Utilisation d’AC en recherche

Ronan Chaligné Post doc, Equipe Edith HEARD, U3215

Ronan.chaligne@curie.fr

Dans quel but ?

Histone H3

H3K4me2 (Upstate)

A B C D E

Quantification / Présence Localisation sub-cellulaire

Rouge : RNA FISH (XIST) Vert : H3K27me3

Purification / Enrichissement

Western Blot

Immunofluorescence

Chromatine immunoprecipitation + Hi-Seq

Dans tous les cas, on est dépendant d’un « bon » AC Un AC spécifique pour certaines applications peut évidemment être très aspécifique dans

d’autres cas

Caractéristiques à prendre en compte : - Spécificité - Espèce reconnue - Applications - Conditions d’utilisations - …

Comment trouver un AC ?

Applications en recherche

1 - Biochimie : Western Blot, ELISA

2 – Immunoprecipitation :

ChIP, Co-IP

3 – Imagerie : Immuno-fluorescence, Immuno-histochimie

Cytométrie de flux

1 - Biochimie Western Blot (WB)

Principe générale : 1 - Préparation échantillon : - Condition native (complexe protéique…) ou dénaturante - Extraction différentielle possible : noyau vs cytoplasme … 2- Electrophorèse et transfert : - Electrophorèse sur gel acrylamide (plusieurs %) puis - Transfert sur membrane de nitrocellulose ou PDVF

But : Quantification d’une protéine entre différentes conditions / échantillons Préférable d’utiliser une protéine contre contrôle de charge

Coloration non spécifique Bleu Commassie

Principe générale : 3 - Blocking : Lait, BSA, … dépend des AC 4- Détection : - AC 1aire : contre protéine d’intérêts - AC 2aire : dirigée contre AC primaire et couplé à un système de révélation (HRP)

Optimisation de la détection : (= optimisation de l’efficacité AC 1aire) - AC polyclonal vs monoclonal - Concentration de l’AC - Solution de saturation : Lait, BSA… - Incubation AC : 1h RT, O/N 4°C…

5 – Lavage et détection : le plus souvent chimiluminescence (HRP + Luminol)

Exemples

Etude de l’activation d’une voie de signalisation

Changement de quantité d’une protéine

Etude de la présence de complexe protéique (Condition native)

Etude des modifications post-traductionnelle intervenant sur les protéines (+/- phosphorylation…)

1 - Biochimie ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays

But : Quantification de la présence d’une protéine Utilisation en diagnostic : détection protéine virale (VIH…)

Exemples : Detection d’AC anti-HIV dans le serum de patient

Si un patient est détecté comme positif (B & C), il est d’abord re-testé en ELISA puis peut être testé par une autre méthode (WB)

HIV antigens

HIV antigens

HIV antigens

HIV antigens

AC anti HIV présent dans le sérum

AC IgG humaines E E E E

Cancer Antigen ELISA Kits, Affymetrix®

This technology allows you to quickly and efficiently screen multiple human serum samples for various antigens shown to be associated with different cancers when present at elevated levels. The four assays Affymetrix offers are for Alpha-fetoprotein and Cancer Antigens CA125, CA15-3, and CA19-9.

2 - Immunoprecipitation

But : Purifier les protéines associées à notre protéine d’intérêt (complexe…) AC est couplé à une bille (sepharose, magnétique…) et permet ainsi de purifier la protéine et ses partenaires.

Co-IP

Analyse ensuite des différents partenaires du complexe via WB, spectrométrie de masse…

Exemples

Hypothèse : Jarid2 appartient au complexe PRC2 Co-IP avec Jarid2 comme « driver » puis WB des protéines du complexe testé.

Exemples

IP de la protéine BRCA1 pour identifier par spectrométrie de masse les protéines associées

Chromatine Immunoprécipitation (ChIP)

PCR en temps réel Hybridation sur puces (ChIP on Chip)

Séquençage Haut débit (ChIP-Seq)

But : Purifier les acides nucléiques cibles de notre protéine d’intérêts (complexe…) Globalement le principe est le même que pour l’IP mais on co-immunoprécipite les acides nucléiques (ADN, ARN) présents dans le complexe.

