Structure primaire d'un inhibiteur pancréatique de la trypsine (inhibiteur de kunitz et northrop)

130 BIOCttIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 25 468

STRUCTURE P R I M A I R E D'UN I N H I B I T E U R PANCRt~ATIQUE

DE LA T R Y P S I N E ( I N H I B I T E U R DE KUNITZ ET NORTHROP)

II. CARACTI~RISATION DES P E P T I D E S Rt~SULTANT

DE L ' H Y D R O L Y S E T R Y P S I Q U E

JACQUELINE CHAUVET, GENEVI~2VE NOUVEL ET ROGER ACHER

Laboratoire de Chimie Biologique, Facultd des Sciences, Paris (France)

(Re~u le 8 juillet, 1965)

SUMMARY

The primary structure of a pancreatic trypsin inhibitor (trypsin inhibitor Kunitz an~l Northrop) II. Characterization of tryptic peptides

The pancreatic trypsin inhibitor, oxidized by performic acid, was submitted to tryptic hydrolysis. The polypeptide chain was split into 9 peptides which were purified by chromatography and electrophoresis and analysed. The sequence of amino acids in each tryptic unit was determined and the 9 peptides account for the 5 8 residues of the inhibitor. Three amide groups were localized. Sequences of identical residues occur quite frequently even though in some cases the total number of residues of the particular amino acid is low: I le-I le (2 residues), Pro-Pro (4 residues), Asn-Asn (5 residues) and two sequences Gly-Gly (6 residues).

INTRODUCTION

L'hydrolyse trypsique (EC 3.4.4.4) est habituellement utilisOe en premier lieu pour scinder une chalne peptidique en fragments parcequ'elle conduit g6ndralement

un nombre prdvisible et restreint de peptides en raison d'une part de l 'dtroite sp6cificit~ de la trypsine et d 'autre part de la scission quasi-complete des liaisons susceptibles. L'inhibiteur contenant 4 r6sidus de lysine et 6 r6sidus d'arginine, dont un en position N-terminale, on peut s 'attendre /~ trouver une dizaine de fragments dans l 'hydrolysat dont la s@aration peut ~tre envisag6e au moyen d'un proc~d6 simple et rapide comme la chromato-dlectrophor~se sur papier. I1 est 6vident que l 'inhibiteur ne sera attaqu6 par la trypsine qu'apr6s un traitement inaetivant. Le polypeptide r6siste d'une fa~on marqu6e ~ la d6naturation. Par contre l 'oxydation par l'acide performique s'est r6v616e tout ~ fait convenable car elle scinde les 3 ponts disulfures que contient la mol6cule et rend l 'inhibiteur sensible aux divers enzymes prot~olytiques: trypsine, chymotrypsine (EC 3.4-4.5), carboxypeptidase A (EC 3.4.2.1). Au cours de ces recherches 9 fragments r6sultant de l 'a t taque par la trypsine du polypeptide oxyd6 ont 6t6 isol6s et caract6ris6s.

Abr6viations: FDNB, dinitrofluorobenz~ne; PITC, ph6nylisothiocyanate; PTH, ph6nyl- thiodanto~nes-aminoacides; DFP, diisopropylfluorophosphate.

Biochim. t?iophys. Acta, 115 (1966) 13o-14o

STRUCTURE DE L'INHIBITEUR DE KUNITZ ET NORTHROP. II 131

MATI~RIEL ET MI~THODES

L'inhibiteur utilis6 pr6sente les caract~ristiques pr6c6demment d6crites 1. Le polypeptide oxyd6 est soumis ~ l 'action de la trypsine et les fragments obtenus sont caract6ris6s par leur composition en acides amin6s, l'identification du r6sidu N-terminal et l 'hydrolyse mfinag6e acide ou enzymatique.

Oxydation de l'inhibiteur L'inhibiteur est oxyd6 par l'acide performique ~ de fa~on ~ rompre les 3 ponts

disulfures et ~t le rendre sensible ~ la trypsine. 15o mg d'inhibiteur sont dissous dans 5 ° m l d'acide performique pr6par6 I h avant utilisation en m61angeant 8 vol. d'acide formique et I vol. d 'eau oxyg6n6e ~ j~o O//o /t la temp6rature du laboratoire. On laisse la r6action s'effectuer ~ --IO ° pendant lO5 min. On ajoute alors un volume dgal d 'eau distillfie, et le produit congel6 est aussit6t lyophilis6. On r6p~te trois fois la lyophili- sation en reprenant chaque fois avec IO ml d'eau de fa~on ~ 6liminer compl~tement l 'agent oxydant. L'analyse en acides amin6s de l 'inhibiteur oxyd6 indique la presence de 6 r6sidus d'acide cyst6ique correspondant ~ l 'oxydation complete des 3 r6sidus de cystine que contient la moldcule.

