Traçabilité de la matière organique par analyses isotopiques dans les milieux complexes

Patrick Jame Anthony Anchisi, Erik Bonjour, Xavier Saupin Institut des Sciences Analytiques UMR5280 Villeurbanne

1

Sciences de l’environnement et biomasse

Toxicologie

Biologie structurale

Analyse de traces

Matériaux

Sciences pharmaceutiques

Miniaturisation

Surfaces et interfaces

Santé

Sciences Analytiquesvoir et comprendre l’invisible

Mission de ISA: Imaginer et développer les outils analytiques de demain

Interactions

Toxicologie

2

Couplage

Analyses des isotopes organiques (13C/12C, 2H/1H, 15N/14N et 18O/16O) Spectromètre de Masse des Rapports isotopiques : IRMS ou SMRI

3

Anode

Filament LentillesV Electroaimant

B

Source

Analyseur

Détecteur

m/z 44: 12C16O2m/z 45: 13C16O2 + 12C16O17O

m/z 46: 13C16O17O + 12C16O18O + 12C17O2

m 46m 45m 44

Gaz issu de l'échantillon

Gaz standard (étalon interne)

Rayon = MV / q B

un analyseur de gaz

Eléments – masses – molécules - rapports isotopiques

4

Gaz Masses Molécule R signaux des M R. isotopique

H H2 2 1H1H 3/2 2H/1H3 2H1H

N N2 28 14N14N 29 + (30) /28 15N/14N29 15N14N30 15N15N

C CO2 44 12C16O16O 45/44 13C/12C 45 13C16O16O + 12C16O17O46 12C16O18O + 13C17O16O + 12C17O17O

O CO 28 12C16O 30/28 18O/16O30 12C18O

CO2 44 12C16O16O 46/44 18O/16O46 12C16O18O

L’unité isotopique : le delta (δ ‰)

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composés Origine naturelle% δ13C

Origine synthèse% δ13C

Vanilline(vanille)

1.101 -20.0 1.093 -27.0

composés Origine naturelle% δ2H

Origine synthèse% δ2H

Benzaldéhyde(HE amande amère)

0,0135 -129 0,0170 +97

𝛿!E =!R "#$%&' − !R (')'*'+,'

!R (')'*'+,'X 1000 (exprimé en pour 1000)

13C/12C SAMPLE = 0.011248

13C/12C SAMPLE = 0.011226

+1‰ variation vs PDB

-1‰ variation vs PDB

13C/12C PDB = 0.011237 Référence internationale PDB ( δ13C PDB=0)

Couplage AE avec IRMS (mesures globales)

6

Mesures globalesCouplage AE-SMRI

-mode combustion/réduction (He+O2-1000°c ) : (Cà CO2 / N à NOxà N2) 13C -15N

-mode pyrolyse (He -1400°c) (Hà H2 / Oà CO) 2H-18O

Couplage GC avec IRMS (méthodes séparatives)

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Méthodes séparativesChromatographie gazeuse Couplage GC-C/P –SMRIMode pyrolyse 2HMode combustion 13C

Couplage CG-C/P-SM- SMRI -Approche moléculaire et isotopique en simultané

-Facilités de passage du mode 2H en13C et possibilité de passer en configuration18O

Ordinateurpilote du SM Quadripôles (identification)

Ordinateurpilote de la SMRI (mesure des deltas)

Thèse CIFRE Albertvieille (2018-2021)Développement GC-C/P- IRMS multi-isotopes 2H /13C/ 18O appliqués aux huiles essentielles

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Chromatographie

ionique Interface liquide

Spectromètre de masse des rapports isotopiques

Couplage IC – co – IRMS (CO2 uniquement)

Séparation dela phase mobile

Réacteur à Oxydationchimique

Séchage du gaz

Cà CO2 par oxydation chimique

Intérêt de IC-co-IRMS

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Sortie:

Molécules séparées dans l’eau

LC-MS : séparation se fait avec éluant acétonitrile, méthanol… composés carbonésLC-co-IRMS impose aucun composé organique dans l’éluant à méthode limitée

IC éluant inorganique (KOH)

Suppresseur d’ions en sortie de IC

Analysesisotopiquesparspectroscopied’absorption:IRIS

Cheminoptiqueeffectif>10km

GRANDESENSIBILITE12CO2et13CO2 sontdifférenciées

12CO2

13CO2

Technologieconçuepourl’analyseisotopiquedeCO2 encontinu.