Exemples

ChIP Seq : Immuno precipitation de différentes protéines chez Drosophila Melanogaster. La position et l’enrichissement de chaque protéine peut être placé sur l’ensemble du génome

Les anticorps peuvent également cibler d’autres molécules que les protéines

Ex : anticorp anti cytosine-méthylé pour faire une IP des régions méthylées du génome

Autre exemple : anticorps ciblant les duplex ARN/ADN pour identifier les régions cibles d’ARN anti-sens

3 – Imagerie Immuno-fluorescence

But : étudier la présence et la localisation de protéines au niveau de chaque cellule. Technique à moins haut débit Mais permet d’étudier la variabilité entre chaque cellule ou alors d’étudier certaines cellules seulement dans un échantillon contenant différent types cellulaires

Detection of XIST RNA positive / KL1 negative cells in tumor section

La cellule

Réticulum endoplasmique

Appareil de Golgi

Mitochondries

Lysosomes

Noyau

Technique qualitative mais peu quantitative

(analyse au max qq 100 de cellules)

Protéine d’intéret

Anticorps primaire

Anticorps secondaire

Fluorochrome

Possibilité de faire des « couches » d’amplification : Ac secondaire couplé à biotine/Ac a streptavidine : Ac couplé à la digoxigenine

Principe général :

Paramètres à prendre en compte

1-Préserver la structure cellulaire/nucléaire:

Cytospin ou culture sur polylysine (gelatine,…) puis fixation

Dépend de la problématique

H3K9Ac

XIST

Merge

Z = 10 Z = 30 Z = 18

Z project from 15 to 25 H3K9Ac XIST Merge

2- Préserver les protéines d’intérêts de la dégradation

+ inhibiteur protéase, +/- inhibiteurs phosphatase…

3- Rendre accessibles les antigènes et les structures d’intérêts

perméabilisation, fixation (temps d’incubation, lyse avec détergeant vs lyse hypotomique…)

4- Avoir un signal de fluorescence suffisant pour être visualisé

double couche, simple couche, type de fluorochromes, traitement images post-acquisition…

5- Limiter le bruit de fond

Saturation : BSA, Lait, Gelatin; Milieu de montage

6- Optimisation de l’AC - Monoclonal (de manière générale moins bruit de fond mais moins de signal) versus polyclonal (inverse) - Être sur de la spécificité de l’AC (Ctl biologique ?!) - Dilution (ni trop ni trop peu) - Type de saturation (Concentration, BSA, Lait…) - Temps et température d’incubation - Double IF : Suffisamment de ctl pour vérifier qu’il n’y a pas de cross hybridation entre AC Iaire - Dilution et qualité de l’AC IIaire et type de fluorochrome

Classiquement, combinaison de Alx 488, Alx 568 et Alx 680

PGK_D7_ blocking done with_BSAnew_CdylgPGK_D7_ blocking done with_BSAnew_Cdylg

PGK_D7_ blocking done with_BSAold_CdylgPGK_D7_ blocking done with_BSAold_Cdylg

PGK_D7_ blocking done with_BSAold+RNA guard_CdylgPGK_D7_ blocking done with_BSAold+RNA guard_Cdylg

DAPI mergeXistCdylDAPI mergeXistCdyl

DAPI mergeXistCdylDAPI mergeXistCdyl

DAPI mergeXistCdylDAPI mergeXistCdyl

Exemple d’optimisation

PGK_D7_blocking done with_ BSABioLab_Cdylg

PGK_D7_ blocking done with_gelatin5%_Cdylg

DAPI mergeXistCdylDAPI mergeXistCdyl

PGK_D7_ blocking done with_gelatin2%_Cdylg

DAPI mergeXistCdylDAPI mergeXistCdyl

DAPI mergeXistCdylDAPI mergeXistCdyl

0

20

40

60

80

100

Cdyl-80/GAR568/gelatin Cdyl-80/GAR568/BSA Cdyl-80/GAR568H/BSA

pe

rce

nta

ge

of

Cd

yl

ac

cu

mu

lati

on

Conditions

Bloking solution analysis in HEK293 cells

Eg : IF + FISH (RNA FISH)

Tenir compte des impératifs des deux protocoles :

compromis ou faire les expériences de manière séquentielle

XIST RNA Cot1 RNA ARN Pol II Merge + DAPI

RNA FISH IF

A faire p/r à un protocole d’IF particulier :

-RNase inhibiteur avec les AC Iaire et II aire pour prévenir la dégradation des ARN