Hydrolyses enzymatiques L'hydrolyse trypsique est utilis6e de fa~on ~ obtenir avec un bon rendement

des fragments en nombre restreint. Cependant la trypsine Worthington raise en oeuvre (produit cristallis6 deux fois, Lot TRSF 6144-5) poss6de une ldg6re activit6 chymotrypsique due soit ~ une contamination par la chymotrypsine, soit ~ une propri6t6 intrins6que de la trypsine elle-m~me. Cette activit6 secondaire, mesur6e sur l 'ester 6thylique de l 'ac6tyl-tyrosine est de 8 unit6s SCHWERT ET TAKENAKA 3 par mg, l 'activit6 trypsique mesur6e sur l 'ester 6thylique de la benzoylarginine 6tant de 9000 U/rag. I1 en r6sulte la pr6sence dans les hydrolysats trypsiques de l 'inhibiteur de peptides suppl6mentaires. Divers traitements de l 'enzyme ont 6t6 essay6s de fa~on

61iminer cette activit6 secondaire: action de l'acide chlorohydrique 4 (trypsine 1% dans HC1 0.06 N pendant 24 h /~ la temp6rature du laboratoire), action du diisopropylfluorophosphate (DFP) en quantit6 restreinte 5 (3/*moles de DFP agissant sur 0.3/*mole de trypsine en solution dans du bicarbonate d 'ammonium o.I M). Dans ces conditions on observe une r6duction d'environ 50 % de l'activit6 trypsique initiale sans obtenir une disparition compl6te de l 'activit6 chymotrypsique. Finale- ment les meilleurs r6sultats on 6t6 obtenus en faisant des hydrolyses de courte dur6e: 8/ ,moles d'inhibiteur oxyd6 sont dissous dans 3 ml de bicarbonate d 'ammonium o.i M (pH 8.0); on ajoute 0.750 mg de trypsine (rapport molaire enzyme/substrate = 1/25o) et on laisse 80 rain ~ 37 °. On obtient ainsi 9 fragments ou "unit6s" trypsiques, avec parfois de l'arginine libre, que l 'on peut s6parer par chromato-61ectrophor6se. L 'hydrolysat est plac6 en dessiccateur en prdsence d'acide sulfurique, puis apr6s 4limination du bicarbonate d 'ammonium, soumis au fractionnement.

L'hydrolyse chymotrypsique a 6t6 effectu6e sur certains grands fragments trypsiques de fa~on ~ obtenir des peptides plus petits. On utilise l 'a-chymotrypsine Worthington (cristallis4 3 fois, Lot CDI 6078 ). Le peptide (environ 0.5/*mole) est dissous dans I ml de bicarbonate d 'ammonium o.I M (pH 8.0) et on fait agir la chymotrypsine (rapport molaire E/S = 1/25) pendant 18 h ~t 37 °. Apr6s 6vaporation en dessiccateur, l 'hydrolysat est fractionn6 par chromato-61ectrophor6se.

Biochim. Biophys. Acta, 115 (1066) 13o-14o

132 J. CHAUVET, G. NOUVEL, R. ACHER

L'hydrolyse par la leucine aminopeptidase (EC 3.4.1.1) a dt~ utilis6e soit pour une hydrolyse totale des peptides respectant les amides, soit pour d6tacher les premiers r6sidus et apporter ainsi des informations sur la s~quence N-terminale. L'enzyme employ~ est le produit Worthington (Lot 5926), mis en oeuvre sans addition sup- pl6mentaire de Mg ~+. Le peptide (environ 0.2/zmole) est dissous dans 0.5 ml de bicarbonate d 'ammonium o.i M et on ajoute la leucine aminopeptidase dans un rapport ponddral enzyme/substrat de i/IOO. Suivant le but recherch6, Faction est effectude pendant des dur6es allant de IO rain /~ 72 h auquel cas l 'hydrolyse est g6n6ralement totale. Apr~s dvaporation de la solution en dessiccateur, l 'hydrolysat est examin6 par 61ectrophor~se, chromatographie sur papier, et les acides amin6s lib6r6s sont dos6s dans un analyseur Spinco.

