M3 Cytogénétique Morphologique Et Moléculaire Beleau Rotureau 18-01-12

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Cytogénétique morphologique et moléculaire

Techniques, nomenclatures

Apport des techniques moléculaires

Pr. MA. Belaud-Rotureau

DCEM1

• I – Introduction : définitions – historique – intérêt

• II – Le chromosome métaphasique : aspect en MO

• III – Cytogénétique conventionnelle : le caryotype

• IV – Cytogénétique moléculaire




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I – Introduction : définitions – historique – intérêt

• Compaction de la chromatine pendant la mitose fins

bâtonnets visibles en microscopie optique : chromosomes

• Le noyau des cellules en interphase contient le matériel

génétique : chromatine = ADN + nucléoprotéines

• Chromosomes : structures issues de la spiralisation et

de la fragmentation de la chromatine pendant la mitose


Chromosome

Un meuble avec

des livres

Nucléotides

Pages du livre

Cytogénétique

= supragénique

Génétique moléculaire

= intragénique

Gène

Livre

Chromatine = bibliothèque

Maladies géniques Maladies chromosomiques

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• Cytogénétique : science qui étudie les chromosomes et

leurs anomalies

Cytogénétique constitutionnelle : étude de la constitution d’un

individu avant (prénatal) ou après (postnatal) la naissance

Cytogénétique acquise : étude des anomalies chromosomiques

acquises par les cellules cancéreuses


• Historique

• 1888 Waldeyer

• 1891 Von Hanseman : 18 – 40 chromosomes

• 1921 Painter : Chromosome Y et 48 chromosomes

• 1952 Tijo et Levan : Choc hypotonique

• 1956 : 46 chromosomes chez l’homme

• 1959 Lejeune : trisomie 21 et essor de la Cytogénétique

• 1970 : Bandes G, R, C,…

Années 80 : Cytogénétique moléculaire puis puces à ADN

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Retard mental, anomalies du

développement, …

Anomalie du génome

Cytogénétique constitutionnelle

pré/postnatale


Anomalies acquises du génome

Cancers

Hémopathies

malignes

Autres cancers :

« tumeurs solides »

Diagnostic ? Pronostic ?

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Diagnostic

• Suspecté sur des signes d’appel cliniques

• Affirmé par examens biologiques et imagerie :

Histologie, cytologie, phénotype, …

• Défini par des classifications (OMS, …)

Diagnostic traitement

Problème : diagnostic parfois difficile

Variabilité inter et intra-pathologiste

Cytologie et/ou phénotype atypique

Pronostic

• Classifications : groupes de pronostic

• Problèmes

Evolution différente dans un même groupe

Que dire à un patient donné ?

• Pronostic choix du traitement

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Marqueurs génétiques

Anomalies du génome

Pertes, gains, translocations

Non aléatoires

Associées à une pathologie donnée

Précision du diagnostic et/ou du pronostic

indépendamment de la morphologie

Techniques

Cytogénétique

Génétique moléculaire








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II – Le chromosome métaphasique : aspect en MO

2 chromatides

reliées entre elles au niveau du centromère (constriction primaire)

extrémités = télomères

2 bras : 1 court « p »

1 long « q »

constriction secondaire : chromosomes 1, 9 et 16

II – Le chromosome métaphasique : aspect en MO

Index centromérique (p/p+q) : types de chromosomes

TELOMERES

TELOMERES

Dans certaines conditions visualisation d’une

alternance de bandes claires et sombres

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• 1 – Généralités

• 2 – Cellules utilisées pour l’obtention du caryotype

• 3 – Techniques chromosomiques pour l’obtention du caryotype

• 4 – Classement des chromosomes

• 5 – Le caryotype normal



1 - Généralités

• Caryotype : Equipement chromosomique caractéristique

d’une espèce donnée

• Etablissement du caryotype (culture / direct) par :

Techniques de CG conventionnelle = Caryotype en bandes

Représentation graphique des chromosomes

Classés par paires (mat + pat) selon taille

index centromérique

alternance bandes

Techniques de CG moléculaire = Caryotype multicouleurs, …

(cf. plus loin)

• Espèce humaine : 46 chromosomes (1956 !!!)

22 paires d’autosomes numérotées de 1 – 22

Une paire de gonosomes : chromosomes sexuels X et Y

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2 – Cellules utilisées pour l’obtention du caryotype

• Cytogénétique constitutionnelle postnatale

• Lymphocytes (prise de sang)

• Fibroblastes (biopsie cutanée)

• Autres (mosaïques)

• Cytogénétique oncologique : cellules tumorales

• Cytogénétique constitutionnelle prénatale

• cellules de villosités choriales (ponction de villosités choriales)

• amniocytes (amniocentèse)

• lymphocytes (sang du cordon)

3 – Techniques chromosomiques caryotype

• Culture : milieu, facteurs de croissance, étuve +/- CO2

• Blocage en métaphase : colchicine

• Choc hypotonique : KCl

• Fixation : acide acétique / méthanol

• Etalement sur lame (hygrométrie contrôlée)

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• Marquage en bandes

Traitement par trypsine (G) coloration GIEMSA

chaleur (R)

NaOH + giemsa II (C)

Autres Argent (NORs)

Quinacrine (QG),…

Bandes sur chromosomes

nature des protéines associées

degré de compaction

nature des nucléotides

400 bandes : 15 – 20 Mb

800 bandes : 5 Mb


Caractéristiques d’une

paire en rapport avec

Nombre de bandes

conditionne la résolution

• Marquage en bandes R

Bandes sombres : euchromatine

• Génétiquement / métaboliquement très active

• Riches en CG et en gènes, histones acétylés

• Duplication précoce durant la phase S

Bandes claires : hétérochromatine

• Génétiquement, métaboliquement peu active

• Riches en AT, peu de gènes

• Duplication tardive durant la phase S

• Constrictions Iaires et IIaires, satellites des acrocentriques, Yq

• Marquage en bandes G : inverse


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G R


• Observation au microscope optique

• Saisie des métaphases ( 20) : caméra numérique

• Traitement des images

• Classement des paires de chromosomes en fonction :