-IF fait en premier donc post-fixation pour fixer les AC avant le FISH (incubation 37°C o/n)

Combinaison de différentes techniques

gH2AX (IF) Xpr DNA Merge

IF + FISH (DNA FISH)

A faire p/r à un protocole d’IF particulier :

- IF fait en premier donc post-fixation pour fixer les AC avant le FISH (incubation 37°C o/n)

- Préférable de faire l’acquisition des images d’IF puis de faire le DNA FISH ensuite

La dénaturation de l’ADN (ie échantillon 10’ à 65°C) nécessaire pour le DNA FISH dégrade le signal IF

IF sur chromosome métaphasique + FISH (DNA FISH)

- Adapter la technique classique de préparation des métaphases (MetOH et Ac Acétique) pour ne pas dégrader certaines protéines (lyse hypotonique et condition non dénaturante)

- Acquisition des images d’IF et ensuite paint des chromosomes d’intérêts.

Lignée tumorale triploïde

IF : H3K27me3 DNA FISH : Peinture chromosomique du X

Immuno-histochimie

- Carcinoembryonic antigen (CEA): used for identification of adenocarcinomas. Not specific for site. - Cytokeratins: used for identification of carcinomas but may also be expressed in some sarcomas. - CD15 and CD30 : used for Hodgkin's disease - Alpha fetoprotein: for yolk sac tumors and hepatocellular carcinoma - CD117 (KIT): for gastrointestinal stromal tumors (GIST) - CD10 (CALLA): for renal cell carcinoma and acute lymphoblastic leukemia - Prostate specific antigen (PSA): for prostate cancer - …

Même principe que l’IF mais l’anticorp secondaire est de manière générale couplé à une enzyme (la peroxidase le plus souvent) La peroxydase, en présence de son substrat, conduit à une réaction colorée (et non à l’émission de lumière dans ce cas) On utilise également une contre coloration pour observer les cellules (Hématoxyline Eosine) But : L’IHC est utilisée en anathomopathologie pour le diagnostic et/ou le suivie des cancers (sur coupe de tissu). Les cellules tumorales peuvent exprimer spécifiquement différents gènes qui sont alors utilisés comme marqueurs tel que :

Exemple : Cancer du sein

Molecular classification

First publication : Sorlie et al, 2001, PNAS

Basal-like ERBB2+ (Her2 amplification)

Luminal (C, B and A)

Probably contamination

by normal tissue

High Grade Low grade

Breast cancer

Prognostic and predictive factors

Hormonal receptors ER and PR

60 to 80 % ER+ 20 to 40 % ER-

Prognostic and predictive factors

HER2 activation

15 to 30% of invasive ductal carcinomas

The anti-HER2 target

(trastuzumab, humanized antibody anti HER2)

Morphology and immunophenotype

of the ‘’basal’’ subtype ductal carcinoma

ER/PR- ERBB2 -

Ck5/6+ CK8/18- P53+

EGFR+

Gonzales et al Oncogene 2009, vol 28.

IHC pour identifier les cellules qui exprime +/- fortement EZH2

Cytometrie en flux

But : Permet de trier / d’analyser au niveau de chaque cellules ses paramètres physiques mais également la fluorescence émise par d’éventuels fluorochromes présents sur la cellule

Déf : Mesure des propriétés optiques de cellules transportées par un liquide vecteur (flux) jusqu’à une source d’excitation lumineuse (souvent un laser).

La technique est beaucoup plus sensible que l’IF ou l’IHC est permet donc plus facilement l’utilisation d’anticorps primaires directement couplés à un fluorochrome.

Monitoring de la différenciation mégacaryocytaires par Cytométrie de flux

Expression of GPVI and α2β1integrin using flow cytometry on mobilized peripheral blood CD34+.

Conclusion

- Les AC sont omniprésents et indispensables en recherche Difficile de travailler sur une protéine (ou une modification post-traductionnelle) si l’on a pas d’AC disponible. Nécessité d’en produire (polyclonal) : long, couteux et pas forcément de bonne qualité

- Nécessité d’avoir des Ac spécifiques (si on a des doutes : ctl biologique)

- On peux avoir à utiliser différents AC contre une même protéine mais pour

différentes applications

- Pour conclure, essayer autant que possible de ne pas tout baser sur l’utilisation d’un seul AC:

Varier les techniques et les approches, utiliser différents AC…