Puri3cation des peplides Les peptides obtenus par action de la trypsine sur l ' inhibiteur oxyd6, ou ceux

obtenus par action de la chymotrypsine ou de l'acide chlorhydrique sur les unit~s trypsiques, sont purifi6s par chromato-~lectrophor~se sur papier Whatman No, 3 en utilisant un tampon acetate de pyridine pH 3.6 pour l'61ectrophor~se (4o V/cm ; 75 min) et un m6lange ~-butanol-acide ac~tique-eau (4:1:5, v/v) pour la chromatographie l. La rdv61ation s'effectue avec la ninhydrine dilute (o.oi % dans l'alcool), les taches sont d6coup6es, et les fragments, lavds ~ l'fither, sont 6lu6s avec de l'acide ac6tique 2 %. Environ 3/~ 6 mg d'hydrolysat (soit o.5 ~ i / ,mole d'inhibiteur) sont utilis6s pour une chromato-dlectrophor~se et permettent d 'obtenir o. 2-o.3/~mole de chaque peptide, quantit6 suffisante pour une analyse. En g~n6ral les peptides ainsi obtenus sont purs, mais il est parfois n~cessaire de soumettre le mat6riel ~ une nouvelle chromato-~lectrophor~se en prolongeant la dur~e de l'61ectrophor~se. La composition en acides amin6s est 6tablie apr~s hydrolyse en tube scell6 avec HC1 6 N pendant 2 4 ou 48 h ~ IOS °. L'analyse est effectu6e selon la m6thode de SPAGKMAN, MOORE ET STEIN 6.

Caractdrisation des peptides Chaque peptide est d 'abord caract~risd par ses rdsidus N- et C-terminaux en

utilisant d'une part les techniques de Sanger et d 'Edman, d 'autre part les carboxy- peptidases A ou B dans les conditions ant6rieurement ddcrites 1. La technique d 'Edman permet d'6tablir l 'enchalnement des 4 ou 5 premiers r6sidus, et les r~sultats sont parfois confirm6s ~ l'aide de la leucine aminopeptidase. Les unit6s trypsiques contenant plus de 4 r~sidus sont scind6es en utilisant soit la chymotrypsine, soit l 'hydrolyse acid m6nag~e (HC1 12 N, 3 J, 37°) • La s6paration des fragments obtenus est effeetu~e par chromato-61ectrophor~se et la composition en acides amin6s de chacun d'eux est d6termin6e. La structure de ces fragments est 6ventuellement 6tudi~e ~ l'aide des techniques pr6c6dentes. La caract6risation complete exige, suivant la longueur du peptide, de 2 ~ 8/,moles.

I~TUDE DES UNITES TRYPSIQUES

Les 9 fragments obtenus par hydrolyse trypsique sont s6par6s par chromato- 61ectrophor~se de la fa~on indiqu6e sur la Fig. I. Ils sont num6rot6s de T1 ~ Tg.

Biochim. Biophys. Acta, i i 5 (1966) 13o-14o

STRUCTURE DE L ' INII lBITEUR DE KUNITZ ET NORTHROP. II 133

Unitd N-terminale T z

Ce peptide qui r6agit assez faiblement avec la ninhydrine, est souvent contamin6 par le peptide T~. Apr~s 6lution au moyen d'acide ac6tique 2 %, le produit est soumis

une deuxi&me chromato-61ectrophor~se dans des conditions semblables, la dur6e de l'61ectrophor6se 6tant augment6e (I h 45 min); on obtient ainsi une sdparation nette des 2 peptides, et la composition en acides amin6s d6termin6e sur 0.2 ~mole, indique que le peptide T 1 est homog~ne (Tableau I). L'analyse r~v~le la pr6sence de

Arg

x 8

~ 4

~ 3

Fig. I. S6para t ion des 9 uni t6s t r yps iques pa r chromato-61ectrophor~se, x d6p6t de l ' h y d r o l y s a t t r y p s i q u e de l ' i nh ib i t eu r oxyd6. Elec t rophor~se r~alis6e en p remie r l ieu ( t ampon ac6 ta t e -py r id ine p H 3.6) p e n d a n t 75 min sous une tens ion de 4 ° V/cm. Chroma t og raph i e effectu6e ensui te dans le m61ange n - b u t a n o l - a c i d e a c 6 t i q u e - e a u (4: 1:5, v/v) p e n d a n t 17 h. Tous les pep t ides donnen t une co lora t ion v io le t t e apr~s r6v61ation avec la n inhyd r ine ~ l ' excep t ion des pep t ides T 8 et T 9 qui r6agissent en d o n n a n t une couleur jaune.