• taille

• forme (index centromérique) 10 métaphases

• alternance des bandes

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A B

C

D E

F G

7 groupes selon

taille, forme, index centromérique, constriction IIaire, bandes

A = grands méta 1, 2 & 3

B = grands subméta 4 & 5

C = moyens subméta 6 à 12 + X

D = grands acro 13, 14 & 15

E = petits subméta 16, 17 & 18

F = petits méta19 & 20

G = petits acro 21 & 22 + Y

4 – Classement des chromosomes

A B

C

C

D

F G

E

G

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4 – Classement des chromosomes

Notion de :

N° paire chro

bras court p / long q

régions

bandes

sous-bandes

chromosome 18

bras long = q région 1

bande 2

exemple : 18q12.3

sous-bande 3

5 – Le caryotype normal

• Spécifique de l’espèce et du sexe

• 23 paires de chromosomes chez l’Homme

22 paires autosomes

2 gonosomes : XX chez femme / XY chez homme

• Variants morphologiques sans conséquence phéno : hétérocromatine

Bras courts acrocentriques (13, 14, 15, 21, 22)

Constrictions secondaires 1, 9 et 16

Bras long du Y

NORs

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5 – Le caryotype normal

46,XY,GTG 46,XX,RHG

46,XX

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46,XY

Nomenclature ISCN pour le caryotype

• Nombre de chromosomes

• Formule gonosomique (sexuelle)

• Anomalies dans l’ordre des n° des chromosomes

– Anomalie de nombre

– Anomalie de structure

46,XX 47,XY,+21 46,XX,t(2;3)(q11;p13)

; on change de chromosome

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• 1 – Hybridation in situ en fluorescence

• 2 – Hybridation génomique comparative et autres techniques




• Hybridation d’une séquence d’ADN cible par des sondes

ADN marquées par un fluorochrome

1 – Hybridation in situ en fluorescence : FISH

Etude ciblée : sondes locus spécifiques

Etude globale : peinture chromosomique, caryotype multicouleurs

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FISH : Préparation des échantillons

Analyse possible d’une grande variété de spécimens

Métaphases (spontanées ou après culture cellulaire)

Noyaux interphasiques

Tissus frais/congelés : coupes, empreintes, cytocentriF

Tissus fixés par le formol : coupes et noyaux isolés

Prétraitement

Favoriser la rencontre sondes / cibles

• Fixation tissus frais ou congelé

• Déparaffinage et hydratation des tissus fixés

• Traitement chimique (HCl, NaSCN, …)

• Traitement enzymatique (pepsine)

• Déshydratation et séchage

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Cot-1 (Abbott)

PNA (Dako)

Codénaturation et hybridation

Hybridation

Dénaturation

ADN à tester

Dénaturation

ADN sondes

Structures simple brin

Chauffage

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Temps

Tem

péra

ture

(°C

)

• Chauffage : exemple de l’hybrite

Codénaturation

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19

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Temps

Tem

péra

ture

(°C

)

• Ou bien un système analogue …

Codénaturation

• Hybridation : 1 nuit à 37°C, hybrite / chambre humide

Hybridation

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20

• 0.4 SSC – 0.3 % NP40, 2min à 73°C

Lavages

• Déshydratation, contre coloration (DAPI)

• Observation au microscope à épifluorescence

• Repérage des zones à analyser (x 100)

Observation des signaux

2R 2V

• Recensement profils d’hybridation (x400 – x1000)

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1 – Hybridation in situ en fluorescence : FISH

• Etude ciblée : FISH

• Etude globale : caryotype multicouleur (M-FISH)

FISH

chromosome spécifique

Compter nbre

chromosomes

FISH

locus spécifique

µ remaniements

FISH

peinture chromosomique

Caractériser

remaniements

M-FISH

Identifier marqueurs

et chromo dérivés

Matériel additionnel sur un X

FISH : peinture chromosomique

Obtenues par tri CMF / hybrides somatiques

Marque un chromosome / bras chromosomique : métaphases

FISH : Caractériser une anomalie de structure

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wcp7

der(X)

Remaniement complexe constitutionnel intéressant les chromosomes 1, 2, 9, 11 et 14

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wcp1 wcp2

der (9)

1 2 9 11 14

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FISH : sondes centromériques

Séquences alpha satellites spécifiques d’un chromosome

donné sauf 13/21 et 14/22 (sondes locus spécifiques)

Noyaux interphasiques

FISH : Caractériser une anomalie de nombre

X Y

Sondes locus-spécifiques

Trisomie 13 Disomie 21

Sondes centromériques

FISH : sondes locus spécifique

Nombre : délétion / gain (trisomie, amplification)

Structure : translocation

Métaphases ou noyaux interphasiques

FISH : Caractériser un remaniement

TUPLE1 22q11.2

ARSA 22q13

Syndrome de Di George

46,XX.ish del(22)(q11.2)(TUPLE1-)

Délétion

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FISH : sondes locus spécifique

Nombre : délétion / gain (trisomie, amplification)

Structure : translocation

Métaphases ou noyaux interphasiques

FISH : Caractériser un remaniement

Her-2 17q11.2

Centromère 17

Cancer du sein

Amplification Her-2 et Herceptin®

Délétion

Translocation t(11;14)(q13;q32) et LNH manteau 14

32

Locus IgH

14q32

11

13

Locus CCND1

11q13

der 14 der 11 11 14

Noyau

interphasique

Normal

LSI® IGH /

CCND1

2R2V

t(11;14)(q13;q32)

LSI® IGH /

CCND1

1R1V2F

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La FISH : pourquoi ?

