Techniques de cytogénétiqueNomenclatureNomenclature

G. Quenum, O. Raoul, C. Turleau

Laboratoire de cytogénétique

Pr. M. Vekemans

Necker Enfants malades

Novembre 2007

Cytogénétique

• La cytogénétique est l’étude du matériel génétique au niveau cellulaire

• Cette étude est réalisée au microscope optique

• Le stade d’analyse des cellules est généralement la • Le stade d’analyse des cellules est généralement la métaphase

• La taille minimale des remaniements détectés est de l’ordre de quelques mégabases

• La FISH permet d’étudier des remaniements inframicroscopiques et/ou de travailler en interphase

Cytogénétique

• étude des chromosomes (de chroma = couleur + soma = corps)

• outil : le microscope optique (x 1000)• outil : le microscope optique (x 1000)

HISTORIQUE

• 1956 Choc hypotonique ⇒ dispersion des chromosomes

• 1959 Tri 21, Turner, Klinefelter

• 1960 Tri 13, Tri 18, Ph

• 1960 Cultures à court terme de lymphocytes sanguins (MOORHEAD)• 1960 Cultures à court terme de lymphocytes sanguins (MOORHEAD)

• 1963 1ère délétion : 5p-

• 1970 Marquage en bandes ⇒ identification de chaque chromosome

• 1975 Haute résolution

• 1990 Hybridation in situ

Ordre de grandeur

• Génome haploïde 3 000 Mb 3.109pdb

• Chr 1 263 Mb (8,6 %)

• Chr 21 50 Mb (1,6%)• Chr 21 50 Mb (1,6%)

• 1 bande 10-20 Mb

• 1 sous-bande 1-5 Mb

• 1 gène « moyen » 2.104 pb

Anomalies chromosomiques

• Constitutionnelles, elles entraînent :

– des échecs de la reproduction

– des malformations congénitales– des malformations congénitales

– des retards mentaux

– des troubles du développement sexuel

• Acquises, elles sont très fréquentes dans les cancers et les leucémies

Formation• gamète parental [méiose]

• 1ères divisions du zygote [mitose]

• tissu différencié [mitose]

Répartition

Constitutionnelles vs.acquises

• somatique et germinale

• homogène ou mosaïque

• somatique*

• clonales

•Association possible des deux types d’anomalies : prédisposition génétique à certains cancers (rétinoblastome, cancers colo-rectaux, leucémie et tri 21, etc...)

• tout l’organisme • limitées à un tissu ou organe

Transmission

• transmissibles • non transmissibles

Type• stables

• habituellement simples

• évolutives (évolutions clonales)

• souvent complexes

• Suspicion d’un syndrome chromosomique connu

• Anomalies congénitales multiples

• Retard mental

• Suspicion d’anomalie de

• Parents d’un enfant atteint d’anomalie chromosomique de structure

• Couple après 2 fausse-couches ou +

Indications du caryotype

• Suspicion d’anomalie de l’empreinte

• Ambiguité sexuelle

• Syndrome d’instabilité chromosomique

• Aménorrhée

• Troubles de la puberté

• Retard de croissance

• Produits d’avortement ou

• Enfants mort-nés

• Indications de diagnostic anténatal

• Indications hématologiques

Cycle cellulaire

Le cycle cellulaire comporte deux parties • l ’interphase (18-24h) au cours de laquelle il n ’y a

pas de modification visible du noyau, est divisée en :– phase G1(Gap1). – phase S (Synthèse). – phase G2 (Gap 2). – phase G2 (Gap 2).

• La mitose (1 h). – les chromosomes deviennent visibles, la membrane

nucléaire disparaît et la structure intérieure de la cellule est remplacée par le fuseau

– séparation des chromatides-sœurs et migration dans chaque cellule-fille

Cycle cellulaire

G01(H)M

G1

S

G2(10H)(4H)

(9H)S

Mitose

La mitose se décompose en– prophase– prométaphase– métaphase– anaphase – Télophase– cytadiérèse– cytadiérèse

• Les 46 chromosomes à 2 chromatides se séparent en 2 lots de 46 chromosomes à 1 chromatide.

• Chaque cellule-fille reçoit un exemplaire de chaque chromatide-sœur.