T A B L E A U I

COMPOSITION EN ACIDES AMIN]~S DES 9 UNITES TRYPSIQUES

A cide amind T 1 T~ T s T 4 T~ T 6. T7 Ts T 9

Lys 0.95 1.o2 I 1.21 Arg 0.76 1.26 I.OO i .IO i .oo CySO3H 1.75 1.67 0.9o i .oo Asp o.92 1.o8 2.15 I.OO Thr o.95 0.97 0.9o Ser I.OO Glu I.OO i . I I I.O6 Pro 3.89 Gly I.OO 3.02 1.75 Ala I.OO I.OO i . o i I 0.96 I.OO Val 0.93 MetO~ I.OO I leu I. IO Leu o.9o i .o6 Tyr** 0.84 1.51 0.55 Phe 0.94 o.98 I.OO I.OO

Nombre de r6sidus 15 2 (4)*** 6 13 2 4 7 5

* Compos i t ion d6termin6e pa r c h r o m a t o g r a p h i e sur papier . ** La ty ros ine est p a r t i e l l e m e n t d6 t ru i t e au cours de l 'hydro lyse .

* * * Voir le t e x t e : Unitd T 3.


134 J. CHAUVET, G. NOUVEL, R. ACHER

15 r6sidus dont les 4 prolines que contient l'inhibiteur. La m6thode du DNFB est appliqu6e sur 0.2/,mole du peptide dans les conditions d6crites 1. La phase 6th6r6e ne contient aucun D N P - a m i n o acide alors qu'on identifie dans la phase aqueuse la DNP-arg in ine et l ' e -DNP-lysine par chromatographic sur papier dans l'alcool amylique tertiaire pH 6.0. La m6thode du PITC est raise en oeuvre sur o,2/,mole de peptide 1. Le premier cycle de rdactions permet d'identifier la PTH-arg in ine par 61ectrophor6se sur papier 5~ pH 4, et le second cycle conduit /t la lib6ration de la PTH-pro l ine caractdris6e par chromatographic sur papier dans les solvants heptane- pyridine (7:3, v/v) et hep tane-n-bu tanol -ac ide formique (2 : 2 : I, v/v). La sdquence N-terminale Arg-Pro ainsi 6tablie, permet de d6duire, compte tenu du fait que le peptide contient les 4 prolines de la mol6cule et que l ' inhibiteur intact poss6de 6galement l 'enchainement N-terminal Arg-Pro, que l'unit6 trypsique 6tudi4e est situ6e en position N-terminale dans la chaine polypeptidique. Les recherches con- cernant la structure de cette unit6 ont 6t6 d6crites dans la communication pr6c6dente 1. La s6quence suivante a 6t6 6tablie:

Arg-Pro-Asp-Phe-CySO3H-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr -Thr -Gly-Pro-CySOaH-Lys .

I1 n 'a pas 6t6 d6termin6 si les rdsidus d'acide aspartique et d'acide glutamique sont amid6s ou non.

Unitds trypsiques T 2 et T 6 I1 s'agit de deux dipeptides ayant respectivement les compositions Alal, Lys 1

et Ala 1, Arg 1 (cf. Tableau I). Les techniques de Sanger et d 'Edman appliqudessur les deux peptides indiquent que dans les deux cas l'alanine occupe la position N-terminale. Ce rdsultat est en accord avec la sp6cificit6 de scission de la trypsine qui permet de situer respectivement la lysine et l 'arginine en position C-terminale. Les structures des deux dipeptides sont donc Ala-Lys et Ala-Arg.