Caryotype Biologie

moléculaire FISH

Exploration

du génome Globale Ciblée Ciblée


Caryotype Biologie

moléculaire FISH

Exploration


Sensibilité 10 – 20 Mb

+++/- -

Mosaïque /

cassures

+++

Diagnostic

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Caryotype Biologie

moléculaire FISH

Exploration



+++/- -

Mosaïque /

cassures

+++

Diagnostic

Applicabilité Frais

(culture)

Frais, congelé

Fixé -/+

Frais, Congelé

Fixé


Caryotype Biologie

moléculaire FISH

Exploration



+++/- -

Mosaïque /

cassures

+++

Diagnostic

Applicabilité Frais

(culture)

Frais, congelé

Fixé -/+

Frais, Congelé

Fixé

Faisabilité +/- +++ +++

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• Marquage de l’ADN de chacune des paires

chromosomiques par une combinatoire spécifique de 1 à

5 fluorochromes : FITC, Rhod, TR, Cy 5, Cy 5.5

Caryotype multicouleur : exemple du SKY

24 combinaisons de 1 à 5 fluorochromes spécifiques des

24 chromosomes humains

SKY : Principe

table combinatoire

ADN (ng) FITC Rhod TR Biot Dig

1 300 300 300

2 500

3 250 250 250 250

4 200 200

5 200 200 200 200

6 200 200 200 200

7 300 300

8 500

9 250 250 250

10 250 250

11 200 200 200

12 250 250

13 200 200

14 400

15 200 200 200

16 250 250

17 400

18 150 150 150

19 150 150

20 150

21 150 150

22 100 100 100 100

X 250 250

Y 100 100 100

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Capture/interférogramme

Analyse du spectre

Réunion des faisceaux

Filtre d’excitation

Fluorescence

Miroir Dichroïque

Filtre d’arrêt

Séparateur

CA

MÉR

A

Xe

Pour chaque pixel : Mesure

d’une séquence

d’intensités de fluorescence

à différentes longueurs

d’ondes

Principe du SKY

LAL enfant : t(12;21)(p13;q21)

FCM + DOP-PCR

PCR inter-Alu

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SKY : 52 XY, +2, +5, +6, -7, -8, +14, +21, +mar1, +mar2, +mar3

• Hybridation génomique comparative (CGH)

• Sur métaphases

• Sur support solide : « puces à ADN » (CGH array)

• Déséquilibres génomiques

• MLPA, QMPSF : Recherche de délétions / gains

6 – Le caryotype : techniques moléculaires

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• 1 – Hybridation in situ en fluorescence

• 2 – Hybridation génomique comparative et autres techniques




2 – Hybridation génomique comparative (CGH)

sur métaphases

RéférenceRéférenceADNADN

TestTestADNADN




TestTestADNADN

TestTestADNADN

TestTestADNADN

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CGH sur puces à ADN (CGH-array)

• 287 clones : BAC (100 – 200 kb)

• Oncogènes et suppresseurs de tumeurs

• Régions sujettes à microdélétions

• Clones témoins (50) pour validation

• 3 spots ADN / clone 861 spots

• Régions sub-télomériques : 2 clones

• Couverture moyenne : 40 Mb

ADN à tester : tumeur

ADN Référence : sujet sain

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Incubation 72h à 37°C

Lavages

Marquage par le DAPI

Scanner :

- Source d’illumination au Xenon

- Roue de filtres 6-positions

- Camera CCD 1.3 million de pixels

- Ordinateur

- Logiciel GenoSensor 300

Analyseur : Genosensor

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La Camera CCD capture la lumière émise pour

chacun des marquages (DAPI, Cy3, Cy5)

Le logiciel superpose les images et identifie chaque

spot (segmentation)

DAPI IV (ADN Total)

+

Cy3 (ADN Test)

+

Cy5 (ADN Rédérence)

CGH array: capture et analyse

Image codée

ratio T/R calculé

3 spots / clone

CGH array : analyse

Amplification

Le logiciel calcule le rapport des intensités de

fluorescence émises (Test/Réf) pour chaque spot

Normalisation ratio « normal » = 1.0

- ratio < 0.8 délétion

- ratio > 1.2 gain

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CGH-array : interprétation

1.0 0.8 1.2

LJ

CFgc

Lymphomes cutanés à grandes cellules

No

mb

re d

e p

ati

en

ts

Gains

Pertes

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Lymphomes cutanés à petites cellules

LZM

CF m

CF u

No

mb

re d

e p

ati

en

ts

Gains

Pertes

LNH B cutanés : anomalies récurrentes

GC type jambe

• anomalies récurrentes +++

• +1q, +7, -8, -9p21 (p14/p16), +12

• agressivité clinique

+2p, +3q, +11q13

Histologie : grandes cellules

CF petites cellules

• Moins d’anomalies

• Anomalies communes

avec les LNH à GC

LZM

• Rares anomalies

• Excellent pronostic

Histologie : petites cellules

• Pas de perte p14/p16

-1p36, +21

• Meilleur pronostic

GC autres

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Anomalies du caryotype numériques

et structurales

Pr. MA. Belaud-Rotureau

DCEM1

Anomalies du caryotype numériques et

structurales

• I – Interpréter un caryotype

• II – Anomalies du nombre des chromosomes

• III – Anomalies de la structure des chromosomes

• IV – Equilibre / déséquilibre génomique

• V – Anomalie homogène ou en mosaïque

• VI – Particularités en oncologie

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I – Interpréter un caryotype

1) Anomalie du nombre de chromosomes (aneuploïdie) ?

2) Anomalie de la structure des chromosomes (aneusomie) ?

Interpréter un caryotype c’est répondre à 4 questions

I – Interpréter un caryotype

Déséquilibre génétique :

mauvais dosage en gènes

Clinique : - dysmorphie

- malfo viscérales

- retard mental

Pas de déséquilibre génétique :

pas de perte ni gain de gènes

- RAS pour le sujet (pb diagnostic)

- hypofertilité

- risques pour la descendance

3) Anomalie de structure / nombre des chromosomes

équilibrée ou déséquilibrée ?

