Aerts, A. Silvani, A. Darsaud• D. Lassance, P. Piscicelli, Y. Dohogne, L. Confetti, P. Ernst, A. Brose• Drs. F. Guillonneau, J. Renaut• A. Plenevaux, B. Herbillon, A. Konings