• Conservation du complément chromosomique de chaque celluleLe complément chromosomique de chaque cellule tel qu ’il

apparaît à la mitose est appelé caryotype

Mitose

Réplication de l’ADN

Condensation de l’ADN en chromosome (2 chromatides)Séparation des centrosomes

Disparition de l’enveloppenucléaire

L’enveloppe du noyau se reformeDécondensation

Chromosomes condensés,à la plaque équatoriale

Séparation des chromatides

Décondensation des chromosomes

Caryotype humainMéthodes d’étude

• Les chromosomes ne sont visibles qu’au moment

de la division cellulaire (métaphase)

• Certains tissus ont un taux de division spontané

suffisant pour une analyse directe :suffisant pour une analyse directe :

• moelle osseuse, villosités choriales, certaines

tumeurs, etc…

• Dans la majorité des cas, une culture cellulaireest

indispensable

Méthodes d’étude : 2 approches

Cytogénétique moléculaire: FISH (hybridation in situ révélée

par fluorescence)– complémentaire du caryotype

– métaphase ou interphase

– remaniements cryptiques– remaniements cryptiques

Cytogénétique classique: le caryotype

– métaphase (prométaphase)

– analyse des bandes

– résolution : plusieurs Mb

Principaux tissus étudiés en cytogénétique humaine

• postnatale- sang +++

- fibroblastes cutanés

• hématologique- moelle osseuse

- sang (blastes)

• prénatale- villosités choriales

- liquide amniotique

- sang fœtal

• tumorale - tissu tumoral

- ganglions

- épanchement liquidiens

Caryotype sanguin

• prélèvement stérile sur héparine de sodium (héparine de lithium et EDTA toxiques)

C’est la technique la plus simple et la plus utilisée en routine.Cellules étudiées : lymphocytes Ttransformés par la PHA

• mise en culture– 0.5 à 1 ml de sang total/10 ml de milieu de culture + sérum

– phytohémagglutinine (PHA) 72h de culture à 37° pH 7-7.4

Culture de lymphocytes

• Milieux de culture - permettent la multiplication des cellules

- constitués de solution saline, d’acides aminés, de vitamines,

auquel on ajoute des antibiotiques et du sérum (veau fœtal)

- certains sont pauvres en acides folique ou thymidine (sites fragiles)

• Phytohémagglutinine PHA - M/P/C

- extraite du haricot Phaseolus vulgaris

- provoque une transformation blastique des lymphocytes T

Obtention des mitoses

• Blocage en métaphase par la colchicine- Inhibe la formation du fuseau,- retarde la séparation des chromatides soeurs- ajoutée 2 heures avant la fin de culture

• Choc hypotonique• Choc hypotonique- ↑du volume cellulaire, lyse des hématies

• Fixation des chromosomes- Alcool/ acide acétique (Carnoy)

• Etalement sur lame• Coloration

Au microscope : objectif 10x

Au microscope : objectif 100x

Culture de fibroblastes

• Indications- Enfants mort-né

- Recherche de mosaïque- Lignes de BLASCHKO

- Asymétrie corporelle- Asymétrie corporelle

- Reconnaissance d’un syndrome connu pour n’exister

qu’en mosaïque (Tri 8 – Tetra 12p)

• Biopsie cutanée- Conservation du prélèvement dans sérum physiologique

/ milieu de culture

• Culture- Longue et délicate

Caryotype prénatal

• Liquide amniotique

– 15-18 SA ; 10-20 ml.

– cellules d’origine variée

– culture de 7 à 15j.

– récolte in situ ou en

• Choriocentèse

– 8-11 SA ; 10-20 mg.

– tissus extra-embryonnaires

– examen direct (cytotropho.)

– culture (stroma villositaire) ; – récolte in situ ou en

suspension

• Sang fœtal

– risque du prélèvement

– résultat rapide 72 heures

– culture (stroma villositaire) ;

7- 10 jours.

Amniocentèse

Amniocentèse

• Réalisée entre 15 et 17 SA

• 20 ml de liquide stérile, température ambianteambiante

• types cellulaires :cellules fœtales, cellules de l’ectoblaste amniotique, cellules

du mésoblaste amniotique, cellules trophoblastiques, cellules

maternelles

Culture de liquide amniotique

• 2 méthodes de culture :- en flacons les cellules devront être décollées (trypsinées) - in situ permet l’analyse directe des clones résultat plus

informatif

• Milieu sans PHA• Milieu sans PHA• Durée de culture- estimation selon l’aspect des colonies (~2 semaines)

• Récolte de la culture• même principe que pour les lymphocytes• Arrêt en métaphase - choc hypotonique – fixation - +/-

étalement

Ponction de villosités choriales

Voie transvaginale

Culture de villosités choriales

• Quelques villosités :10 à 20 mg- Cellules trophoblastiques (ext), cellules mésenchymateuses (int)- Tissu extraembryonnaire