4) Anomalie homogène ou en mosaïque ?

Règles pour la cytogénétique constitutionnelle

Particularités en oncologie : cours du 25/02

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structurales



• 1 – Anomalies du nombre des autosomes

• 2 – Anomalies du nombre des gonosomes


• IV – Equilibre / déséquilibre génomique



• A la conception fréq monos = fréq trisom et toutes les

paires chromosomiques sont concernées mais sélection

Pas de monosomies viables

Seules les trisomies 13, 18 et 21 sont viables Retard mental

Dysmorphie

Malformations visc

II – 1) Anomalie du nombre des autosomes

• Diagnostic anténatal

• 50% des œufs ne s’implantent pas, la plupart

présentent des anomalies chromosomiques

• Ségrégation meïotique anormale (1ère ou 2nde division)

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40

Autosomes

47,XY,+18 47,XY,+13

47,XX,+21


49,XY,+mar,+mar,+mar Marqueurs

Petits chromosomes surnuméraires


Clinique

Hétéro/euchromatine

FISH, CGH, …

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II – 2) Anomalie du nombre des gonosomes

• Syndrome de Turner : 45, XO

• 0,4/1000, intelligence normale, stérilité

• Retard de croissance, impubérisme, malfo cœur + reins fquentes

• Syndrome de Klinefelter : 47, XXY

• 1,5/1000, intelligence normale, hypo/infertilité

• Aspect physique normal (++) / longiligne / obésité gynoïde (25%)

• X surnuméraire : XXX (normal) XXXX, XXXXX (débilité)

• Y surnuméraire : XYY (normal), violence ????

47,XYY

47,XXY

47,XXX

45,X0

II – 2) Anomalie du nombre des gonosomes

47,XXX

Klinefelter Turner

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42

47,XXY

XXY

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structurales




• 1 – Translocations réciproques

• 2 – Translocations robertsoniennes

• 3 – Inversions

• 4 – Délétions

• 5 – Chromosomes en anneau

• 6 – Isochromosomes

• 7 – Duplications

• 8 – Insertions

• 9 – Dicentriques / pseudodicentriques

• 10 – Remaniements complexes

III – 1) Translocations réciproques

= échange de matériel entre 2 chromosomes

Appariement des séquences homologues

Meïose : stade pachytène

70 % ( CO)

5 – 10%

• Ano équilibrée pas de phénotype

• Risque pour la descendance

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La translocation réciproque implique un chromosome acrocentrique

Meïose : stade pachytène

Viable !

47,XX,+mar

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45

Cen14/22

wcp22

wcp11

11 22 der(11)t(11;22) der(22)t(11;22)

Enfant : deux chromosomes 11 normaux

deux chromosomes 22 normaux

dérivé 22 en plus => trisomie 11 partielle + trisomie 22 partielle

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= échange de matériel entre 2 chromosomes

III – 2) Translocations robertsoniennes

• Entre chromosomes acrocentriques : 13, 14, 15, 21, 22

• Très fréquentes (1/1000) : évolution

• Fusion centrique ou cassures juxtacentromériques (+++)

Caryotype à 45 chromosomes

Pas de phénotype

Risque pour la descendance

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47


Pat : 1/50

Mat : 1/5


= fusion centromérique de 2 chromosomes acrocentriques

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48

III – 3) Inversions

• Inversions : remaniements équilibrés (phénotype normal)

• Péricentriques : impliquent le centromère

• Paracentriques : cassures sur le même bras chromosomique

Risque pour la descendance

• Meïose : boucle d’appariement gamètes anormaux par duplication / déficience

• Létalité avec taille des segments inversés, Inv para chrom dic + acentrique

III – 3) Inversions

inversions paracentriques péricentriques

46,XX,inv(3)

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49

=>Déséquilibre des

segments extérieurs

à l’inversion

Déséquilibre des

segments extérieurs

à l’inversion

Acentrique

Dicentrique

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50

III – 4) Délétions

• Délétions terminales ou intercalaires (de novo 85%/ deldup)

- Une cassure chromosomique

avec perte du segment distal :

délétion terminale

- Deux cassures chromosomiques

avec perte du segment

intercalaire : délétion interstitielle

Microdélétions (FISH)

46,X,del(X)(p22)

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del(4)(p16.3)

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52

TUPLE1 22q11.2

ARSA 22q13

Syndrome de Di George

46,XX.fish del(22)(q11.2q11.2)(TUPLE1-)

MICRODELETION

délétion

III – 5) Chromosomes en anneau

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r(20)

Anneau : mécanique à la mitose

0 ou nb pair de

crossing-over 1 ou nb impair

de crossing-over

Anneau double dicentrique

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III – 6) Isochromosomes

Isochromosome composé de deux bras longs ou deux

bras courts d’un même chromosome avec perte de l’autre

bras.

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isoXp i(X)(p10)

i(X)(q10)

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III – 7) Duplications

Duplication intrachromosomique en tandem ou en miroir

Trisomie pure

III – 8) Insertions

• Trois cassures transfert d’un segment intercalaire à

l’intérieur d’un autre bras chromosomique.

• Peut exister dans un seul chromosome (insertion

intrachromosomique)

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Fils

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m-banding 5 Fils

Banding multicolore

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• Fusion de deux chromosomes (régions télomériques svt)

• Pseudodicentrique : un centromère inactif

III – 9) Dicentriques / pseudodicentriques

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60

III – 10) Remaniements complexes

• Association de plusieurs anomalies chromosomiques :

translocation, insertion, délétion, …

• Acquis +++ mais aussi constitutionnels

t(6;22)+t(12;20) ?

wcp22

Wcp12 vert

Wcp20 rouge

wcp22

6

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t(1;2;9) + t(11;14) ???

wcp1 rouge wcp2 vert wcp9 rouge wcp11 vert

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structurales




• IV – Equilibre / déséquilibre du génome



IV – Anomalie équilibrée ou déséquilibrée ?