(Off-AxisIntegratedCavityOutputSpectroscopy)

Analyseur 2H /18O de l’eau

Analyseur 13C dans le CO2

(IRIS:IsotopeRatioInfra-red Spectroscopy)

Instrumentation Isotopique à ISA

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IRMS 6 spectromètres de masse des rapports isotopiques (IRMS) :-3 couplages analyseur élémentaires pour 2H, 13C, 15N et 18O -4 couplage GC-C/P-IRMS (2H ou 13C dont un impliqué en recherche 18O)-1 couplage Chromato ionique- oxydation chimique – SMRI (13C)

IRIS -Laser LGR IWAP 45 (analyse 2H et 18O dans H2O en simultané)-Laser LGR CCIA 38 (analyse 13C et 18O dans le CO2 en flux continu )

- Des investigations dans le domaine des teneurs naturelles comme dans le suivi de marquages isotopiques

- Domaines d’applications : Naturalité / Biomasse / Biosourcé / environnement / santé /matériaux

- à Mission: apporter des solutions les plus pertinentes possibles dans des problématiques complexes

Applications

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Intérêts et limitations de la méthode isotopique

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Cycle de Calvin ou C3 Cycle de Hatch - Slack ou C4

CAM Crassulacean acid metabolism

95% des espèces 1% des espèces 4% des espècesPommesOranges

Betteravescéréales

MaïsCanne à sucre

Vanille

Ananas

δ13C: -20 à -33 ‰ δ13C: -9 à -14 ‰ δ13C: -10 à -24 ‰

Cycles de fixation du CO2 et valeurs δ13C

Analyses isotopiques pour l’authentification - méthodes officielles

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Depuis 30 ans , beaucoup de publications, des méthodes officielles normalisées

Origine de la vanilline (arôme de vanille) : Fraude à l’origine ( naturelle /synthèse)Naturelle (gousse) δ13C/12C : -20 ‰Synthèse δ13C/12C : -27 ‰Biotechnologie acide férulique δ13C/12C : -35 ‰

Miels: 1991 Méthode AOAC Fraude sur l’ajout de sucres ( sucre représente 90% miel)Mesure du δ13C/12C Sucresδ13C/12C Protéines - δ13C/12C Miels < -1 ‰

Analyses isotopiques pour connaitre l’origine

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Objectifs: Différentiations 13C dans l’origine naturelle entre le végétal (olive) et l’animal (requin) : le squalane un émollient utilisé dans les cosmétiques

Risque d’extinction des requins matière première non renouvelable et durable.Engage ment de ne pas mettre de l’origine animal dans les cosmétiques

Differentiation of the origin of squalene and squalane using stable isotope ratio analysis »P.Jame, H.Casabianca, M.Batteau, P.Goetinck, V.Salomon. SOFW Journal vol 136 1/2 2010 p 2-10.

Determination of squalane Origin in Commercial Cosmetic creams using isotope Ratio Mass Spectrometry” P.Jame, H.Casabianca, M.Batteau, P.Goetinck, S.Guibert, R.Watts SOFW Journal vol137 1/2 2011 p 12-16