Unitd trypsique T 3 Ce peptide contenant de l'isoleucine, l 'hydrolyse acide totale a 6t6 prolong6e

jusqu'~ 48 h. Dans ce cas on trouve des quantit6s 6gales d'isoleucine et d'arginine (Ileu - - 0.266/,mole, Arg = 0.240/*mole). Lorsque l'on fait agir la carboxypeptidase B sur ce peptide, on obtient de l'arginine libre et un peptide qui poss6de un RE diff6rent de l'isoleucine et de l'arginine au cours de la chromatographic snr papier dans le solvant n-butanol--acide ac6tique-eau. L'hydrolyse acide de ce peptide ne fournit que de l'isoleucine d'oh on d6duit sa structure I leu-Ileu puisqu'il n 'y a que deux r6sidus d'isoleucine dans l'inhibiteur. La s6quence I leu-I leu-Arg-Arg peut seule rendre compte ~t la fois de la composition en acides amin6s du peptide T 3 et du r6sultat obtenu avec la carboxypeptidase B. Dans certains hydrolysats un peptide contenant 2 r6sidus d'isoleucine pour i r6sidu d'arginine a 6t6 obtenu (Ileu = o.194/*mole, Arg = 0.o99/*mole) et la s6quence I leu-I leu-Arg a 6t6 attribu6e ~t ce fragment. On sait que la liaison Arg-Arg n'est pas seindde par la trypsine avec un bon rendement et ceci peut expliquer la pr6sence des peptides I leu-I leu-Arg et I leu-I leu-Arg-Arg.

Unitd trypsique T , Ce peptide poss6de, au cours de la chromatographic dans le solvant n-butanol -

acide acdtique-eau, un RE voisin de celui de la proline et chemine vers la cathode au

Biochim. Biophys, dcta, 115 (1966) 13o-14o

SIRUCTURE DE L'INI-IIBITEUR DE KUNITZ ET NORTHROP. II 135

cours de l'61ectrophor~se ~ pH 3.6. Sa composition en acides amines est: Tyr 2, Phe 1, Asp1, LySl, Alav

L'hydrolyse totale par la leucine aminopeptidase permet d'identifier l 'asparagine ce qui indique que le r6sidu d'acide aspartique est amid6. La technique d 'Edman

T A B L E A U I I

STRUCTURE DE L'UNIT1~ T 4

Mdthode Composition ou sdquence

Leucine a m i n o p e p t i d a s e (hydro lyse totale)

Techn ique d ' E d m a n

Ty r 2, Phe 1, Asn 1, Ala 1, Lys 1

T y r - P h e - T y r

H y d r o l y s e c h y m o t r y p s i q u e C 1 Ty r C 2 Phe C 3 A s n - A l a - L y s

S t ruc tu re T y r - P h e - T y r - A s n - A l a - L y s

permet d ' f tabl ir l 'enchalnement N-terminal Tyr -Phe-Tyr . L'hydrolyse par la chymotrypsine fournit de la tyrosine et de la ph6nylalanine libres, et un tripeptide (Asn-Ala- Lys dont la structure est d6termin6e par la m6thode de Sanger (DNP-Asp). L'ensemble des op6rations ayant permis de d6terminer la structure de l 'hexapeptide est r6sum6 dans le Tableau II . Cette structure est:

T y r - P h e - T y r - A s n - A l a - L y s .

Unitd trypsique T5 Cette unit6 contient 13 r6sidus et la composition en acides amin6s est la suivante :

Ala 1, Glya, Leu 1, CySOaH 2, Thr 1, Glu 1, Phe 1 Val 1, Tyr 1, Argl. Elle contient l 'unique r6sidu de valine de l'inhibiteur. Le mat6riel obtenu de la premiere chromato-flectro-

T A B L E A U I I I

COMPOSITION DES PEPTIDES CHYMOTRYPSIQUES OBTENUS PAR SCISSION DE L'UNIT~ T 5

Acides aminds C 1 C z Ca

i~moles Nombre de tzmoles Nombre de Izmoles Nombre de rdsidus rdsidus rdsidus

Ala o.o75 1.o3 Gly o.o79 i .o8 Leu o.o73 i .oo CySOaH o.o72 o.99 Thr 0.073 I.OO Glu 0.056 0.77 Phe o.o77 1.o5 Val Ty r Arg