• Equilibrée : dosage en gènes normal

pas de phénotype

risque pour la descendance

• Déséquilibrée : mauvais dosage en gènes

phénotype

• Anomalie structure et/ou nombre des chromosomes

46,XX,t(1;17)(q41;p12)

45,XY,t(13;14)(q10;q10)

46,XY,der(17)t(1;17)mat

47,XY,+21

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46,XY,t(10;21)(p12;q21)

Translocation réciproque

équilibrée à 46 déséquilibrée à 47

IV – Anomalie équilibrée / déséquilibrée

47,XY,t(10;21),+21

46,XX,t(1;17)(q41;p12) 46,XY,der(17)t(1;17)mat

Translocation réciproque



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Translocation robertsonienne



46,XX,t(21;21),+21


structurales







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V – Anomalie homogène ou en mosaïque ?

• Anomalie de nombre homogène : toutes les cellules

présentent la même anomalie. Aneuploïdie (# 2n)

• Anomalie de nombre en mosaïque : plusieurs

populations cellulaires (clones) dans un même individu

(constitutionnel) ou un même tissu (acquis)

• Par non-disjonction méiotique : monosomie / trisomie

lors de la première division : tous les gamètes sont déséquilibrés

lors de la deuxième division : deux gamètes déséquilibrés, deux normaux

Autosomes : trisomie 21, 13, 18 viables, monosomie 22 (mosaïque)

Gonosomes : monosomie X, trisomies viables.

• Par anomalie de la fécondation : polyploïdie

Triploïdie : 69 chromosomes (20% des fausses couches spontanées)

Diandrie : 2 spz fécondant même ovocyte 69,XXX 69,XXY 69,XYY

Digynie : non expulsion du 2è globule polaire 69,XXX 69,XXY

Tétraploïdie : 92 chromosomes (6% des FCS)

V – 1) Anomalie homogène

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Anomalie

de nombre

homogène

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67

Centromère 16 Centromère18

Triploïdie Triploïdie

• Variations du phénotype problèmes de diagnostic

• Conséquence d’une erreur de division mitotique

• Le phénotype dépend de la proportion des différents

clones dans les différents tissus (étude de fibroblastes

en plus du caryotype sur lymphocytes)

V – 2) Anomalie en mosaïque

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68


structurales







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69

VI – Particularités en oncologie

• Anomalies nombre / structure chromosomes restreinte

aux cellules tumorales avantage sélectif

Gains / pertes gènes : amplification oncogènes / délétion GST

Translocations surexpression génique / gène de fusion

Importance : - facteur de diagnostic

- facteur de pronostic

- réponse au traitement

Diagnostic : cytogénétique chromosomique et moléculaire

Cours du 25/02…

Aspects cliniques des anomalies chromosomiques constitutionnelles

Prs. S Odent, MA Belaud-Rotureau

DCEM1

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Trisomie 21

– 1,45 nouveau né sur 1000

– Lejeune 1959

Diagnostic clinique de trisomie 21

Phénotype du nouveau-né – Hypotonie marquée

– Dysmorphie cranio-faciale

– Membres

• Mains

• Pieds

– Abdomen distendu, hernie ombilicale

– Malformations

• Cardiopathies CIV et CAV

• Sténose duodénale

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– Hypotonie marquée

– Abdomen distendu, hernie ombilicale, diastasis des grands droits

Phénotype du nouveau-né


– Dysmorphie cranio-faciale :

• visage rond et plat

• Crâne petit, rond, occiput plat

• Brachycéphalie : soudure précoce os crâne (suture coronale) tête courte et large, aplatie en arrière.

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• Fentes palpébrales obliques en haut et en dehors

• Épicanthus interne (repli de peau au coin interne de l'œil)

• Tâches de Brushfield dans l’iris (pathognomonique, yx bleus)

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• Nuque courte, plate, large avec excès de peau


• Racine du nez plate, nez court, narines antéversées


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– Hypotonie

– Dysmorphie cranio-faciale :

• visage rond et plat

• Crâne petit et rond

• Fentes palpébrales obliques en haut et en dehors

• Épicanthus

• Tâches de Brushfield

• Nuque courte, plate, large avec excès de peau

• Racine du nez plate, nez

court, narines antéversées

• Bouche petite, lèvres épaisses, fendillées,

macroglossie, glossite exfoliatrice


– Oreilles sont souvent bas implantées, petites, rondes, mal ourlées

avec un développement transversal de la racine de l’hélix (crux

cymbae)

http://www.gyneweb.fr/sources/echographie/bbenoit/patho3D/oreilleT21.jpg

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75

– Hypotonie


– Membres

• Mains

– larges et trapues

– Doigts courts

– Brachymésophalangie du V (raccourcissement de la deuxième phalange)

– Clinodactylie du Vème doigt (déviation vers le côté de la main)

– Pli palmaire transverse unique


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76


– Hypotonie


– Membres

• Mains

• Pieds

– Larges, plats et petits

– Écartement important des deux premiers orteils

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– Hypotonie


– Membres

• Mains

• Pieds

– Abdomen distendu, hernie ombilicale

– Bassin étroit

– Peau sèche

– Malformations

• Cardiopathies (40%) CAV, CIV et CIA

• Sténose duodénale

– Dépistage :

• Dilatation pyélo-calicielle

• Hypothyroïdie

• Leucose néonatale

Phénotype dans l’enfance

– Dysmorphie

– eczéma

– Sensibilité accrue aux infections (otites…)

– Suivi ophtalmologique (strabisme, blépharite, …)

– Retard mental

• QI en moyenne à 50 à 5 ans

• Déficit cognitif sur l’apprentissage et le raisonnement

– Mémoire verbale à court terme

– Langage (syntaxe et intelligibilité)