• Technique directe : cytotrophoblaste- métaphases obtenues à partir des cellules spontanément en division - métaphases obtenues à partir des cellules spontanément en division - Résultat dès 24-48H

• Culture : stroma mésenchymateux- désagrégation mécanique et enzymatique des villosités- cellules mésenchymateuses et fibroblastes, mises en culture- Résultat 10-15j

• Sortie de culture : - Arrêt en métaphase - choc hypotonique – fixation - étalement

Evolution des techniques cytogénétiques

• 1960 Coloration homogène des chromosomes- Caryotype normal

- Anomalies de nombre

- Anomalies de structure MAIS de grande taille sans indication précise des chromosomes en cause

• 1970 Bandes chromosomiques métaphasiques• 1970 Bandes chromosomiques métaphasiques- Identification précises des chromosomes

- Trisomies et monosomies partielles

- Localisation fine par dosage génique

• 1980 caryotype prométaphasique- Syndromes microdélétionnels

- Pathologie du point de cassure

• 1990 FISH- Remaniements inframicroscopiques

Bandes chromosomiques

• méthodes générales d’identification : les bandes sont réparties sur toute la longueur des chromatides– bandes Q (quinacrine)– bandes G (trypsine/giemsa)– bandes R (réverse/chaleur)

• mise en évidence de structures particulières• mise en évidence de structures particulières– bandes C (constitutive hétérochromatine)– bandes T (terminales)– coloration NORs (organisateurs nucléolaires)– autres…

• bandes de réplication– incorporation de 5-bromodeoxyuridine (5-BrdU)

Type Méthode Localisation

bandes R dénaturation par la chaleur réparties le long du + coloration au Giemsa chromosome

bandes G digestion par la trypsine réparties le long du + coloration au Giemsa chromosome

bandes Q coloration fluorescente réparties le long du par la Quinacrine chromosomepar la Quinacrine chromosome

bandes C dénaturation par BaOH centromères, + coloration au Giemsa constrictions secondaires, Yq

bandes T chaleur + Giemsa extrémités chromosomiques

bandes de incorporation de BrdU coloration des bandes en réplication + coloration FPG fonction de leur moment de

réplication

Coloration Giemsa standard

• Coloration :- Giemsa à 3% eau distillée tamponnée pH 6,7 pendant 10’

- Rinçage à l’eau du robinet

• Observation• Observation- Lumière ordinaire

- 2 objectifs : 10 chercher les mitoses - 100 à immersion analyse

• Résultats- Chromosomes bien colorés(euchromatine/hétérochromatine)

- Classification en groupes (A/B/C/D/E/F/G)

- bras courts des acrocentriques, constriction IIiaires (1,9,16),

bras long Y

Coloration Giemsa standard

Bandes chromosomiques-I.

• méthodes générales d’identification :

– bandes Q (quinacrine)

– bandes G (trypsine/giemsa)– bandes G (trypsine/giemsa)

– bandes R (réverse/chaleur)

ces bandes sont réparties

sur toute la longueur des chromatides

Hétérochromatine

Extrémités :bandes T

Organisateursnucléolaires :Nors

Bandes chromosomiques

Hétérochromatineconstitutive :bandes C

Euchromatine :bandes G /Qbandes R b. de réplication Acrocentriques

Bandes R

• Technique- Dénaturation thermique ménagée (Dutrillaux Lejeune 1971)

Earle pH 6,5 à 87°cTemps variable ( 40’-60’) selon âge des lames

- Coloration Giemsa- Observation - Observation

Contraste de phase 100 à immersion

• Résultats- Alternance bandes claires et sombres- Constriction Iaires non colorées- Bras courts acrocentriques et extrémité de l’Ypeuvent être colorés (marqueurs)

Bandes R

Bandes G

• Technique

- Dénaturation par la trypsine(Dutrillaux et col. – Seabright)

Lames dans solution de trypsine

3’’-30’’ selon l’âge des lames

Rinçage dans PBS (Phosphate Buffered Saline)

- Coloration au Giemsa

• Résultats- Alternance de bandes claires et sombres (inverse des bandes R)

- Reconnaissance individuelle des chromosomes

- Régions hétérochromatiques variables

Bandes G

Bandes Q

• Technique- Coloration solution de quinacrine 20’- Rinçage tampon phosphate- Montage tampon phosphate

• Observation• Observation- Lumière U.V.

• Résultats- Alternance de bandes claires et sombres, identiques

aux bandes G (différences pour l’hétérochromatine)- Centromère du 3 parfois du 4- Certains bras courts d’acrocentriques- Surtout bras long de l’Y

Bandes Q