0.256 2.32 0.038 2.00

O.lO 5 0.95 o.o16 0.84

0 . I I 0 1.00

0.070 0.64 O. l l 4 1.o 3 o.o19 i .oo


136 j . CHAUVET, G. NOUVEL, R. ACllER

phorfse doit 6tre soumis A une deuxifme sdparation dans des conditions identiques de fagon A obtenir un produit pur. La technique de Sanger indique que l'alanine est en position N-terminale et la m6thode d'Edman donne l'enchalnement Ala-Gly-Leu. L'hydrolyse chymotrypsique, r6alisde sur 0 .2/ ,mole de peptide pendant I8 h fournit 4 fragments qui sont sdpards par chromato-61ectrophor6se et dont les compositions en acides amin6s sont ddtermin6es (Tableau III et IV). L'heptapeptide C 1 contient les sept premiers rdsidus de l'unit6 T5 et l'hexapeptide C 1 contient les six derniers. Les fragments C a et C 4 sont respectivement un dipeptide et un tetrapeptide r6sultant de

TABLEAU IV

STRUCTURE DE L'UNITt~ T 5

Mdthode

Technique de Sanger M6thode d'Edman

Fragments chymotrypsiques CI : Conlposition

Technique d'Edman Hydrolyse partielle acide

C2

C3

C4

Carboxypeptidase A

Composition Technique de Sanger

Composition

Composition Technique de Sanger Hydrolyse partielle acide

Structure

Composition ou sdquence

Ala Ala-Gly-Leu

(Ala, Gly, Leu, CySOaH, Glu, Thr, Phe) Ala-Gly-Leu-CySOaH

(Ala, Gly) (Leu, CySOaH )

(CySOaH, Glu) (Thr, Phe)

(CySOaH, Glu, Thr, Phe) Phe

(Val, Tyr, Gly, Gly, CySOalq, Arg) Val

(Val, Tyr)

(Gly, Gly, CySO3H, Arg) Gly

(Gly, Gly) (Gly, CyS03H )

(CyS0aH, Arg)

Ala-Gly-Leu-CySOaH-Glu-Thr-Phe Val-Tyr-Gly-Gly-CySO3H-Arg

la scission de l'hexapeptide C 2, scission imparfaite, la chymotrypsine n'ayant pas coup6 la liaison Tyr-Gly avec un rendement trSs 61ev6. L'ensemble des donn6es, r6capitul6es dans le Tableau IV, permet d'attribuer A l'unit6 T 5 la structure suivante :

Ala-Gly-Leu-CySO3H-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-CySOa H-Arg.

Unitd trypsique T~ La composition en acides amin6s est la suivante: Asp2, Phel, Lysl, l'hydrolyse

totale par la leucine aminopeptidase confirmant les r6sultats de l'hydrolyse acide et indiquant en outre que les 2 r6sidus d'acide aspartique sont amid6s (cf. Tableaux I et V). La m6thode de Sanger indique qu'un r6sidu d'acide aspartique est en position N-terminale. La technique d'Edman permet de d6terminer la s4quence des 3 premiers r6sidus et d'identifier deux r6sidus d'asparagine. Enfin la carboxypeptidase B con-

]3iochim. Biophys. Mcta, 115 (1966) 13o-14o

STRUCTURE DE L'INHIBITEUR DE KUNITZ ET NORTHROP. II 137

TABLEAU V

STRUCTURE DE L ' U N I T ~ T 7


Leucine aminopeptidase (hydrolyse totale) Ash 2 Phe I Lys 1

Technique de Sanger Asp Technique d 'Edman Asn-Asn-Phe-Lys Carboxypeptidase B Lys

Structure Asn-Asn-Phe-Lys

firme que la lysine occupe la position C-terminale, ce qui pouvait ~tre d6duit de la sp6cificit6 d'action de la trypsine. Le Tableau V r6capitule les op6rations permettant d 'attr ibuer au t6trapeptide la structure:

Asn-Asn-Phe-Lys.

Unitd trypsique T 8 La composition en acides amin6s est la suivante: Serl, Alal, Glu D ASpl ,

CySO3H1, MetOz 1, Argl" Cet heptapeptide contient l'unique r6sidu de s6rine et l'unique r&idu de m&hionine de l'inhibiteur. La technique de Sanger permet de localiser la s6rine en position N-terminale et la m6thode d 'Edman fournit l'enchalnement des cinq premiers r6sidus. La leucine aminopeptidase lib&e la s6rine et l'alanine ce qui confirme la s6quence des deux premiers acides amin6s d&ermin6e par les deux m6thodes chimiques. L'hydrolyse partielle acide fournit 7 peptides s@ar6s par chromato-6lectrophor~se et dont les compositions en acides amin6s sont d&ermin6es. Les r6sultats confirment la structure qui pouvait ~tre d6duite des exp6riences pr&6dentes, l'arginine &ant localis& en position C-terminale en raison de la sp6cificit6 d'action