– Troubles du comportement, surtout adaptatif (anxiété, dépression), troubles

autistiques

– Grande sociabilité et affectivité

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Prise en charge globale

– médicale, avec suivi régulier

• Général (croissance, RGO, constipation, maladie de Hirschsprung)

• Ophtalmologique annuel

• ORL annuel

• Stomatologique annuel (caries +++, articulé dentaire)

• Endocrinien annuel

• Musculo-squelettique (scoliose +++)

• Bilan hématologique annuel


– Paramédicale, en CAMPS

• Kinésithérapie motrice précoce

• Orthophonie précoce et adaptée

• Séances de psychomotricité

• Assistante sociale (dossier de prise en

charge à 100% pour ALD, AEH, contact

avec MDPH …)

• Psychologique, pédopsychiatrique

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Phénotype le l’adolescent

– Petite taille

– Tendance au surpoids

– Puberté normale, femmes parfois fertiles

– Sensibilité aux infections

– Risque accru de leucémie (LAM, multiplié par 20)

et de l’adulte

– Endocrinopathies • Diabète

• Hyperuricémie

• Hypothyroïdie

– Vieillissement prématuré • Voix rauque

• Cataracte

• Maladie d’Alzheimer

– Espérance de vie de 50 ans avec un taux de mortalité augmenté dans les premiers mois de vie

– Travail protégé possible, foyer de vie, viellissement des parents

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80

Diagnostic cytogénétique de la trisomie 21

Doit toujours confirmer le diagnostic clinique

Sur lymphocytes circulants

++++ pour le conseil génétique

Trisomie 21 libre : 95 %

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Trisomie 21 par translocation : 5 %

46, XY, der(14;21)(q10;q10)+21

Trisomie 21 en mosaïque (3%)

18/01/2012

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• Trisomie 21 libre – Caryotypes parentaux le plus souvent normaux

– Risque de récurrence théorique de 1% (mosaïcisme germinal parental possible)

• Trisomie 21 par translocation – 50% héritée

• Translocation robertsonienne (95%)

• Risque de récidive dépend du sexe du parent porteur, de la taille des fragments transloqués

CARYOTYPES PARENTAUX pour le conseil génétique

Diagnostic cytogénétique de la trisomie 21

Age maternel

Risque à terme

20 1 / 1700

25 1 / 1250

30 1 / 900

35 1 / 400

38 1/ 187

40 1 / 100

43 1 / 50

45 1 / 24

1. Effet de l’âge maternel

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4. Signes d’appel échographiques

• 12 SA : mesure de la clarté nucale (SAE d’anomalie chromosomique)

– > 3 mm

– Hygroma kystique

– Œdème sous cutané diffus

18/01/2012

84

18/01/2012

85

3. Signes d’appel échographiques

• 12 SA • 22 SA :

– malformations • Atrésie dudodénale (45%) • Cardiopathie (45 à 50%) : CIV et CAV

– signes mineurs • Fémur court • Pyélectasie • Morphologie faciale (protrusion de la langue, hypoplasie des OPN) ou

des mains (clino V, brachymésophalangie) • Anses digestives hyperéchogènes

18/01/2012

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18/01/2012

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Sonde 21q

Sonde 13q

Recherche rapide des aneuploïdies les plus fréquentes (13,18,21,X et Y)

• par hybridation in situ (FISH) avec un mélange de sondes fluorescentes, spécifiquement complémentaires d’une région de chacun des chromosomes

• sur trophoblaste ou liquide amniotique non cultivé

18/01/2012

88

Autres anomalies chromosomiques autosomiques déséquilibrées

• Associées le plus souvent à un phénotype sévère

polymalformatif, associé à un retard mental, appelé retard mental syndromique

• Perte ou gain de matériel chromosomique • Homogène ou en mosaïque (intra-tissulaire ou

tissulaire)

• Anomalies de nombre,

– Fréquentes, le plus souvent homogène : trisomie 21, 13 et 18

– Rares, souvent en mosaïque : trisomie 8 et 12

• Anomalies de structure déséquilibrées, dont le phénotype associé dépend de:

– la région chromosomique impliquée

– sa taille

– du caractère homogène ou en mosaïque

– Chaque remaniement est « privé », avec un phénotype propre

– risque de récidive si parent porteur d’une AC équilibrée

Anomalies chromosomiques autosomiques déséquilibrées

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Trisomie 13

Syndrome de Patau

Phénotype

1/8000

le plus souvent, libre et homogène

18/01/2012

90

Phénotype prénatal Précoce le plus souvent

• Hyperclarté nucale

• Malformations très fréquentes

– Anomalies du SNC (holoprosencéphalie : défaut de développement de la

partie antérieure de l'encéphale + malformation du visage)

– Fente labio-palatine

– Cardiopathie

– Malformations rénales

– Polydactylie postaxiale

• Croissance normale le plus souvent

• Artère ombilicale unique

• Anomalies de quantité de LA (hydramnios ou oligoamnios)

• Dysmorphie faciale

• Anomalies des membres

• Malformations, sévères et fréquentes

• Hypotonie

• Croissance – Poids à la naissance souvent normal

– microcéphalie fréquente

• Pronostic – Réservé, 97% de décès avant 6 mois

– Épilepsie

– Retard psychomoteur et mental sévère

Phénotype postnatal

18/01/2012

91

Dysmorphie cranio-faciale

− Front fuyant

− Fontanelles et sutures larges

− Microphtalmie colobomateuse (fissure

paupières, iris, choroïde ou rétine), voire

anophtalmie

− Hypotélorisme, voire cyclopie

− Fente labiale bilatérale, fente palatine

(50%), bec de lièvre

− Oreilles basses et martelées

Fente labiale bilatérale Fente palatine

Bec de lièvre

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92

Trisomie 13 et malformations du pôle cérébral

Neurologiques : – Holoprosencéphalie et hypoplasie du

bourgeon frontal, défaut de clivage du prosencéphale

– Cyclopie, anophtalmie, proboscis – Hypotélorisme, microphtalmie – Thalamus ou ventricule cérébral unique – Arhinencéphalie (absence du bulbe et du

tractus olfactif) – Absence des commissures, du corps calleux,

de la faux du cerveau, des nerfs ou lobes olfactifs

• Oculaires : constantes

– Colobome – Cyclopie – Cataracte – Opacités cornéennes – Glaucome – Hyperplasie et persistance du vitré primitif – Dysplasie rétinienne