Composé Origine δ 13C ‰

Squalène Olive (végétal) -28.2Squalène Requin (animal) -20.4

Squalane Olive (végétal) -28.1Squalane Requin (animal) -20.1

Bagasse de canne à sucre

Farnesène

Squalane

Fermentation

Dimérisation / Hydrogénation

δ 13C/12C : -10 ‰ Squalane fabriqué par Biotechnologie

Farnesane

Carburant avion

Analyses isotopique pour connaitre l’origine

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Authentication of wintergreen (Gaultheria genus) essential oils naturalness by gas chromatography, isotope ratio mass spectrometry and radiocarbon assessment A. Cuchet, P. Jame, A. Anchisi, F.Schiets Ch. Oberlin, JC. Lefèvre, E. Carénini, H. CasabiancaIndustrial Crops & Products 142 (2019) 111873

Différentiation naturelle-synthèseApproche multi-isotopes HE Wintergreen (Gaulthérie)(99% méthyl salicylate)

Comparaison entre analyse 13C et mesure radioactivté14C14C méthode officielle d’authentification

- Activité = 0 produit de synthèse- Activité = 13.7 dpm (produit naturel ou Biosourcé)

- Corrélation bonne… sauf pour un échantillon commercialδ13C = synthèse alors 14C= naturel

Après déméthylation, la valeur 14C n’est plus la mêmeLe produit est de synthèse et a été modifié par un groupement carboné artificiellement enrichi en 14C

Biosourcé: analyses δ13C de plastiques Biosourcés

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origine

% végétal théoriqueIndiqué

δ13C (‰) mesuré

Canne à sucre 100 -11,0

M1 30 -23,83

M1 30 -23,54

M2 20 -24.96

M2 20 -25.00

M3 0 -27,63

M3 0 -27,79

M4 0 -28,73

M4 0 -28,69

M5 0 -28,06

M5 0 -27,86

M6 0 -28,93

M6 0 -28,91

y = 0,1714x - 28,401R² = 0,9909

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

00 20 40 60 80 100 120

vale

urs

D13C

% biosourcés

Contenu en Biosourcé

100% Biosourcé

100 % Fossile

Projet européen FP7 Open Bio (2013-2016) Deliverable N° 3.8: Report on the use of isotopes

http://www.biobasedeconomy.eu/research/open-bio/publications/

Quantification en Biosourcé

Approche multi-isotopes pour la détermination du Biosourcé dans les surfactants

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A. Gaubert, P. Jame, C. B, Sylvie Bordes, S. Guibert, M. Batteau, T. Lomberget, A. Anchisi, P. Lanteri, H. Casabianca,B. Rapid Communication in Mass Spectrometry , 2016, 30 ,1108-1114

Représentation 3D (delta 2H, 13C et 18O) de surfactants origines Biosourcés et non Biosourcés

Quantification en Biosourcé

Traçabilité de la matière organique dans les stations à roseaux

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Analytical indicators to characterize Particulate Organic Matter (POM) and its evolution in French Vertical Flow Constructed Wetlands (VFCWs) M. Kania, M. Gautier , Z. Ni, E. Bonjour,, R. Guégan , P. Michel , P. Jame J. Liuc, R. Gourdon.Science of the Total Environment 622–623 (2018) 801–813

Caractérisation de la matière organique dans les stations à roseauxIsotopes indicateurs de fonctionnement, du vieillissement des stations

Impact de la pollution sur les populations de gammares

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Monitoring priority substances in biota under the Water Framework Directive: How effective is a tiered approach based on caged invertebrates? A proof of concept study targeting PFOS in French rivers, M. Babut; B. Ferrari, P. Jame, A. Assoumani,, ; F. Lestremau; N. Hette-Tronquart, C. Miege, O. Perceval,Environmental Sciences Europe volume 32, 131 (2020)

Mises en places de cages de gammares et suivi Impact de la pollution sur les populations de gammares (13C et 15N indicateurs de leurs santés)

Remarque: analyse isotopique 13C ou 15N possible avec 200 µg de matière

Analyses isotopiques 2H et 18O d’inclusions de fluides

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-90-70-50-30-101030507090

110

-20-10 0 10 20 30 40 50

d2H

VSM

OW

d18OVSMOW

Water23°C

Water28°C

Water36°C

HALITE23°C

HALITE28°C

Projet CNRS Défi Isotopes 2020-2021Extraction de fluides de roches et analyses isotopiques pour reconstituer l’histoire de la croissance de massifs montagneux