TABLEAU VI

STRUCTURE DE L 'UNITE T 8


Technique de Sanger Leucine aminopeptidase Technique d 'Edman Hydrolyse partielle acide

AI A2 A3 A4 A5 A6 A7

Structure

Set Ser, Ala Ser-Ala-Glu-Asp-CySOaH (MetO2, Arg)

(Ser, Ala) (Set, Ala, Glu) (Ser, Ala, Glu, Asp, CySOsH ) (Ser, Ala, Glu, Asp, CySO3H, MetO2)

(Asp, CySO3H ) (Asp, CySOsH, MetO~)

(Glu, Asp, CySO3H, MetO 2, Arg)

Ser-Ala-Glu-Asp-CySO3H-Met O~-Arg


I 3 8 J. CHAUVET, G. NOUVEL, R. ACHER

de la trypsine. L'ensemble des op6rations, r6sum6 dans le Tableau VI, permet d 'at tr i- buer ~ l'unit6 trypsique T s la structure:

Ser -Ala -Glu-Asp-CySOsH-MetO2-Arg .

La leucine amino peptidase agissant sur un peptide chymotrypsique contenant cette s6quence, lib~re l'acide glutamique. Par contre il n 'a pas ~t6 d~termin6 s i l e r6sidu d'acide aspartique est amid6 ou non.

Unitd C-terminale (Tg) Cette unit6 est la seule ~t ne pas contenir d'acide amin6 basique et ceci indique

qu'elle occupe la position C-terminale. La composition en acides amin6s est: Tyr 1, CySO3H v Gly 2, Ala v Le r6sidu C-terminal d6termin6 par hydrazinolyse est l'alanine, acide amin6 qui occupe la position C-terminale dans l ' inhibiteur et ceci confirme qu'il s 'agit de la derni~re unit6 de la chalne. La structure du pentapeptide a ~t6 6tablie en faisant appel ~t la technique de Sanger, l 'hydrazinolyse et l 'hydrolyse acide m~nagde et les rdsultats ont dt6 indiqu6s pr6c6demment ~. La s6quence de l'unit6 T o est la suivante :

Thr -CySOaH-Gly -Gly -Ala .

DISCUSSION

L'hydrolyse de l ' inhibiteur oxyd6 par la trypsine fournit 9 peptides qui ont 6t6 purifids et analysds. L'inhibiteur contenant 4 r~sidus de lysine et 6 r6sidus d'arginine dont un engag6 dans une liaison Arg-Pro, on peut s 'at tendre & trouver io fragments dans l 'hydrolysat. La succession de deux r6sidus basiques conduit ~ l 'apparition d'arginine libre au lieu d'un peptide, et le nombre d'unit6s trypsiques se trouve r~duit ~ 9.

La s6quence des acides amin6s dans les 9 unitds trypsiques a fit6 ddtermin6e et le Tableau VII indique l 'ensemble des r6sultats. Ces diff6rents peptides rendent compte

T A B L E A U V I I

UNITES "TRYPSIQUES" OBTENUES PAR SCISSION DE L'INHIBITEUR

Unitds Sdquence Nombre de rdsidus

T 1 Arg-Pro-Asp*-Phe-CySO3 H - L e u - G l u * - P r o - P r o - T y r - T h r - G l y - P r o - C y S O 3 H - L y s 15 T 2 Ala-Arg 2 T a l l e u - I l e u - A r g - A r g 4 T 4 T y r - P h e - T y r - A s n *-Ala-Lys 6 T 5 Ala -Gly -Leu-CySO3H-GIu * -Thr -Phe -Va l -Tyr -Gly -Gly -CySO3 H - A r g 13 1" 6 Ala-Lys 2 T 7 A s n - A s n - P h e - L y s 4 Ts Se r -Ala -Glu-Asp-CySO3H-MetO2-Arg 7 T9 Th r -CySO3H -G l y -G l y -A l a 5

Nombre total de r6sidus des 9 unit6s 58

* Trois r6sidus amid6s sur les 4 que contient l ' inhibiteur ont 6t6 identifi~s. Le quatr i~me r6sidu amid~ n 'a pas ~t6 localis6 et peut 6tre un des r6sidus marqu6s d 'un ast6risque.

i J. CHAOVET, G. NOUVEL ET R. ACHER, Biochim. Biophys. Acta, 115 (1966) 121.