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Trisomie 13 et malformations

• Membres :

– Mains :

• hexadactylie uni/bilatérale, au bord

cubital (postaxiale)

• doigts fléchis +/- chevauchements

• ongles hyperconvexes

– Pieds en piolet

• Hexadactylie moins fréquente

Trisomie 13 et autres malformations

• Cardiaques (80%) : CIV, canal artériel, CIA

• Rénales (30-50%): kystes du cortex rénal, duplication rénale ou urétérale

• Malrotation du colon

• Organes génitaux : – utérus bifide

– cryptorchidie avec insertion phallique anormale

• aplasie cutanée du vertex

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94

Trisomie 18

Syndrome d’Edwards

Phénotype 1/8000

le plus souvent, libre et homogène

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95

Phénotype prénatal

Précoce le plus souvent

– RCIU sévère précoce

– Hyperclarté nucale

– Malformations

• Mains crispées, pieds bots ou en piolet

• Cardiopathies

• Neurologiques : myéloméningocèle

• Digestives : omphalocèle (absence de fermeture de la paroi ventrale de l’embryon)

• Rénales

– Artère ombilicale unique

– Hydramnios

18/01/2012

96

• Dysmorphie faciale

• Hypotrophie constante, microcéphalie fréquente

• Anomalies des membres

• Malformations, sévères et fréquentes

• Hypotonie

• Pronostic

– Réservé, décès avant 6 mois

– Retard psychomoteur et mental sévère


Dysmorphie cranio-faciale

• Occiput saillant, microcéphalie

• Petite bouche, palais étroit

• Micrognathie

• Oreilles faunesques, bas implantées

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97

Trisomie 18 et membres

• Mains caractéristiques : poings

fermés, index recouvre le troisième

doigt, le cinquième recouvre le

quatrième

• Attitude du suppliant

• Pieds en piolet

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98

18/01/2012

99

Trisomie 18 et autres malformations

• Cryptorchidie constante

• Cardiaques (95%) : CIV, canal artériel

• Rénales fréquentes (rein en fer à cheval, méga uretère ou uretère

double)

• Digestives : diverticule de Meckel, omphalocèle, sténose du pylore,

hernie diaphragmatique

• myéloméningocèle

Trisomie 13 et 18 et conseil génétique

– 90 % libre et homogène,

– 10% liée à une translocation robertsonienne

(13,14,15,21,22) ou réciproque

Conseil génétique +++, selon les caryotypes parentaux

– Rares libre et en mosaïque

Risque de récurrence de 1% (mosaïcisme germinal)

18/01/2012

100

Phénotypes Trisomie 21 Trisomie 13 Trisomie 18

Anténatal

Hyperclarté nucale

Croissance normale RCIU sévère et précoce

Atrésie duodénale Anomalies du pole céphalique

Omphalocèle

Cardiopathie

Clinodactylie V

Petites mains

polydactylie Mains bots, pieds en piolet

AOU, qté de LA normal AOU, hydramnios

Postnatal

Dysmorphie

Hypotonie

RM, R langae

Hypotonie, RM sévère, épilepsie, décès avant 6 mois

RM sévère, décès avant 6 mois

Fémur court Microcéphalie fréquente

Retard de croissance (P, T, PC)

Pyélectasie Malformations oculaires, neurologiques, OGE

Malformations rénales

Atteinte oculaire, thyroïdienne, LAM

Aplasie cutanée du vertex

Mains crispées, attitude du suppliant

Anomalies de structure autosomiques déséquilibrées

– Phénotype lié aux • Régions chromosomiques impliquées • Taille des fragments • Caractère homogène ou en mosaïque • Richesse en gènes de ces régions

– Retard mental syndromique • Retard mental de sévérité variable • Malformations • Anomalies de croissance • Dysmorphie faciale et anomalies des extrémités • Épilepsie fréquente

– Conseil génétique selon caryotype des parents

18/01/2012

101

Caryotype maternel présentant une t(3;7) équilibrée

Anomalies gonosomiques

• Aneuploïdie

– Homogène /mosaïque

– Phénotype variable +++,

circonstances de découverte

variables +++

– RM plus fréquent avec le

nombre de chromosome X

• Quelques anomalies de

structure du chromosome X ou

Y

Formule chromosomique

Phénotype clinique

45, X

Mos 45,X/46,XX

Mos 45,X/46,XiXq

Mos 45,X/46,Xr(X)

Mos 45,X/46,XY

…

Syndrome de Türner

47, XXX Aucun

47,XXY Syndrome de Klinefelter

47,XYY Aucun

48,XXXX ou Y Retard mental

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Syndrome de Turner

Syndrome de Turner

• Lié à une monosomie X

– Complète (50%) ou partielle (30%) (le

deuxième X présente une anomalie de

structure)

– Homogène ou en mosaïque (20%)

18/01/2012

103

Formule chromosomique la plus fréquente : 45,X

Phénotype prénatal

• Aucun retrouvé

• Fausse-couche spontanée précoce ou mort fœtale in utero :

évolution clinique la plus fréquente, mais méconnue le plus souvent,

2% de survie des conceptus 45,X

• Hygroma cervical (12 SA)

• Cardiopathie (15-35%): coarctation de l’aorte

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• Naissance : 1 fille sur 2500