Objectif : extraire eaux incluses (sels, roches…) et effectuer les mesures isotopiques 2H et 18O de l’eau en mode onlineProtocole: couplage système minéralisation avec laser H2O

Analyses isotopiques d’halites (sels anciens) pour la reconstitution d’environnements (climats) anciens

Simultaneous δ2H and δ18O analyses of water inclusions in halite with Off-Axis Integrated Cavity Output Spectroscopy (OA-ICOS) FrancoisFourel , Christophe Lecuyer, Patrick Jame, Alexandre Guironnet, Antoine Boutier, Nigel Blamey, Uwe Brand , Filip Fralik Journal of Mass Spectrometry (2020) 55,e4615

Approches marquages isotopiques

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Détermination du devenir d’une antibiotique dans le sol

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C. Letourniant et al .Complementarity of LC-MS/MS and IRMS to study the fate of antibiotics in soil: case of sulfadiméthoxine 38th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry, Jun 2014, Lausanne, Switzerland

- Déposer l’antibiotique marquée au sommet de la colonne.- Arroser régulièrement (simulation de pluie) - Recueillir les lixiviats (antibiotique + fraction organique collectée) et analyser

- Comparaison des courbes intéressantes- Intérêt de la détermination en 13C : début de la montée de la courbe et si dégradation de la molécule

But: déterminer le destin d’une antibiotique (sulfadiméthoxine) dans le sol

Approche marquage isotopique (utilisation d’une molécule enrichie en13CComparaison de mesure AE-IRMS 13C et LC-MS/MS

Suivi de la dégradation d’un polymère dans le sol

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Objectif: suivi de dégradation d’un polymère super-absorbant (SAP) dans le sol.

Contrainte: le polymère est insoluble donc impossible à mesurer en LC-MS, Maldi TOF, ou SEC

Méthodologie utilisée : synthèse d’un polymère enrichi en 13C qui est intégré dans des chambres dynamiques (avec sol et compost) et comparé à des témoins sans SAPMesure du 13C dans le CO2 produit pendant 5 mois à raison de 1 à 2 fois/semaine

5-10% CO2

10000-20000 ppm CO2

Résultats de l’expérimentation

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-30,00

-25,00

-20,00

-15,00

-10,00

-5,00

0,000 20 40 60 80 100 120 140 160

représentation des 13C moyens et écarts max en fonction du temps

moyenne val MAXI moyenne val MAXI moyenne val MAXI

- Courbe noire : moyennes et écarts maximum des flacons témoins (T)- Courbe verte : moyennes et écarts maximum des flacons SAP (S)- Courbe rouge : moyennes et écarts maximum des flacons SAP marqués en 13C (M)

Mise en évidence du 13CO2 dégagé

Projet ADEME-COMPIC rapport public en cours d’édition

Mise au point d’une méthode d’analyse fluxomique par IRMS des macromolécules fractionnées

EA-IRMS : Distribution des flux de synthèse macromoléculaire

(vitesse d’incorporation des atomes lourds)

GC-IRMS

Fractionnement biochimique

Hydrolyse, Digestion

enzymatique(Protection des acides amines labiles)

: Décomposition des flux

EA-IRMSGC-IRMSIEC-IRMS

Nutrimentinjecté

Macromolécule fractionnéeSous-unité

Nutriment enrichi en isotopes 2H /13C

biomasse cellulaireInvestigations sur des mêmes familles de molécules

Colloque SFIS 12-15 novembre Orsay 2019 -Communications orale d’ouverture de congrès - Apport de l’IRMS pour la connaissance des flux métaboliques cellulaires dans le développement du cancer du sein. X. Saupin, E. Bonjour, A. Anchisi, H. Chevrotée, Patrick Jame et Arnaud Vigneron

Merci de votre attention

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