Biochim. Biophys. Acta, I I 5 (1966) 13o-14o

STRUCTURE DE L ' INI i lBITEUR DE KUNITZ ET NORTHROP. I I 139

des 58 r6sidus que contient l'inhibiteur. L'enchatnement des acides amin6s a 6t6 confirm6 par l'6tude des fragments obtenus par hydrolyse chymotrypsique et ces unit6s chymotrypsiques ont permis d'ordonner les 9 peptides trypsiques de fa~on

6tablir la sfquence compl+te des acides amin6s de l'inhibiteur 7. Ces r~sultats ont 6t6 confirmfs par KASSEL ET LASKOWSKI s qui ont isol6 par hydrolyse trypsique de l'inhibiteur r6duit et earboxym6thyld, 9 unit6s trypsiques ayant des compositions en acides amin6s identiques A l'exception d'un r~sidu d'arginine. La position de ce r6sidu demeure discut6e, les auteurs amdricains le situant clans une liaison Lys-Arg (isolement des peptides Ala-Lys et Ala-Lys-Arg) alors que les r6sultats de ces recherches sont en faveur d'une liaison Arg-Arg (isolement des peptides Ileu-Ileu-Arg et Ileu-Ileu-Arg-Arg). La trypsine scinde imparfaitement la liaison qui unit deux r~sidus basiques et la solution de cette question doit 6tre trouvfe dans l'6tude des peptides obtenus par action de la chymotrypsine.

L'examen des unit~s trypsiques rdv~le que la succession de r6sidus identiques le long de la ehaine est assez fr6quente; ceci est particuli6rement g noter lorsque le nombre de r6sidus de l'aeide amin6 consider6 est peu 6lev6: Ileu-Ileu (2 r6sidus dans l'inhibiteur), Pro-Pro (4 rdsidus), Asn-Asn (5 r6sidus) et deux s6quenees Gly-Gly (6 r6sidus). Cette r6p6tition d'un m~me aeide amin6 a d6j~t 6t6 signal6e chez les enzymes, entre autres dans le cas de la ribonucl6ase 9 (deux s6quences Ser-Ser et une Ser-Ser-Ser; une s6quence Ala-Ala et une Ala-Ala-Ala- etc.), du cytochrome c du coeur de cheval 1° (trois s6quences Lys-Lys et une Lys-Lys-Lys etc.), dans les trypsinog+nes de boeuf et de porc n,a2 (s6quence Asp-Asp-Asp-Asp). On peut trouver d'autres exemples dans les hormones prot6iques as. Ce fait ne paratt donc pas li~ g une fonction biologique donn6e de la mol6cule exigeant une certaine structure, mais plut6t au m~eanisme g6n6ral de la biosynth~se des prot~ines.

REMERCIEMENTS

Les auteurs sont heureux de remercier ici Mme J. RELANDEAU de sa pr6cieuse collaboration technique.

R~SUM~

L'inhibiteur pancrdatique de la trypsine, oxyd6 par l'acide performique, a 6t6 soumis ~ une hydrolyse par la trypsine. La chalne polypeptidique est scind6e en 9 fragments qui sont s6par~s par chromato-61ectrophor~se et analys6s. L'enchalnement des acides amin6s clans chaque unit6 trypsique a dt6 d~termin~ et la somme des r6sidus des 9 fragments rend compte des 5 8 r6sidus que contient la mol6cule d'inhibiteur. Trois groupes amid6s ont 6t~ localisds. Bien que le nombre de r6sidus de certains acides amin6s soit peu 61ev6, on observe une r6p6tition fr6quente du m6me acide amin6 dans la chaine peptidique: Ileu-Ileu (2 r6sidus par mole), Pro-Pro (4 r6sidus), Asn-Asn (5 r6sidus), et deux s6quences Gly-Gly (6 r6sidus).

R ~ F ~ R E N C E S

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Biochim. Biophys. Acta, 115 (1966) 13o-14-o

140 j . CHAUVET, G. NOUVEL, R. ACHIER

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Biochim. Biophys. Acta, I15 (1966) 13o--14o

Structure primaire d'un inhibiteur pancréatique de la trypsine (inhibiteur de kunitz et northrop)

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