• Phénotype circonstances de révélation

– 1/3 chez le nourrisson

– 1/3 chez la petite fille

– 1/3 chez adolescente

– Chez la femme adulte


• Chez le nourrisson :

– Petite taille (45-47,5 cm)

– Lymphoedème limité aux mains et aux pieds (disparition

spontanée avant 2 ans)

– Excès de peau dans la nuque

Syndrome de Bonnevie-Ullrich

+ Cardiopathie (20 %) dont 50 % : coartaction de l’aorte

+ dépister une malformation rénale (50%) : rein en fer à cheval,

duplication, malrotation


18/01/2012

105

18/01/2012

106


• Chez la petite fille • Dysmorphie faciale

• Anomalies squelettiques

• Révélation de maladies récessives liées à l’X

• Naevi pigmentaires

• Myopie sévère, surdité (Otites à répétition), cataracte

congénitale fréquentes

• Dysthyroïdie

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• Dysmorphie faciale inconstante

– Visage triangulaire

– Fentes palpébrales en bas et en dehors ±

épicanthus ± ptosis

– Palais ogival, malimplantation dentaire

– Micro-rétrognathisme

– Implantation basse des cheveux dans la

nuque

– Cou large et court, pterygium colli

18/01/2012

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• Anomalies squelettiques – Petit taille persistante (-3 /-4 DS)

– Retard d’âge osseux, ostéoporose

– Thorax large, mamelons écartés

– Membres :

• Brachymétacarpie IV et V

• Déformation de Madelung (malposition des os

du carpe)

• Cubitus valgus

• Écrasement du plateau tibial interne (signe de

Kosowizc) avec genu varum

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• Développement psychomoteur et intellectuel normal

• Risque de difficultés d’apprentissage du langage et de la

lecture

• Difficultés en arithmétique et géométrie dans l’espace

• Caractère souvent réservé ou immature


• Prise en charge chez la petite fille • Endocrinologue pédiatre

– un traitement par GH (+ 10cm) et oestroprogestatif prolongé (puberté

et vie sexuelle normale)

– Gonadectomie si présence de matériel Y (risque de gonadoblastome)

• Prise en charge psychologique

• Suivi ORL

• Prise en charge cardiaque ou rénale

18/01/2012

110


• Chez l’adolescente

– Aménorrhée primaire

– Retard pubertaire d’origine gonadique

• Pilosité pubienne et axillaire réduite

• Aménorrhée primaire

• Ovaires cordons fibreux

– Utérus hypoplasique

– Petite taille (142 +/- 6cm sans traitement)


• Chez la femme adulte

• Infertilité

• 10-15% de puberté spontanée, 1-2% de fertilité spontanée (

mosaïque pas forcément détectable dans le sang)

• Aménorrhée secondaire

• Mosaïques 46,XX / 45,X

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Pronostic au moment du diagnostic • Prudent

• Phénotype variable ++++ :

– petite taille et troubles de la fertilité/puberté (dysgénésie gonadique) constants

– Dysmorphie, malformations, atteinte squelettique, développement psychomoteur variables ++++

– Phénotype très modéré si

• mosaïque avec forte proportion de cellules normales 46,XX

• anomalie de structure de l’X avec petite délétion (délétion de SHOX sur le bras court de l’X associé à une malformation de

Madelung et une petite taille)

– Phénotype sévère avec retard mental sévère : présence d’un petit anneau du chromosome X, non inactivé, car

il a perdu le centre d’inactivation (XIST en Xq13)

• Fertilité dépend de :

– la présence de cellules germinales normales 46,XX (10-15% de puberté spontanée; 1-2% de fertilité spontanée)

– Don d’ovocytes

– Morphologie de l’utérus compatible avec la gestation (possible le plus souvent)

Syndrome de Klinefelter

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47, XXY


• 1/700

• Age maternel

• Formule chromosomique : 47,XXY

• Phénotype variable +++

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Le plus souvent, le diagnostic est porté

– Retard pubertaire avec faible pilosité

– Stérilité

• sclérohyalinose des tubes séminifères et azoospermie

• Atrophie testiculaire, avec puberté normale

– Gynécomastie uni ou bilatérale (1/3)

Syndrome de klinefelter

• Développement intellectuel normal

• dyslexie (orthophonie 50%)

• Signes variables du phénotype:

– Difficultés d’acquisition du langage inconstantes

– Quelques difficultés de coordination des mouvements,

maladresse (sports individuels)

– Timidité, immaturité, faible confiance en soi

– Morphotype parfois longiligne

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• Traitement/prise en charge – Testostérone dès le début de la puberté, parfois poursuivi à l’âge

adulte. Il améliore la puberté

– Des difficultés d’apprentissage, identique aux autres enfants à caryotype normal

– Possible procréation médicalement assistée (PMA) avec ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïdes) et souvent après biopsie testiculaire. Pas de risque pour la descendance.

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• Le diagnostic peut être porté par le caryotype fœtal (age maternel ou marqueurs sériques)

– Difficultés +++ de l’annonce : angoisse parentale

– Difficultés à prédire le phénotype

• Conseil génétique est rassurant pour une future grossesse – Risque de récidive faible, sauf age maternel élevé


• Formules chromosomiques – 47,XXY

– 15 à 20% de formule en mosaïque

– Plus exceptionnel : 48,XXXY; 49,XXXXY (perte de 15 points de QI

par X supplémentaire)

– 46,XX,ish(SRY+)

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Constitution : 47,XYY

• 1,1 p 1000

• Phénotype normal

• Fécondité normale

• Découverte fortuite

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47, XXX

Autres polygonosomies

• 48,XXXX (tétrasomie X)

• 49,XXXXX

• …

• Formule en mosaïque possible

• Pronostic intellectuel proportionnel au nombre de

X surnuméraires

M3 Cytogénétique Morphologique Et Moléculaire Beleau Rotureau 18-01-12

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